L-Istatus kurrenti tan-newroprotezzjoni fil-parti 1 tal-mard tal-qalb konġenitali

Astratt:

Il-preżenza ta 'DNA ektopiku fiċ-ċitoplasma tinduċi infjammazzjoni u mewt taċ-ċelluli. Ġie rrappurtat b'mod wiesa 'li t-tnixxija tad-DNA nukleari fiċ-ċitoplasma tista' tinħass prinċipalment minn cyclicGMP-AMP synthase (cGAS).

Id-DNA hija l-molekula li tispeċifika l-informazzjoni ġenetika ta’ kull persuna u tinsab f’kull waħda miċ-ċelloli tagħna. Riċerka reċenti turi li d-DNA jista 'jnixxi fiċ-ċitoplasma permezz ta' ċerti mogħdijiet u jaffettwa l-memorja tagħna.

Dan il-fenomenu huwa komuni f'adulti anzjani u nies b'indeboliment konjittiv. Meta d-DNA joħroġ fiċ-ċitoplasma, jinterferixxi mal-funzjonijiet normali fiċ-ċellula u jżid ir-riskju ta 'telf ta' memorja u indeboliment konjittiv.

Madankollu, m'għandniex għalfejn inħossuna depressi u bla tama dwar dan. Hemm ħafna modi kif intejbu l-memorja u l-abbiltajiet konjittivi biex jgħinuna nżommu moħħ b'saħħtu.

L-ewwel, trid iżżomm stil ta 'ħajja b'saħħtu. Dan jinkludi li tiekol dieta bilanċjata, torqod biżżejjed, tagħmel eżerċizzju moderat, u tnaqqas l-istress. Dawn il-prattiki jippromwovu s-saħħa tal-moħħ, u b'hekk jevitaw it-tnixxija tad-DNA u jtejbu l-memorja.

It-tieni, taħriġ konjittiv huwa meħtieġ. Dan jista 'jinkludi l-logħob tal-matematika, il-qari, it-tagħlim ta' ħiliet ġodda, eċċ. Dawn l-attivitajiet jistgħu jgħinu biex jistimulaw il-moħħ u jippromwovu n-newroġenesi biex tiġi evitata t-tnixxija tad-DNA.

Fl-aħħarnett, żomm attitudni pożittiva. L-instabilità emozzjonali u l-istress eċċessiv jistgħu jikkawżaw bidliet fil-kimika tal-moħħ li jippromwovu t-tnixxija tad-DNA. Għalhekk, irridu nitgħallmu niffaċċjaw l-isfidi fil-ħajja b’mod pożittiv u nżommu attitudni ottimista.

Fil-qosor, għalkemm it-tnixxija tad-DNA fiċ-ċitoplasma tista 'taffettwa l-memorja, nistgħu ntejbu s-saħħa tal-moħħ, nevitaw it-tnixxija tad-DNA, u fl-aħħar intejbu l-memorja tagħna billi nadottaw l-istil ta' ħajja t-tajjeb, nidħlu f'taħriġ konjittiv, u nżommu mentalità pożittiva. Memorja u abbiltajiet konjittivi. Wieħed jista 'jara li għandna bżonn intejbu l-memorja, u Cistanche deserticola jista' jtejjeb b'mod sinifikanti l-memorja minħabba li Cistanche deserticola huwa materjal mediċinali tradizzjonali Ċiniż li għandu ħafna effetti uniċi, li wieħed minnhom huwa li jtejjeb il-memorja. L-effikaċja ta 'Cistanche deserticola ġejja mill-ingredjenti attivi multipli li fih, inkluż aċidu tanniku, polisakkaridi, glikożidi flavonojdi, eċċ Dawn l-ingredjenti jistgħu jippromwovu s-saħħa tal-moħħ permezz ta' varjetà ta 'mogħdijiet.

