L-Inibizzjoni Lokali Sostnuta tat-Trombina Jippreserva l-Mikroarkitettura Renali U l-Funzjoni Wara l-Bidu ta' Korriment Akut fil-Kliewi

Kuntatt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Ian Vargas et al

Astratt

Korriment akut tal-kliewiIl-ġestjoni (AKI) tibqa 'prinċipalment ta' appoġġ peress li l-ebda aġenti terapewtiċi speċifiċi diretti lejn mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni singulari ma rnexxielhom fi provi kliniċi. Hawnhekk, nirrapportaw li l-inibizzjoni ta 'tagħqid immexxi mit-trombina u sinjalar infjammatorju bl-użu ta' nanopartiċelli perfluworokarboniċi mmirati lejn trombin li jaġixxu lokalment (PFC NP) jipproteġi l-vaskulatura renali u jimmodula b'mod wiesa 'proċessi infjammatorji varji li jikkawżaw korriment ta' iskemija-riperfużjoni renali. Kull PFC NP kien kumpless b'~13,650 kopja tal-inibitur dirett tat-trombina, PPACK (proline-phenylalanine-arginine-chloromethyl-ketone). Ġrieden ittrattati wara l-bidu ta 'AKI b'PPACK PFC NP urew VCAM-1, ICAM-1, prostanoid PGD2, M-CSF, IL{-6, u infiltrati ta' ċelluli mast. L-arkitettura mikrovaskulari, il-membrani tal-kantina tubulari, u l-komponenti tal-fruntiera tal-pinzell ġew ippreservati aħjar. In-nuqqas ta' riperfużjoni tnaqqset kif indikat minn tnaqqis fl-insib taċ-ċelluli ħomor tad-demm u ħadid mhux eme.Kilwail-funzjoni u n-nekrożi tubulari tjiebu f'24 siegħa kontra l-grupp ta 'kontroll mhux ittrattat, li jissuġġerixxi benefiċċju għal inibizzjoni doppja ta' trombożi u infjammazzjoni minn PPACK PFC NP.

Kliem ewlieni: Korriment akut tal-kliewi; Trombożi; Infjammazzjoni; Nanopartiċelli tal-perfluworokarbon; Ħsara tal-bastiment

Cistanche tubulosa jipprevjeni mard tal-kliewi, ikklikkja hawn biex tikseb il-kampjun

Korriment akut tal-kliewi(AKI) hija problema klinika frekwenti kemm fiż-żgħażagħ kif ukoll fl-anzjani b'inċidenza li qed tiżdied u rata ta' mortalità għolja b'mod mhux aċċettabbli li ma tjiebitx b'mod sostanzjali f'għexieren ta' snin.1,2 Is-sindromu tipikament jiżviluppa wara tnaqqis temporanju f'daqqa fil-fluss tad-demm totali jew reġjonali lejn ilkliewibħala konsegwenza ta’ għadd ta’ insulti inklużi pressjoni baxxa, sepsis, tossini, eċċ.3 AKI tevoka panoplija kumplessa ta’ atturi molekulari patofiżjoloġiċi u avvenimenti ta’ sinjalar fi proċess ta’ mard li jevolvi maż-żmien fi stadji.3–6 Mediċi selettivi u speċifiċi mmirati molekulari. terapiji għall-AKI għadhom ma jeżistux, minkejja l-ħtieġa medika urġenti.7 Tabilħaqq, wara snin ta 'sforzi ta' riċerka preklinika u klinika, it-trattamenti attwali jibqgħu essenzjalment ta 'appoġġ.

Hawnhekk nippostulaw li interventi terapewtiċi bbażati fuq nanopartiċelli li jimmiraw lejn it-trombina li jistgħu jżommu l-integrità mikrovaskulari u l-funzjoni tal-barriera u fl-istess ħin inaqqsu s-sinjalar infjammatorju se jibbenefikaw ir-riżultati tal-AKI. It-trombina hija molekula prinċipali ateroġenika u tal-fejqan tal-feriti li tmexxi ħafna molekuli infjammatorji oħra li jipparteċipaw fl-attivazzjoni endoteljali wara korriment bħal NF-κB,8 NADPH oxidase,⁹

u oħrajn permezz ta’ riċetturi attivati ​​bil-protease (PAR-1) kemm fuq l-endotelju kif ukoll fuq il-makrofaġi.10,11 It-tipi kollha taċ-ċelluli fil-kliewiesperjenzaw bidliet fil-mudell tal-espressjoni tal-ġeni, li jinkludu żieda fl-espressjoni ta’ markaturi ta’ ħsara u ġeni tal-iżvilupp kif muri minn Rudman-Melnick et al fi studju ta’ sekwenzar ta’ ċellula waħda ta’ kors ta’ żmien dwar iskemija-riperfużjoni unilateralikliewiinjury.12 Barra minn hekk, studju ta 'annimali gerriema ta' sekwenzar ta 'RNA ta' nukleu wieħed f'korriment bilaterali tal-kliewi ta 'iskemija-riperfużjoni13 identifika popolazzjoni ta' ċelluli tat-tubuli prossimali speċifiċi li jesprimu żejjed ġeni ta 'proinflammation u profibrotic wara korriment ta' iskemija-riperfużjoni sħuna. Dawn ir-riżultati jindikaw li l-infjammazzjoni għandha tirrappreżenta mira terapewtika utli. Għalkemm il-formazzjoni ta 'emboli solidi intravaskulari tidher mhux komuni fl-AKI, aħna ipoteżijna aktar li l-mitigazzjoni tal-attività prokoagulanti mikrovaskulari permezz ta' antagonisti tan-nanopartiċelli anti-trombina potenti li jaġixxu lokalment14–17 tista 'ttejjeb il-fluss tad-demm, tnaqqas "no-reflow", u attenwa s-sinjalar infjammatorju biex tippreserva. funzjoni renali.

