PARTⅠ:Effetti Protettivi Ġodda Ta' Estratt ta' Cistanche Tubulosa Kontra Retinopatija Deġenerattiva Indotta mid-Dawl Blu ta' Luminanza Baxxa

Kuntatt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Man-Ru Wu Cheng-Hui Lin Jau-Der Hob George Hsiao, Yu-Wen Cheng

Skola tal-Farmaċija, Kulleġġ tal-Farmaċija, Università Medika ta' Taipei, Taipei, Dipartiment tal-Oftalmoloġija, Università Medika ta' Taipei, Taipei, Dipartiment tal-Farmakoloġija, Skola tal-Mediċina, Kulleġġ tal-Mediċina, Università Medika ta' Taipei, Taipei, Istitut tal-Gradwati tax-Xjenzi Mediċi, Kulleġġ ta' Mediċina, Taipei Medical University, Taipei, Ph.D. Programm fir-Riċerka u l-Iżvilupp tal-Bijoteknoloġija, Kulleġġ tal-Farmaċija, Università Medika ta’ Taipei, Taipei, Tajwan

Astratt

Sfond/Għanijiet:Il-fototossiċità indotta minn dajowd li jarmi d-dawl blu (BLL) għandha rwol importanti f'mard okulari u tikkawża deġenerazzjoni tar-retina u apoptożi fiċ-ċelloli epiteljali tal-pigment tar-retina umana (RPE).Estratt ta' Cistanche tubulosa (CTE)hija mediċina tradizzjonali Ċiniża b'ħafna proprjetajiet protettivi ta 'benefiċċju; madankollu, ftit studji eżaminaw ir-rwoli protettivi okulari tas-CTE. F'dan l-istudju, investigajna l-mekkaniżmi sottostanti l-effetti ta 'CTE fuq apoptosi indotta minn BLL in vitro u in vivo. Metodi: Ċelloli RPE ġew applikati fl-istudju attwali in vitro u l-vijabbiltà taċ-ċelluli kienet determinata minn 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,{{6} }assaġġ tal-bromur tad-diphenyltetrazolium. L-espressjoni tal-proteina relatata mal-apoptożi ġiet iddeterminata permezz ta 'analiżi tal-western blot u tbajja' ta' immunofluworexxenza. Il-firien kannella Norveġja ntużaw biex jeżaminaw l-espożizzjoni għal BLL disponibbli kummerċjalment in vivo. Tbajja ta 'Hematoxylin u eosin, terminali deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL), u testijiet tal-western blot intużaw biex jeżaminaw id-deformazzjoni morfoloġika tar-retina. Riżultati: CTE inibixxi b'mod sinifikanti l-perossidu tal-idroġenu, idroperossidu tat-tertbutyl, ażide tas-sodju, u ħsara RPE indotta minn BLL. Barra minn hekk, CTE naqqas l-espressjoni ta 'markaturi apoptotiċi bħal caspase cleaved-3 u tbajja 'TUNEL wara espożizzjoni BLL billi inattiva l-mogħdijiet apoptotiċi, kif muri permezz ta' tbajja 'immunofluworexxenti. Barra minn hekk, CTE inibixxi l-fosforilazzjoni indotta minn BLL ta 'c-Jun N-terminal kinase, kinases extra relatati mas-sinjali 1/2, u p38 fiċ-ċelloli RPE. In vivo, l-amministrazzjoni orali ta 'CTE salvat 60-jum perjodiku tnaqqis ta' espożizzjoni BLL indotta fil-ħxuna tar-retina u naqqas in-numru ta 'ċelluli pożittivi għal TUNEL fil-mudell tal-far tan-Norveġja kannella. Konklużjoni: CTE huwa aġent profilattiku potenzjali kontra fototossiċità indotta minn BLL

