Stabbilizzazzjoni Simultanja taċ-Ċitoskeletru ta' Actin f'Ċelluli Multipli speċifiċi għal Nephron Tħares Il-Kliewi minn Korriment Diversi

Mard kroniku tal-kliewiukorriment akut fil-kliewihuma mekkanistikamentmard distint tal-kliewi. Filwaqt li mard kroniku tal-kliewi huma assoċjati makorriment tal-podoċiti, korriment akut fil-kliewijaffettwa ċ-ċelloli epiteljali tubulari tal-kliewi. Minkejja dawn id-differenzi,karatteristika kardinalitat-tnejnmard tal-kliewi akut u kronikuhuwa ċ-ċitoskeletru tal-actin mhux regolat. Urejna danattivazzjoni farmakoloġika ta' GTPase dynaminittejjeb il-ħsara tal-podoċiti fimudelli murini ta 'mard kroniku tal-kliewiminnpromozzjoni tal-polimerizzazzjoni tal-aktina. Hawnhekk nistabbilixxu r-rwol tad-dynamin fil-modulazzjoni tal-ebusija u l-polarità ta 'ċelluli epiteljali tubulari tal-kliewibilli crosslinking filamenti actin f'netwerks ramifikati. L-attivazzjoni tal-kapaċità ta' crosslinking tad-dynamin minn agonist ta' molekula żgħira tistabbilizza l-kortiċi tal-actomyosin tal-membrana apikali kontra l-ħsara, li mbagħadjippreserva l-funzjoni renalif'diversi mudelli murini ta 'korriment akut fil-kliewi. Notevolment, agonist tad-dinamina simultanjament attenwa podocyte ukorriment tubularifil-mudell murini ġenetiku tas-sindromu ta 'Alport. L-istudju tagħna jipprovdi evidenza għall-fattibilità u jenfasizza l-benefiċċji ta’ terapiji ħolistiċi ġodda li jipproteġu n-nephron.

IKKLIKKJA HAWN BIEX TAF FORMULAZZJONI TAL-ĦEJAR TA' CISTANCHE TAJBA GĦAL KORRIMENT AKUT TAL-KLIEI

Il-kawżi ewlenin ta’ ħsara akuta fil-kliewi(AKI) humaiskemija, ipoksja, jewnefrotossiċità1. Filwaqt li jista' jitreġġa' lura, l-AKI tirrappreżenta problema sinifikanti tal-kura tas-saħħa b'mortalità għolja u mingħajr trattament definittiv. Irrispettivament mill-etjoloġija tagħha, l-AKI primarjament jweġġa 'ċelluli epiteljali polarizzati tat-tubuli renali li l-mikrovilli apikali tagħhom jiffurmaw il-fruntiera tal-pinzell tubulari li tipparteċipa fil-koordinazzjoni tal-elettrolit essenzjali u t-trasport tal-ilma2. Karatteristika morfoloġika bikrija tal-AKI hija t-telf tal-bord tal-pinzell u l-polarità taċ-ċelluli minħabba t-tqassim tal-kortiċi tal-actomyosin fil-membrana apikali1.

L-istabbiliment u l-manutenzjoni tal-polarità taċ-ċelluli jinvolvu kaskati tas-sinjalar, traffikar tal-membrana, u dinamika ċitoskeletali, li kollha huma kkoordinati ħafna3. L-organizzazzjoni tal-membrana apikali hija ddeterminata fil-biċċa l-kbira mill-arkitettura tan-netwerks tal-actomyosin4, li tistabbilixxi l-ebusija tal-kortiċi, u b'hekk tiffaċilita l-aggruppament tal-proteini tal-polarità. Filwaqt li l-muturi myosin II huma meqjusa bħala l-ġeneratur primarju tal-ebusija kortikali5,6, l-arkitettura tal-kortiċi tal-actomyosin hija stabbilita minn numru kbir ta 'proteini li jorbtu l-actin (ABPs)7.