Kwistjonijiet kritiċi li jimmilitaw kontra l-applikazzjoni ta' inibituri diretti tat-trombina biex jipprevjenu korriment mill-iskemija-riperfużjoni tal-kliewi (IRI) jinkludu l-effetti sekondarji tossiċi potenzjali tagħhom u r-riskju sistemiku ta' fsada. Rigward it-trombożi, terapewtiċi antikoagulanti konvenzjonali ma kellhomx suċċess b'mod speċjali għalkemm trombomodulin solubbli jista' jeżerċita azzjonijiet rinoprotettivi,18,19 kif jista' jattiva proteina C,20,21 u antitrombina III,22 għalkemm b'kumplikazzjonijiet potenzjali ta' fsada eċċessiv.21 Barra minn hekk, kemm warfarin kif ukoll dabigatran ġew assoċjati ma’ tossiċità renali.^23,24Madankollu, il-fatt li dawn l-approċċi anti-koagulanti għadhom ma rnexxewx klinikament ma jnaqqasx il-valur potenzjali tat-trombina bħala mira, minħabba l-funzjonijiet doppji tiegħu kemm fil-koagulazzjoni kif ukoll fl-infjammazzjoni. Għalkemm m'hemm l-ebda studju kliniku dwar it-trattament b'VEGF għall-AKI, studju prekliniku wera li VEGF huwa medjatur importanti fir-rinoprotezzjoni waqt AKI,25 li jappoġġja aktar il-mekkaniżmu terapewtiku ipotetiku propost tagħna tal-preservazzjoni tal-vini renali fil-protezzjoni tal-funzjoni renali waqt l-AKI.

Żviluppajna pjattaforma stabbli, bijokompatibbli u mhux nefrotossika tan-nanopartiċelli tal-perfluworokarbon (PFC NP) li tinibixxi l-attività tal-protease tat-trombina mingħajr ma tikkawża dijateżi ta’ fsada. qalba u qoxra ta' barra ta' fosfolipidi-surfactant u li jvarjaw fid-dijametru minn ~160-250 nm. Fi studji preliminari riċenti tal-AKI, amministrajna anti-thrombin PFC NP bħala trattament minn qabel biex nikkonfermaw li t-trombina hija mira siewja biex tħaffef l-irkupru tal-funzjoni renali parzjalment billi tippreserva l-integrità mikrovaskulari u tnaqqas in-non-riperfużjoni fl-IRI meta amministrata qabel l-iskemija-riperfużjoni. injury.16 Anti-thrombin PFC NPS jipproteġi wkoll allografts tal-kliewi mill-IRI u juri tnaqqis immarkat fil-perċentwali ta 'nekrożi tubulari parenkimali assoċjata ma' lonġevità tal-kliewi mtejba wara t-trapjant.27 Madankollu, mhuwiex ċar jekk din in-nanopartiċelli kontra t-trombożi tkunx għadha effettiva wara l-bidu ta 'l-AKI, li jirrappreżenta sett kompletament differenti ta' popolazzjonijiet ta 'pazjenti.

Għaldaqstant, fix-xogħol preżenti, fittxejna li testendi l-użu ta 'dan l-approċċ għal AKI stabbilit wara IRI biex niċċaraw il-potenzjal tiegħu għat-traduzzjoni klinika. Għall-prova tal-kunċett, aħna nimpjegaw PPACK (Phe[D]-Pro-Arg-chloromethyl ketone) bħala l-moety antithrombin għall-konjugazzjoni ma 'PFC NP, li wrejna jipprevjeni s-sinjalar tat-trombina u t-trombożi mikrovaskulari f'mudelli ta' aterosklerożi u korriment akut tal-kliewi ( AKI).14–17 PPACK innifsu huwa inibitur tat-trombina dirett u irriversibbli magħruf sew, li huwa forma ħielsa jitneħħa malajr wisq mill-kliewi biex ikun ta’ valur bħala aġent terapewtiku.14,15 Hawnhekk aħna niċċaraw ir-risponsi patofiżjoloġiċi bikrija għal Terapija PPACK PFC NP li tillimita l-avvenimenti ta 'sinjalazzjoni infjammatorja kemm fil-kliewi kif ukoll sistemikament, tippreserva l-mikroarkitettura renali, u tnaqqas il-ħsara vaskulari. Din id-dejta timplika li dan l-approċċ terapewtiku bbażat fuq nanopartiċelli għal AKI kontinwu jista 'jwaqqaf l-istadju għall-iżvilupp kliniku ta' aġent kontra t-trombina li jeżerċita effetti plejotropiċi ristretti lokalment u jista 'jiġi amministrat b'mod sikur fil-fażijiet bikrija ta' AKI.

Metodi

Formulazzjoni tan-nanopartiċelli

Nanopartiċelli tal-perfluworokarbon ġew ifformulati kif deskritt qabel.14 Fil-qosor, taħlita tal-lipidi ta '98.5 mol fil-mija tal-bajd L- - phosphatidylcholine u 1.5 mol fil-mija ta' 1,2-distearoyl snglycero- 3-phosphoethanolamine-N-[ carboxy(polyethylene glycol)-2000] (melħ tas-sodju) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) ġie ppreparat fi kloroform: metanol (3:1), qabel ma jitnixxef biex jifforma film tal-lipidi taħt vakwu. Il-film tal-lipidi (2 fil-mija (wt/vol)) imbagħad ġie kkombinat ma' PFOB (20 fil-mija (vol/vol)) (Exfluor Research Corp.) (gliċerina 1.7 fil-mija (wt/vol)) (Sigma, St. Louis, MO ), u ilma MilliQ, qabel ma jiġi emulsifikat (Microfluidics Inc) fuq is-silġ għal 4 minuti f'20,000 psi. Biex tiffunzjona n-nanopartiċelli bil-konjugazzjoni PPACK, użajna l-metodu ta 'akkoppjar Amine-carboxyl. In-nanopartiċelli (1 ml) l-ewwel tħalltu ma' 2 mg ta' EDCI 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethyl carbodiimide methiodide (Sigma, St. Louis, MO) għal siegħa , qabel ma żżid 12.5 mg PPACK (BACHEM, Torrance, CA) fuq it-temperatura tal-kamra ta 'l-orbital shaker matul il-lejl. Dijaliżi b'cutoff tal-piż molekulari 3000-5000 g/mol (Fisher Scientific, Waltham, MA) saret biex tneħħi l-EDCI u l-PPACK żejda. Metodu ta 'formulazzjoni dettaljat ġie inkluż f'Materjali Supplimentari.