Ikklikkja taf 10 modi biex ittejjeb il-memorja

Aħna reċentement irrappurtajna li d-DNA doppju ċitoplasmiku derivat mill-mitokondrija (dsDNA) li ħarbet mid-degradazzjoni liżosomali jinduċi ċelluli inkulturati ċitotossiċi sinifikanti u in vivo. Id-DNA mitokondrijali ċitoplasmika huwa preżunt li huwa involut f'diversi mard u disturbi, u aktar u aktar karti ġew ippubblikati li jikkonfermaw dan. Min-naħa l-oħra, il-metodu attwali għall-evalwazzjoni tad-DNA mitokondrijali fiċ-ċitoplasma jista 'ma jkunx kwantitattiv.

Hawnhekk, nintroduċu fid-dettall metodu biex nevalwaw iċ-ċelluli ektopiċi tad-DNA mitokondrijali. Dan il-metodu huwa utli fir-riċerka bażika kif ukoll fl-istudju tat-tixjiħ, il-marda ta 'Parkinson, il-marda ta' Alzheimer, insuffiċjenza tal-qalb, mard awtoimmuni, kanċer u kundizzjonijiet oħra.

Kliem ewlieni: DNA ektopiku; DNA mitokondrijali; Fattur ta' traskrizzjoni mitokondrijali A (TFAM);Il-marda ta' Parkinson.

1. Introduzzjoni

Id-DNA fih informazzjoni importanti għas-sopravivenza u l-wirt, u jeħtieġ li tiġi protetta minn diversi stressors, inklużi ossidanti u mutaġeni. Iċ-ċelloli ewkarjotiċi fihom mitokondrija, li jipproduċu l-enerġija, flimkien ma 'ħafna speċi attivi ta' ossiġnu, permezz ta 'respirazzjoni aerobika.

Għalhekk, fiċ-ċellula ewkarjotika, id-DNA jeżisti fin-nukleu jew fil-mitokondrija, ippakkjat ġewwa l-membrana nukleari jew il-membrana mitokondrijali, rispettivament. 4].

Anke f'xi kundizzjonijiet mhux infettivi (pereżempju, ix-xjuħija jew diversi disturbi relatati mal-età jew kanċer), id-DNA jista 'jkun leaked fiċ-ċitoplasma min-nukleu jew mill-mitokondrija [5-7].

Id-DNA fiċ-ċitoplasma jista 'jkun infjammatorju u tossiku għaċ-ċelloli. Ġie rrappurtat b'mod wiesa 'li t-tnixxija tad-DNA nukleari fiċ-ċitoplasma jinduċi infjammazzjoni, ċitotossiċità, u fenotip sekretorju assoċjat mas-senescence (SASP), prinċipalment permezz tal-stimulatur ċikliku GMP-AMP synthase (cGAS) tal-mogħdija tal-ġeni tal-interferon (STING). 5,6].

Aħna reċentement irrappurtajna li d-DNA ċitosoliku bi strand doppju (dsDNA) ta 'oriġini mitokondrijali li jaħrab mid-degradazzjoni lisosomali intwera li jinduċi ċitotossiċità u newrodeġenerazzjoni f'mudelli ċellulari tal-marda ta' Parkinson [8]. Il-preżenza jew iż-żieda f'tali DNA ektopiku spiss kienet indikata minn stampi mikroskopiċi rappreżentattivi u evidenza ċirkostanzjali, mhux miż-żieda fit-tnixxija tad-DNA nnifisha.

Huwa mistenni li l-evalwazzjoni ta 'dan id-DNA ektopiku ssir dejjem aktar importanti, mhux biss riċerka bażika iżda wkoll għal riċerka dwar ix-xjuħija u mard ieħor, bħall-marda ta' Parkinson, marda ta 'Alzheimer, sklerożi laterali amiotrofika, insuffiċjenza tal-qalb, mard awtoimmuni, dijabete, steatohepatitis mhux alkoħoliku (NASH), u kanċers. Il-passaġġ cGAS–STING ġie rrappurtat li huwa kruċjali mhux biss fit-tixjiħ iżda wkoll fil-patoġenesi ta 'dan il-mard [8-17].

Probabbilment minħabba ċ-ċirkostanzi ossidattivi madwar il-mitokondrija u n-nuqqas ta 'sistema effiċjenti ta' tiswija tad-DNA għad-DNA mitokondrijali, id-DNA mitokondrijali hija ħafna aktar suxxettibbli għal mutazzjoni jew ħsara mid-DNA nukleari [18,19].