Minbarra l-ABPs magħrufa, il-bord tal-pinzell tat-tubuli renali huwa arrikkit ħafna f'dynamin8, GTPase magħruf l-aktar għar-rwol tiegħu fl-endoċitosi9. Dynamin għandu propensità intrinsika li jinġabar fi stati multipli ta 'oligomerizzazzjoni bħal dimeri, tetrameri, ċrieki u spirali9. Aħna identifikajna għall-ewwel darba interazzjonijiet diretti dynamin-actin10 u wrejna li l-oligomerizzazzjoni tad-dynamin tirregola l-polimerizzazzjoni tal-actin f'podocytes11,12, ċelluli speċjalizzati essenzjali għas-selettività tal-filtru tal-kliewi. Bl-użu ta 'mudelli murini ta' CKD, urejna li l-attivazzjoni ta 'polimerizzazzjoni ta' actin dipendenti fuq id-dinamina treġġa' lura l-ħsara tal-podoċiti billi tirrestawra l-istruttura u l-funzjoni unika tagħhom12.

Hawnhekk nuru li fiċelluli epiteljali tubulari tal-kliewi, dynamin cross-links actin filamentous (F-actin) f'netwerks ramifikati. Il-kapaċità ta 'cross-linking ta' Dynamin hija definita mill-istat ta 'oligomerizzazzjoni tagħha u t-tul ta' F-actin. L-attivazzjoni farmakoloġika tal-oligomerizzazzjoni tad-dinamina tikkontrobatta l-AKI billi tistabbilizza n-netwerks tal-actin u għalhekk l-integrità taċ-ċelluli, li tipproteġi parzjalment iċ-ċelloli epiteljali renali minn korriment indott mill-istress ossidattiv. L-istudju tagħna jidentifika l-kortiċi actomyosin tal-membrana apikali taċ-ċellula tubulari tal-kliewi bħala mira drogabbli fl-AKI permezz tad-dinamina bħala prokura

Riżultati Dynamin oligomerization tistabbilixxi l-ebusija u l-morfoloġija tal-membrana apikali.

Biex neżaminaw ir-rwol tal-interazzjonijiet dynamin-actin fiċ-ċelloli epiteljali tubulari tal-kliewi polarizzati, użajna Bis-T-23, attivatur allosteriku ta 'oligomerizzazzjoni tad-dinamina dipendenti fuq l-actin f'sistema rikostitwita13, fiċ-ċelloli11,13, u fil- organiżmu kollu12. Il-fenotipi ċellulari ġew ivvalutati fiċ-ċelloli Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) billi ssegwi l-istatus tal-F-actin u l-mudell tat-tbajja’ ta’ proteina ta’ junction stretta zonula occludens-1 (ZO-1), li hija meqjus bħala bijomarkatur tal-polarità taċ-ċelluli. Cytochalasin D (CytoD) u latrunculin A (LatA), inibituri magħrufa tal-polimerizzazzjoni ta 'l-actin, naqsu l-livelli ta' F-actin, u indoxxew tbajja discontinua ta 'ZO-1 (Fig. Supplimentari 1a). B'kuntrast, Bis-T-23 indotta żieda żgħira fil-livelli ta' F-actin mingħajr ebda effett fuq it-tbajja' ta' ZO-1. Żieda ta' Bis-T-23 qabel iżda mhux wara LatA, livelli F-actin parzjalment ippreservati u polarità taċ-ċelluli. La l-vettura DMSO u lanqas l-inibitur tad-dinamina dynole14 ma wrew xi effett (Fig. 1a Supplimentari).

Il-mikroskopija tal-elettroni tal-iskannjar (SEM) ippermettietna naraw alterazzjonijiet indotti mid-droga tal-morfoloġija taċ-ċelluli li tiffoka fuq il-membrana apikali (Fig. 1a). L-għoli medju taċ-ċellula MDCK kien 11 ± 2 µm, u t-tul medju tal-mikrovilli kien 0.63 ± 0.2 µm (Tabella 1), li hija fil-medda osservata fil-kliewi15. LatA naqas l-għoli taċ-ċellula, u t-tul tal-mikrovilli u biddel il-mikrovilli mqassma b'mod uniformi fi gruppi, filwaqt li Bis-T-23 indotta l-effetti opposti (Tabella 1, Fig. 1a). Meta miżjuda qabel LatA, Bis-T-23 ippreserva parzjalment l-għoli taċ-ċellula u t-tul tal-mikrovilli. Peress li l-mikrovilli juru kontroll exquisit tat-tul definit mill-actin kortikali fil-bażi tagħhom16, din id-dejta tipprovdi evidenza li Bis-T-23 immodifika l-kortiċi tal-actomiosin fil-membrana apikali.

