Determinazzjoni Strutturali NMR mingħajr ambigwità Ta' Prodotti ta' Reazzjoni Dimerika ta' Catechin-Laccase Bħala Markers Potenzjali ta' Ossidazzjoni ta' Għeneb U Inbid

Għal aktar dettalji, ikkuntattja:tina.xiang@wecistanche.com

Astratt:( plus )-Catechin—laccaseossidazzjonistandards dimeriċi kienu Hemi-sintetizzati bl-użu ta 'laccase minn Trametes Versicolor hija soluzzjoni ta' ilma-etanol f'pH 3.6. Ġew skoperti tmien frazzjonijiet li jikkorrispondu għal tmien prodotti dimeriċi ta 'ossidazzjoni potenzjali. Il-profili tal-frazzjonijiet tqabblu ma' profili miksuba b'żewġ oxidoreductases oħra:polyphenol oxidaseestratt mill-għeneb u laccase minn Botrytis cinerea. Il-profili kienu simili ħafna, għalkemm xi differenzi minuri ssuġġerew differenzi possibbli fir-reattività ta 'dawn l-enzimi. Ħames frazzjonijiet imbagħad ġew iżolati u analizzati bi spettroskopija NMR 1D u 2D. Iż-żieda ta 'traċċi ta' nitrat tal-kadmju fil-kampjuni solubilizzati fl-aċetun wasslet għal sinjali NMR solvuti bis-sħiħ ta 'protoni fenoliċi, li jippermettu d-determinazzjoni strutturali mingħajr ambigwità ta' sitt prodotti ta 'reazzjoni, waħda mill-frazzjonijiet li fiha żewġ enantiomers. Dawn il-prodotti jistgħu jintużaw aktar bħala markaturi tal-ossidazzjoni biex jinvestigaw il-preżenza tagħhom u l-evoluzzjoni fl-inbid waqt il-produzzjoni tal-inbid u t-tiqdim tal-inbid.

Kliem ewlieni: markatur ta 'ossidazzjoni;( plus )-catechin; sinjali fenoliċi NMR; laccase; nitrat tal-kadmju; polyphenol oxidase

Ikklikkja biex tikseb aktar informazzjoni

1. Introduzzjoni

Polifenolihuma familja ta 'komposti kimiċi preżenti ħafna fin-natura. Jinstabu f'ammonti sinifikanti fit-tè [1], kakaw [2,3], blueberries [4], għeneb [5l, u prodotti iffermentati bħall-inbid [6]. Billi huma miri primarji ta' ossidazzjoni J7,8], l-istrutturi kimiċi tal-polifenoli jevolvu kontinwament. Dawn il-bidliet għandhom impatt fuq il-proprjetajiet organolettiċi ta' ħafna tipi ta' ikel; huma responsabbli għal fenomeni bħal tiswir tal-ikel [9]u modifiki tal-karatteristiċi sensorji tal-inbid [10,11. Fl-enoloġija, dan il-fenomenu ta 'ossidazzjoni jseħħ fl-għeneb jew l-inbejjed. Rigward l-ossidazzjoni enżimatika, l-enzimi ewlenin responsabbli għall-kannella huma oxidoreductases, b'mod aktar preċiż,polyphenol oxidasepreżenti fl-għeneb u laccase prodotti minn Botrytis cinerea [12].

Enżimatikuossidazzjoniprinċipalment iseħħ fil-most tal-għeneb, iżda aktar tiswir tal-inbid jista’ jkun dovut għal reazzjonijiet ta’ ossidazzjoni kimika |7,13]jew għal Botrytis cinerea laccase li tista’ tkun stabbli ħafna matul il-maturazzjoni tal-inbid14. Jistgħu jseħħu żewġ attivitajiet enżimatiċi ta 'ossidazzjoni fuq sottostrati fenoliċi: attività ta' monophenol oxidase ikkaratterizzata mill-idrossilazzjoni ta 'grupp ta' hydroxyl eżistenti pożizzjoni biswit u attività diphenol oxidase li tikkorrispondi għall-ossidazzjoni ta 'orto-dihydroxybenzenes għal orto-benzoquinones.

Skont il-Kumitat tan-Nomenklatura tal-Unjoni Internazzjonali tal-Bijokimika u l-Bijoloġija Molekulari (NC-IUBMB), dawn l-attivitajiet enżimatiċi huma katalizzati minn enzimi tal-klassi EC1-li jikkorrispondu għall-ossidorduttażi. Fost dawn, it-tliet klassijiet ewlenin ta 'oxidoreductases li jikkatalizzaw l-ossidazzjoni tal-polifenol huma EC1.14.18.1 (monophenol monooxygenase), EC1.11.1 (peroxidase/POD), u EC1.10.3 (oxidoreductases li jaġixxu fuq diphenols).

Din l-aħħar klassi hija maqsuma f'subklassijiet differenti, u tnejn minnhom dehru partikolarment interessanti għal dan l-istudju: EC1.10.3.1 (polyphenol oxidase/PPO) u EC1.10.3.2 (laccase) (Ara Materjali Supplimentari Figura S1).

PPO, laccase, u peroxidase huma l-oxidoreductases prinċipalment responsabbli għall-kannella waqt l-ipproċessar tal-għeneb [13]. It-tiswir ikkawżat mill-POD huwa negliġibbli fil-frott iżda jista’ jżid id-degradazzjoni tal-fenoli meta kkombinat ma’ PPO[15]. Il-PPO huwa preżenti b'mod naturali fl-għeneb u huwa kapaċi jikkatalizza l-ossidazzjoni tal-monofenoli għal katekoli u ta 'catechols għal pigmenti kannella [8,13,16]. Laccases, li jseħħu fl-għeneb infettat b'Botrytis, għandhom spettru ta' azzjoni usa'|17|billi jistgħu jikkatalizzaw l-ossidazzjoni ta' ħafna substrati differenti. Il-miri ta' ossidazzjoni tal-laccases ewlenin jibqgħu 1-2 u 1-4 dihydroxybenzene.