Il-mudell ta 'korriment akut fil-kliewi

Ġrieden adulti C57BL/6 (n=22) għaddew minn iskemija sħuna renali bilaterali-riperfużjoni biex jinduċu ħsara akuta fil-kliewi. L-annimali ġew anestetizzati b'cocktail ta 'ketamine (85 mg/kg) u xylazine (13 mg/kg) qabel ma jgħaddu minn laparotomija biex jipproduċu 17-il minuta ta' iskemija sħuna. Ġiet introdotta inċiżjoni addominali tal-linja tan-nofs biex tesponi kemm l-arterja renali kif ukoll il-vina. Iskemija renali kienet indotta minn klampi okklussivi kemm fuq l-arterja kif ukoll fuq il-vina biex jirrestrinġu l-fluss tad-demm lejn il-kliewi. Il-waqfien b'suċċess tal-fluss tad-demm tal-kliewi ġie kkonfermat viżwalment b'bidla fil-kulur tal-kliewi minn roża għal vjola skur. It-temperatura tal-ġisem tal-ġrieden inżammet f'37 grad bl-użu ta 'sistema ta' tisħin ta 'annimali żgħar. Il-klampi ġew rilaxxati wara 17-il minuta biex jippermettu r-restawr tal-fluss tad-demm tal-kliewi, li ġie kkonfermat mill-bidla tal-kulur tal-kliewi għal roża. Il-ferita kirurġika mbagħad ingħalqet f'saffi u l-annimali ġew immonitorjati u rritornati fil-gaġġa wara moviment liberu. Wara riperfużjoni għal sagħtejn, doża waħda ta' PPACK

PFC NP ({{0}}.5 ml/kg PFC NP; 0.05 mg/kg PPACK) jew sempliċi (kontroll) PFC NP ingħata ġol-vini b'injezzjoni fil-vini tad-denb. Peress li l-istudju preċedenti tagħna wera li doża preventiva waħda ta 'PPACK PFC NP uriet effetti protettivi renali, 16 hawnhekk applikajna trattament ta' doża waħda wara l-bidu ta 'AKI biex nevalwaw l-effett protettiv renali tiegħu. Il-proċeduri u l-protokolli ġew approvati mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali fl-Università ta 'South Florida.

Ġbir u preservazzjoni tat-tessuti 24 siegħa wara l-amministrazzjoni tan-nanopartiċelli, il-ġrieden ġew ewtanizzati, u l-kliewi ġew estratti għall-analiżi. Qabel it-tneħħija tal-kliewi għal evalwazzjonijiet istoloġiċi u molekulari, id-demm inġabar permezz ta’ titqib kardijaku għal analiżi tas-serum downstream, u mbagħad kull ġurdien ġie mxerred b’mod sistemiku b’salina normali (Cat#: 23-535435, Fisher Scientific, Waltham, MA) sakemm ma jibqax. demm ġie mlaħalħa mill-kliewi. Biex jiġbor is-serum, id-demm sħiħ ġie mgħaqqad f'temperatura tal-kamra għal 30 minuta, qabel ma ġie ċentrifugat f'2000 × g għal 10 minuti f'4 gradi. Is-serum miġbur kien maħżun f'-80 grad qabel l-evalwazzjonijiet tan-nitroġenu tal-urea fid-demm u taċ-ċitokini. Għal analiżi istoloġika, il-kliewi mneħħija ġew iffissati f'formalin ta '10 fil-mija, qabel l-ipproċessar tat-tessut, inkorporat fil-paraffin, u sezzjoni. Għall-evalwazzjonijiet tal-eicosanoids, il-kliewi mneħħija ġew isseparati aktar biex jisseparaw il-kortiċi u l-medulla, qabel ma ġew iffriżati snap fin-nitroġenu likwidu u maħżuna f'-80 grad għall-analiżi.

Istoloġija

Tbajja dettaljata tal-istoloġija u metodi ta 'analiżi tad-dejta ġew inklużi fil-Materjali Supplimentari. Is-slajds ġew deparaffinizzati u idratati mill-ġdid qabel it-tbajja' ta' ematossilin u eosina, Tbajja ta' Schiff Aċidu Perjodiku (PAS) (Cat#: ab150680, Abcam, Cambridge, MA), Tbajja tal-Ħadid Blu Prussjan, Tbajja Immunoistokimika biex tivisualizza CD31, VCAM -1, u ICAM-1 espressjoni, u Mast Cell-Eosinophil Staining (Cat#: 150665, Abcam, Cambridge, MA). Id-dejta tat-tbajja tal-kontroll tal-isotip tal-Fenek IgG hija ppreżentata f'Figuri Supplimentari 2 u 3 biex turi l-ispeċifiċità tar-riżultati tat-tbajja' immunoistokimiku. L-immaġini mikroskopiċi kollha ġew akkwistati bl-istess settings tal-qawwa u parametri tad-diġitizzazzjoni. Evalwazzjonijiet mikroskopiċi saru b'mikroskopju Olympus bright-field mgħammar b'kamera diġitali DP27 biex jirreġistra immaġini ta 'sezzjonijiet patoloġiċi b'ingrandiment ta' 20 × jew 40 ×. Twettqet analiżi tad-dejta double-blind fuq l-immaġini kollha.

Nitroġenu urea fid-demm (BUN)

Il-kejl tal-BUN twettaq b'Kit ta' Sejbien Kolorimetriku tan-Nitroġenu Urea (BUN) (Cat#: K024-H5, Arbor Assays, Ann Arbor, MI) wara d-direzzjonijiet tal-manifattur.

Preparazzjoni u analiżi eicosanoid

Eicosanoids ġew estratti permezz ta 'proċess ta' estrazzjoni modifikat u analizzati minn UPLC ESI-MS/MS kif deskritt qabel.28 Metodi dettaljati użati għal dan l-istudju ġew inklużi f'Materjali Supplimentari.

Evalwazzjoni taċ-ċitokini fis-serum

Array ta 'ċitokini apposta nxtrat minn R&D Systems (Minneapolis, MN) u evalwat b'Luminex 200 (Northbrook, IL) wara l-istruzzjonijiet tal-manwal tal-utent.

Statistika

Ir-riżultati huma espressi bħala medja ± żball standard tal-medja (SEM). L-analiżi statistika għal kull esperiment hija miġbura fil-qosor fit-Tabella Supplimentari 1. Intuża ttestjar t fuq żewġ naħat jew ANOVA f'direzzjoni waħda bit-test Scheffe. Twettqu analiżi ta 'korrelazzjoni għal pari ta' metriċi magħżula biex jiġi kkalkulat valur r Pearsonjan. Is-sinifikat statistiku tad-differenzi kien attribwit f'P <>

Riżultati

It-trattament PPACK PFC NP itejjeb il-funzjoni tal-kliewi wara l-bidu takorriment akut fil-kliewi.

