L-Effetti Ta 'Naringenin Fuq Profili MiRNA-mRNA fiċ-Ċelloli HepaRG

Għal aktar dettalji, ikkuntattja:tina.xiang@wecistanche.com

Astratt: Naringenin, naturaliflavonojdimisjub ħafna fil-frott taċ-ċitru, ġie rrappurtat li jippossjedi proprjetajiet antiossidanti, anti-infjammatorji u epatoprotettivi bħala suppliment tad-dieta naturali. Madankollu, il-mekkaniżmu regolatorju ta 'naringenin fil-fwied tal-bniedem għadu mhux ċar. Fl-istudju preżenti, is-sekwenzjar tal-RNA tal-messaġġier (mRNA-seq), is-sekwenzjar tal-microRNA (miRNA-seq), u l-qPCR f'ħin reali ntużaw biex jiddistingwu d-differenzi tal-espressjoni bejn iċ-ċelluli HepaRG ta 'kontroll u ttrattati b'naringenin. Ksibna 1037 mRNAs espressi b'mod differenzjat u 234 miRNAs. Skont il-previżjoni tal-mira u l-analiżi tal-integrazzjoni in silico, sibna 20 par potenzjali miRNA-mRNA involuti fifwiedmetaboliżmu. Dan l-istudju huwa l-ewwel li jipprovdi perspettiva ta 'interazzjonijiet miRNA-mRNA fir-regolamentazzjoni ta' naringenin permezz ta 'analiżi integrata ta' mRNA-seq u miRNA-seq fiċ-ċelloli HepaRG, li tikkaratterizza aktar il-valur nutraċewtiku ta 'naringenin bħala addittiv tal-ikel.

Kliem ewlieni: naringenin; mRNA-seq; miRNA-seq; Ċelloli HepaRG

ikklikkja biex tikseb aktar informazzjoni dwar il-prodott

1. Introduzzjoni

Naringenin, flavonoid naturali, jinstab b'mod abbundanti fil-frott taċ-ċitru u frott ieħor li jittiekel, bħall-grejpfrut, larinġ, bergamot, tadam, u tin [1]. Wara l-amministrazzjoni orali, naringenin huwa mqassam b'mod wiesa 'fil-passaġġ gastro-intestinali u l-fwied [2,3] u juri proprjetà antiossidant diretta b'attività ta' tneħħija ta 'radikali ħielsa minħabba l-istruttura molekulari tiegħu, u jinduċi s-sistema antiossidant endoġena fil-fwied [4]. Evidenza dejjem tikber kemm minn studji in vitro kif ukoll in vivo identifikat diversi kapaċitajiet protettivi ta 'naringenin, bħalanti-infjammatorji[5], antiossidant [6], anti-fibrosis [Z], u epatoprotective 4,8| attivitajiet. Dawn il-kapaċitajiet jissuġġerixxu li naringenin tad-dieta jista’ jiġi applikat biex jipprevjeni s-sindromu metaboliku u mard malinn, inkluż epatite fulminanti, xaħammard tal-fwied, fibrożi, eċċ 19,10]. Madankollu, hemm ftit studji dettaljati dwar l-effetti regolatorji ta 'naringenin fuq il-ġeni ġenerali tal-fwied [4].

MicroRNAs (miRNAs) huma klassi ta' molekuli ta' RNA single-stranded mhux kodifikati b'tul ta' 18-26 nukleotidi kodifikati minn ġeni endoġeni, li juru firxa wiesgħa ta' funzjonijiet regolatorji bijoloġiċi fil-filoġenja, id-divrenzjar, il-proliferazzjoni u l-apoptożi. [11]. miRNA, RNAs messaġġier li jorbtu (mRNAs) permezz ta 'rikonoxximent speċifiku għas-sekwenza, jirregola b'mod negattiv l-espressjoni tal-ġeni fil-livell ta' wara t-traskrizzjoni permezz tad-degradazzjoni tal-mRNAs fil-mira [12]. Taħt stimulazzjoni eżoġena, l-espressjoni tal-miRNA tinbidel, u mbagħad l-espressjoni tal-mRNA fil-mira hija regolata. Eventwalment, funzjonijiet fiżjoloġiċi estensivi jinbidlu biex ilaħħqu mal-isfidi kkawżati minn stimulazzjoni eżoġena [13]. Metodu aktar affidabbli għat-tbassir tar-relazzjonijiet fil-mira miRNA-mRNA huwa li fl-istess ħin tiġi integrata l-analiżi mRNA-seq ma 'analiżi miRNA-seq bl-użu ta' kuntest ta 'proċessar partikolari in silico [14].