Fl-inbid, il-benzoquinone prodott bl-ossidazzjoni (PPO jew laccases) jista’ faċilment jgħaddi minn aktar reazzjonijiet skont il-proprjetajiet redox u l-affinitajiet elettroniċi tagħhom [15]. Jistgħu jew jaġixxu bħala elettrofili u jirreaġixxu ma 'derivattivi amminiċi [18] jew jaġixxu bħala ossidanti u jirreaġixxu, fost oħrajn, ma' substrati fenoliċi. Skont il-konformazzjoni kimika tagħhom (quinone jew semi-quinone), benzoquinone jista 'jwassal għal prodotti ta' reazzjoni ta 'ossidazzjoni differenti. F'pH newtrali, ( plus )-catechin se jiġi ossidizzat għal quinone fuq il-pożizzjoni taċ-ċirku A C5 jew C7 u jwassal għall-formazzjoni ta' sitt isomeri dimeriċi possibbli li jimplikaw rabta bejn il-pożizzjoni taċ-ċirku B C2', C5', jew C6' ta' l-unità ta' katechin ta' fuq u l-pożizzjoni taċ-ċirku A C6 jew C8 ta' l-unità t'isfel [19,20]. Dehydrodicatechin huwa prodott magħruf sew ta' dan l-akkoppjar [21]. Il-pożizzjonijiet tat-tikkettjar tal-istrutturi huma murija fil-Figura 1. Taħt kundizzjonijiet aċidużi, forom semi-quinone jistgħu wkoll ikunu preżenti fuq iċ-ċirku B (pożizzjoni OH3'jew OH4') u jwasslu għal erba' isomeri dimeriċi possibbli [20,22] b' l-unità ta 'catechin ta' fuq u ċ-ċirku A tal-unità t'isfel (pożizzjoni C6 jew C8). L-ossidazzjoni enżimatika tal-catechin ġiet investigata fi studji preċedenti [22,23], u l-prodotti ta 'ossidazzjoni assoċjati kienu kkaratterizzati minn HPLC [24], għalkemm aktar rari iżolati u qatt ikkaratterizzati kompletament minn NMR.

L-għan ta’ dan ix-xogħol kien l-ewwel li jitqabbel permezz ta’ UHPLC-MS il-profili tal-prodotti ta’ ossidazzjoni dimeriċi( plus )-catechin fil-preżenza ta’ tliet estratti ta’ oxidoreductase, jiġifieri, PPO estratt mill-għeneb, laccase mill-fungus Botrytis cinerea preżenti fl-inbejjed ħelwin botritizzati. [14], u laccase minn Trametes Versicolor.

It-tieni għan kien li hemisynthesize u jikkaratterizzaw l-istrutturi ta 'xi prodotti ta' ossidazzjoni dimerika permezz ta 'spettroskopija NMR miksuba b'laccase minn Trametes Versicolor.

2. Riżultati u Diskussjoni

2.1. Tqabbil ta' Profili ta' Prodotti ta' Reazzjoni Dimerika bi Tliet Oxydoreductases Differenti u (plus)-Catechin

( plus )-Catechin l-ewwel ġie ossidizzat fil-preżenza ta 'laccase minn Trametes Versicolor f'pH3.6 fis-soluzzjoni ta' l-inbid mudell. Wara s-separazzjoni tal-frazzjoni dimerika minn residwu( plus )-catechin u frazzjonijiet polimeriċi oħra, tmien frazzjonijiet ewlenin inġabru u analizzati minn UHPLC-UV-MS, innutati minn N1 sa N8 f'ordni ta 'żmien ta' żamma dejjem tiżdied (Tabella 1). L-ispettri tal-massa tal-electrospray fil-modalità pożittiva wrew il-qċaċet tal-jone [M plus H] plus f'm/z 579 għal N1 sa N6, ipotetikament jikkorrispondu għal dimer iffurmat minn rabta waħda bejn żewġ unitajiet ta 'catechin, u [M plus H] plus f' m/577 għal N7 u N8, ipotetikament jissuġġerixxi l-formazzjoni ta 'rabta addizzjonali.

Dawn tmienjaossidazzjonifrazzjonijiet ġew potenzjalment osservati wara d-depolimerizzazzjoni kimika ta 'frazzjoni tat-tannin f'xogħlijiet preċedenti [25,26] u jistgħu possibbilment ikunu l-istess bħal dawk diġà deskritti minn Guyot et al. [20], anki jekk il-kundizzjonijiet sperimentali kienu kemmxejn differenti. Tabilħaqq, f'dan l-istudju preċedenti, intuża estratt PPO mhux raffinat f'pH3 u 6 biex jinkisbu tmien frazzjonijiet. Fl-istudju preżenti, tliet enzimi differenti ġew imqabbla f'pH3.6 fis-soluzzjoni tal-inbid mudell. L-analiżi komparattiva LC-MS tal-frazzjonijiet ta' ossidazzjoni ewlenin miksuba bit-tliet enzimi differenti (laccase minn Trametes Versicolor, lac-case minn Botrytis cinerea, u polyphenol oxidase estratt mill-għeneb) huma ppreżentati fit-Tabella 2. Għal kull waħda mit-tmien frazzjonijiet, il-ħinijiet ta 'żamma kienu kważi identiċi ma' l-enzimi differenti, u m/z simili ġew determinati bl-analiżi MS. Dawn ir-riżultati jsostnu l-ipoteżi li l-istess frazzjonijiet inkisbu għal kull enzima, li kien fihom prodotti bi strutturi simili għal dawk ipotizzati minn Guyot et al. [20]. Lopez-Serrano u Ros Barcel6 [27] wettqu wkoll studju komparattiv tal-prodotti ta’ ossidazzjoni ( plus )-catechin b’żewġ enzimi differenti: peroxidase u polyphenol oxidase, it-tnejn estratti mill-frawli. Huma kkonkludew li l-prodotti miksuba biż-żewġ enzimi kienu kwalitattivament l-istess. Kompost addizzjonali jismu N4' b'm/z=578 Th u Rt=15.66 min kien osservat f'esperimenti b'laccase minn Botrytis cinerea u PPO estratt iżda mhux b'laccase minn Trametes Versicolor, li jissuġġerixxi differenzi possibbli fir-reattività għal dawn l-enzimi.