Biex niddeterminaw l-effett eżatt li kellu Bis-T-23 fuq l-actin kortikali, aħna viżwalizzajna l-kortiċi tal-actomijosin fi ħdan il-lamellipodia billi tuża mikroskopija elettronika replika tal-platinu (PR-EM). LatA naqqas id-densità tan-netwerks ta 'l-actin, u dan l-effett kien parzjalment imħassar biż-żieda ta' Bis-T -23 qabel LatA (Fig. 1b). Hekk kif LatA jaċċellera d-depolimerizzazzjoni tal-filament tal-actin billi jissekwestra l-monomeri tal-actin, imbagħad eżaminajna jekk il-preservazzjoni osservata tal-kortiċi tal-actinju minn Bis-T-23 kinitx dovuta għall-effett pożittiv tagħha fuq il-polimerizzazzjoni tal-actin. B'kuntrast mal-istimulazzjoni qawwija tal-polimerizzazzjoni tal-actin osservata fl-estratti taċ-ċelluli podoċiti10,11, Bis-T -23 żiedet biss marġinalment il-polimerizzazzjoni tal-actin fl-estratt taċ-ċelluli MDCK (Fig. 1b Supplimentari). Bl-istess mod, l-immunodeplezzjoni tad-dinamina endoġena -2 (Dyn2) mill-estratt jew l-inibizzjoni tal-attività GTPase tagħha permezz tad-dynode irriżulta f'indeboliment marġinali tal-polimerizzazzjoni tal-actin (Figura 1c Supplimentari). Filwaqt li LatA u CytoD imfixkla b'mod sinifikanti l-polimerizzazzjoni ta 'l-actin, iż-żieda ta' Bis-T -23 qabel LatA jew CytoD ma setgħetx tegħleb l-effetti inibitorji tagħhom (Fig. Supplimentari 1d, e). Jasplakinolide, mediċina li tinduċi l-polimerizzazzjoni ta 'l-actin billi tistimula n-nukleazzjoni tal-filament ta' l-actin17, ma żiedx b'mod sinifikanti l-livell ġenerali ta 'polimerizzazzjoni (Fig. Supplimentari 1d), li tissuġġerixxi li l-lysate taċ-ċelluli MDCK juri livell kważi massimu ta' actin polimerizzat. Flimkien, din id-dejta indikat li l-effetti ta 'Bis-T-23 fuq il-morfoloġija tal-membrana apikali fiċ-ċelloli MDCK kienu mmexxija minn mekkaniżmu ieħor għajr il-polimerizzazzjoni tal-actin.

Minħabba l-għarfien komuni tal-lokalizzazzjoni arrikkita ta 'Dyn2 u F-actin fil-bord tal-pinzell taċ-ċelluli epiteljali renali8, u r-rwol tad-dinamina fl-endoċitosi, imbagħad investigajna jekk Bis-T-23 kienx qed jaffettwa l-actin indirettament permezz ta' alterazzjonijiet fl-endoċitosi. Kif mistenni, kemm Dyn2 kif ukoll F-actin ko-lokalizzaw fil-kortiċi tal-actomyosin taħt il-membrana apikali, fi ħdan il-mikrovilli, u f'ħofor miksija bil-klatrin (CCPs), definiti mill-forma u d-daqs distinti tagħhom (Fig. 1f Supplimentari). Aħna eżaminajna d-dinamika tas-CCPs bl-użu ta 'mikroskopija ta' fluworexxenza ta 'riflessjoni interna totali (TIRF)18,19. Bis-T-23, anke fl-ogħla konċentrazzjoni tiegħu, ma kellu l-ebda effett fuq id-distribuzzjoni tal-ħajja tas-CCPs, filwaqt li d-dynole naqqas in-numru ta 'CCPs produttivi (Figura Supplimentari 1g). Dan in-nuqqas ta' korrelazzjoni bejn il-livell ta' endoċitosi u alterazzjonijiet fil-morfoloġija taċ-ċelluli jafferma li Bis-T- 23 jimmira lejn l-actin kortikali mingħajr ma jinfluwenza r-rwol tad-dinamina fl-endoċitosi.