Cistanche tubulosa

Introduzzjoni

Studji dwar id-deġenerazzjoni makulari relatata mal-età (AMD) irrappurtaw li 8.7 fil-mija tal-popolazzjoni tad-dinja tbati minn din il-marda [1]. L-AMD hija marda newrodeġenerattiva li tikkawża deformazzjoni tal-fotoreċetturi, atrofija tal-epitelju tal-pigment tar-retina (RPE), apoptożi taċ-ċelluli tal-ganglioni, u telf tal-vista ċentrali fil-popolazzjoni anzjana, u qed issir piż soċjali globali. AMD huwa kklassifikat jew f'forma niexfa jew imxarrba [2, 3]. It-titjib fit-teknoloġija wassal biex in-nies iqattgħu aktar ħin jużaw apparat diġitali modern, u konsegwentement, in-nies huma esposti għal emissjonijiet tad-dawl blu (BL) fuq perjodi twal. Madankollu, il-kwistjoni ta 'fototossiċità indotta minn BL fir-retina mhix investigata sew. L-espożizzjoni żejda għal BL ta 'tul ta' mewġ qasir (450–495 nm) tirriżulta fil-ġenerazzjoni ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS), bħal superoxide u radicals hydroxyl, li jikkawżaw żidiet fil-konsum ta 'ossiġnu u jinduċu ħsara fid-DNA mitokondrijali. L-akkumulazzjoni ta 'ROS tirriżulta fi stress ossidattiv u l-akkumulazzjoni estensiva ta' adducts retinojdi, li jagħmlu ħsara lir-retina aktar [4]. Ir-riċerka wriet li l-istress ossidattiv huwa fattur ewlieni fil-patoġenesi ta 'AMD niexfa [5]. Barra minn hekk, l-irradjazzjoni BL tnaqqas l-espressjoni ta 'enzimi antiossidanti tar-retina, bħal superoxide dismutase u catalase, billi timmedja l-interazzjonijiet tal-proteini Bax/Bcl-2 u tippromwovi l-produzzjoni endoġena ta' ROS. Bħala tali, iċ-ċelloli RPE u l-mitokondrija tas-segment ta 'barra tal-fotoreċetturi jsofru minn korriment ikkawżat mill-irradjazzjoni BL [6, 7]. Minbarra l-ġenerazzjoni ROS, l-irradjazzjoni BL jattiva proteina kinases attivati ​​minn mitoġenu (MAPKs), li għandhom rwol importanti fis-sopravivenza taċ-ċelluli u l-apoptosi. Proteini pro-apoptotiċi relatati mal-apoptożi dipendenti mill-mitokondrija, bħal Bax u caspase-3, huma attivati ​​bl-irradjazzjoni tad-dawl tad-dijodu li jarmi BL (BLL) permezz tal-kinase c-Jun N-terminal (JNK) u mogħdijiet p38 f' RPE u ċelluli tal-ganglion tar-retina [8]. Barra minn hekk, il-mogħdijiet anti-ossidattivi dipendenti fuq il-fosfatidilinositol 3-kinase (PI3K)/Akt u l-fattur nukleari eritrojdi 2-relatati mal-fattur 2 (Nrf2) huma komponenti tas-sistema ta' difiża taċ-ċelloli RPE [{{34} }].

Estratt ta' Cistanche tubulosa (CTE)fih derivattivi ta 'phenylethanoid glycoside u ilu jintuża bħala mediċina tradizzjonali Ċiniża għal għexieren ta' snin. Echinacoside, acteoside, u isoacteoside huma tliet komposti attivi ewlenin ta 'CTE li huma kkaratterizzati bħala li għandhom proprjetajiet newroprotettivi, li jsaħħu l-memorja, li jirregolaw l-immunità u kontra l-fibrożi tal-fwied [13, 14]. Echinacoside huwa kennies ROS u jipproteġi kontra l-apoptosi indotta minn 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP plus ) f'mudelli ta' annimali tal-marda ta' Parkinson [15, 16]. Acteoside jipproteġi kontra n-newrotossiċità kkaġunata mill-amilojde- -u jnaqqas l-infjammazzjoni stimulata minn lipopolysaccharide, attribwibbli għat-traslokazzjoni ta' Nrf2 miċ-ċitoplasma għan-nukleu u l-irbit ma' elementi ta' rispons antiossidanti. It-terapiji disponibbli attwali għall-AMD imxarrab, bħal pegaptanib, ranibizumab, bevacizumab u aflibercept, jintużaw biex jinibixxu anġjoġenesi eċċessiva [17, 18]. Madankollu, ma jeżistu l-ebda trattamenti effettivi għall-AMD niexfa, minħabba l-kumplikazzjonijiet patoloġiċi multipli ta 'din il-marda.