2.2. Studju u Ottimizzazzjoni tal-Parametri Fiżikokimiċi fuq Sinjali OH Fenoliċi u Alifatiċi 1H-NMR

Il-karatterizzazzjoni strutturali tad-dimeri tal-procyanidins tista' tinkiseb b'analiżi NMR. B'mod partikolari, il-pożizzjoni preċiża ta' rabta bejn l-unitajiet tista' tiġi determinata bl-użu ta' spettri ta' korrelazzjoni HMBC u/jew ROESY [28,29] (Figuri S2 u S3). Fil-każ ta 'bond tat-tip etere (COC), l-attribuzzjoni tal-protoni tas-sinjal idrossiliku hija meħtieġa. Jista' jkun kruċjali wkoll fil-każ ta' konnessjonijiet CC jekk xi protoni alifatiċi jew aromatiċi jikkoinċidu jew jekk xi korrelazzjonijiet ewlenin huma neqsin. Madankollu, anke f'solvent aprotiku, il-protoni hydroxyl tal-polifenoli spiss jidhru bħala sinjali wesgħin li minnhom ma tista' tinkiseb l-ebda informazzjoni strutturali [30]. Din il-kwistjoni kienet tentattivament indirizzata biż-żieda ta 'traċċi ta'

Cd(NO3)2 fis-soluzzjonijiet tal-kampjun. Tabilħaqq, 'H sinjali wesgħin ta' gruppi OH huma dovuti għall-iskambju intermolekulari bejn dawn il-protoni OH u protoni oħra fis-solvent jew solut. Billi tnaqqas ir-rabtiet intermolekulari, il-preżenza ta 'nitrat tal-kadmju fil-kampjuni tista' tnaqqas dawn l-iskambji, u b'hekk ittejjeb is-sharpness tas-sinjali tal-proton OH.

2.2.1.Effett taż-żieda tal-kadmju

Wara t-tnixxif bil-friża, il-ħames frazzjonijiet N2, N3, N4, N6, u N8 ġew solubilizzati fl-aċetun-dg. Imbagħad, l-ispettri tal-proton NMR 1D ġew akkwistati f'25 grad qabel (Figura 2A) u wara ż-żieda ta 'ammonti żgħar ta' kadmju (Figura 2B). Fl-aċetun pur-d., il-protoni OH fenoliċi tal-frazzjonijiet kollha dehru bħala qċaċet wesgħin. Wara ż-żieda tal-kadmju, dawn il-protoni wrew sinjali riżolti ħafna fil-każ tal-frazzjonijiet N6 u N8, filwaqt li għall-frazzjonijiet N2, N3, u N4 is-sinjali kienu biss ftit aktar qawwija. Għandu jissemma wkoll li ż-żieda fil-kontenut ta 'Cd ma kellha l-ebda effett fuq ir-riżoluzzjoni tas-sinjal OH, peress li ma ġiet osservata l-ebda sharpness jew wisa' tal-ogħla wisa 'tal-linja meta ammonti żgħar suċċessivi ta' Cd ġew miżjuda mal-kampjuni (dejta mhux murija).

Sinjali OH fenoliċi solvuti ħafna mill-prodotti N2, N3, u N4 inkisbu grazzi għal tnixxif u risolubilizzazzjoni addizzjonali (Figura 2C, D).

Id-differenza fl-imġieba fuq iż-żieda tas-Cd bejn il-frazzjonijiet tista 'tiġi spjegata mill-qawwa ta' interazzjonijiet molekulari: aktar b'saħħitha fil-każ ta 'N2, N3, u N4 meta mqabbla ma' N6 u N8, pass ieħor huwa meħtieġ biex jinkisru dawn ir-rabtiet.

Dan il-pass addizzjonali jista 'jkun il-pass ewlieni meta tuża Cd biex tikseb sinjali OH fenoliċi solvuti ħafna fi kwalunkwe sitwazzjoni, tkun xi tkun l-oriġini tal-kampjuni, ir-reazzjoni ta' sinteżi, jew il-prodotti polifenoliċi naturali.

Xogħol preċedenti li jittratta l-karatterizzazzjoni strutturali mhux ambigwa tapolifenoldimeri li jużaw sinjali NMR fenoliċi OH riżolti ħafna grazzi għaż-żieda ta’ nitrat tal-kadmju ġie ppubblikat fl-1996[30]. Sa fejn nafu, l-ebda dokument ta’ riċerka ieħor li juża din il-metodoloġija ma ġie ppubblikat minn dakinhar. Investigazzjonijiet oħra twettqu sussegwentement biex jintlaħaq dan il-għan, jew permezz ta 'addizzjonijiet ta' dożaġġ ta 'aċidu pikriku [31]jew bl-użu ta' temperatura ta 'akkwist baxx [32]. Dan jista' jiġi spjegat mill-pass ulterjuri meħtieġ biex jinkiseb effett deċiżiv fuq l-ogħla sharpness tal-OH b'żieda ta' Cd, kif deskritt hawn fuq. Madankollu, il-kadmju jidher li huwa ta 'valur kbir, peress li sinjali riżolti ħafna jistgħu jinkisbu mingħajr il-ħtieġa li jiżdiedu ammonti preċiżi, b'kuntrast mal-akkwist tal-aċidu picric jew tal-ispettri NMR f'temperaturi baxxi.

2.2.2. Effett tat-Temperatura

Tnaqqis fit-temperatura minn 25 grad C sa 15-il grad ma kellu l-ebda impatt fuq is-sharpness tas-sinjali OH fenoliċi jew OH alifatiċi. Madankollu, ċaqliq 'l isfel tal-qċaċet tal-protoni skambjabbli ppermettewlna nisseparaw xi sinjali OH fenoliċi u alifatiċi li jikkoinċidu, u jagħmlu l-identifikazzjoni tagħhom aktar ovvja (Figura 3). Billi tnaqqas it-temperatura, ir-rata tal-kambju tal-protoni tnaqqset, u wieħed jista 'jistenna qċaċet OH alifatiċi aktar qawwija [31]. It-temperatura ta '15-il grad ovvjament mhix baxxa biżżejjed biex tikseb sinjali OH alifatiċi solvuti tajjeb. Madankollu, ippermettilna nidentifikaw b'mod ċar ir-reżonanza ta 'żewġ protoni OH alifatiċi fil-kampjuni N3 u N6 u ta' wieħed fil-kampjun N8. L-ispettru tal-kampjun N2 wera wkoll żewġ sinjali ta 'protoni alifatiċi OH, li kienu aktar distingwibbli f'25 grad C milli fi 15 grad (Figura 2E). Fil-każ tal-kampjun N4, is-sinjali li joħorġu minn OH alifatiku kienu biss parzjalment viżibbli fil- spettri, kemm jekk it-temperatura kienet issettjata għal 25 grad jew għal 15-il grad C, minħabba koinċidenza persistenti (Figura 2E).

2.3.Karatterizzazzjoni Strutturali tal-Istandards Dimeriċi — Analiżi tal-Ispettru NMR

L-ispettri NMR tal-frazzjonijiet N2, N3, N4, N6, u N8 wrew li l-prodotti ta 'ossidazzjoni kienu ta' purità għolja peress li l-intensitajiet tas-sinjal ta 'komposti oħra misjuba kienu inqas minn 10 fil-mija meta mqabbla ma' dawk ta 'dawn il-prodotti.

