L-Istatus kurrenti tan-newroprotezzjoni fil-parti 2 tal-mard tal-qalb konġenitali

L-immaġini mikroskopiċi mbagħad ġew soġġetti għal kalkolu tal-immaġni bl-użu ta 'softwer ImageJ (Istituti Nazzjonali tas-Saħħa, Bethesda, MD, USA). Is-sinjal ta 'Hsp60 ġie mmultiplikat b' "x".

Hsp60 hija molekula ta 'proteina importanti li għandha rwol bijoloġiku importanti fil-ġisem tal-bniedem. Ir-riċerka f'dawn l-aħħar snin wriet li l-preżenza ta 'Hsp60 hija relatata mill-qrib mal-memorja tal-bniedem.

Hsp60 hija proteina chaperone molekulari li hija prinċipalment involuta fit-tiwi, l-iżvolġiment, l-istabbilizzazzjoni u d-degradazzjoni tal-proteini. Dawn il-proċessi huma importanti ħafna għall-metaboliżmu normali u l-funzjoni ċellulari tal-ġisem tal-bniedem. Fl-istess ħin, Hsp60 għandu wkoll effetti antiossidanti, anti-infjammatorji u immunomodulatorji, u għandu rwol kbir fiż-żamma tas-saħħa tal-bniedem u l-bilanċ tas-sistema immuni.

Ir-riċerka sabet li Hsp60 għandu rwol kruċjali fil-formazzjoni u l-manutenzjoni tal-memorja. Matul il-proċess ta 'tagħlim u memorja, iċ-ċelloli tal-moħħ jipproduċu numru kbir ta' molekuli Hsp60. Dawn il-molekuli jistgħu jipproteġu ċ-ċelloli minn interferenza u ħsara mill-ambjent estern biex jiżguraw il-progress bla xkiel tat-tagħlim u l-memorja. Barra minn hekk, Hsp60 jista 'wkoll jaffettwa l-ħsieb u l-imġieba tal-bniedem billi jibdel it-trasduzzjoni tas-sinjal taċ-ċelloli tal-moħħ u l-iżvilupp tan-newroni u għandu impatt pożittiv fuq il-konjizzjoni u r-reżistenza għall-istress.

Għalkemm ir-rwol ta 'Hsp60 wera effetti pożittivi fuq il-ġisem tal-bniedem, in-nies jeħtieġu wkoll jirrealizzaw li kemm l-eċċess kif ukoll id-defiċjenza ta' Hsp60 jista 'jkollhom effetti negattivi fuq is-saħħa tal-bniedem. Għalhekk, għandna nesploraw u nistudjaw b'mod attiv il-mekkaniżmu ta 'Hsp60 f'diversi kundizzjonijiet fiżjoloġiċi u patoloġiċi tal-ġisem tal-bniedem biex nifhmu aħjar il-pożizzjoni u r-rwol ta' Hsp60 fis-saħħa tal-bniedem. Wieħed jista 'jara li għandna bżonn intejbu l-memorja, u Cistanche deserticola jista' jtejjeb b'mod sinifikanti l-memorja, minħabba li Cistanche deserticola għandu effetti antiossidanti, anti-infjammatorji u kontra t-tixjiħ, li jistgħu jgħinu jnaqqsu l-ossidazzjoni u r-reazzjonijiet infjammatorji fil-moħħ, u b'hekk jipproteġu l- saħħa tas-sistema nervuża. Barra minn hekk, Cistanche deserticola tista 'wkoll tippromwovi t-tkabbir u t-tiswija taċ-ċelloli tan-nervituri, u b'hekk ittejjeb il-konnettività u l-funzjoni tan-netwerks newrali. Dawn l-effetti jistgħu jgħinu biex itejbu l-memorja, il-ħila tat-tagħlim, u l-veloċità tal-ħsieb, u jistgħu wkoll jipprevjenu l-iżvilupp ta 'disfunzjoni konjittiva u mard newrodeġenerattiv.

Ikklikkja Kun af biex ittejjeb il-memorja għal żmien qasir

Il-valur "x" ġie determinat kif ġej: it-tnaqqis tas-sinjal Hsp60 mitwi "x" mis-sinjal tad-DNA mitokondrijali fil-grupp ta 'kontroll għamel il-valur tad-DNA mitokondrijali inqas minn jew ugwali għal żero. Is-sinjal ta 'histone H2B ġie mmultiplikat b' "y".