Għalhekk, l-għan tagħna kien li nistudjaw l-effetti ta 'naringenin fuq ġeni globali u jenfasizzaw il-mekkaniżmu regolatorju possibbli ta' pari miRNA-mRNA fil-fwied. Fl-istudju preżenti, bidliet fl-espressjoni ta 'mRNA u profili ta' espressjoni ta 'miRNA ġew investigati f'HepaRGcells billi wettqu mRNA-seq, miRNA-seq, analiżi bijoinformatiċi, u qPCR f'ħin reali biex jipprovdu evidenza għall-potenzjal ta' naringenin bħala suppliment tad-dieta naturali.

2. Riżultati

2.1.Analiżi tas-Sekwenzar tat-Trancriptome fir-Rispons għal Naringenin

Biex jiġu identifikati bidliet fl-espressjoni tal-mRNAĊelloli HepaRGbi tweġiba għal naringenin, tmien libreriji komplementari tad-DNA(cDNA) fil-grupp ta' kontroll (CK-1, CK-2, CK-3, u CK-4) u l-grupp sperimentali (T-1, T-2, T-3, u T{-4) ġew mibnija b'RNA totali u soġġetti għal sekwenzar Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou , iċ-Ċina). Ħarsa ġenerali tar-riżultati tas-sekwenzjar u l-assemblaġġ għall-grupp ta 'kontroll u l-grupp sperimentali huma murija fit-Tabella 1. Bidliet fl-espressjoni tal-ġeni ġew analizzati billi tqabbel il-gruppi ttrattati u ta' kontroll. Kif muri fil-Figura la, il-grupp espost għal naringenin esprima 1037 ġeni espressi b'mod differenzjali (DEGs) meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll. Mappa tas-sħana ta '1037 DEGs wriet l-analiżi tar-raggruppament tal-grupp ta' kontroll u l-grupp ta 'naringenin (Figura 1b; 381 'il fuq u 656 ġeni regolati 'l isfel; Tabella S1, Materjali Supplimentari).

Skont is-sistema ta 'klassifikazzjoni tal-Ontoloġija tal-Ġene (GO), 1037 DEG ġew ikklassifikati fi tliet kategoriji funzjonali ewlenin (proċess bijoloġiku, komponent ċellulari u funzjoni molekulari) u 61 sottokategorija (Figura 2). Fost il-proċess bijoloġiku, il-proċess ċellulari (731) kien l-aktar rappreżentat b'mod komuni, segwit mill-proċess ta 'organiżmu wieħed (672) u r-regolamentazzjoni bijoloġika (595). Fil-kategorija tal-komponent ċellulari, proporzjon sinifikanti ta 'clusters ġie assenjat għal cell(727), parti taċ-ċelluli (721), u organelle (580). Ġeni involuti fil-gruppi ta 'rbit (666) u attività katalitika (238) kienu notevolment rappreżentati fil-kategorija tal-funzjoni molekulari.

Il-klassifikazzjoni tal-Enċiklopedija ta 'Ġeni u Ġenomi ta' Kyoto (KEGG) instabet għal 1037 DEGs li ġew ikklassifikati aktar fl-aqwa għoxrin mogħdija bijokimiċi skont l-iżgħar q-valur u l-akbar GeneNumber fl-annotazzjoni tal-mogħdija (Figura 3). Il-GeneNumber u l-proporzjon tal-ġeni annotati tal-aqwa ħames mogħdijiet huma lupus erythematosus sistemiku (33,8.4 fil-mija), alkoħoliżmu (38,9.67 fil-mija), regolazzjoni ħażina tat-traskrizzjoni fil-kanċer (22, 5.6 fil-mija), mogħdija ta 'sinjalazzjoni PI3K-Akt (34, 8.65 fil-mija ), u komplement u kaskati tal-koagulazzjoni (12, 3.05 fil-mija o). Kien hemm aktar minn 10 ġeni arrikkit fost il-ħames mogħdijiet. B'mod ġenerali, it-trattament ta 'naringenin kellu impatt sinifikanti fuq il-profil globali tal-espressjoni tal-ġeni taċ-ċelloli HepaRG. Dawn ir-riżultati implikaw li l-ġeni involuti f'dawn il-mogħdijiet jista 'jkollhom rwoli kruċjali fir-regolamentazzjoni ta' naringenin.

2.2. Analiżi tal-Livelli tat-Traskrizzjoni tal-miRNA bi Rispons għal Naringenin

F'dan l-istudju, għandna l-għan li niddeterminaw jekknaringeninl-espożizzjoni tbiddel il-livelli ta' espressjoni ta' miRNAs fiċ-ċelloli HepaRG. Wara l-espożizzjoni, ġabarna RNAs żgħar u kejlna l-abbundanza relattiva tagħhom bl-użu ta 'Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou, China). Kif muri fit-Tabella 2, qari nodfa ta 'tmien kampjuni ġew iġġenerati, rispettivament, wara li tneħħew qari kontaminanti. Ħarsa ġenerali lejn il-qari għal sekwenzar ta' RNA żgħir minn dejta mhux ipproċessata għal kwalità għolja u b'filtrazzjoni ta' kwalità hija pprovduta fit-Tabella 2. Id-distribuzzjonijiet tat-tul ta' RNAs żgħar kienu simili fost il-libreriji f'dak 21-23 nt RNAs kienu l-aktar abbundanti (Figura 4). ).