Fl-ispettri kollha, jistgħu jiġu distinti erba' reġjuni ta' bidla kimika lH tipiċi ta' unitajiet ta' catechin (Figura 2C): sinjali tal-protoni alifatiċi ta 'ċrieki pyran (ċrieki C) jinstabu fir-reġjun minn 2.3 sa 5. 0 ppm, u dawk tal-protoni tas-sinjal aromatiċi ta 'ċrieki resorcinol (ċrieki A) u ta' ċrieki catechol (Jġib) minn 5.5 sa 6.3 ppm u 6.3 sa 7.1 ppm, rispettivament. Is-sinjali tal-fenol OH taż-żewġ ċrieki A u B dehru minn 7.1 sa 10 ppm. L-ispettri NMR taż-żewġ frazzjonijiet wrew il-preżenza ta 'settijiet ta' sinjali distinti ta 'unitajiet ta' catechin fi proporzjon ta 'intensità kostanti: żewġ settijiet ta' sinjali ġew osservati fl-ispettri ta 'frazzjonijiet N2, N3, N6, u N8 skond il-preżenza ta' dimeri, u erba 'settijiet fl-ispettri N4, li jistgħu jikkorrispondu għal tetramer wieħed, żewġ dimeri, jew taħlita ta' oligomeri differenti, jiġifieri, trimer wieħed flimkien ma 'monomeru wieħed. Sabiex jiġi ddeterminat il-grad ta' oligomerizzazzjoni tal-prodotti preżenti fil-frazzjoni N4, sar esperiment 'H DOSY bl-użu ta' taħlita li fiha alikwoti taż-żewġ frazzjonijiet N4 u N2. Il-koeffiċjenti tad-diffużjoni tas-sinjali kollha wrew valuri simili (Figura 4), li jindikaw il-preżenza ta 'żewġ dimeri ta' catechin fil-frazzjoni N4.

Grazzi għas-sinjali tal-fenol OH riżolti bis-sħiħ li jipprovdu riżultati kwantitattivi affidabbli, it-tip ta 'rabta bejn l-unitajiet tal-catechin jista' jiġi dedott direttament mill-integrazzjoni tal-ogħla żona tal-wiċċ. Għalhekk, għaż-żewġ frazzjonijiet, N3 u N6, in-nuqqas ta’ OHphenol wieħed (li jappartjeni jew għal resorcinol jew għal ċirku catechol) u n-nuqqas ta’ proton aromatiku wieħed resorcinol indikaw rabta interflavanic (IFL) ta’ tip etere li timplika Oppożizzjoni f’A jew ċirku B u pożizzjoni C6 jew C8 f'ċirku A. Fil-każ tal-kampjun N2, żewġ protoni aromatiċi kienu neqsin, wieħed ta 'ċirku B u wieħed ta' ċirku A, li jimplika CA-CB IFL. L-ispettru 1D 'H tal-frazzjoni N4 wera li żewġ protoni taċ-ċirku B kienu neqsin, kif ukoll żewġ protoni taċ-ċirku A. Ir-rabtiet bejn l-unitajiet dimer tal-frazzjoni N4 huma għalhekk it-tnejn tat-tipi CC. L-ispettri tal-frazzjoni N8 kienu pjuttost differenti mill-erba 'oħrajn. Xi sinjali kienu tipiċi ta 'unitajiet ta' catechin, li fihom tliet fenoli OH, ċirku wieħed aromatiku A, u protoni wieħed ta 'ċirku B kienu neqsin, kif ukoll OH alifatiku wieħed. Min-naħa l-oħra, xi sinjali NMR oħra huma atipiċi ta 'unità ta' catechin: metilen b'ċaqliq kimiċi 13C deblinded (~ 40 ppm) u grupp ketone (~ 192 ppm).

Is-sistemi ta 'spin tal-proton taċ-ċrieki C, A u B ġew determinati bl-użu kemm ta' spettri 'H 1D kif ukoll 1H 2D TOCSY (mhux murija). Żewġ sistemi ABMX C-ring spin (tipiċi ta 'catechin) ġew osservati fl-ispettri tal-frazzjonijiet N2, N3, N6, u N8, u erbgħa għall-frazzjoni N4. Fl-ispettri tal-frazzjonijiet N2, N3, N6, u N8, żewġ doublets meta-akkoppjati (J ~ 2Hz) u wieħed fir-reġjun aromatiku taċ-ċirku A ġew assenjati, rispettivament, lill-protoni taċ-ċirku A tal-unità catechin mhux marbuta u lill-proton residwu taċ-ċirku A tal-unità tal-catechin marbuta C6-jew C8-. Fl-ispettri ta 'N4, minħabba l-preżenza ta' żewġ dimeri, erba 'doublets meta-akkoppjati u żewġ singlets ġew skoperti u assenjati kif deskritt hawn fuq. Is-sistemi tal-protoni taċ-ċirku B kienu wkoll iddeterminati faċilment minn dawn l-ispettri u ppermettewlna nidentifikaw żewġ sistemi ta’ spin tal-proton ABM għad-dimeri tal-frazzjonijiet N3 u N6, filwaqt li sistemi ta’ spin tal-proton ABM wieħed u AB ġew skoperti għal dimer N2, u ABM wieħed u sistemi wieħed ta' spin tal-proton AM għad-dimer N4. Id-dimer N8 wera sistema waħda biss ABM B-ring spin tipika ta 'monomeru catechin.

2.3.1.Determinazzjoni tal-Pożizzjoni Ċirku A tal-IFL tad-Dimeri tal-Frazzjonijiet N2, N3, N4, u N6

L-istabbiliment tal-pont li jinsab fuq iċ-ċirku A ta 'dimeri (jiġifieri, pożizzjoni C6A-jew C8A) jeħtieġ l-attribuzzjoni tal-proton HA residwu tal-unità tal-catechin marbuta ma' CA. Grazzi għas-sinjali OH fenoliċi solvuti ħafna, punt tat-tluq faċli kien l-identifikazzjoni taż-żewġ protoni OHphenol tal-unitajiet A ring-linked, jiġifieri, iċ-ċirku A li

had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm） li kienu faċilment attribwiti lil C7A u C8A, rispettivament. Ladarba C6A u C8A jiġu assenjati, il-proton HA residwu jista' jiġi attribwit direttament lill-ispettri HSQC. Għalhekk instab li dan il-proton HA residwu kien H6A għall-frazzjonijiet kollha N2, N3, N4, N6. L-IFL bejn l-unitajiet tal-katechina għalhekk implika pożizzjoni C8A għad-dimeri kollha.