Eżami mikroskopiku tad-dehra ġenerali tal-kliewi 24 siegħa wara t-trattament PFC NP ta' wara r-riperfużjoni anti-thrombin (PPACK) indika titjib tal-ħsara f'AKI stabbilita (Figura 1, AB). Il-ħsara f'24 siegħa kienet tinsab prinċipalment fil-junction kortikomedullari tal-kliewi u t-tubuli prossimali kienu preferenzjali bil-ħsara. Il-mudell ta 'korriment kien dak ta' nekrożi tat-tip koagulattiv. Kien hemm infiltrazzjoni infjammatorja minuri fil-punt tal-ħin ta' 24-hrs. Il-kwantifikazzjoni ta 'ħsara tubulari f'sezzjonijiet imtebbgħin H&E (Figura 1, C) wriet li ġrieden ittrattati PPACK PFC NP manifestaw tnaqqis ġenerali ta' 33.95 fil-mija fin-nekrożi tubulari akuta (ATN) vs ġrieden ittrattati NP ta 'kontroll (24.44 ± 1.76 fil-mija vs 37.{{. 16}} ± 4.96 fil-mija rispettivament; P=0.035). Il-Figura 1, D turi li l-ġrieden li qed jirċievu t-trattament urew tnaqqis ta’ 44.03 fil-mija fil-BUN b’24 siegħa (110.96 ± 6.21 mg/dL vs 62.10 ± 8.71 mg/dL għall-kontroll NP vs PPACK PFC NP; P=0.0002) . Dawn ir-riżultati ta 'benefiċċju bikrija jirriflettu l-protezzjoni li osservajna qabel b'reġimi ta' kontra t-trombin ta 'qabel it-trattament f'24 siegħa,16 li jissuġġerixxu li t-trombina tkompli jkollha rwol kritiku fl-evoluzzjoni ta' AKI lil hinn mill-insult iskemiku inizjali.

Il-Figura 2 turi r-risponsi reġjonali tal-membrana tal-kantina u l-istrutturi tal-fruntiera tal-pinzell għal trattament kontra t-trombina bbażat fuq semi-kwantifikazzjoni ta 'tbajja' PAS. Figura 2, AC turi li t-trattament saħħaħ il-perċentwali ta 'glomeruli b'membrani tal-kantina intatti minn 51.43 fil-mija ± 2.61 fil-mija għal 70.00 fil-mija ± 3.09 fil-mija (P=0.00033). Figura 2, DF turi l-ħsara aktar profonda mġarrba mill-bordijiet tal-pinzell tubulari fejn minoranza biss żammet il-bordijiet tal-pinzell kompletament intatti f'24 siegħa. Madankollu, it-trattament tejjeb l-integrità tal-fruntiera tal-pinzell b'50.79 fil-mija (P=0.015). It-trattament naqqas il-firxa ġenerali tal-aggregati tal-proteini b'54.09 fil-mija (P=0.032) (Figura 2, GI), li jista 'jkun mistenni li jipprevjeni l-konġestjoni tubulari biex iżżomm il-funzjoni renali.

It-trattament PPACK PFC NP ippreserva l-integrità vaskulari wara l-bidu tal-IRI

Biex jiġi kkwantifikat il-potenzjal għal PPACK PFC NP biex jipproteġi l-elementi vaskulari, sezzjonijiet tal-kliewi ġew imtebba għal CD31.

Il-Figura 3 turi l-prevalenza akbar ta 'tbajja' CD31 f'24 siegħa fil-kortiċi u l-medulla tal-ġrieden ittrattati b'PPACK NP kontra l-kontroll NP (Figura 3, A u D kontra B u E). F'reġjuni kortikali, it-tbajja 'CD31 kienet tinkludi 4.28 fil-mija ± 0.62 fil-mija tat-trattati vs 1.75 fil-mija ± 0.34 fil-mija għall-annimali ta' kontroll (P=0.0{{ 25}}18), jew żieda relattiva ta’ 144.57 fil-mija (Figura 3, C). F'reġjuni medullari, it-tbajja CD31 kienet tinkludi 3.24 fil-mija ± 0.38 fil-mija għal PPACK NP ittrattat vs 1.91 fil-mija ± 0.29 fil-mija għal annimali ta 'kontroll ittrattati NP (P=0.0073), jew żieda relattiva ta' 88.81 fil-mija (Figura 3, F) . Valutazzjoni mikroskopika tal-integrità vaskulari ma żvelat l-ebda nekrożi artejolari apprezzabbli fil-punt tal-ħin ta' 24-hrs.

Id-dehra taċ-ċelluli ħomor tad-demm (RBC) f'immaġini mikroskopiċi kienet differenti bejn il-ġrieden ittrattati b'PPACK NP u l-kontroll NP f'24 siegħa (Figura 4). Minħabba li l-ġrieden kienu mxerrda b'mod sistemiku biex jaħslu d-demm f'territorji tal-kliewi li jistgħu jiġu mnaddfa, il-preżenza ta 'RBCs indikat jew aggregazzjoni f'kondjuwits mikrovaskulari mxerrda ħażin jew estravasazzjoni interstizjali, jew possibilment it-tnejn. Fil-glomeruli (Figura 4, AB), RBCs ġew osservati fi trofof vaskulari iżda rarament fil-kapsula ta 'Bowman f'24 siegħa. It-trattament naqqas il-prevalenza glomerulari RBC b'40.78 fil-mija (P=0.007) (Figura 3, C). Fil-medulla (Figura 4, DE), ma kienx possibbli li jiġi assenjat post definittiv għall-RBCs ibbażat fuq tbajja' H&E, iżda t-trattament naqqas il-prevalenza ġenerali tal-RBC b'34.92 fil-mija (P=0.049) (Figura 4, F) .

Biex tiddelinea aktar il-konsegwenzi tad-depożizzjoni u l-insib ta 'RBC, tbajja' tal-ħadid mhux heme saret bil-Prussian Blue. Tbajja tal-ħadid kienu pożittivi kemm fl-istrutturi ċellulari glomerulari kif ukoll tubulari. It-trattament naqqas il-prevalenza tal-ħadid kemm fil-kortiċi (tnaqqis fil-mija 44.23; P=0.022) (Figura 5, AC) u medulla (tnaqqis fil-mija 50.50; P=0.006) (Figura 5, DF) ) f'24 siegħa, konsistenti mal-effett tat-trattament kontra t-trombina fuq l-insib RBC.