Peress li l-polarità taċ-ċelluli tal-kliewi tinżamm mill-arkitettura u l-kontrazzjoni sostnuta tan-netwerks tal-actomyosin, li tistabbilixxi l-ebusija taċ-ċelluli fil-membrana apikali20, aħna mbagħad imkejla l-ebusija taċ-ċelluli billi tuża mikroskopija tal-forza atomika (AFM). Is-sistema Nanowizard IV u s-softwer ta 'analiżi JPK intużaw biex jiddeterminaw bidliet fil-Modulus21 ta' Young taħt settings sperimentali differenti (Fig. 2a Supplimentari). It-trattament b'LatA rriżulta fi tnaqqis sinifikanti fl-ebusija tal-kuntatt bejn iċ-ċelluli u ċ-ċelluli u l-ebusija taċ-ċelluli apikali fiċ-ċelloli MDCK (Fig. 1c–e). B'kuntrast, Bis-T-23 żied b'mod sinifikanti l-ebusija taċ-ċelluli meta mqabbel mal-vettura DMSO (Fig. 1c–e), konsistenti mal-effetti pożittivi tagħha fuq l-għoli taċ-ċelluli, in-numru tal-mikrovilli, u d-densità tan-netwerks tal-actin (Tabella 1 u Fig. 1b)22. Iż-żieda ta' Bis-T-23 qabel LatA naqqset b'mod qawwi l-effett negattiv ta' LatA fuq l-ebusija taċ-ċelluli (Fig. 1c–e), skont l-effett pożittiv ta' Bis-T-23 fuq in-netwerks tal-actin u l-morfoloġija taċ-ċelluli apikali (Tabella 1, Fig. 1b).

Fig. 1 L-oligomerizzazzjoni tad-dynamin tiddefinixxi l-ebusija taċ-ċelluli billi tinfluwenza l-arkitettura tal-actin fiċ-ċelloli epiteljali renali. a Immaġini SEM rappreżentattivi ta' ċelluli MDCK ittrattati b'DMSO (0.1%) jew Bis-T-23 (30 µM, 0.1% DMSO) għal 1 0 min qabel iż-żieda ta' DMSO (0.1%) jew LatA (0.2 µM, 0.1% DMSO) għal 2{{23} } min. Immaġini mkabbra tal-inserzjonijiet (reġjuni b'kaxxa oranġjo) juru l-arranġament, id-distribuzzjoni, u d-densità tal-mikrovilli fil-membrana apikali. b Immaġini PR-EM rappreżentattivi taċ-ċelloli MDCK ittrattati kif spjegat f'(a). L-immaġini juru bidliet fl-organizzazzjoni tal-kortiċi tal-actomyosin fiċ-ċelloli MDCK taħt il-kundizzjonijiet indikati. c Immaġini rappreżentattivi tal-mapep tal-Modulu ta' Young taċ-ċelloli MDCK trattati kif spjegat f'(a). d, e Bar graphs li jirrappreżentaw il-Modulu ta' Young li juru l-ebusija taċ-ċelluli mkejla fil-junction ċellula-ċellula (d) jew fil-membrana apikali (e). Kull simbolu jirrappreżenta l-ebusija medja ta 'ċellula waħda. Ir-riżultati murija f'd, e ġew iġġenerati minn mill-inqas ċellula 10 minn mill-inqas tliet dixxijiet tal-kultura. Bars ta' żball, medja ± SD (*P Inqas minn jew ugwali għal 0.05, **P Inqas minn jew ugwali għal 0.01, ***P Inqas minn jew ugwali għal 0.001, ****P Inqas minn jew ugwali għal 0.0001, mhux imqabbla test t b'żewġ denbu). ns, mhux sinifikanti.

Iddeterminajna wkoll l-ebusija taċ-ċelluli billi tuża s-sistema BioScope II bħala approċċ sperimentali alternattiv għall-AFM. F'dan il-każ, il-kurvi ta 'l-indentazzjoni tal-forza nkisbu skont il-mudell ta' Discher u sħabhom ikkalkulati bis-softwer Matlab23. Xejriet simili fir-rigward tal-ebusija taċ-ċelluli ġew irreġistrati għall-interazzjoni bejn LatA u Bis-T -23 (Figura Supplimentari 2b, 2c). Barra minn hekk, dynode ma wera l-ebda effett fuq l-ebusija taċ-ċelluli, filwaqt li CytoD naqqas b'mod sinifikanti l-ebusija taċ-ċelluli (Fig. Supplimentari 2d, e), skont il-fenotipi tal-actin tagħhom (Fig. 1a Supplimentari). Flimkien, din id-dejta tistabbilixxi l-korrelazzjoni bejn l-istatus tal-kortiċi tal-actomyosin, l-ebusija taċ-ċelluli, il-morfoloġija tal-membrana apikali, u l-polarità taċ-ċelluli. Dawn is-sejbiet juru wkoll b'mod konvinċenti r-rwol tal-oligomerizzazzjoni tad-dinamina fid-definizzjoni tal-parametri mekkaniċi tal-polarità taċ-ċelluli epiteljali permezz tal-effett tagħha fuq il-kortiċi tal-actomyosin