2.3.2. Determinazzjoni tal-Pożizzjoni B Ring tal-IFL

Dimeri tal-frazzjonijiet N2 u N4. L-ispettri tal-frazzjoni N2 wrew żewġ tipi differenti ta 'sistemi ta' spin tal-protoni taċ-ċirku B: AMX wieħed li jikkorrispondi għaċ-ċirku B tal-unità mhux konnessa, u AM wieħed b'kostanti ta 'akkoppjar ta' madwar 8 Hz, karatteristika ta 'H6'B u H5' B ta' unità C2'B-linked. Ir-rabta bejn l-unitajiet tad-dimer N2 hija għalhekk C2'B-C8A. L-ispettri NMR tal-frazzjoni N4 wrew ukoll sistemi differenti ta' spin B: żewġ AMX, li jikkorrispondu maċ-ċirku B mhux konness, u żewġ sistemi AXspin, it-tnejn li huma juru kostanti ta' akkoppjar ta' madwar 2 Hz, li huma karatteristiċi ta' H2'B u H6' Protoni B ta' unitajiet C5'B-linked. Il-preżenza ta 'korrelazzjonijiet ta' medda twila'H/13C bejn H6'Band C8A, li kienu osservati fl-ispettri HMBC taż-żewġ dimeri, huma skond rabta C5/'B-C8A (Figura 5).

Dimeri tal-frazzjonijiet N3 u N6. L-ispettri tal-frazzjonijiet N3 u N6 wrew il-preżenza ta 'żewġ sistemi ta' protoni AMX B-ring u n-nuqqas ta 'sinjal wieħed tal-fenol OH. Peress li l-protoni fenoliċi OHA kollha tal-unitajiet dimer ġew identifikati (kif deskritt hawn fuq), is-sinjal fenoliku OH nieqes jista 'jkun jew dak ta' OH3'B jew dak ta 'OH4'B.

Il-pożizzjoni OH (3'B jew 4'B) tista' tiġi ddeterminata faċilment permezz ta' korrelazzjonijiet ROE ma' H2'Bor H5'B, rispettivament, jew bl-użu ta' korrelazzjonijiet HMBC fuq medda twila kif muri fil-Figura 5.

L-attribuzzjoni tal-OH residwu taċ-ċrieki B saret faċilment bl-użu ta' korrelazzjonijiet HMBC jew ROESY fuq medda twila, kif muri fil-Figura 5. Fil-każ tad-dimer N3, ġiet osservata korrelazzjoni ROE bejn l-H5'B u l-OH residwu 'B ta' l-unità tal-katechina marbuta permezz taċ-ċirku B tagħha. Dan l-OH għalhekk ġie identifikat bħala OH4'B. Fil-każ tal-frazzjoni N6, l-OH'B residwu ġie assenjat lil OH3'B, peress li ġiet osservata korrelazzjoni ROE bejn dan l-OH u H2'B. Il-korrelazzjonijiet HMBC fuq medda twila huma skond dawn l-attribuzzjonijiet. Il-pożizzjonijiet ta' rabta ta' dawn iż-żewġ dimeri mbagħad ġew determinati kif ġej: CO3'B-C8A u CO4'B-C8A għal N3 u N6. rispettivament.

Frazzjoni N8.Analiżi tal-ispettru tad-dimer N8 wriet li unità waħda ta 'dan id-dimer hija l-catechin b'żewġ pożizzjonijiet ta' rabta waħda ċ-ċirku A, waħda fil-C8A, u l-oħra fil-pożizzjoni C-O7A, peress li l-protoni H8A u OH7A huma nieqsa. L-unità l-oħra ta 'dan id-dimer esebiti karatteristiċi spettrali singulari, li jindikaw it-telf tal-aromatiċità taċ-ċirku B u l-preżenza ta' diversi pożizzjonijiet ta 'rabta kemm fuq ċrieki B kif ukoll C.

Is-sinjali 'H NMR li joħorġu miċ-ċirku B kienu żewġ doublets f'2.49 u 2.71 ppm, li juru akkoppjar geminal ta' ~ 15 Hz (12.03 ppm) tipiku ta 'grupp ta' metilin u singlet f'6.38 ppm li jirriżultaw minn proton etilenic. Peress li dawn il-protoni tal-metilin u tal-etilene ma kinux akkoppjati, x'aktarx li jkunu fil-pożizzjonijiet 2'B u 5'B. L-ispettru HIMBC wera l-korrelazzjonijiet kollha, li ppermetta attribuzzjonijiet preċiżi ta 'dawn il-karbonju taċ-ċirku B, kif muri fil-Figura 5. L-H2C ta' din l-unità ta tliet korrelazzjonijiet mal-karbonju taċ-ċirku B: wieħed huwa l-karbonju tal-metilen f'~45 ppm, li għalhekk ġie attribwit lil C2'B, u t-tnejn li jifdal, b'karboni li jirrisonaw għal ~ 90 ppm u ~ 162 ppm, li jistgħu jiġu assenjati lil C1'B u C6'B.H5'B taw biss korrelazzjonijiet 3J qawwija ma 'żewġ karboni kwaternarji ta' dan iċ-ċirku B. : wieħed huwa l-karbonju preċedentement assenjat għal C3'B (~ 95 ppm), u l-ieħor, li rresonat għal ~ 90 ppm, għalhekk jista 'jiġi attribwit għal C1'B. Il-karbonju f'~162 ppm imbagħad ġie dedott bħala C6'B.

Il-preżenza ta 'OH alifatiku (~ 5.8 ppm) fil-pożizzjoni C3'B (~ 95 ppm) ġiet iddeterminata permezz tal-korrelazzjoni ROE tagħha maż-żewġ protoni H2'B. Barra minn hekk, OH3/B ta korrelazzjoni HMBC ma 'karbonju kwaternarju f'~192.5 ppm, karatteristika ta' grupp ketone fil-pożizzjoni C4'B.

L-ilqugħ ta' dan C1'B ta' madwar 40 ppm huwa skond telf ta' aromatiċità taċ-ċirku B. Barra minn hekk, in-nuqqas ta' OH fil-pożizzjoni C7A ta' l-unità l-oħra huwa taqbel ma' rabta ta' etere C1'BO-C7A.

Id-dejta tal-NMR wriet li ċ-ċirku C ta 'din l-unità m'għandux OH3C. Il-preżenza ta 'rabta C3C-O-C3'B hija skond l-ilqugħ ta' C3C ta 'madwar 1.5ppm kif ukoll il-bidla kimika ta' C3'B li hija tipika ta 'karbonju hemiketal (95 ppm).