It-trattament PPACK PFC NP naqqas l-infjammazzjoni lokali u sistemika wara l-bidu ta 'AKI

Biex niċċaraw ir-rwol tat-trombina fis-sostenn tal-attivazzjoni endoteljali u l-infjammazzjoni lokali fil-kliewi, aħna kkwantifikajna kemm ICAM-1 kif ukoll VCAM-1. L-espressjoni VCAM-1 fil-kortiċi ma nbidlitx bit-trattament PPACK (Figura 6, AC). Madankollu, l-espressjoni tal-VCAM- 1 fil-medulla kienet irregolata sostanzjalment b'65.25 fil-mija (P=0.011) wara t-trattament (Figura 6, DF). Espressjoni mtejba ta 'ICAM endoteljali-1 kienet osservata kemm fil-kortiċi kif ukoll fil-medulla fil-ġrieden ta' kontroll ittrattati b'NP (Figura 7, B, u E). ICAM-1 kien regolat 'l isfel bit-trattament b'36.89 fil-mija (P=0.0083) fil-kortiċi (Figura 7, AC) u b'31.17 fil-mija (P=0.030) fil-medulla (Figura 7) , DF).

Biex tiddelinea r-rwol tat-trombina fir-regolazzjoni tal-lipidi bijoattivi infjammatorji fl-evoluzzjoni bikrija ta 'AKI, wettaqna analiżi lipidomiċi fuq tessuti estratti separatament mill-kortiċi u l-medulla f'24 siegħa. It-Tabelli Supplimentari 2 u 3 jelenkaw l-analiżi molekulari speċifiċi, ir-reġjun tal-kliewi, u t-tipi tas-suġġett (AKI ittrattat, AKI mhux ittrattat, jew normali mingħajr AKI). Tabella Supplimentari 4 telenka l-bidla perċentwali medja mil-linja bażi normali b'saħħitha għal kull lipidu fil-kortiċi u l-medulla. B'mod ġenerali, iż-żewġ reġjuni kortikali u medullari wrew espressjoni devjata ta 'kważi l-lipidi bijoattivi kollha evalwati meta mqabbla mal-kliewi normali (Tabelli Supplimentari 2 u 3), u kważi l-lipidi ta' sinjalazzjoni kollha kellhom xejra li ċċaqilqu lejn livelli normali wara terapija anti-trombina. Bħala metrika simplifikata għall-infjammazzjoni reġjonali (Tabella Supplimentari 4), il-bidla perċentwali medja għal-lipidi kollha kienet 65.13 fil-mija u 38.60 fil-mija għall-kortiċi u 136.42 fil-mija u 90.76 fil-mija għall-medulla fil-gruppi ta 'kontroll NP u PPACK NP rispettivament, li jindika li l-infjammazzjoni f' medulla qabeż dak għall-kortiċi skond analiżi lipidomic.

Għalkemm ix-xejriet ta' soluzzjoni kienu evidenti wara t-trattament għal kważi l-ispeċi kollha tal-lipidi, ħafna ma laħqux sinifikat statistiku. Madankollu, notevoli f'dawn l-assaġġi kien ir-rispons sinifikanti ta 'PDG2, li naqas b'47.62 fil-mija fil-kortiċi (Figura 8, A) (P=0.012) u 50.21 fil-mija fil-medulla (Figura 8, B) ( P=0.0249), rispettivament. Ibbażat fuq din l-osservazzjoni, aħna kkwantifikajna l-prevalenza ta 'ċelluli mast li jinfiltraw, li huma sors prominenti magħruf ta' PGD2 infjammatorju. Figura 8, CE tindika trattament b'antitrombina kontenut imnaqqas taċ-ċelluli mast fis-sezzjoni kollha tal-kliewi b'54.27 fil-mija (P=0.002) f'24 siegħa. Dan jaqbel mat-tnaqqis osservat f'VCAM-1 u ICAM-1 (Figuri 6 u 7) bħala ċelluli mast attivati ​​li jesprimu LFA-1 (antiġen 1 assoċjat mal-funzjoni tal-limfoċiti) u VLA (tard ħafna antiġen) molekuli ta 'adeżjoni speċifiċi għat-tessuti ligati għat-trasmigrazzjoni f'tessuti infjammati.29,30 Barra minn hekk, kimokini/ċitokini assoċjati maċ-ċelluli mast bħal M-CSF u IL-6 kienu regolati b'mod konkomitanti minn nanopartiċelli anti-trombina. Wara t-trattament PPACK NP, is-serum M-CSF u IL-6 tnaqqsu b'36.60 fil-mija (P=0.0448) u 27.44 fil-mija (P=0.0454), rispettivament, meta mqabbla ma' il-grupp ta 'kontroll mhux ittrattat (Figura 8, F).

Mis-sett tad-dejta ħarġu diversi korrelazzjonijiet interessanti relatati mal-infiltrazzjoni taċ-ċelluli mast, il-ħsara vaskulari u l-funzjoni renali għall-gruppi totali kkombinati ta 'annimali ttrattati u mhux ittrattati kemm fir-reġjuni tal-kortiċi kif ukoll tal-medulla. Relazzjoni indiretta kienet tappartjeni bejn BUN u CD31 (r=0.75, P=0.000009), li tindika li l-insuffiċjenza renali aggravata kienet assoċjata ma 'kompromess vaskulari akbar (Figura Supplimentari 1, A). Kienet teżisti relazzjoni diretta bejn in-numri taċ-ċelluli mast u BUN (r=0.71, P=0.004), li tindika tnaqqis progressiv

tal-funzjoni tal-kliewi flimkien ma 'infiltrazzjoni taċ-ċelluli mast (Figura Supplimentari 1, B). Kienet osservata relazzjoni indiretta bejn in-numri taċ-ċelluli mast u CD31 (r=0.59, P=0.002), li tindika li l-ħsara vaskulari marret għall-agħar b'żieda fl-infiltrazzjoni taċ-ċelluli mast (Figura Supplimentari 1, C). Fl-aħħarnett, ġiet osservata relazzjoni diretta bejn in-numru taċ-ċelluli mast u l-espressjoni globali ICAM-1 (r=0.54, P=0.008), konsistenti ma 'aspettattiva li molekuli ta' adeżjoni vaskulari regolati 'l fuq jippromwovu homing taċ-ċelluli mast għal tessuti midruba (Figura Supplimentari 1, D). Relazzjoni diretta saħansitra eqreb kienet tirrigwarda l-espressjoni VCAM medullari u l-għadd taċ-ċelluli mast (r=0.69, P=0.009; data mhux murija).