Dynamin cross-links filamenti actin f'netwerks ramifikati li huma l-bażi tal-polarità taċ-ċelluli. Sabiex niċċaraw il-mekkaniżmu molekulari li bih l-oligomerizzazzjoni tad-dinamina tinfluwenza l-arkitettura tal-kortiċi tal-actomyosin, imbagħad eżaminajna l-effett tad-dinamina fuq il-filamenti tal-actin f'sistema rikostitwita. Ibbażat fuq l-ipoteżi attwali, it-tul tal-filamenti ta 'l-actin jiddefinixxi l-mod tagħhom ta' cross-linking6. Peress li t-tul medju tal-filamenti ta 'l-actin kortikali f'netwerk fix-xifer ta' quddiem huwa bejn 100 u 150 nm24, aħna eżaminajna l-effetti tad-dinamina fuq l-organizzazzjoni ta 'filamenti iqsar iġġenerati billi tilfu F-actin b'gelsolin (Gsn-actin) (Fig. 2a). Iż-żieda ta 'Dyn2 rriżultat fil-formazzjoni ta' netwerks kbar u ramifikati (Fig. 2b, c). Ibbażat fuq id-daqsijiet u l-forom ta 'Dyn2 rikombinanti (Fig. 2d), in-netwerks kienu ffurmati prinċipalment minn Dyn2 dimers (Dyn2DIMER) u tetramers (Dyn2TETRA) li jinteraġixxu ma' diversi filamenti ta 'actin (Fig. 2e): Dyn2DIMER marbut sa żewġ filamenti, Dyn2TETRA marbut sa erba' filamenti, u Dyn2RING marbut sa sitt filamenti. Tkabbir baxx ta 'l-immaġini żvela li netwerks dipendenti mid-dinamina jiffurmaw mudell ta' forom iżgħar u akbar bħal ċirku (Fig. 2c).

Biex tikkorrelata l-osservazzjonijiet mis-sistema rikostitwita mar-rwol tad-dinamina fiċ-ċelloli, imbagħad iddeterminajna l-lokalizzazzjoni ta 'Dyn2 endoġenu fuq netwerks ta' actin kortikali bl-użu ta 'antikorp monoklonali anti-Dyn2 segwit minn antikorp sekondarju konjugat fid-deheb (Fig. Supplimentari 3a-c). Kif jidher fis-sistema rikostitwita, dynamin hija assoċjata ma 'numru distint ta' F-actin f'netwerks ramifikati (Fig. 2f). Flimkien, din id-dejta jidentifikaw attività ġdida ta 'dinamina, jiġifieri cross-linking F-actin f'netwerks ramifikati.

Biex tikkorrelata l-kapaċità ta' cross-linking tad-dynamin u l-effett protettiv ta' Bis-T-23 fuq il-kortiċi tal-actomyosin u l-morfoloġija tal-membrana apikali, imbagħad eżaminajna l-effetti ta' Bis-T-23 fuq medjat mid-dinamina netwerks f'sistemi rikostitwiti (Fig. 3a). Ibbażat fuq plots tal-kontorn, li jipprovdu rappreżentazzjonijiet topografiċi ta 'densitajiet ta' filament li jvarjaw, Bis T-23 żied id-densità ġenerali tan-netwerk (Fig. 3a), li tista 'tiġi spjegata biż-żieda fin-numru ta' F-actin marbut mad-dinamina minħabba iż-żieda fl-oligomerizzazzjoni tagħha. Barra minn hekk, dynamin aktar qawwi cross-linked filamenti iqsar minn twil F-actin (Fig. 3a-c), li jissuġġerixxi li l-kapaċità dynamin li jiffurmaw netwerks ramifikati hija definita mill-istatus oligomerization tagħha u t-tul ta 'filamenti actin. L-abbiltà li l-filamenti ta 'l-actin jiġu cross-link f'netwerks kienet kondiviża minn żewġ iżoformi tad-dinamina, Dyn2 espressi b'mod kullimkien u dynamin speċifiku għan-newron -1 (Dyn1) (Fig. 3b, c).

Servizz ta 'Appoġġ Ta' Wecistanche-L-akbar esportatur ta' cistanche fiċ-Ċina:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Ħanut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop