Parti 2: Echinacoside Iżid il-Kwantità ta 'l-Isperma fil-Firien Billi Jimmira lejn ir-Riċettur Ipotalamiku ta' Androgen

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2

Pls ikklikkja hawn għall-Parti 1

Esperiment Trattament.

Esperiment 1. Il-ġrieden kienu maqsuma b'mod każwali f'sitt gruppi, seba 'ġrieden f'kull grupp (n = 7).ECHEchinacoside mill-cistanche)(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, iċ-Ċina) ingħata bl-użu ta 'tubu intragastriku, u propionate tat-testosterone (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, iċ- Ċina) ingħataw b' injezzjoni ġol- muskoli darba kuljum għal 14- il jum skond id- disinn sperimentali li ġej: Grupp ta ' kontroll: salina normali (10 mL/ kg), ECH_(L)grupp (5 mg/kg), ECH_(M)grupp (20 mg/kg), ECH_(H)grupp (80 mg/kg), TP (15 mg/kg) u enzalutamide (inibitur AR, darba kuljum kuljum għal 14-il jum; 20 mg/kg; CAS: 915087- 33-1; Aladdin, Shanghai, iċ-Ċina).

Wara ġimagħtejn ta 'trattamenti, il-ġrieden kienu anestetizzati b'etere diethyl biex jiġbru kampjuni tad-demm għal analiżi tal-livelli ta' ormoni. Il-ġrieden imbagħad ġew dissegati biex jisseparaw l-ipotalamu, l-enċefaljun + il-pitwitarju, it-testikoli u l-epididis cauda. Kampjuni ta 'cauda epididymis tqiegħdu f'salina normali b'5% BSA għall-valutazzjoni tal-kwalità ta' l-isperma, u l-ipotalamu, l-enċefaljun + pitwitarju u t-testijiet ġew iffriżati f'nitroġenu likwidu u maħżuna f'temperatura ta '- 80 °C għal aktar investigazzjonijiet.

Esperiment 2. Il-ġrieden kienu maqsuma b'mod każwali f'10 gruppi, ħames annimali għal kull grupp. ECH (20 mg/kg) ingħata mill-ħalq u l-ġrieden f'kull grupp kienu anestetizzati bid-diethyl ether fil-punti tal-ħin 0.5 h, 1 h, 1.5 h, 2 h, 2.5 h, 3 h, 4 h, 6 h, 9 h u 12-il siegħa wara l-għoti għall-ġbir tal-kampjuni.

Il- plażma nġabret u l- qalb kienet esposta. Il- perfużjoni tas- salina normali fil- ventrikoli tax- xellug saret minn apparat għall- infużjoni sakemm il- fwied u l- pulmuni kienu mgħaddsa. Imbagħad inġabru l-ipotalamu u t-testikoli biex jiġu ddeterminati l-konċentrazzjonijiet tat-tessuti ta' ECH(Echinacoside mill-cistanche).

Esperiment 3. Il-ġrieden kienu maqsuma bl-addoċċ f'4 gruppi, sebgħa f'kull grupp. ECH(Echinacoside mill-cistanche)u BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Shanghai, iċ-Ċina) ġew amministrati bl-użu ta' tubu intragastiku darba kuljum għal 6 ġimgħat skont id-disinn sperimentali ta' segwitu: grupp normali (żejt tal-qamħ, 10 mL/kg, bw/d), grupp mudell: grupp BPA (BPA 200 mg/kg, bw/d, żejt tal-qamħirrum), u grupp sperimentali: grupp BPA + ECH (BPA 200 mg/kg; ECH 20 mg/kg).

Wara 42 jum ta 'trattament, il-ġrieden kienu anestetizzati bid-diethyl ether u l-kampjuni tad-demm inġabru għal analiżi tal-livell tal-ormoni. It-testikoli u l-epididis cauda ġew separati u miġbura. L-epididimi cauda ntuża għall-valutazzjoni tal-kwalità tal-isperma u t-testikoli kienu ffriżati f'nitroġenu likwidu u maħżuna f'temperatura ta' -80 °C għal aktar investigazzjoni.

Figura 7. Mogħdijiet regolati minn ormon u proteina magħżula relatati mal-assi HPG fir-riproduzzjoni maskili kif imbassar mid-Database tal-Ontoloġija tal-Mogħdija u d-Database tal-Mogħdija KEGG.

Noti: Il-proċessi regolati huma rappreżentati minn sfondi ta 'kuluri u forom differenti, u avvenimenti regolatorji jintwerew bl-użu ta' vleġeġ u linji.