Diskussjoni

Minkejja għexieren ta 'snin ta' sforzi fit-tfittxija ta 'ġestjoni effettiva ta'korriment akut fil-kliewi, current treatments remain essentially supportive. Failure of single agents tested in numerous AKI clinical trials now prompts a renewed search for agents that might exert more pleiotropic or broad-spectrum therapeutic actions for preserving renal function.3–7 The present data indicate that targeting thrombin with locally acting nanoparticle agents represents one such approach to accelerating functional recovery, preserving vascular and tubular integrity, and modulating inflammation. The exceptional local potency of PPACK PFC NP against thrombin with normal bleeding times and clotting parameters by 30-60 min after injection14,15 is due to the fact that each nanoparticle situates >104 frazzjonijiet kontra t-trombina f'siti ta 'trombożi mikrovaskulari u attivazzjoni ta' PAR-1 (deskrizzjoni addizzjonali f'Materjali Supplimentari), strateġija ta 'amplifikazzjoni li ma tistax tinkiseb bl-istokjometrija 1:1 ta' aġenti ħielsa konvenzjonali li jinibixxu t-trombina, inkluż PPACK.

Is-sett tad-dejta preżenti juri li l-korriment akut tal-iskemija-riperfużjoni tal-kliewi mhix kompluta sa 2 sigħat wara r-riperfużjoni u t-trombina tibqa’ mira ta’ valur għoli fit-tessuti bil-ħsara wara r-riperfużjoni. Sforzi preċedenti mill-assoċjati ta' Molitoris u oħrajn jappoġġjaw l-isforz kontinwu biex jitfasslu metodi sikuri għall-inibizzjoni diretta tat-trombina fl-AKI.^18,31–33Mill-ħidma preċedenti tagħna qabel it-trattament tal-AKI b'PPACK PFC NP, nafu li n-nanopartiċelli kontra t-trombina jipprovdu sorveljanza sostnuta kontra trombina attivata lokalment li żżomm l-integrità vaskulari, attenwaw b'mod notevoli l-fenomenu ta' no-reflow b'~50 fil-mija, u jreġġa' lura malajr id-disfunzjoni renali b'24. hrs.16 Meħuda flimkien mad-dejta preżenti, huwa ċar li n-nanopartiċelli anti-trombina jkomplu jiksbu aċċess għal tessuti tal-kliewi bil-ħsara iżda vijabbli sew wara r-riperfużjoni biex jipprevjenu ħsara vaskulari u tubulari addizzjonali. Rapporti preċedenti li ġrieden knockout PAR-1 isofru korriment imnaqqas ta' iskemija-riperfużjoni renali jaqblu wkoll mal-istrateġija tagħna ta' inibizzjoni farmakoloġika qawwija u persistenti tal-attivazzjoni ta' PAR-1 fl-AKI permezz tal-inibizzjoni tat-trombina.³⁴

Il-protezzjoni tal-istrutturi vaskulari tal-kliewi (Figura 3), il-bord tal-pinzell, u l-membrana tal-kantina (Figura 2) ipprovduta minn antithrombin PFC NP, flimkien mad-dejta preċedenti tagħna li turi li t-terapija kontra t-trombina twassal għal titjib 2× fil-perfużjoni fir-reġjuni kortikomedullari f’ AKI,16 jikkonferma benefiċċju emerġenti tat-titjib tal-mikroanġjopatija renali. Għalkemm in-natura eżatta tal-ħsara lill-kapillari u l-venules peritubulari ma ġietx spjegata għal kollox f'dawn il-punti ta' żmien bikrin wara r-riperfużjoni, huma deskritti permeabilità mtejba tal-bastimenti u attivazzjoni ta' caspase proapoptotic endoteljali-3, kif ukoll it-tnaqqis tas-sinjal għal CD31 (PECAM),35 li jirregola l-integrità tal-junction endoteljali.36 Is-sintesi u l-espressjoni ta 'CD31 fil-junctions taċ-ċelluli huma regolati 'l isfel minn ċitokini infjammatorji li huma espressi minn ċelluli mast attivati ​​(TNF- u IFN- ), li jtejbu l-permeabilità vaskulari.^37,38Barra minn hekk, l-induzzjoni tal-fattur tat-tessut permezz tat-trombina permezz tal-attivazzjoni PAR-1 hija rregolata minn CD31, u l-ġrieden knockout CD31 juru żieda fl-epitelju tubulari u apoptosi endoteljali, żieda fid-depożizzjoni tal-fibrina, u espressjoni tal-fattur tat-tessut.³⁹Għaldaqstant, il-kapaċità ta 'PPACK PFC NP li jippreserva l-espressjoni CD31 tista' tkun vitali biex tillimita l-attivazzjoni kontinwa tal-kaskata tat-tagħqid u biex tinżamm l-integrità endoteljali.

Teżisti rabta lokali bejn l-infjammazzjoni u l-koagulazzjoni fil-fażi ta 'estensjoni ta' AKI li tirrestrinġi l-perfużjoni kapillari medullari ta 'barra li tikkawża iskemija/ipoksja reġjonali fit-tul, li mbagħad tfixkel it-tiswija u r-riġenerazzjoni taċ-ċelloli tubulari. tal-medulla ta' barra fl-AKI jindika li l-ħsara fil-bastiment tkompli u s-sinjalar tal-VEGF huwa mrażżan.^40–42Barra minn hekk, hemm evidenza abbundanti li r-rarefazzjoni vaskulari twassal għal ipoksja kronika li twassal għal fibrożi tubulointerstizjali progressiva.⁴³Fil-mudell ta 'iskemija / korriment akut tal-firien, it-tubuli prossimali huma partikolarment sensittivi għall-ipoksja manifesta minn sloughing taċ-ċelluli tat-tubuli u anke diżintegrazzjoni totali, li tipproduċi mortalità eċċessiva. mard kroniku tal-kliewi.⁴⁶

Id-dejta tagħna tikkonferma wkoll li l-ħsara vaskulari tippromwovi l-insib RBC u d-depożizzjoni mhux heme (Figuri 4 u 5) li jistgħu jaggravaw il-mard kroniku tal-kliewi,⁴⁷iżda li huwa suġġett għal terapija antitrombina. Is-sors tal-ħadid tat-tessut kemm fiċ-ċelluli glomerulari kif ukoll fit-tubulari (Figura 5) bla dubju oriġina minn tqassim tal-RBC f'dawk it-territorji bħala konsegwenza ta 'emorraġija u/jew trombożi mikrovaskulari, konsistenti ma' stampa ta 'kompromess vaskulari li huwa mtaffi minn terapija anti-trombina. Għaldaqstant, approċċi li jippreservaw l-integrità vaskulari jistgħu jirrappreżentaw l-ewwel pass kritiku lejn iż-żamma tal-linji tal-provvista għal sottostrati nutrittivi li jiffaċilitaw fejqan aktar mgħaġġel ta 'strutturi tubulari bil-ħsara.

Interessanti, PPACK PFC NP jidher li joffri protezzjoni bikrija ta 'strutturi vaskulari u jnaqqas diversi markaturi ta' infjammazzjoni (Figuri 6 u 7; Tabelli Supplimentari 2-4) kemm fil-kortiċi kif ukoll fil-medulla. Fi studji sperimentali tradizzjonali ta 'AKI, il-kortiċi huwa preżunt li huwa aktar reżistenti għall-ħsara milli hija l-medulla minħabba domanda metabolika aktar baxxa, iżda l-attivazzjoni endoteljali u l-infjammazzjoni patofiżjoloġika jidhru mifruxa kif evidenzjat mill-assaġġi lipidomiċi u istokimiċi tagħna. Barra minn hekk, id-depożizzjoni wiesgħa ta 'ħadid mhux heme bħala prodott sekondarju tat-tqassim ta' RBC maqbuda kemm fil-kortiċi kif ukoll fil-medulla - u l-mitigazzjoni tagħha minn nanopartiċelli anti-trombina - taqbel ma 'mudell ġeneralizzat ta' infjammazzjoni u ħsara anke jekk il-kortiċi jista 'jkun aktar. affettwati b'mod temporanju u ħafif milli hi l-medulla matul il-kors tal-marda.

Ir-rispons bikri sorprendenti tal-infiltrazzjoni taċ-ċelluli mast fi żmien 24 siegħa (Figura 8) jissuġġerixxi rwol importanti għal ċelloli infjammatorji minbarra atturi tradizzjonali bħal newtrofili u makrofaġi. Iċ-ċelloli mast huma tipikament meqjusa bħala medjaturi ta 'risponsi allerġiċi, iżda hemm korp ta' letteratura dwar l-implikazzjonijiet patofiżjoloġiċi tagħhom fil-ħsara renali akuta u kronika.^48–52 Għalkemm in-newtrofili huma rispons bikri għall-ħsara fit-tessuti, il-makrofaġi ma jidħlux fl-istampa qabel aktar tard fil-proċess infjammatorju, li jissuġġerixxi li ċ-ċelloli mast qed ikollhom rwol importanti fil-fażi bikrija ta 'AKI. Tabilħaqq, Danelli et al wrew li d-degranulazzjoni taċ-ċelluli mast isseħħ kmieni fl-AKI u li t-tnaqqis taċ-ċelluli mast fil-ħin tal-induzzjoni tal-AKI iżda mhux 48 siegħa wara jagħti effett ta 'benefiċċju fit-tul fuq il-funzjoni renali, atrofija u fibrożi.⁵³Konklużjonijiet simili ntlaħqu minn Tong et al fi proċeduri ta’ mast cell stabbilizzati bil-cromolyn imwettqa qabel ir-riperfużjoni.54 Summers wera li ġrieden defiċjenti ta’ mast cell (KitW-sh/W-sh) isofru inqas korriment iskemiku minn tipi selvaġġi u li huma jelaboraw livelli mnaqqsa ta 'chemoattractants lewkoċiti.⁵⁵

Iċ-ċelloli mast jesprimu riċetturi attivati ​​mill-protease Iċ-ċelloli mast jesprimu riċetturi attivati ​​mill-protease (PARs) li jistgħu jiġu attivati ​​bit-trombina biex jiddegranulaw u joħorġu għadd ta’ chemokines preformati, ċitokini, u lipidi bijoattivi.56–58 It-trombina tikkawża wkoll adeżjoni taċ-ċelluli mast mal-matriċi. proteini (eż. fibronectin) u espressjoni ta' interleukin (eż. IL-6) permezz ta' interazzjonijiet PAR- 1.⁵⁹Wara l-inibizzjoni tat-trombina, osservajna livelli mnaqqsa ta 'PGD2 li huma konsistenti ma' tnaqqis relattiv ta 'ċelluli mast minħabba li PGD2 huwa eicosanoid bijoattiv prinċipali mnixxija minn ċelluli mast f'reazzjonijiet ta' tip allerġiku.60 Barra minn hekk, ir-regolazzjoni 'l isfel ta' ICAM -1 u VCAM-1 wara trattament ta 'nanopartiċelli kontra t-trombina huwa konsistenti ma' infiltrazzjoni mnaqqsa taċ-ċelluli mast peress li jesprimu LFA-1 u VLA u jutilizzaw molekuli ta 'adeżjoni biex jiksbu dħul fit-tessut.^29,30

Rwol patoġeniku speċifiku għal PGD2 innifsu fl-evoluzzjoni tal-IRI renali s'issa ma ġiex deskritt sa fejn nafu tagħna, iżda jservi bħala bijomarkatur ċar għall-attivazzjoni taċ-ċelluli mast.⁵²Fl-infjammazzjoni pulmonari, PDG2 intwera li jtejjeb l-espressjoni taċ-ċitokini proinfjammatorji tal-makrofagi permezz tar-riċetturi tiegħu (DP1 u DP2), li mbagħad jattivaw l-influss tan-newtrofili.61 L-osservazzjoni tagħna ta 'żieda ta' M-CSF u IL-6 (Figura 8) f'AKI li huma regolati 'l isfel minn PPACK PFC NP permezz ta' soppressjoni taċ-ċelluli mast ikunu konsistenti ma 'tali mekkaniżmu putattiv. Madankollu, peress li ċ-ċelluli mast huma magħrufa li jirrilaxxaw għadd ta 'fatturi potenzjalment ta' ħsara għall-funzjoni renali,51,52 kwalunkwe numru ta 'determinanti responsabbli jistgħu jkunu suġġetti ta' studju futur għall-kontroll mill-inibizzjoni tat-trombina jew aġenti oħra mmirati molekulari. Għaldaqstant, interventi li jtardjaw l-attrazzjoni u d-degranulazzjoni bikrija taċ-ċelluli mast jistgħu jkunu protettivi ħafna tal-integrità vaskulari u l-funzjoni tal-kliewi kif manifestat minn inibizzjoni lokali tat-trombina fid-dejta preżenti.