F'dan l-istudju, aħna nuru l-effetti protettivi ta 'CTE fiċ-ċelloli RPE u firien Brown Norway (BN). Barra minn hekk, applikajna espożizzjoni BLL ta 'luminanza baxxa fit-tul għal mudelli kemm in vitro kif ukoll in vivo biex nevalwaw l-effetti protettivi ta' CTE. Sibna li CTE naqqas l-espressjoni ta 'proteini relatati mal-apoptożi wara l-espożizzjoni għal BLL. Barra minn hekk, CTE naqqas in-numru ta 'ċelluli pożittivi ta' terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) fir-retina tal-firien BN wara espożizzjoni fit-tul għal BLL ta 'luminanza baxxa. Dan l-istudju jipprovdi aktar għarfien dwar l-effetti ġodda anti-apoptotiċi tas-CTE u informazzjoni dwar strateġija ġdida għat-trattament tad-deġenerazzjoni tar-retina.

Estratt ta 'Cistanche tubulosa (CTE): phenylethanoid glycoside

Materjali u metodi

Kimiċi u prodotti

CTE ġie pprovdut b'mod ġeneruż minn Sinphar Pharmaceutical Company (Yilan, Tajwan). Kits ta' skoperta ta' mewt taċ-ċelluli in situ (Nru tal-Kat. 11-684-817-910) inxtraw minn Roche (Mannheim, il-Ġermanja).

Kultura taċ-ċelluli RPE

Iċ-ċelloli RPE (ARPE{{0}} u ATCC® CRL-2302™) inxtraw mill-American Type Culture Collection (Manassas, VA) u kkultivati ​​fil-mezz ta’ Eagle modifikat ta’ Dulbecco (Gibco, Grand Island, NY) supplimentat b'10 fil-mija serum bovin tal-fetu f'atmosfera umidifikata ta' 5 fil-mija CO2 f'37 grad. Iċ-ċelloli ARPE-19 fil-passaġġ 19–30 inżammu fuq dixxijiet tal-kultura taċ-ċelluli ta' 10-cm (Orange Scientific, Braine-l'Alleud, il-Belġju). Malli tgħaddi b'0.05 fil-mija trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (Gibco), iċ-ċelloli ġew replated fi proporzjon 1:4. Qabel l-ittestjar, iċ-ċelluli ARPE-19 ġew miżrugħa fuq 48-pjanċi tal-bir (Orange Scientific) għal analiżi tal-vijabbiltà taċ-ċelluli f'densità ta' 1.0 × 105 ċelluli/mL u fuq dixxijiet ta' 6-ċm (Orange Scientific ) għal analiżi tal-western blott f'densità ta' 2.0 × 105 ċelluli/mL għal 24 siegħa. Wara li ċ-ċelloli ARPE-19 laħqu 80 fil-mija ta' konfluwenza, saru l-esperimenti li ġejjin.

Trattament tad-droga u analiżi tal-vijabbiltà taċ-ċelluli

Iċ-ċelloli RPE fil-passaġġ 19-30 ġew miżrugħa fuq 48-pjanċi bir-bir u kotrattati għal 24 siegħa b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'CTE, perossidu tal-idroġenu (H2O2), idroperossidu tat-tert-butil (t-BHP), u ażide tas-sodju ( NaN3). Iċ-ċelloli mbagħad ġew ikkultivati ​​b'3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl){-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) f'konċentrazzjoni finali ta' 1 mg /mL u inkubat għal 30 min. Dimethyl sulfoxide (200 µL) imbagħad ġie miżjud ma 'kull bir biex jinħall iċ-ċelloli. L-assorbiment tkejjel f'570 nm bl-użu ta' qarrej tal-assaġġ tal-immunosorbenti marbut mal-enżimi tal-ispettrofotometru Sunrise™ (MRX-TC; Dynex Technologies, Chantilly, VA). Il-valuri ġew ikkoreġuti għall-assorbiment fl-isfond billi jitnaqqsu l-vojt xierqa. Id-dejta hija minn ħames analiżi indipendenti.

Protokoll ta' espożizzjoni in vitro BL

Is-sors tad-dawl u l-pjanċi taċ-ċelluli tqiegħdu 25 ċm 'il bogħod minn xulxin, kif deskritt fl-istudju preċedenti tagħna [19]. Il-luminanza kienet imkejla b'miter tad-dawl (LM-81LX; Lutron Electronic Enterprise, Taipei, Tajwan). BLL laħaq il-quċċata f'460 nm (60 lux) għall-ħin indikat (0-48 h), skont id-disinn sperimentali.

Western blotting

Wara 0–48-siegħa ko-trattament b'espożizzjoni għal CTE u BLL, iċ-ċelluli ġew maħsula darbtejn b'salina phosphate-buffered (PBS) kiesħa fis-silġ u sospiżi mill-ġdid f'liżi buffer ta' analiżi radjoimmunopreċipitazzjoni (1 fil-mija Nonidet P-40, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 1 mM ethylene glycol-bis (-aminoethylether)-N,N,N′,N′-aċidu tetraacetic, 1 mM NaF , u cocktail inibitur tal-protease/phosphatase). Il-lisat taċ-ċelluli nkiseb permezz ta 'ċentrifugazzjoni fi 12, 000 × g għal 35 min, u s-supernatant inġabar biex jiddetermina l-konċentrazzjonijiet tal-proteini permezz tar-reaġent Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Ammonti ugwali ta 'kampjuni ta' proteini ġew isseparati b'elettroforeżi tal-ġell ta '10-12 fil-mija tas-sodju dodecyl sulfate-polyacrylamide u mbagħad trasferiti fuq membrana ta' polyvinylidene difluoride. Wara li l-membrana ġiet imblukkata b'5 fil-mija ħalib bla xaħam u inkubata f'salina b'Tris-buffered b'Tween 20 (TBST) għal siegħa, immunoblotting sar b'antikorpi primarji speċifiċi għal caspase cleaved-3, phospho-JNK, JNK , fosfo-p38, p38, kinażi relatata mas-sinjali fosfo-extraċellulari (ERK), ERK, Bcl-2, Bax, proteina assoċjata mal-Fas mad-dominju tal-mewt (FADD), caspase-8 (GeneTex, Irvine , CA), Fas-ligand (Abcam, Cambridge, UK), u b-actin (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO). Il-blots ġew imbagħad inkubati b'antikorpi sekondarji konjugati bil-perossidażi tar-ravanell (1:6000 f'TBST; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Bl-użu ta 'kit ta' kimiluminixxenza msaħħa (Millipore, Billerica, MA), l-intensità tal-meded fuq kull blot ġiet analizzata b'softwer Image J wara n-normalizzazzjoni għal b-actin.

Immunofluworexxenza

Iċ-ċelloli RPE ġew iffissati b'4 fil-mija paraformaldehyde f'PBS għal 15-il minuta. Triton X-100 f'PBS (0.2 fil-mija) imbagħad ġie miżjud maċ-ċelloli għal 15-il minuta, segwit minn 5 fil-mija serum bovin tal-fetu f'PBS għal 30 min; iċ-ċelloli mbagħad ġew inkubati b'antikorp caspase-3 anti-cleaved fi proporzjon ta' 1:250 għal 24 siegħa (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Antikorp sekondarju IgG kontra l-fenek tal-mogħoż (Dylight 594) intuża fi proporzjon ta '1:200 (Vector Laboratories, Burlingame, CA). In-nuklei taċ-ċelluli kienu mtebbgħin b'4′-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; AAT Bioquest, Sunnyvale, CA). Bidliet fil-fluworexxenza ġew osservati b'sistema tal-immaġni tal-mikroskopju spettrali konfokali tal-laser CS SP5 (Leica, Ġonna Teban, Singapor).