B'differenza mid-DNA nukleari, id-DNA mitokondrijali jeżisti f'kopji multipli f'ċellula waħda u huwa sintetizzat kif meħtieġ. Għalhekk, id-DNA mitokondrijali jista' jkollu ċans ħafna akbar li joħroġ fiċ-ċitoplasma waqt ix-xjuħija jew f'kundizzjonijiet malinni bħal disturbi relatati mal-età, disfunzjoni mitokondrijali. , jew kanċer.

L-iskoperta u l-kejl ta 'tali DNA ċitoplasmika mitokondrijali jistgħu jkunu importanti biex jifhmu l-patoġenesi ta' diversi mard u tixjiħ u jistgħu jsiru bijomarkatur u mira terapewtika.

Żviluppajna metodu semi-kwantitattiv biex nevalwaw id-DNA mitokondrijali ektopika li tnixxi fiċ-ċitoplasma, u hawnhekk niddeskrivu l-metodu fid-dettall. Dan id-dokument jippermetti evalwazzjoni oġġettiva tat-tnixxija tad-DNA mitokondrijali u huwa utli fl-istudju ta 'diversi patoloġiji ta' mard.

2. Materjali u Metodi

2.1. Linji Ċelluli, Trattament ta 'siRNA, u Analiżi Kwantitattiva tal-PCR (qPCR).

Iċ-ċelloli HeLa ġew derivati ​​minn ċelloli tal-kanċer ċervikali minn pazjenta femminili (ATCC,CCL-2). Iċ-ċelloli HeLa ġew ikkultivati ​​f'37 ◦C taħt 5% CO2 f'Dulbecco's Modified EagleMedium (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) supplimentat b'10% fetali bovineserum (FBS) (Biowest, Nuaillé, Franza) u soluzzjoni peniċillina-streptomycin ( 100 unità/mLpeniċillina G u 100 µg/mL streptomycin sulfate, Wako, Osaka, Ġappun).

Ġurnata qabel it-trasfezzjoni, iċ-ċelloli HeLa ġew ibbanjati f'densità ta' 600 ċellula/µL. L-espressjoni tal-ġeni ta' interess ġiet imsikkta fiċ-ċelloli HeLa bl-użu ta' Stealth RNAi siRNA (fattur ta' traskrizzjoni mitokondrijali A, TFAM: HSS144251, glucocerebrosidase, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) f'Lipofectamine RNAiMAX Transfection to Reagent Scientific Thermo l-istruzzjonijiet tal-manifattur (konċentrazzjoni finali ta' RNA ta' 10 nM).

Tlett ijiem wara l-knockdown tas-siRNA, l-RNA ċellulari totali ġie iżolat bl-użu ta 'TRIzolreagent skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur (Thermo Fisher Scientific). Is-cDNAtemplates ġew sintetizzati mill-RNA purifikat bl-użu tal-ProtoScript II First StrandcDNA Synthesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) b'oligo (dT) 20 primers. qPCR sar bl-użu ta' TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu). , Ġappun) u analizzati f'Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio). Il-primars tal-PCR użati fl-istudju preżenti kienu GBA bil-quddiem (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC), GBA reverse (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM quddiem (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM reverse (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA), Glyceraldehyde-3-Phosphate Deidroġenu) u Glyceraldehyde-3-Phosphate Deidroġenu CAAGCAGAGAGAAGTCAC (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC) reverse (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

Analiżi statistiċi saru bl-użu tas-software GraphPad Prism verżjoni 9.3.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). It-testijiet t ta' Student fuq żewġ naħat intużaw biex iqabblu l-mezzi aritmetiċi bejn żewġ gruppi. Id-dejta hija ppreżentata bħala l-mezzi u ± żbalji standard tal-mezzi.