Limitazzjonijiet

Dawn l-istudji ma kinux iddisinjati biex jiċċaraw il-benefiċċji sostnuti tal-inibizzjoni tat-trombina peress li l-mudell AKI huwa ffokat fuq protezzjoni bikrija kontra IRI u mekkaniżmi relatati. Jekk benefiċċji fit-tul ta 'doża waħda ta' nanopartiċelli anti-trombina jistgħux jillimitaw il-progressjoni għal mard kroniku tal-kliewi huwa lil hinn mill-ambitu tar-rapport preżenti u jkun jeħtieġ mudell u ipoteżi sperimentali differenti. Barra minn hekk, it-tieqa temporali ta 'opportunità għall-kisba ta' rkupru funzjonali billi jinibixxi t-trombina fil-fażi ta 'estensjoni ta' AKI mhix indirizzata hawnhekk iżda hija suġġett ta 'interess għal studji futuri. Sa liema punt l-effetti ta' benefiċċju prinċipali tal-inibizzjoni lokali tat-trombina fl-AKI huma dovuti għas-soppressjoni tal-attivazzjoni tal-mast cell jibqa' konġetturali iżda jista' jiġi ttestjat fi studji mekkanistiċi dettaljati sussegwenti. Madankollu, għalkemm il-korrelazzjonijiet lineari sinifikanti fost in-numri taċ-ċelluli mast, CD31, u BUN mhux neċessarjament jistabbilixxu kawża u effett, il-konkordanza tagħhom tappoġġja relazzjoni qawwija bejn iċ-ċelluli mast u l-ħsara vaskulari fl-istadji bikrija tal-IRI tal-kliewi. Fl-aħħarnett, l-użu ta 'PPACK bħala l-parti kontra t-trombina huwa biss eżempju wieħed ta' ingredjent terapewtiku konjugabbli li jista 'jitwassal b'mod sikur u lokalment fuq nanostruttura biex irażżan is-sinjalar tat-trombina.

1. Benoit SW, Devarajan P. Korriment akut tal-kliewi: farmakoterapiji emerġenti fi provi kliniċi kurrenti. Pediatr Nephrol 2018;33:779-87.

2. Chen H, Busse LW. Terapiji ġodda għal ħsara akuta fil-kliewi. Kidney Int Rep 2017;2:785-99.

3. Bonventre JV, Yang L. Patofiżjoloġija ċellulari ta 'ħsara akuta fil-kliewi iskemika. J Clin Invest 2011;121:4210-21.

4. Sharfuddin AA, Molitoris BA. Patofiżjoloġija ta 'korriment iskemiku akut fil-kliewi. Nat Rev Nephrol 2011;7:189-200.

5. Bonventre JV. Patofiżjoloġija ta 'AKI: korriment u tiswija normali u anormali. Contrib Nephrol 2010;165:9-17.

6. Zuk A, Palevsky PM, Fried L, Harrell Jr FE, Khan S, McKay DB, et al. Negħlbu l-ostakli tat-traduzzjoni f'korriment akut fil-kliewi: rapport minn workshop NIDDK. Clin J Am Soc Nephrol 2018;13:1113-23.

7. Zuk A, Bonventre JV. Avvanzi riċenti fil-ħsara akuta tal-kliewi u l-konsegwenzi u l-impatt tagħha fuq il-mard kroniku tal-kliewi. Curr Opin Nephrol Hypertens 2019;28:397-405.

8. Rahman A, Fazal F. Imblukkar NF-kappaB: kwistjoni infjammatorja. Proc Am Thorac Soc 2011;8:497-503.

9. Jagadeesha DK, Takapoo M, Banfi B, Bhalla RC, Miller Jr FJ. It-transattivazzjoni Nox1 tar-riċettur tal-fattur tat-tkabbir epidermali tippromwovi t-twaqqigħ ta 'N-cadherin u l-migrazzjoni taċ-ċelluli tal-muskoli lixxi. Cardiovasc Res 2012;93:406-13.

10. Lopez ML, Bruges G, Crespo G, Salazar V, Deglesne PA, Schneider H, et al. It-trombina tinduċi b'mod selettiv it-traskrizzjoni tal-ġeni fil-monoċiti umani involuti fl-infjammazzjoni u l-fejqan tal-feriti. Thromb Haemost 2014;112:992-1001.

11. Borissoff JI, Spronk HM, Heeneman S, ten Cate H. It-trombina hija attur ewlieni fil-labirint tal-'koagulazzjoni-ateroġenesi'? Cardiovasc Res 2009;82:392-403.

12. Rudman-Melnick V, Adam M, Potter A, Chokshi SM, Ma Q, Drake KA, et al. Profiling ta 'ċellula waħda ta' AKI f'mudell murin jiżvela firem traskrizzjoni ġodda, fenotip profibrotiku, u crosstalk epiteljali għal stromali. Ġurnal tas-Soċjetà Amerikana tan-Nefroloġija: JASN 2020;31:2793-814.

13. Kirita Y, Wu H, Uchimura K, Wilson PC, Humphreys BD. Il-profil taċ-ċelluli tal-ħsara akuta fil-kliewi tal-ġurdien jiżvela risponsi ċellulari kkonservati għall-ħsara. Proc Natl Acad Sci USA 2020;117:15874-83.

14. Myerson J, He L, Lanza G, Tollefsen D, Wickline S. Nanopartiċelli tal-perfluorokarbon li jinibixxu t-trombina jipprovdu strateġija ġdida għat-trattament u l-immaġini ta 'reżonanza manjetika ta' trombożi akuta. Ġurnal ta 'trombożi u emostasi: JTH 2011;9:1292-300.

15. Myerson JW, He L, Allen JS, Williams T, Lanza G, Tollefsen D, et al. Nanopartiċelli li jinibixxu t-trombina malajr jikkostitwixxu uċuħ anticlotting versatili u skoperti. Nanoteknoloġija 2014;25:395101.

16. Chen J, Vemuri C, Palekar RU, Gaut JP, Goette M, Hu L, et al. In-nanopartiċelli ta 'antitrombina jtejbu r-riperfużjoni tal-kliewi u jipproteġu l-funzjoni tal-kliewi wara korriment ta' iskemija-riperfużjoni. Am J Physiol Renal Physiol 2015;308:F765-73