L-RNAs żgħar kollha ġew allinjati fid-database tal-GeneBank (Rilaxx 209.0) u fid-database Rfam (11.0) biex jidentifikaw u jneħħu RNA ribosomali (rRNA), RNA kondizzjonali żgħir (scRNA), nukleolari żgħar (snoRNA), nukleari żgħar (snRNA), u RNA tat-trasferiment (tRNA). Skont il-ġenoma ta 'referenza, dawn l-RNAs żgħar immappjati għal exons, introns, u sekwenzi ripetuti tneħħew ukoll. L-RNAs żgħar tal-filtrazzjoni ġew imfittxija kontra d-database miRBase (Rilaxx 21) biex jiġu identifikati l-miRNAs. Il-mappa tas-sħana ta '3373 miRNAs turi l-analiżi tar-raggruppament tal-grupp ta' kontroll u l-grupp ta 'naringenin fil-Figura 5a. Il-profil Illumina HiSeq2500 tat-3373 miRNAs analizzati f'espożizzjoni ta' naringenin vs kampjuni ta' kontroll wera li total ta' 234 miRNAs espressi b'mod differenzjali (DEMs, 174up-u 60 down-regulated; Tabella S2, Materjali Supplimentari) kienu skoperti fiċ-ċelloli HepaRG (Figura 5b) .

2.3.Target Tbassir u Analiżi ta' Integrazzjoni ta' Profili ta' Espressjoni ta' mRNA u miRNA bi Rispons għal Naringenin

Filwaqt li jaġixxu fil-livell ta 'wara t-traskrizzjoni, il-miRNAs is-silenzju u/jew jirregolaw l-espressjoni tal-ġeni tal-mRNA ċellulari permezz tal-qsim tal-RNA fil-mira. Biex inbassru l-ġeni fil-mira ta' 234 DEMs, għamilna analiżi komputazzjonali bl-użu tal-RNAhybrid (v2.1.2) flimkien ma' skylight (v6). .01), Miranda (v3.3a), u TargetScan (Verżjoni:7.0). Il-profiling simultanju ta '234 DEMs u 1037 DEG livelli in silico jista' jidentifika l-mRNAs fil-mira preżuntiva ta 'miRNAs. Aħna għażilna l-intersezzjoni ta 'DEGs u ġeni fil-mira ta' DEMs u mbagħad wettaqna analiżi bijoinformatika fuq dawn il-ġeni ta 'intersezzjoni. Inkisbu total ta '5607 pari negattivi ta' miRNA-mRNA għat-trattament ta 'naringenin, bl-involviment ta' 216 ​​DEMs u 681 DEGs (Tabella S3, Materjali Supplimentari). F'konformità mas-sistema ta' klassifikazzjoni GO, 681 DEG ġew ikklassifikati fi 58 sottokategorija (Figura 6). L-ewwel tliet sottokategoriji ma nbidlux fi tliet kategoriji funzjonali ewlenin meta mqabbla mal-analiżi tas-sekwenzjar tat-traskriptome (Figuri 2 u 6).

Analiżi ta' arrikkiment tal-mogħdija għal 681 DEGs ta' 5607 pari negattivi ta' miRNA-mRNA identifikaw l-aqwa għoxrin mogħdija skont l-iżgħar valur q u l-akbar GeneNumber fl-annotazzjoni tal-mogħdija wara l-espożizzjoni tan-naringenin (Figura 7): b'mogħdija ta 'sinjalazzjoni PI3K-Akt (25,8.96) fil-mija) hija t-tmien mogħdija u t-tieni l-aktar abbundanti.

2.4.Validazzjoni qPCR f'ħin reali tar-Regolament ta' Naringenin fil-Metaboliżmu tal-Fwied u Pari Regolatorji Potenzjali ta' miRNA-mRNA

Skont l-annotazzjonijiet tal-funzjoni tal-ġeni globali, ir-reviżjoni tal-letteratura, u r-relazzjoni potenzjali tagħhom ma 'miRNAs li jirrispondu għal naringenin, 19 DEGs (ALOX15, CA9, TH, HKDC1, NDUFA4L2, RRM2, ACSL5, PLA2G4C, LIPT2, UGDH, FTCD, ABAT, AZSTIN2, AZHS66) , B4GALT6, GUSB, DCT, ALAS2, u MAT1A) ġew magħżula manwalment bħala rappreżentanti għar-rwoli potenzjali tagħhom fil-metaboliżmu tal-fwied. Barra minn hekk, il-mogħdija ta 'sinjalazzjoni PI3K-Akt kienet ġiet arrikkita b'mod sinifikanti (ir-raba' fl-analiżi KEGG ta 'RNA-seq, Figura 3; it-tmien fil-KEGG ta' analiżi miRNA-RNA-seq, Figura 7); għalhekk.11 DEG (PDGFRB. CSF1R. FGFR2, IL2RG, IL7R, ITGB4, GNG4, PCK1, CREB3L3, CREB3L1, u NFkB1) fost il-mogħdija tas-sinjalar PI3K-Akt ġew skrinjati.