Tbajja 'TUNEL

Frammenti tad-DNA, li jistgħu jiġu skoperti permezz ta 'assaġġ TUNEL, huma karatteristika sinifikanti ta' apoptożi. Aħna użajna In Situ Cell Death Detection Kit (Kat. Nru. 11-684-817-910; Roche) biex inkejlu l-mewt taċ-ċelluli RPE programmata apoptotika skont il-protokoll tal-manifattur. Fil-qosor, aħna ffissaw ċelluli RPE b'4 fil-mija paraformaldehyde u ttikkettjaw il-waqfiet tal-linja tad-DNA f'reazzjoni enżimatika biex tiskopri ċelluli pożittivi għal TUNEL, li ppreżentaw tebgħa fluworexxenti ħadra. Iċ-ċelloli mtebbgħin imbagħad ġew skennjati u analizzati b'Tissue FAXS-plus Imaging System (TissueGnostics, Vjenna, Awstrija). Għaxart elef avveniment ġew magħduda fir-reġjun RPE gated, u aħna analizzaw l-immaġini għan-numru ta 'ċelluli pożittivi TUNEL bis-softwer TissueQuest/HistoQuest (TissueGnostics).

Esperimenti fuq l-annimali

Firien BN maskili (piż tal-ġisem 300-350 g) inxtraw miċ-Ċentru Nazzjonali tal-Annimali tal-Laboratorju (Taipei, Tajwan) u nżammu għal 2-3 xhur. Il-firien inżammu f'ċiklu ta' dawl/dlam 12-h/{12-h f'26 ± 1 grad, proporzjon ta' umdità relattiva 35-47 fil-mija, u aċċess ad libitum għall-ilma u l-ikel. Firien mhux ittrattati nżammu fid-dlam biex iservu bħala kontrolli. Il-protokolli tal-istudju ġew approvati mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Użu tal-Kura tal-Annimali tal-Università Medika ta 'Taipei (numru ta' approvazzjoni: LAC-2016-0442). Il-proċeduri sperimentali kollha li jinvolvu l-użu ta 'annimali kkonformaw mad-dikjarazzjonijiet ta' l-Assoċjazzjoni għar-Riċerka fil-Viżjoni u l-Oftalmoloġija għall-użu ta 'annimali fir-riċerka sperimentali oftalmika u tal-vista.

Mudell tal-far indott minn BLL ta 'deġenerazzjoni tar-retina

Aħna użajna mudell perjodiku ta 'luminanza baxxa fit-tul indott mill-espożizzjoni BLL ta' deġenerazzjoni tar-retina, kif deskritt fl-istudju preċedenti tagħna [19]. Fil-qosor, il-firien BN kienu maqsuma fi tliet gruppi: grupp ta 'kontroll, li nżamm taħt kundizzjonijiet mudlama; grupp espost għal BLL, li kien espost għal BLL perjodiku fid-dlam mingħajr dilatazzjoni tal-pupil (460 nm, 150 lux) għal 3 sigħat kuljum għal 60 jum; u grupp espost b'CTE flimkien ma' BLL, li kien trattat minn qabel b'CTE (100 mg/kg piż tal-ġisem) għal 14-il jum u mbagħad ikkurat flimkien b'espożizzjoni perjodika għal BLL għal 3 sigħat kuljum għal 60 jum. Il-firien kollha ġew ritornati lejn il-kolonji tal-annimali u ċ-ċiklu normali tad-dawl/dlam (250 lux, 12 h/12 ​​h) reġa’ beda fi tmiem il-perjodu sperimentali.