B'kollox, id-dejta spettrali NMR tippermettilna nikkonkludu li dan id-dimer jikkorrispondi għad-dehydrocatechin A deskritt qabel minn Winges et al.[33] u mbagħad minn Guyot et al.[20].

L-istrutturi tas-sitt komposti dimeriċi determinati minn dawn l-analiżi NMR huma murija fil-Figura 6, N2, N3, N6, u N8 huma prodotti puri, u N4 huwa taħlita ta 'żewġ isomeri.

3. Materjali u Metodi

3.1.Kimiċi

( plus )-Catechin hydrate Ikbar minn jew ugwali għal 98 fil-mija; laccase minn Trametes Versicolor(0.94 U·mg-1); sodium phosphate dibasic dihydrate Ikbar minn jew ugwali għal 98 fil-mija; aċidu ċitriku (reaġent ACS, nitrat tal-kadmju tetraidrat 99.997 fil-mija; aċidu formiku u Amberlite XAD7HP inkisbu minn Sigma-Aldrich) (Saint-Louis, MO, USA). Acetone-dgwas mixtrija minn Euriso-top (Saarbrüicken, Ġermanja), u trifluoroacetic aċidu (TFA) minn Roth Labo(Karlsruhe, il-Ġermanja).Ilma LC-MS, acetonitrile LC-MS(ACN), u metanol LC-MS (MeOH) kienu kollha minn VWR (Radnor, PA, USA).

3.2. Preparazzjoni tas-Soluzzjoni tal-Inbid Mudell

Is-soluzzjoni ta' l-inbid mudell kienet soluzzjoni ta' etanol/ilma (12/88;o/o) b'{2}}.033 M aċidu tartariku, aġġustat għal pH 3.6 b'NaOH 1 M [34].

3.3. Estratti tal-PPO tal-għeneb mhux raffinat

L-estratt tal-PPO kien ippreparat kif deskritt qabel minn Singleton et al.[35]. Għeneb iffriżat tħallat l-ewwel f'buffer aċetat (1.5 M, pH5; 10 gL-I aċidu askorbiku). It-taħlita mbagħad ġiet iffiltrata u ċentrifugata (3000 g; 10 min). Ir-residwu kien finalment maħsul bl-aċetun (80 fil-mija) u mnixxef bl-arja.

3.4.Laccase minn Botrytis Cinerea

Laccase minn Botrytis cinerea inkisbet kif deskritt minn Quijada-Morin et al.[36]. Ġie prodott mir-razza VA612 (miġbura f'2005 f'vinja f'Hautvillers, Champagne, Franza, mill-kultivar Pinot Noir). Fil-qosor, kulturi fuq medju solidu tal-ħmira tax-xgħir tħallew għal ġimgħa f'24 grad taħt dawl blu. L-ispori mbagħad ġew mibruxa u mlaqqma fi flixkun Erlenmeyer ta' 5{0{0 mL li kien fih 125 mL ta' medja ta' kultura (4{{30}} gL-1glukożju, 7 gL{{1{0}}gliċerol, 0.5 g·L-1L-histidine,0.1 g:L-1 CuSO,1.8gL-1 NaNO3,0.5g:L -1 KCl,0.5gL-1 CaCl2·H2O,0.05g:L-1 FeSO4.7H2O,1.0g L{-1KH2PO4, u 0.7 gL{-1 MgSO 4-7H2O).Wara 3 ijiem ta 'inkubazzjoni u jumejn ta' tkabbir fl-istess medju preċedenti, aċidu galliku (2 gL{-1) ġie miżjud mal-pre-kulturi. Wara 5 ijiem, il-mezz likwidu ġie ffiltrat, u s-supernatant ġie sottomess għal filtrazzjoni tanġenzjali f'sistema ta 'filtrazzjoni Quixstand (GE Healthcare UK, Little Chalfont, England) mgħammra b'piż molekulari ta' 30 kDa maqtugħ il-membrana. Il-konċentrat kien finalment soġġett għal dijafiltrazzjoni kontra ilma distillat, u nżammu biss il-frazzjonijiet li ppreżentaw attività ossidant kontra ABTS (-80 grad ).

3.5.Proċedura ta' Ossidazzjoni

Soluzzjoni ta' laccase (1 gL-1) f'buffer ta' fosfat-ċitrat kienet ippreparata qabel u miżjuda ma' soluzzjoni ta' 6g.L{-1( flimkien ma' )-catechin (inbid mudell) biex tinkiseb konċentrazzjoni finali ta' laccase ta' { {6}}.3 gL-1. Is-soluzzjoni miksuba mbagħad tħawwad bil-mod (180 rpm) f'temperatura tal-kamra għal 2 sigħat. Il-konċentrazzjonijiet kienu ottimizzati qabel, u l-esperimentazzjoni twettqet fi tliet kopji.

3.6. Waqfien tar-Reazzjoni fuq Resin Amberlite XAD7HP

Kolonna amber lite ġiet ikkundizzjonata bl-etanol (assoluta) u laħlaħ b'żewġ volumi ta 'kolonna ta' ilma milli-O. Il-mezz ta' reazzjoni tal-laccase/( plus )-catechin preċedenti twaqqa' fuq il-kolonna u l-ewwel ġie eluwit b'żewġ volumi ta' kolonna milli-Qwater [37]. Il-kolonna mbagħad ġiet eluwata bl-etanol sakemm il-frazzjoni miġbura ma kinitx ikkulurita. Il-frazzjonijiet tal-etanol biss inżammu, evaporati u lajofilizzati. It-trab inħażen fi -80 grad sakemm intuża.

3.7.Proċedura ta 'Purifikazzjoni tal-Frazzjoni Dimerika Bl-Użu tal-Kromatografija Flash

It-trab lajofilizzat ġie l-ewwel ippurifikat bl-użu ta 'sistema ta' kromatografija flash puriflash430 mgħammra b'ditekter UV issettjat f'280 nm u kolonna Puriflash diol 50 um f0025. Il-fażi mobbli binarja kienet tikkonsisti f'acetonitrile (solvent A) u metanol (solvent B), it-tnejn aċidifikati b'0.1 fil-mija TFA. Serje ta 'injezzjonijiet saru b'rata ta' fluss kostanti ta '20 mL·min-1, bl-użu tal-gradjent li ġej: 100 fil-mija A għal 4.4 min; 0-10 fil-mija B f'10 min;10 fil-mija B għal 5 min; 10-90 fil-mija B f'5 min;90 fil-mija B għal 3 min;90-10 fil-mija B f'2 min;10 fil-mija B għal 10 min. Il-volum tal-injezzjoni kien 1mL (300 mg trab lajofilizzat maħlul f'1 mL ta 'solvent A). Tliet frazzjonijiet distinti nġabru kull darba. L-ewwel waħda kienet tikkorrispondi għal residwu ( plus )-catechin, u t-tielet waħda kienet taħlita ta 'polifenoli ta' piż molekulari għoli. It-tieni frazzjoni elużita, li fiha taħlita ta 'prodotti ta' ossidazzjoni dimerika, ġiet evaporata u lajofilizzata qabel it-tieni pass ta 'purifikazzjoni.