Il-valur "y" ġie determinat kif ġej: it-tnaqqis tas-sinjal tal-histone-H2B mitwi "y" mis-sinjal nukleari-DNA fil-grupp ta 'kontroll għamel il-valur nukleari-DNA inqas minn jew ugwali għal żero. Jekk is-sinjal fl-isfond isir għoli mill-multiplikazzjoni, il-kuntrast tal-immaġini multiplikati jista 'jiġi aġġustat għall-istess kundizzjonijiet fil-kampjuni kollha.

L-immaġni tat-tbajja tad-dsDNA, nieqsa l-immaġni aġġustata ta 'Hsp60 multiplikata u histone H2B, intużat għal analiżi sussegwenti. Bl-użu tal-funzjoni "Aġġusta-Threshold", dawn l-immaġini kienu binarizzati. Aħna għażilna dsDNA puncta li jvarjaw fid-daqs minn 2 sa 20 µm2 (ċirkolarità 0.1–1.0), u ġew magħduda bl-użu tal-funzjoni "Analizza-Analizza Partiċelli".

2.3. Mikroskopija Elettronika

Ġurnata qabel it-trasfezzjoni, iċ-ċelloli HeLa ġew ibbanjati f'densità ta' 600 ċellula/µL. L-espressjoni tal-ġeni ta' interess ġiet imsikkta f'ċelloli HeLa bl-użu ta' Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) f'Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (ThermoFisher Scientific) skont il- istruzzjonijiet tal-manifattur (b'konċentrazzjoni finali ta' RNA ta' 10 nM).

Erbat ijiem wara t-twaqqigħ tas-siRNA, iċ-ċelloli ġew soġġetti għal fissazzjoni. Kampjuni tal-kultura taċ-ċelluli ġew iffissati b'2% PFA u 2% glutaraldehyde f'0.1 M phosphatebuffer, pH 7.4, f'37 ◦C, imbagħad imqiegħda f'4 ◦ ◦C friġġ għal 30 min. Il-kampjuni ġew iffissati fi 2% glutaraldehyde f'0.1 M phosphate buffer matul il-lejl f'4 ◦C. Il-kampjuni ġew maħsula tliet darbiet b'0.1 M phosphate buffer għal 30 min u wara ffissati b'2% osmiumtetroxide f'0.1 M phosphate buffer f'4 ◦C għal siegħa.

Il-kampjuni ġew deidratati soluzzjonijiet ta' etanol gradat, trasferiti għal raża (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokyo, Ġappun), u polimerizzati f'60 ◦C għal 48 siegħa. Ir-reżini polimerizzati nqatgħu f'sezzjonijiet ultrarqiqa 70-nm b'sikkina tad-djamanti bl-użu ta 'ultramicrotome (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, il-Ġermanja) u mbagħad ġew immuntati fuq grilji tar-ram.

Is-sezzjonijiet ġew imtebba 'b'2% aċetat ta' uranil f'RT għal 15-il minuta u maħsula b'ilma distillat, segwit minn tbajja sekondarja b'soluzzjoni ta 'tbajja' taċ-ċomb (Sigma-Aldrich, Tokyo, Ġappun) f'RT għal 3 min.

Il-grids ġew osservati taħt mikroskopju elettroniku ta' trażmissjoni (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tokyo, Ġappun) b'vultaġġ ta 'aċċelerazzjoni ta' 80 kV (moħħ zebrafish) jew 100 kV (ċellula), u immaġni ġew irreġistrati bl-użu ta 'charge-coupled-device (CCD) kamera (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Mikroskopija immunoelettroniċi

Il-kampjuni fuq id-diski tad-deheb ġew iffriżati fi propan likwidu f'-175 ◦C. Wara li l-kampjuni ġew iffriżati, ġew sostitwiti bil-friża b'1% aċidu tanniku fl-etanol u 2% ilma distillat f'-80 ◦C għal 24 siegħa.

Il-kampjuni mbagħad inżammu f'-20 ◦C għal 4 sigħat, segwiti minn inkubazzjoni f'4 ◦C għal siegħa. Sussegwentement, il-kampjuni ġew deidratati f'etanol anidru 3 darbiet għal 30 min. kull darba, segwit minn infiltrazzjoni b'taħlita 50:50 ta 'reżina etanoland (LR abjad: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) f'4 ◦C għal 1 siegħa. Il-kampjuni ġew trasferiti għal reżina friska 100% u inkubati f'4 ◦C għal 30 min, u dan il-proċess ġie ripetut tliet darbiet.

Il-kampjuni ġew trasferiti għal reżina friska ta '100% u ġew polimerizzati f'50 ◦CO/N. Ir-reżini polimerizzati kienu sezzjoni ultra-rqiqa f'90 nm b'sikkina tad-djamanti bl-użu ta 'ultramicrotome (Ultracut UCT; Leica), u s-sezzjonijiet kienu mqiegħda fuq grilji tan-nikil. Il-gradilja ġew inkubati b'antikorp anti-dsDNA (35I9 DNA) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) f'1% BSA/PBS f'4 ◦CO/N, segwit minn tliet tlaħliħ bi 1% BSA/PBS għal 1 min kull wieħed.