Analiżi statistika

Differenzi sinifikanti ġew ikkalkulati bl-użu ta' analiżi ta' varjanza f'direzzjoni waħda segwita mit-test post hoc ta' Tukey u test ta' paraguni multipli. Is-sinifikat statistiku kien determinat minn p-valuri ta '<>

Prodotti Cistanche tubulosa

Riżultati

CTE jipproteġi ċ-ċelloli RPE mill-ħsara mill-istress ossidattiv

Biex tiġi evalwata ċ-ċitotossiċità tas-CTE permezz tal-assaġġ MTT, ġew applikati diversi konċentrazzjonijiet ta' CTE ({{{{20}}}}–500 ug/mL) għaċ-ċelloli RPE. It-trattament CTE ma kellu l-ebda effetti tossiċi ovvji fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli RPE fi kwalunkwe waħda mill-konċentrazzjonijiet ittestjati (Fig. 1A). Għalhekk, 50 u 100 ug/mL CTE ġew użati fl-esperimenti sussegwenti. Biex jiġu investigati l-effetti anti-apoptotiċi ta 'CTE, indutturi ossidattivi differenti (H2O2, t-BHP, u NaN3) ġew ko-amministrati ma' CTE għal ċelloli RPE għal 24 siegħa. H2O2, NaN3, u t-BHP naqsu l-vijabbiltà taċ-ċelluli u għamlu ħsara liċ-ċelloli RPE b'mod dipendenti fuq id-doża (vireg imqaxxra, Fig. 1B, 1C, u 1D); il-vijabbiltà taċ-ċelluli kienet inqas b'mod sinifikanti fiċ-ċelloli ttrattati b'0.03 mM H2O2, 0.3 mM NaN3, u 0.3 mM t-BHP milli fil-grupp ta 'kontroll.

Madankollu, ko-trattament b'50 u 100 ug/mL CTE attenwat il-ħsara taċ-ċelluli RPE indotta minn H2O2-, NaN{3-, u t-BHP u reġġa' lura t-tnaqqis fil-vijabbiltà taċ-ċelluli (vireg suwed, Fig. 1B, 1C, u 1D). Id-dejta ta 'hawn fuq tissuġġerixxi li CTE isalva ċelloli RPE minn ħsara ta' stress ossidattiv.

CTE jinibixxi l-mewt taċ-ċelluli RPE indotta minn BLL

Fl-istudju preċedenti tagħna, sibna li BLL huwa ċitotossiku għaċ-ċelloli RPE, li kien attribwibbli għal bidliet fl-espressjoni ta 'Bcl-2 u Bax. Fl-istudju preżenti, aħna eżaminajna aktar l-effetti protettivi ta 'CTE fuq il-ħsara taċ-ċelluli RPE indotta minn BLL. Poġġejna żewġ pjanċi LED elettriċi blu f'inkubatur tal-kultura taċ-ċelluli. Id-distanza bejn is-sors tad-dawl u l-pjanċi taċ-ċelluli kienet 25 ċm, u l-intensità BLL kienet 60 lux, kif imkejla b'miter tad-dawl (Fig. 2A). Assaġġ MTT wera li l-espożizzjoni BLL għal perjodi ta 'żmien differenti (6-48 h) ikkawżat mewt taċ-ċelluli RPE b'mod dipendenti fuq iż-żmien (Fig. 2B). It-tnaqqis ikkawżat minn BLL fil-vijabbiltà taċ-ċelluli wara 24 u 48 siegħa kien attenwat b'mod sinifikanti meta ċ-ċelloli ġew kotrattati b'CTE (100 ug/mL) (Fig. 2C). Din id-dejta tissuġġerixxi li CTE tipproteġi ċ-ċelloli RPE minn fototossiċità indotta minn BLL.