3.8. Proċedura ta' Purifikazzjoni ta' Prodotti ta' Ossidazzjoni mill-Frazzjoni Dimerika Bl-użu ta' Sistema Kromatografika ta' Semi-Preparazzjoni

Il-frazzjoni li fiha prodotti ta 'ossidazzjoni dimerika ġiet ippurifikata permezz ta' sistema ta 'kromatografija ta' pressjoni medja Bio-Rad NGC 10 semi-preparattiva mgħammra b'kolonna Microsorb Varian Dynamax C18 ta 'fażi inversa (250 × 21.2 mm; 3 um). Il-fażi mobbli binarja kienet tikkonsisti f'ilma milli-O (solvent A) u 80 fil-mija aċetonitrile, 20 fil-mija ilma Milli-Q (solvent B), it-tnejn aċidifikati b'0.05 fil-mija TFA. Serje ta 'injezzjonijiet (300 μL) tat-trab lajofilizzat (20 mg maħlul f'200 uL ta' solvent A u 100 uL ta 'ACN) saru taħt il-kundizzjonijiet ta' elużjoni li ġejjin: 100 fil-mija A għal 4 min; 0-35 fil-mija B f'46 min;35-100 fil-mija B f'2 min;100 fil-mija B għal 5 min. Inġabru tmien frazzjonijiet distinti kull darba, li jikkorrispondu għal sinjali UPLC puri f'280 nm. Kull frazzjoni ġiet evaporata u lajofilizzata qabel l-analiżi NMR.

3.9.Preparazzjoni tal-Kampjun għall-Analiżi NMR

Madwar 1 mg ta 'kull trab lajofilizzat peżat f'tubi Eppendorf ġie solvut f'500 μL ta' acetone-dg. Imbagħad, ~ 10 uL ta 'soluzzjoni kkonċentrata ta' nitrat tal-kadmju fl-aċetun-d, ġiet miżjuda mal-kampjuni, u s-soluzzjonijiet li jirriżultaw ġew trasferiti għal tubi NMR ta '5 mm għall-analiżi NMR. Sar pass addizzjonali għal xi kampjuni: wara s-solubilizzazzjoni tat-trabijiet lajofilizzati f'aċetun-dg fil-preżenza ta 'traċċi ta' kadmju, il-kampjuni ġew evaporati sa nixfa u mbagħad risolubilizzati f'aċetun-d mingħajr aktar żieda ta 'Cd.

3.10.Speċifikazzjonijiet tal-Istrument

Analiżi UPLC-MS. Ir-reazzjonijiet ġew immonitorjati bl-użu ta' żewġ sistemi UPLC-MS. L-ewwel wieħed intuża biex jidentifika b'mod preċiż il-ħinijiet ta 'żamma tal-prodotti bl-użu ta' metodu ta 'gradjent twil. Jiġifieri, Il-Kromatografija Likwida ta' Prestazzjoni Ultra-Għolja ta' Waters akkoppjata ma' Spettrometrija tal-Massa (UHPLC-MS). Is-sistema tal-kromatografija likwida kienet Acquity UPLC(Waters, Milford, MA, USA)mgħammar b'detector ta' firxa ta' photodiode. Aħna użajna kolonna Acquity UPLC HSS T3 (1.8 um, 2.1 ×150 mm). It-temperatura tal-kolonna kienet 25 grad. Il-fażi mobbli binarja kienet tikkonsisti minn 0.1 fil-mija aċidu formiku fl-ilma (solvent A) u aċetonitrile (solvent B). Is-separazzjoni twettqet b'rata ta 'fluss kostanti ta' 0.25mL·min-1,bl-użu tal-gradjent li ġej:8-11 fil-mija B f'2 min; 11 fil-mija B għal 8 min; 11-25 fil-mija B fi 15 min;25-55 fil-mija Bin 5 min;55-99 fil-mija Bin 1 min;99 fil-mija B għal 4 min;99-8 fil-mija Bin1 min;8 fil-mija B għal 4 min. Il-volum tal-injezzjoni kien 5 μL. L-ispettrometru tal-massa kien quadrupole sempliċi Waters Acquity QDa electrospray ionization (ESI) (Waters, Milford, MA, USA). Il-vultaġġ kapillari kien issettjat għal 0.8 kV. L-ispettri tal-massa ġew akkwistati fuq medda ta' massa ta' 200-900 Irqiq il-mod tal-jone pożittiv.

It-tieni sistema UHPLC-MS, użata għall-verifika rapida matul il-passi tal-purifikazzjoni, kienet l-istess kif deskritta qabel, b'kolonna Acquity UHPLC HSS T3 （1.8 μm, 2.1×100 mm） msaħħna fi 38 grad. Is-separazzjoni twettqet b'rata ta 'fluss kostanti ta' 0.55 mL·min-1, bl-użu tal-gradjent mgħaġġel li ġej: 0.1-40 fil-mija B f'5 min; 40-99 fil-mija B f'2 min; 99 fil-mija B għal 1 min; 99-0.1 fil-mija B f'1 min. Il-volum tal-injezzjoni kien 2 μL. L-ispettrometru tal-massa kien nassa tal-jone Bruker Amazon X electrospray ionization (ESI) (Bruker Daltonics, Bremen, il-Ġermanja). Il-vultaġġ kapillari kien issettjat għal -5.5 kV. L-ispettri tal-massa ġew akkwistati fuq medda ta' massa ta' 50-2000 Irqiq il-mod tal-jone pożittiv.

L-analiżi UPLC-MS kollha saru fi tliet kopji.

Strumentazzjoni NMR. L-ispettri NMR kollha ġew irreġistrati fuq spettrometru Agilent DD{{0}} MHz (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), li jaħdem f'500.05 u 125.74 MHz għal nuklei tal-protoni u tal-karbonju-13, rispettivament, bl-użu ta 'sonda ta' skoperta indiretta ta '5 mm mgħammra b'koljatura ta' gradjent. .1 Softwer (Mestrelab Research, Spanja). Il-kejl DOSY ġie akkwistat u pproċessat kif deskritt qabel 38]. Il-parametri ta 'akkwist tas-sekwenza tal-polz DgcsteSL kienu kif ġej: il-ħin tad-dewmien tad-diffużjoni u l-wisa' tal-polz tal-gradjent ġew issettjati għal 50 ms u 2 ms, rispettivament, il-qawwa tal-gradjent (g) ġiet inkrementata f'16-il pass bi spazjar ugwali g2 minn 0.3 sa 32G · ċm-I. Wara l-korrezzjoni tal-fażi, l-ispettri 2D DOSY ġew mibnija mill-kejl tal-għoli tal-quċċata bl-użu ta 'softwer VNMRJ4.2.

L-ispettri kollha kienu referenzjati għas-sinjali solvent acetone-dg ("sinjal residwu H f'2.05 ppm u sinjal 13C f'29.92 ppm).

4. Konklużjonijiet

L-azzjoni ta 'tliet oxidoreductases differenti (polyphenol oxidase estratt mill-għeneb, laccase minn Botrytis cinerea, u laccase minn Trametes Versicolor) fuq ( plus ) -catechin ġew investigati, u l-profili li jirriżultaw LC-UV-MS kienu simili ħafna, għalkemm xi differenzi żgħar issuġġerixxa differenzi possibbli fir-reattività ta’ dawn l-enzimi.

L-istrutturi ta’ sitt prodotti ta’ ossidazzjoni ta’ catechin-laccase (bl-użu ta’ laccase minn Trametes Versicolor) inkisbu fuq il-bażi ta’ firem NMR speċifiċi (erba’ prodotti puri, jiġifieri, N2, N3, N6, u N8, u N4, li jikkorrispondu għal taħlita ta’ żewġ iżomeri). L-attribuzzjoni sħiħa ta 'sinjali OH fenoliċi kienet possibbli grazzi għaż-żieda ta' nitrat tal-kadmju bi proċedura ta 'preparazzjoni ta' kampjun li ppermettiet l-attribuzzjoni mhux ambigwa tar-rabtiet bejn l-unitajiet tal-catechin għal xi wħud mill-komposti ta 'interess. Din il-proċedura se tissimplifika bil-kbir l-analiżi NMR ta 'taħlitiet ta' polifenoli, jew sintetizzati jew estratti minn prodotti naturali.

L-istandards miksuba f'dan ix-xogħol jistgħu jintużaw fil-futur bħala markaturi tal-ossidazzjoni biex jinvestigaw il-preżenza u l-evoluzzjoni tagħhom matul il-maturazzjoni tal-għeneb u t-tiqdim tal-inbid. Minbarra l-catechin, komposti oħra tal-polifenoli, inklużi flavonoids u non-flavonoids, jistgħu jintużaw ukoll bħala sottostrati ta 'laccase biex jinkisbu standards ġodda addizzjonali.

Abbrevjazzjonijiet

NMR: reżonanza manjetika nukleari,

Cd: kadmju,

TOCSY: spettroskopija ta' korrelazzjoni totali,

ROESY: Spettroskopija tal-effett Overhauser nukleari b'qafas rotanti,

HSQC: esperiment ta 'korrelazzjoni ta' kwantum wieħed eteronukleari,

HMBC: konnettività multi-band eteronukleari,

DOSY: spettroskopija ordnata tad-diffużjoni.

Referenzi

1. Khan, N.; Mukhtar, H. Polifenoli tat-te għall-Promozzjoni tas-Saħħa. Ħajja Sci. 2007, 81, 519–533. [CrossRef]

2. Fayeulle, N.; Vallverdu-Queralt, A.; Meudec, E.; Lewn, C.; Boulanger, R.; Cheynier, V.; Sommerer, N. Karatterizzazzjoni ta' New Flavan-3-Ol Derivatives in Fermented Cocoa Beans. Chem tal-Ikel. 2018, 259, 207–212. [CrossRef] [PubMed]

3. Rimbach, G.; Melchin, M.; Moehring, J.; Wagner, AE Polifenoli mill-Kawkaw u s-Saħħa Vaskulari—Reviżjoni Kritika. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 4290–4309. [CrossRef]

4. Avram, AM; Morin, P.; Brownmiller, C.; Howard, LR; Sengupta, A.; Wickramasinghe, SR Konċentrazzjonijiet ta 'Polifenoli mill-Estratt tal-Pomace Blueberry Bl-użu ta' Nanofiltrazzjoni. Ikel Bioprod. Proċess. 2017, 106, 91–101. [CrossRef]

5. Antoniolli, A.; Fontana, AR; Piccoli, P.; Bottini, R. Karatterizzazzjoni ta 'Polifenoli u Evalwazzjoni tal-Kapaċità Antiossidanti fil-Pomace tal-Għeneb tas-Cv. Malbec. Chem tal-Ikel. 2015, 178, 172–178. [CrossRef]

6. Saucier, C. Kif jevolvu l-polifenoli tal-inbid matul it-tixjiħ tal-inbid? Cerevisia 2010, 35, 11–15. [CrossRef]

7. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, Mekkaniżmi ta' Ossidazzjoni AMS li Jseħħu fl-Inbejjed. Ikel Res. Int. 2011, 44, 1115–1126. [CrossRef]

8. Singleton, VL Ossiġenu b'Fenoli u Reazzjonijiet Relatati f'Most, Inbejjed, u Sistemi Mudell: Osservazzjonijiet u Implikazzjonijiet Prattiċi. Em. J. Enol. Vitic. 1987, 38, 69–77.

9. Mathew, AG; Parpia, HAB Ikel Browning bħala Reazzjoni Polifenol. Fl-Avvanzi fir-Riċerka dwar l-Ikel; Chichester, CO, Mrak, EM, Stewart, GF, Eds.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 1971; Volum 19, p. 75–145. [CrossRef]

10. Gambuti, A.; Rinaldi, A.; Ugliano, M.; Moio, L. Evoluzzjoni ta 'Komposti Fenoliċi u Astringenza matul it-Tixjiħ ta' Inbid Aħmar: Effett ta 'Espożizzjoni għall-Ossiġenu qabel u wara l-Ibbottiljar. J. Agri. Chem tal-Ikel. 2013, 61, 1618–1627. [CrossRef] [PubMed]