2.2. Sejbien ta 'Immunofluworexxenza ta' DNA Ektopiku Mitokondrijali u Analiżi ta 'Immaġini

Ġurnata qabel it-trasfezzjoni, iċ-ċelloli HeLa ġew ibbanjati f'densità ta' 600 ċellula/µL. L-espressjoni tal-ġeni ta' interess ġiet imsikkta f'ċelloli HeLa bl-użu ta' Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) f'Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (ThermoFisher Scientific) skont il- istruzzjonijiet tal-manifattur (konċentrazzjoni finali ta' RNA ta' 10 nM).

Tlett ijiem wara t-tbatija tas-siRNA, iċ-ċelloli ġew soġġetti għal tbajja ta 'immunofluworexxenza. Għall-iskoperta tad-DNA mitokondrijali, antikorp anti-dsDNA (Abcam, Cambridge, UK, klonu 35I9, Cat# ab27156, RRID: AB_470907 jew EMD Millipore, Billerica,MA, USA, klonu AC-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) wera proporzjon aħjar tas-sinjal għall-istorbju minn Hoechst 33258, DAPI, jew Picogreen. Hawnhekk għaqqadna tliet antikorpi primarji: antikorp anti-dsDNA (35I9 DNA) (Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907), antikorp anti-histone-H2B (Abcam, Cat# ab134211), u anti-sħana- antikorp tal-proteina tax-xokk-60 (Hsp60) (Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444).

Antikorpi oħra jistgħu jintgħażlu jew immarkati b'mod fluworexxenti bl-histone, jew Hsp60 jista 'jintuża alternattivament, iżda huwa meħtieġ li jiġu ottimizzati l-kundizzjonijiet ta' tbajja tripla għal kull kombinazzjoni.

Iċ-ċelloli ġew maħsula darbtejn b'salina buffered bil-fosfat (PBS) u ffissati b'metanol kiesaħ bis-silġ għal 10 min f'4 ◦C.Alternattivament, 4% paraformaldehyde (PFA) jista 'jintuża għall-iffissar, iżda s-sinjali tal-isfond jidhru ferm akbar f'kampjuni ffissati bil-PFA. Wara l-iffissar, iċ-ċelloli ġew maħsula tliet darbiet b'salina buffered bil-fosfat bi Tween 20 (PBST) għal 5 minuti kull wieħed. Iċ-ċelloli kienu permeabilizzati b'PBS li kien fih 0.2% (w/v) Triton X-100 għal 10 min.

Wara li nħaslu tliet darbiet b'PBST għal 5 minuti kull darba, iċ-ċelloli ġew inkubati b'2% (w/v) albumina tas-serum bovin (BSA) f'PBST għal 30 min. Iċ-ċelloli ġew inkubati b'antikorp wieħed primarju, antikorp anti-histone-H2B (1/400, Abcam, Cat # ab134211) dilwit f'2% (w/v) BSA f'PBST O/N f'4 ◦C. Wara li nħaslu tliet darbiet bil-PBST għal 5 minuti kull darba, iċ-ċelloli ġew inkubati b'Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey kontra Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17 }}) dilwit fi 2% (w/v) BSA f'PBST għal siegħa f'temperatura tal-kamra (RT).

Wara li nħaslu tliet darbiet għal 5 minuti kull darba b'PBST, iċ-ċelloli ġew inkubati b'antikorpi primarji, u antikorp anti-dsDNA (35I9 DNA) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) u anti -Antikorp Hsp60 (1/400, Abcam, Cat# ab46798,RRID: AB_881444) dilwit fi 2% (w/v) BSA f'PBST ġew applikati għal siegħa f'RT jew matul il-lejl (O/N) fi 4◦C.

Wara li nħaslu tliet darbiet bil-PBST għal 5 minuti kull darba, iċ-ċelluli ġew inkubati b'Alexa Fluor 680-konjugat Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (1/200, Thermo Fisher Scientific, Cat# A10043) , RRID: AB_2534018) ​​u Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB{_2732073)dilwit fi 2% (w/v) BSA f'PBST għal siegħa f'RT.

Iċ-ċelloli ġew maħsula tliet darbiet b'PBST għal 5 minuti kull darba, u l-kampjun ġie analizzat bl-użu ta 'mikroskopju konfokali A1R + (Nikon, Tokyo, Ġappun).

For more information:1950477648nn@gmail.com