CTE jinibixxi l-apoptosi indotta minn BLL fiċ-ċelloli RPE billi jirregola l-mogħdijiet Bcl-2/Bax u Fas/FasL

Fuq il-bażi tal-effetti protettivi potenzjali tas-CTE fiċ-ċelloli RPE, investigajna aktar l-involviment possibbli tas-CTE f'dan il-proċess. Ġew eżaminati żewġ mogħdijiet ta' sinjalazzjoni apoptotika, jiġifieri, il-mogħdijiet Bax/Bcl{{{0}} u Fas/Fas ligand (FasL), u proteini relatati (eż., pro-caspase-8 u pro-caspase -3; Fig. 3A u 3B). Espożizzjoni BILL (6-48 h) instab li upregulate l-espressjoni ta 'proteini Bax/Bcl -2, FasL, u FADD b'mod dipendenti fuq iż-żmien (Fig. 3A). Barra minn hekk, BLL irregola l-espressjoni tal-proteina ta' procaspase-3 u procaspase-8, li rriżulta f'aktar forom ta' qsim ta' caspase-3 u caspase-8 wara l-espożizzjoni tal-BLL, li hija konsistenti mal- tagħna studju preċedenti [19]. Biex jiġu evalwati l-effetti protettivi ta 'CTE aktar, ġew applikati konċentrazzjonijiet differenti ta' CTE għal ċelloli RPE esposti għal BLL (Fig. 3B). Wara 48-h espożizzjoni BLL, CTE (50 µg/mL) naqqas il-proporzjon Bax/Bcl-2. Barra minn hekk, CTE (10{0 µg/mL) naqqas l-espressjoni tal-proteini ta 'FasL u FADD, iżda żied b'mod sinifikanti l-livelli ta' procaspase-8 u procaspase-3 (Fig. 3C u 3D). Studji wrew li l-attivazzjoni ta' caspase-3 hija markatur ta' apoptożi fiċ-ċelloli RPE [20]. Biex nikkonfermaw l-effetti protettivi ta 'CTE aktar, wettaqna tbajja immunofluworexxenti ta' caspase cleaved-3. L-espożizzjoni tal-BILL għal 48 siegħa instab li jinduċi qsim ta' caspase-3 u traslokazzjoni fin-nukleu, li rriżulta f'apoptosi taċ-ċelluli RPE (vleġeġ isfar, Fig. 4A). Madankollu, meta ċelluli esposti għal BLL ġew kotrattati b'CTE (100 µg/mL), l-espressjoni indotta minn BLL ta 'caspase cleaved-3 ġiet inibita. Biex nifhmu aħjar l-effetti anti-apoptotiċi tas-CTE, użajna t-tbajja’ TUNEL biex niskopru frammenti tad-DNA fiċ-ċelloli RPE. Wara 48-h espożizzjoni BLL, iċ-ċelloli pożittivi għal TUNEL żdiedu minn 1.78 ± 0.36 fil-mija għal 23.82 ± 0.33 fil-mija; dan l-effett kien attenwat permezz ta 'ko-trattament ma' CTE (23.82 ± 0.33 fil-mija għal 2.22 ± 0.11 fil-mija; Fig. 4B, 4C, u 4D). Dawn ir-riżultati jindikaw li t-trattament CTE jipproteġi bil-qawwa ċ-ċelloli RPE mill-apoptosi indotta minn BLL billi timmedja l-mogħdijiet Bax/Bcl-2 u FasL/FADD.

CTE jinibixxi l-fosforilazzjoni indotta minn BLL ta 'proteini ta' rispons għall-istress fiċ-ċelloli RPE

Studji preċedenti wrew li mogħdijiet MAPK, bħal ERK, JNK, u p38 MAP, huma attivati ​​fiċ-ċelloli RPE u fir-retina wara espożizzjoni għal dawl ultravjola jew BL [21, 22]. Għalhekk, biex tinvestiga l-effetti regolatorji ta 'CTE fuq il-mogħdija ta' rispons għall-istress MAPK wara espożizzjoni BLL, 100 µg / mL CTE ġiet applikata għal ċelloli RPE taħt ħinijiet ta 'espożizzjoni BLL differenti (Fig. 5A). Analiżi Western blot indikat li ERK fosforilati, JNK, u p38 ġew attivati ​​fuq espożizzjoni BLL, iżda inibit b'mod sinifikanti fuq ko-trattament ma CTE fiċ-ċelloli RPE (Fig. 5B). Ir-riżultati ta 'hawn fuq jindikaw li CTE jinibixxi l-ħsara taċ-ċelluli RPE indotta minn BLL, li tista' tkun assoċjata mal-inibizzjoni ta 'MAPK fiċ-ċelloli RPE.