Ir-referenzi marbuta ma 'kull proteina kienu bbażati fuq Il-Bażi tad-Dejta tal-Ontoloġija tal-Mogħdija u d-Database tal-Mogħdija KEGG, u mhumiex elenkati.

Determinazzjoni tal-kwalità ta' l-isperma. Preparazzjoni tas-sospensjoni ta 'l-isperma. Cauda epididymides ġew ikkapuljati f'5 mL ta' salina normali b'5% BSA u inkubati għal 5 min f'temperatura ta' 37 °C biex il-kontenut tagħhom ikun jista' jinfirex fil-mezz.

Numru tal-isperma: Skont il-metodu deskritt minn Yokoi (2003), is-sospensjoni tal-isperma dilwita (1:10; v/v; sospensjoni tal-isperma/10% metanol) ġiet trasferita lil kull kamra tal-għadd ta' emoċitometru u tħalliet toqgħod għal 5 min u mbagħad tingħadd taħt mikroskopju ħafif (Nikon, Strumenti Inc., il-Ġappun) fil-ingrandiment X200.

Vijabbiltà ta' l-isperma: Total ta' 20 μL ta' sospensjoni ta' l-isperma kien imħallat ma' volum ugwali ta' tebgħa eosin-nigrosin għal 2 min; l-isperma mhux imtebba' kienu magħduda taħt mikroskopju ħafif f'ingrandiment ta' 200x.

Motility ta 'l-isperma: Total ta' 10 μL ta 'sospensjoni ta' l-isperma tpoġġa fuq slide tal-ħġieġ u ġie rreġistrat jew mobbli jew immobbli taħt mikroskopju tad-dawl f'ingrandiment ta '200x.

Determinazzjoni tal-livelli ta 'ormoni. Il-livelli ta' testosterone (T) u LH ġew ikkwantifikati f'omoġenizzazzjonijiet fis-serum, l-enċefalsjoni + pitwitarji u tat-testikoli bl-użu ta' kits radioimmunoassay (RIA) (l-Istitut tat-Teknoloġija Bijoloġika ta' Beijing Sino-UK, Beijing, iċ-Ċina). Fil-qosor, antikorp anti-testosterone jew anti-LH IgG (100 μL) u antikorp anti-mouse ikkonjugat minn 125-I ġew miżjuda ma' kampjuni jew l-istandard (100 μL), u mħallta fuq rocker matul il-lejl f'4 °C. Wara l-ħasil tliet darbiet bil-PBS-Tween 20 (500 μL), it-taħlitiet kienu ċentrifugati (3500 rpm/min) f'4 °C għal 15-il minuta. Il-valuri CPM tal-preċipitati ġew ivvalutati mill-istrument radioimmunoassay (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Beijing, iċ-Ċina) u l-konċentrazzjonijiet ta' T u LH ġew ikkalkulati skont il-formula ta' kurva standard. Il-koeffiċjent T u LH tal-varjazzjoni huwa 2.8% u 3.2% fil-gruppi tal-kampjun, u 2.1% u 2.8% fi gruppi standard, rispettivament.

Determinazzjoni ta' espressjonijiet tal-ġeni permezz ta' PCR kwantitattiv f'ħin reali. L-RNA totali kienet iżolata minn testikulari ffriżati u enċefalija + tessuti pitwitarji bl-użu ta ' kit RNA Totali Sempliċi RNA (Tiangen, Beijing, iċ-Ċina). PCR kwantitattiv f'ħin reali (q RT-PCR) sar għall-amplifikazzjoni tas-cDNA bl-użu ta' 2 × SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, iċ-Ċina). Il-proċedura PCR kienet tikkonsisti f'95 °C għal 30 sekonda segwiti minn 35 ċiklu ta' 95 °C għal 15-il sekonda, 58 °C għal 30 sekonda u 72 °C għal 30 sekonda. L-analiżi tal-kurva tat-tidwib saret fuq il-prodotti pcr biex tivverifika l-ispeċifiċità tal-primer u l-purità tal-prodott. Saret kurva ta' dissoċjazzjoni għal kull pjanċa biex tikkonferma l-produzzjoni ta' prodott wieħed. L-abbundanza relattiva ta' kull mRNA ġiet ikkalkulata. Il-primers tal-PCR użati għall-istudju huma murija f'Tabella 2.

Blot tal-Punent. Għall-analiżi tal-espressjoni AR, l-estrazzjoni u l-iżolament tal-proteina ċitoplasmika u nukleari saru bl-użu ta' Kit ta' Estrazzjoni ta' Proteina Ċitoplasmika u Nukleari (Beyotime, Nanjing, iċ-Ċina) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il- konċentrazzjonijiet ta ' proteini ċitoplasiċi u nukleari ġew ivvalutati bl- użu ta ' Bradford Protein Assay Kit (Beyotime, Jiangsu, iċ- Ċina). Kampjuni ta ' proteini (80 μg) saru fuq ġel ta ' 12% u 5% SDS- PAGE u trasferiti fuq membrani PVDF. Wara l-imblukkar, il-membrani ġew inkubati b'antikorpi anti-AR IgG (1:1,000; Bijossijiet; Beijing iċ-Ċina), u antikorpi anti-GAPDH poliklonali tal-ġrieden (1:1,000; Bijoloġiċi ta 'Wuhan BosterTeknoloġija, Wuhan, Ċina) jew antikorpi anti-Lamin b1 poliklonali tal-ġrieden għal 2 siegħa. Il-membrana nħaslet tliet darbiet bit-TBST u inkubata b'antikorp IgG tal-fenek kontra l-ġurdien ikkonjugat mill-HRP (1:5,000; Bijossijiet; Beijing iċ-Ċina). Is-sinjal ġie viżwalizzat bl-użu tas-Sistema tal-Immaġini ChemiDoc (Tanon-3,500, Shanghai, iċ-Ċina).

Assaġġ tal-Kromatografija Likwida ta' Prestazzjoni Għolja (HPLC). Id- demm inġabar f' tubi tal- ħġieġ eparinazzati. Il-plażma kienet separata b'ċentrifugazzjoni immedjata f'6,000 rpm għal 10 minuti u maħżuna f'temperatura ta' -20 °C għal aktar esperiment. Il-kampjuni tal-ipotalamu u tat-testikoli minn kull punt ta' ħin inġabru u ġew omoġenizzati bil-metanol. Wara ċ-ċentrifugazzjoni f'10,000 rpm f'4 °C għal 10 min, is-supernatant kien ikkonċentrat b'N2 u r-residwu ġie maħlul f'50 μL ta' metanol u ffiltrat minn flter ta' 0.45 μm. Għaxar μL tal-likwidu ffiltrat tal-kampjun ġie injettat fis-sistema HPLC għall-analiżi.

Il-kurva standard kienet tikkonsisti f'kampjuni li fihom 50, 100, 250, 500 u 750 ng/mL tal-ECH(Echinacoside mill-cistanche)(Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Sichuan, iċ-Ċina). Kampjuni ta' kontroll tal-kwalità tal-plażma miżjuda b'75ng/mL (baxx), 150 ng/mL (medju) u 300 ng/mL (għoli) tal-ECH kienu ppreparati kif xieraq biex ikejlu l-eżattezza u l-preċiżjoni tal-metodu.

Il-kromatografija twettqet b'sistema HPLC (serje Elite D2000, Hitachi, il-Ġappun) flimkien ma' ditekter UV (L-2400, Hitachi, il-Ġappun). Is-separazzjoni saret fuq kolonna termo-C18 (250 mm × 4.6 mm i.d., 4.6 μm partiċelli) miżmuma f'25 °C. Il-fażi mobbli kienet xaqliba ppreparata minn 0.1% aċidu fosforiku li fih 0.04% trimethylamine (komponent A) u metanol (komponent B). Il-gradjent lineari kien kif ġej: 70-90% A aktar minn 0-2 min, 60-70% A aktar minn 2-6 min, 55-60% B aktar minn 6-8 min u mbagħad irritorna għal 90% A fi 8 minuti immedjatament. Ir-rata tal-fluss kienet 0.8 mL / min. Id-ditekter UV kien operat fi 332 nm. L-erja tal-Quċċata ġiet evalwata bħala l-kejl analitiku.

Studji farmakokinetiċi fil- ġrieden. Il-penetrazzjoni tal-ECH(Echinacoside mill-cistanche)għall-ipotalamu u t-testikoli kienu soġġetti għal analiżi farmakokinetika bis-softwer tad-Droga u l-Istatistika (Drug and Statistics, Mathematical pharmacology Professional Committee of China). Il- parametri farmakokinetiċi kienu determinati bl- użu tal- metodu mhux kompartimentali bbażat fuq it- teorija tal- mument statistiku. Il- parametri farmakokinetiċi preliminari inkluż il- ħin sal- ogħla kostant (Tmax), l- ogħla konċentrazzjoni (Cmax), il- kostant tar- rata ta ' eliminazzjoni (Ke), il- half- life ta ' l- eliminazzjoni (T0. 5), l- erja taħt il- kurva (AUC0- 12), il- volum ta ' distribuzzjoni apparenti (Vc), u t- tneħħija (CL) inkisbu għal aktar analiżi. Il- proporzjonijiet tal- moħħ/ plażma kienu kkalkulati fuq il- bażi tal- valuri AUC0- t għall- plażma u l- moħħ.