Sussegwentement ġew inkubati bl-antikorp sekondarju konjugat ma' partiċelli tad-deheb {{0}}nm (antikorp poliklonali tal-Mogħoż kontra l-Ġurdien IgG) għal 2 sigħat f'RT. Wara t-tlaħliħ bil-PBS, il-grilji tqiegħdu f'2% glutaraldehydein 0.1 M cacodylate buffer.

Wara, il-grilji ġew imnixxfa u mbagħad imtebbgħin b'2% aċetat ta' uranil għal 15-il minuta u b'soluzzjoni ta 'tebgħa taċ-ċomb (Sigma-Aldrich) f'RT għal 3 min. Il-grilji ġew osservati permezz ta' mikroskopju elettroniku ta 'trażmissjoni (JEM -1400 plus; JEOLLtd.) b'vultaġġ ta' aċċelerazzjoni ta' 100 kV. Immaġini diġitali nkisbu b'kamera CCD (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Riżultati

3.1. Tnaqqis ta' TFAM jew GBA Jinduċi Żieda fid-DNA Ektopiku Mitokondrijali

L-ewwel, aħna wrejna eżempju ta 'l-iskoperta ta' ċitoplasmDNA derivat mill-mitokondrija fiċ-ċelloli HeLa li fihom il-proteina TFAM ġiet imwaqqfa minn siRNA (Figura 1A).TFAM huwa fattur ewlieni ta 'traskrizzjoni mitokondrijali u jaħdem ukoll fir-replikazzjoni u t-tiswija mitokondrijali [20] .

Polimorfiżmi ta' sekwenza f'dan il-ġene huma rrappurtati li huma assoċjati mal-marda ta' Parkinson [21,22]. Wara 3 ijiem ta 'knockdown tal-proteina TFAM, ġew skoperti ħafna tikek tad-DNA bi stranded doppju fiċ-ċitoplasma taċ-ċelloli HeLa.

Istoni huma markaturi pożittivi għal DNA ta 'oriġini nukleari fiċ-ċitoplasma, u markaturi negattivi għal DNA mitokondrijali u DNA ta' oriġini mitokondrijali fiċ-ċitoplasma [23].Dawn it-tikek ma ko-lokalizzawx ma 'histones, li jissuġġerixxu li ma kinux DNA derivati ​​minn nukleari. Barra minn hekk, xi wħud minn dawn it-tikek tad-DNA ċitoplasmiċi u ektopiċi ma ko-lokalizzawx ma' Hsp60, markatur għall-matriċi mitokondrijali, li jindika li kienu joqogħdu barra mill-mitokondrija (Figura 1B, C).

Il-mikroskopija elettronika wriet ukoll li d-DNA ektopiku ħareġ mill-mitokondrija (Figura 2A, B). Fil-qosor, iż-żieda ta 'DNAdots ektopiċi fiċ-ċitoplażma permezz ta' knockdown TFAM kienet dovuta għal DNA mitokondrijali li jnixxi mill-mitokondrija. It-tieni nett, urejna eżempju ieħor ta 'l-iskoperta ta' DNA ċitoplasmiku derivat mill-mitokondrija fiċ-ċelloli HeLa li fihom il-proteina GBA ġiet imwaqqfa minn siRNA. (Figura 1A).

GBA huwa l-ġene kawżattiv għall-marda ta' Gaucher, iżda mutazzjoni eterozigota ta' GBA hija wkoll fattur ta' riskju għall-marda ta' Parkinson [24]. Ġew skoperti ħafna tikek tad-DNA double-stranded fiċ-ċitoplasma taċ-ċelloli HeLa wara 3 ijiem ta 'knockdown tal-proteina GBA. Xi tikek tad-DNA kienu lokalizzati flimkien ma 'histones, li jissuġġerixxu li kienu DNA derivati ​​minn nukleari.

Tikek tad-DNA oħra ma kinux lokalizzati flimkien ma 'histones, li jissuġġerixxu li ma kinux DNA derivat minn nukleari iżda DNA derivat mill-mitokondrija (Figura 1D). Fil-qosor, iż-żieda fit-tikek tad-DNA ektopiċi fiċ-ċitoplasma permezz ta' knockdown tal-GBA kienet mill-inqas parzjalment dovuta għal DNA mitokondrijali li jnixxi mill-mitokondrija.

For more information:1950477648nn@gmail.com