CTE isalva ħsara fir-retina kkawżata minn BLL wara espożizzjoni perjodika fit-tul f'mudell tal-far

Biex nevalwaw l-effetti protettivi tas-CTE, esponejna l-firien BN għal espożizzjoni fit-tul għal BLL għal 60 ijiem u evalwajna l-effetti tas-CTE. Kif muri fl-skematika ppreżentata f'Fig. 6A, il-firien BN kienu maqsuma fi tliet gruppi: grupp ta 'kontroll, grupp espost għal BLL, u grupp CTE flimkien ma' BLL (Fig. 6A). Fil-grupp CTE flimkien ma' BLL, il-firien BN kienu kontinwament supplimentati b'CTE (100 mg/kg piż tal-ġisem) permezz ta' gavage orali darba kuljum għal 14-il jum qabel l-espożizzjoni għal BLL. F'jum 0, il-firien BN ġew kotrattati b'CTE (100 mg/kg piż tal-ġisem) u esposti għal BLL għal 3 sigħat kuljum għal 60 jum. Wara 60 jum ta 'espożizzjoni BLL, l-annimali ġew sagrifikati għal analiżi tal-western blot u tbajja 'l-immunoistokimika. Fil-grupp CTE plus BLL, l-espressjoni tal-proteina procaspase-3 fl-omoġenati tal-għajnejn tal-firien kienet ogħla wara t-trattament CTE milli fil-grupp BLL (Fig. 6B u 6C). Din id-dejta turi li s-CTE jipprevjeni l-fototossiċità tar-retina indotta minn BLL ta' luminanza baxxa fit-tul u l-apoptożi billi jinibixxi l-attivazzjoni ta' caspase cleaved-3. It-tbajja 'l-immunoistokimika pprovdiet aktar evidenza dwar l-effetti protettivi ta' CTE fuq l-istruttura u l-mogħdijiet fiżjoloġiċi tar-retina (Fig. 7). Barra minn hekk, wara l-espożizzjoni BLL sibna li s-saff ta 'ġewwa tan-newroni naqas u osservajna deformazzjonijiet morfoloġiċi fis-saff ta' barra tan-newroni (ONL), inkluż is-segment ta 'ġewwa / is-segment ta' barra kemm fir-retina ċentrali kif ukoll periferali, li hija konsistenti mal-istudju preċedenti tagħna ( Fig. 7B). Importanti, CTE impedixxa d-deformazzjoni taċ-ċelluli RPE, il-ħsara taċ-ċelluli newronali, u t-tirqiq ġenerali tar-retina fil-grupp CTE flimkien ma 'BLL (Fig. 7C). Barra minn hekk, aħna ma osservajnax ċelluli pożittivi għal TUNEL fir-retina ċentrali u periferali tal-firien normali (Fig. 8Ab u 8Bb). Bil-maqlub, wara espożizzjoni BLL għal 60 jum, ċelluli pożittivi TUNEL ġew skoperti ta 'spiss fl-ONL tar-retina ċentrali u periferali (Fig. 8Ae u 8Be). Tbajja DAPI tal-ONL tar-retina ċentrali naqset b'mod notevoli fil-grupp BLL (Fig. 8Ad). Madankollu, il-preżenza ta 'ċelluli pożittivi TUNEL ġiet attenwata u t-tbajja' DAPI tar-retina ċentrali u periferali ONL żdiedet fil-grupp CTE plus BLL (Fig. 8Ai u 8Bi).

Prodotti Cistanche tubulosa

Il-parti Ⅱ li jmiss trid tkompli