Hawnhekk iddeskrivejna l-interazzjoni bejn it-30 DEG u l-11-il miRNA uman (hsa-miR-1306-5p, hsa-miR-627-3p, hsa-miR-194-3p, hsa-miR{{9 }}p, hsa-miR-6837-5p, hsa-miR-429, hsa-miR-100-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR{{19} }a-3p, hsa-miR-7-5p, u hsa-miR-200a-5p), inklużi 20 interazzjoni negattiva miRNA-mRNA (Figura 9). Kif muri f'Figura 9, miRNA wieħed jista' jirregola mRNAs fil-mira multipli u viċi versa (eż., ABAT HS6ST3, B4GALT6, u DCT jistgħu possibbilment ikunu regolati simultanjament minn hsa-miR-429; HS6ST3 jista' jkun irregolat simultanjament minn hsa-miR -429, hsa-miR-100-3p, hsa-miR-519a-3p, hsa-miR-676-3p, hsa-miR-7-5 p, u hsa-miR-194-5p; xi DEGs ma kellhomx DEMs paired). Il-profili ta 'espressjoni ta' 19 DEG relatati mal-metaboliżmu tal-fwied u 11 DEG fost il-mogħdija ta 'sinjalazzjoni PI3K-Akt ġew validati aktar bl-użu ta' qPCR f'ħin reali (Figura 9a, b). Il-livell ta 'espressjoni ta' 11-il miRNAs uman (tnejn 'il fuq u disa' 'l isfel regolati) ġie vvalutat aktar għal bidliet indotti minn naringenin permezz ta' qPCR f'ħin reali konsistenti mar-riżultati tas-sekwenzjar (Figura 9c). Għalkemm kien hemm xi differenzi kwantitattivi bejn iż-żewġ pjattaformi analitiċi, ix-xebh bejn id-dejta RNA-seq u l-PCR f'ħin reali ssuġġeriet li d-dejta RNA-seq kienet riproduċibbli u affidabbli.

3. Diskussjoni u Konklużjonijiet

Is-sejbiet diskussi hawn jiżvelaw l-ewwel informazzjoni dettaljata dwar bidliet paralleli fl-espressjoni ta’ mRNA u miRNA fiċ-ċelloli HepaRG bi tweġiba għalnaringenin. Aħna wettaqna analiżi integrattiva ta 'din id-dejta inklużi 234 DEMs u 1037 DEGs indotti minn naringenin, li jipprovdu għarfien globali dwar l-interazzjonijiet miRNA-mRNA ta' naringenin fil-mekkaniżmu regolatorju. Skont l-annotazzjonijiet tal-funzjoni tal-ġeni u r-reviżjoni tal-letteratura, ġew skrinjati 19 DEG relatati mal-metaboliżmu. B'mod partikolari, il-mogħdija tas-sinjalar PI3K-Akt ġiet arrikkita b'mod sinifikanti kemm fl-analiżi tas-sekwenzjar tat-traskriptome (it-tielet l-aktar abbundanti, u kklassifikati fir-raba ') kif ukoll fl-analiżi tal-integrazzjoni tal-profili tal-espressjoni ta' miRNA-mRNA (it-tieni l-aktar abbundanti, u kklassifikati fit-tmien post) fi tweġibiet għal naringenin. Barra minn hekk, 11-il DEG fil-mogħdija tas-sinjalar PI3K-Akt ġew validati aktar bl-użu ta 'analiżi qPCR f'ħin reali. F'dan ix-xogħol, bnejna netwerk regolatorju miRNA-mRNA skont is-settijiet tad-dejta DEMs u DEGs u l-informazzjoni dwar il-mira tal-miRNA. Xi studji wrew li n-netwerk regolatorju miRNA-mRNA jirrispondiħsara fil-fwied, inkluż karċinoma epatoċellulari u stress ossidattiv [15]. Għalkemm ġew identifikati diversi fenomeni ta 'attivazzjoni ta' RNA indotti minn miRNA [16], fil-biċċa l-kbira taċ-ċirkostanzi, il-korrelazzjoni negattiva bejn il-miRNAs u l-mRNAs fil-mira tagħhom ħafna drabi titqies bħala appoġġ għall-mira tal-miRNA [17]. Fl-aħħar mill-aħħar, 20 pari ta 'korrelazzjoni negattiva miRNA-mRNA ġew identifikati bl-involviment tal-metaboliżmu tal-fwied u l-mogħdija ta' sinjalazzjoni PI3K-Akt.

Fir-rigward tal-ġeni globali, indirizzajna l-mistoqsija ta’ riċerka partikolari tagħna bl-użu ta’ analiżi tal-mogħdija biex nenfasizzaw 19 DEG relatati mal-clusters funzjonali: metaboliżmu, inkluż metaboliżmu tal-lipidi (ALOX15, ACSL5, PLA2G4C, u B4GALT6), metaboliżmu tal-enerġija (CA9 u NDUFA4L2) , Metaboliżmu ta 'kofatturi u vitamini (TH, LIPT2, u FTCD), metaboliżmu ta' aċidi amminiċi (RRM2, AZIN2, DCT, ALAS2, u MAT1A), bijosintesi u metaboliżmu tal-Glycan (HS6ST3 u GUSB), u metaboliżmu tal-karboidrati "(HKDC1, PCK1, UGDH, u ABAT). Dawn id-19-il DEGs arrikkit għall-metaboliżmu huma primarjament involuti fis-sensittività għall-insulina, l-akkumulazzjoni tal-lipidi, il-ħażna tal-glikoġenu, u l-infiq tal-enerġija. Studji preċedenti rrappurtaw li r-regolazzjoni 'l isfel ta' ALOX15 f'ħsara fil-fwied tal-ġrieden indotta mill-alkoħol[18], CA9 fil-ġrieden BALB/C [19], THin nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD)[20], HKDC1[21], u r-regolamentazzjoni 'l fuq ta' UGDH [22] jistgħu jtaffu b'mod sinifikanti l-istress ossidattiv, l-akkumulazzjoni tal-lipidi u l-ħsara fil-fwied. Knockdown ta 'NDUFA4L2 mrażżna akkumulazzjoni ta' ROS zzjoni u apoptożi fiċ-ċelloli tal-karċinoma epatoċellulari (HCC) [23]. Is-sajlenser RRM2 inibixxi l-proliferazzjoni taċ-ċelluli NCI-H929 [24], u l-espressjoni żejda ta 'FTCD soppressa l-proliferazzjoni taċ-ċelluli billi tippromwovi ħsara fid-DNA u tinduċi l-apoptożi taċ-ċelluli fiċ-ċelloli HCC [25]. L-ablazzjoni ta 'ACSL5 tejbet is-sensittività għall-insulina żiedet in-nefqa tal-enerġija, u ttardjat l-assorbiment tat-trigliċeridi fil-ġrieden [26]. Is-supplimentazzjoni tad-DCT tejbet l-isteatożi u l-infjammazzjoni tal-fwied assoċjati mal-età [27]. Il-formazzjoni tal-qtar tal-lipidi fuq l-istimulazzjoni tal-aċidu xaħmi u l-virus tal-epatite Ċ fiċ-ċelloli knockdown PLA2G4C kienet indebolita [28]. Ir-regolazzjoni 'l isfel ta' LIPT2 inibita s-sintesi ta 'aċidu xaħmi [29]. Ir-regolamentazzjoni 'l fuq ta' ABAT [30], AZIN2 [31], B4GALT6 [32], HS6ST3 [33], u GUSB [34] tista 'tippromwovi d-dekompożizzjoni ta' aċidu xaħmi u glycogen. L-espressjoni żejda ALAS2 tista 'ttejjeb il-kapaċità ematopojetika tal-fwied [35l, u MAT1A espress f'epatoċiti żammet l-istat differenzjat ta' dawn iċ-ċelloli [36]. B'mod konsistenti mas-sejbiet deskritti hawn fuq, ir-regolamentazzjoni ta 'dawn il-ġeni metaboliċi fir-riżultati tagħna tista' tkun favorevoli biex ittejjeb il-metaboliżmu b'rispons għal naringenin.

Il-mogħdija ta 'sinjalazzjoni PI3K-Akt tista' toffri ħjiel għall-mekkaniżmu molekulari involut fil-metaboliżmu, infjammazzjoni u stress ossidattiv [37], li għandu rwol ċentrali fir-rispons għan-naringenin. Il-mogħdija tas-sinjalar PI3K-Akt għandha effetti downstream diversi fuq il-metaboliżmu ċellulari jew permezz ta’ regolazzjoni diretta ta’ trasportaturi tan-nutrijenti u enzimi metaboliċi jew il-kontroll ta’ fatturi ta’ traskrizzjoni li jirregolaw l-espressjoni ta’ komponenti ewlenin ta’ mogħdijiet metaboliċi [38,39], inkluż il-metaboliżmu tal-glukosju, il-bijosintesi. tal-makromolekuli, u ż-żamma tal-bilanċ redox. Ġie rrappurtat li s-sajlenser PDGFRB inibixxi l-attivazzjoni u l-proliferazzjoni ta 'ċelluli stellati tal-fwied u l-fibrożi tal-fwied tjiebet [40]. L-inibizzjoni kollaborattiva ta 'CSF1R u FGFR2 hija mistennija li ttejjeb l-effetti kontra t-tumur billi timmira l-evażjoni immuni u l-anġjoġenesi fil-mikroambjent tat-tumur [41]. It-twaqqigħ ta 'ITGB4 soppressa l-glikolisi f'fibroblasti assoċjati mal-kanċer [42]. Il-knockdown ġenetiku ta 'PCK1 impedixxa żieda kkaġunata mill-aċidu xaħmi fil-fluss ossidattiv, stress ossidattiv, u infjammazzjoni [43], li kienet ukoll korrelata ma' mogħdijiet ta' sinjalazzjoni rregolati mill-insulina [44]. Intwera li l-espressjoni żejda ta 'CREB3L3 nukleari indotta lipolisi sistemika, ketoġenesi tal-fwied, u sensittività għall-insulina b'nefqa akbar fl-enerġija [45]. Allegatament, l-inibizzjoni ta' CREB3L1 imblukkat l-invażjoni u l-metastasi tal-kanċer [46]. NFkB huwa regolatur ewlieni tal-iżvilupp immuni, ir-risponsi immuni, l-infjammazzjoni u l-kanċer [47]. Ġie stabbilit sew li s-soppressjoni ta 'NFkB trans-duce sinjali anti-infjammatorji u tnaqqas l-infjammazzjoni [48]. Fil-mogħdija tas-sinjalar PI3K-Akt, ir-riżultati tagħna wrew li naringenin irregola b'mod sinifikanti l-espressjonijiet tal-mRNA ta' PDGFRB, PCK1, CREB3L1, u NFkB1 b'miRNAs relatati (has-miR-1306-5p u hsa-miR{{40} }p) li jkunu rregolati b'mod sinifikanti. Għalhekk, id-dejta tagħna ssuġġeriet li naringenin jista 'jkollha rwol salutarju fl-istress anti-infjammatorju, kontra l-ossidazzjoni, u fil-metaboliżmu ta' titjib permezz tal-inibizzjoni tal-mogħdija ta 'sinjalazzjoni PI3K-Akt.

Dan l-istudju kien l-ewwel wieħed li jintegra l-analiżi ta 'mRNA-seq u miRNA-seq fil-fwied bi tweġiba għal naringenin u pprovda perspettiva ta' metaboliżmu fir-regolamentazzjoni ta 'naringenin. F'termini ta 'metaboliżmu u l-mogħdija tas-sinjalar PI3K-Akt, il-11-il DEMs, 30 DEGs, u 20 pari miRNA-mRNA jeħtieġu aktar riċerka għall-attivitajiet ta' naringenin. Hemm xi limitazzjonijiet ta 'din ir-riċerka; per eżempju, l-effetti dipendenti fuq id-doża u dipendenti fuq il-ħin ta 'naringenin fl-interazzjonijiet miRNA-mRNA kienu għadhom mhux ċari. Għalkemm mogħtija miRNAs analizzati in silico kapaċitajiet regolatorji ssuġġeriti, il-funzjonijiet tagħhom jeħtieġ li jiġu ċċertifikati aktar f'kuntest speċifiku fi ħdan sistema ħajja. Fil-qosor, ipprovdejna riċerka preliminari li tanalizza l-espressjoni tal-mRNA u tal-miRNA u l-profil tal-metaboliżmu. Il-mekkaniżmu regolatorju tal-pari miRNA-mRNA jista 'jkun evidenza addizzjonali possibbli għall-annotazzjoni tal-valur nutraċewtiku ta' naringenin.

4. Materjali u Metodi

4.1. Kimiċi u Reaġenti

Il-linja taċ-ċelluli HepaRG kienet oriġinarjament mixtrija minn Biopredic International (Rennes, Franza). RPMI-1640 medju u soluzzjoni penicillin-streptomycin-glutamine nkisbu minn Gibco (Gaithersburg, MD, USA). Serum bovin tal-fetu (FBS) inxtara minn Corning (Auckland, New Zealand). Naringenin u dimethyl sulfoxide (DMSO) kienu minn Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA). TRIzolTM reaġent ġie fornut minn Thermo Fisher (Carlsbad, CA, USA). Ilma ultrapur ġie ppurifikat permezz ta 'sistema ta' purifikazzjoni tal-ilma akkademika Milli-O (Millipore, Bedford, MA, USA). Ir-reaġenti l-oħra kollha kienu prodotti kkummerċjalizzati tal-ogħla grad analitiku disponibbli.

4.2. Kultura taċ-Ċelloli HepaRG

Iċ-ċelluli HepaRG ġew miżrugħa f'5 × 10 * ċelluli/cm- fi pjanċi b'sitt bir u mkabbra f'medja RPMI-1640, ikkultivati ​​bi jew mingħajr 100 uM naringenin għal 48 siegħa, u supplimentati b'10 fil-mija FBS u 1 fil-mija antibijotiċi (100 U/mL peniċillina u 100 ug/mLstrepto-mycin) at37 grad fi CO umidifikat 5 fil-mija, inkubatur. CK-1, CK-2, CK-3, u CK-4 jirreferu għall-grupp tal-kontroll tal-kontroll; T-1, T-2, T-3, u T-4 jirreferu għall-grupp ta 'trattament ta' 100 μM naringenin. In-numri 1, 2, 3, u 4 jirrappreżentaw kampjuni minn erba' esperimenti ripetuti indipendenti.

4.3.Total RNA Estrazzjoni

Iċ-ċelluli HepaRG ġew maħsula darbtejn b'salina phosphate-buffered (PBS) kiesħa fis-silġ u maħsuda bir-reaġent TRIzolTM kif rakkomandat mill-manifattur. Intużaw Thermo Scientific NanoDropTM2000 c Spettrofotometri (Wilmington, DE, USA) biex ikejlu l-kwalità u l-kwantità tal-RNA ta 'kull kampjun skont il-protokoll tal-manifattur.

4.4.Sekwenzar tal-RNA

L-mRNA ġie arrikkit b'żibeġ Oligo(dT), imbagħad l-mRNA arrikkit ġie frammentat u traskritt b'lura f'cDNA b'primers każwali permezz ta 'kit ta' estrazzjoni OiaOuick PCR (Qiagen, Venlo, l-Olanda). Molekuli RNA f'firxa ta 'daqs ta' 18-30 nt ġew arrikkit bl-elettroforesi tal-ġel tal-polyacrylamide. L-adapters 3'u 5' ġew miżjuda, imbagħad RNAs arrikkit ġew reverse-traskritti mill-kit ta 'estrazzjoni QiaQuick PCR, skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur (Qiagen, Venlo, l-Olanda). Il-prodotti tal-ligazzjoni ġew magħżula fid-daqs permezz ta 'elettroforesi tal-ġel tal-agarose. Kien hemm erba 'kampjuni fil-grupp ta' naringenin u erba 'kampjuni fil-grupp ta' kontroll. Kull kampjun iġġenera żewġ libreriji cDNA: waħda għal mRNA-seq u l-oħra għal miRNA-seg. Prodotti amplifikati PCR ġew arrikkit biex rispettivament jiġġeneraw 16-il librerija cDNA u sekwenzati bl-użu ta 'Ⅲlumina HiSeq2500 minn Genedenovo Biotechnology Co. (Guangzhou, Ċina). Id-dejta tas-sekwenzjar tal-RNA u tal-RNA żgħira ġiet iddepożitata fl-Arkivju Aqra tas-Sekwenza tal-NCBI (numri ta 'adeżjoni minn SRR13675952 sa SRR13675963).

4.5. qPCR f'ħin reali

It-traskrizzjoni ta 'mRNA fis-cDNA saret bis-Sistema ta' Traskrizzjoni Reverse GoScriptTM (Promega, Madison, WI, USA) minn 3 ugs ta 'RNA totali, skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Għall-analiżi tal-miRNA, is-sinteżi tal-cDNA saret bis-sintesi tal-cDNA tal-Ewwel Strand tal-miRNA (Tailing Reaction, Sangon Biotech, Shanghai, iċ-Ċina) minn 2 ugs ta 'RNA totali.

b'GoTaq® qPCR Master Mix（Promega, Madison, WI, USA) fuq LightCycler 480 (Roche, Mannheim, il-Ġermanja), kif rakkomandat mill-manifattur. Il-proċedura taċ-ċikli termali bdiet b'denaturazzjoni inizjali f'95C għal 10 min. Dan kien segwit minn 45cycles ta 'denaturazzjoni għal 10s f'95 grad, primer vinkolanti għal 20 s f'60 grad, u titwil għal 20 sat 72 grad. Il-proċedura ntemmet b'amplifikazzjoni finali f'95 grad għal 5s, 65 grad C għal 1 min, iż-żieda ta 'pass tal-kurva ta' dissoċjazzjoni, u pass ta 'tkessiħ. Primers inxtraw minn Sangon Biotech (Shanghai, iċ-Ċina). Is-sekwenzi tal-pari primer użati għall-validazzjoni tal-firma huma deskritti fit-Tabelli 3 u 4. Il-valuri Ct ġew ikkalkulati b'referenza għal -actin jew U6.

4.6.Analiżi u Statistika Bijoinformatika

DEGs u DEMs ġew identifikati permezz ta' pakkett ta' softwer ibbażat fuq R. Il-valur tal-limitu għall-għażla ta' DEGs u DEMs kien valur q (valur p aġġustat) Inqas minn jew ugwali għal 0.05 u bidla darbiet (FC) Akbar minn jew ugwali għal 2 jew Inqas minn jew ugwali għal 0.5. Il-klassifikazzjoni KEGG u GO inklużi funzjonijiet molekulari, proċessi bijoloġiċi, u komponenti ċellulari ntużaw biex janalizzaw DEGs u DEMs.

Ir-riżultati tal-assaġġ bijoloġiku huma ppreżentati fil-forma ta 'medja ± SD ibbażata fuq erba' esperimenti indipendenti f'GraphPad Prism 8.

Materjali Supplimentari: Dawn li ġejjin huma disponibbli onlajn fuq https://www.mdpi.com/1422-0 067/22/5/2292/s1: Tabella S1, Identifikazzjoni ta '1037 mRNAs espressi b'mod differenzjali bi tweġiba għal naringenin; Tabella S2, Identifikazzjoni ta '234 miRNAs espressi b'mod differenzjali bi tweġiba għal naringenin; Tabella S3, Identifikazzjoni ta' 5607 pari negattivi ta' miRNA-mRNA bi tweġiba għal naringenin, bl-involviment ta' 216 ​​DEM u 681 DEG b'kollox

Referenzi

1. Salehi, B.; Fokou, PVT Il-Potenzjal Terapewtiku ta 'Naringenin: Reviżjoni ta' Provi Kliniċi. Farmaċewtiċi 2019, 12, 11. [CrossRef] [PubMed]

2. Bai, Y.; Peng, W.; Yang, C.; Zou, W.; Liu, M.; Wu, H.; Fan, L.; Li, P.; Zeng, X.; Su, W. Farmakokinetika u Metaboliżmu ta 'Naringin u Naringenin Metabolit Attiv fil-Firien, Klieb, Bnedmin, u d-Differenzi Bejn Speċi. Quddiem. Pharmacol. 2020, 11, 364. [CrossRef]

3. Joshi, R.; Kulkarni, YA; Wairkar, S. Aspetti farmakokinetiċi, farmakodinamiċi u formulazzjonijiet ta 'Naringenin: Aġġornament. Ħajja Sci. 2018, 215, 43–56. [CrossRef]

4. Hernández-Aquino, E.; Muriel, P. Effetti ta 'benefiċċju ta' naringenin fil-mard tal-fwied: Mekkaniżmi molekulari. Dinja J. Gastroenterol. 2018, 24, 1679–1707. [CrossRef]

5. Wang, Q.; Ou, Y.; Tgħanniqa.; Wen, C.; Yue, S.; Chen, C.; Xu, L.; Xie, J.; Dai, H.; Xiao, H.; et al. Naringenin jnaqqas il-mard tal-fwied xaħmi mhux alkoħoliku billi jirregola l-passaġġ NLRP3/NF-κB fil-ġrieden. Br. J. Pharmacol. 2020, 177, 1806–1821. [CrossRef]

6. Khan, TH; Ganaie, MA Naringenin jipprevjeni t-tossiċità indotta minn doxorubicin fit-tessuti tal-kliewi billi jirregola l-insult ossidattiv u infjammatorju fil-firien Wistar. Arch. Physiol. Biochem. 2020, 126, 300–307. [CrossRef]

7. Wang, J.; Ding, Y.; Zhou, W. Albumin liposomi awtomodifikati għal terapija tal-fibrożi epatika permezz ta 'mogħdijiet dipendenti fuq SPARC. Int. J. Pharm. 2020, 574, 118940. [CrossRef]

8. Kometsi, L.; Govender, K.; Mofo Mato, EP; Hurchund, R.; Owira, PMO Billi jnaqqas l-istress ossidattiv, naringenin itaffu r-regolazzjoni 'l fuq indotta mill-ipergliċemija tal-fattur epatiku nukleari erythroid 2-relatat fattur 2 proteina. J. Pharm. Pharmacol. 2020, 72, 1394–1404. [CrossRef] [PubMed]

9. Rossino, MG; Casini, G. Nutraceuticals għat-Trattament tar-Retinopatija Dijabetika. Nutrijenti 2019, 11, 771. [CrossRef] [PubMed]

10. Hernández-Aquino, E.; Quezada-Ramírez, MA; Silva-Olivares, A.; Casas-Grajales, S.; Ramos-Tovar, E.; Flores-Beltrán, RE; Segovia, J.; Shibayama, M.; Muriel, P. Naringenin attenwa l-progressjoni tal-fifibrożi tal-fwied permezz ta 'inattivazzjoni ta' ċelloli stellati epatiċi u mogħdijiet profibroġeniċi. Eur. J. Pharmacol. 2019, 865, 172730. [CrossRef] [PubMed]