Sinteżi u identifikazzjoni ta' ECH-Ovalbumin (ECH-OVA). Total ta ' 9.(Echinacoside mill-cistanche)u 1.0 mg ta' butanediol anhydride ġew maħlula f'2 mL pyridine, imħallta għal 12-il siegħa waqt li tħawwdu f'temperatura ambjentali. It-taħlita kienet ikkonċentrata minn N2 u r-residwu ġie kkombinat ma' 10.8 mg ta' N-hydroxysuccinimide (NHS) u 19.3 mg ta' dicyclohexylcarbodiimide (DCC) u maħlul f'4 mL N, N-dimethylformamide (DMF) għal 12-il siegħa b'tħawwid f'temperatura ambjentali. Wara ċ-ċentrifugazzjoni f'2,000 g għal 5 min f'4 °C, is-supernatant ġie miżjud ma' 5 mL ta' PBS li fih ġie maħlul 14.4 mg ovalbumin (OVA). It-taħlita l-ġdida tħawwad għal 24 siegħa f'temperatura ta' 4 °C. Is-soluzzjoni tar-reazzjoni mbagħad ġiet ċempel kontra l-PBS għal tlett ijiem. Il- preżenza ta ' ECH- OVA kienet ikkonfermata minn spettra UV (Strumenti Shimadzu Scientifc, Inc. Columbia, MD USA) f' wavelength li tvarja minn 190 sa 400 nm kif ukoll minn paġna ta ' denaturazzjoni.

ELISA indiretta (iELISA). Pjanċa mikrotiter kienet miksija bl-ECH-OVA (2 μg/100 μL) u inkubata matul il-lejl f'4 °C. Il-pjanċa nħaslet tliet darbiet bil-PBST u darbtejn bil-PBS; u 5% PBSM (PBS li fih 5% ħalib xkumat) ġie miżjud biex jimblokka s-siti mhux marbuta f'temperatura ta' 37 °C għal 2 siegħa. Wara li l-pjanċi nħaslu bil-PBST u l-PBS, il-bjar kienu maqsuma f'4 gruppi; grupp sperimentali, proteina totali ta' 1 μg AR/100 μL; grupp pożittiv, antikorp kontra l-OVA tal-fenek (1:1,000); grupp negattiv, 1 μg ta' albumina tas-serum tal-bovini; u grupp vojt li fih il-PBS. Wara l-inkubazzjoni għal 1.5 siegħa, il-pjanċi nħaslu, u 100 μL/bir ta' IgG ikkonjugat mill-Fenek HRP (1:1,000) ġie miżjud mal-grupp pożittiv, 100 μL/bir ta' anti-AR ġie miżjud (1:1,000) mal-gruppi l-oħra. Wara inkubazzjoni għal 1.5 siegħa, il-Fenek imċaqlaq mill-HRP (1:5,000) dilwizzjoni ġiet miżjuda mal-pjanċi. Wara l-inkubazzjoni f'temperatura ta' 37 °C għal 1 siegħa, il-pjanċi nħaslu tliet darbiet bil-PBST u darbtejn bil-PBS. TMB imbagħad ġie miżjud u inkubat għal 10 min fid-dlam f'temperatura tal-kamra u 2 M H2SO4 ġie miżjud biex iwaqqaf ir-reazzjoni. L-assorbenza nqrat f'wavelength ta' 450 nm.

Docking molekulari. Sar studju molekulari tad-docking biex jiġi investigat il-mod ta' rbit tal-ECH kompost(Echinacoside mill-cistanche)għar- riċettur ta ' l- androġen uman (AR) bl- użu ta ' Autodock vina 1. 1. 2 (http://vina.scripps.edu). L-istruttura tridimensjonali (3D) ta 'AR (PDB ID: 2YHD) tniżżlet mill-Protein Data Bank (http://www. rcsb.org/pdb/home/hone.do). L-istruttura 3D ta 'ECH inkisbet minn softwer ChemBioDraw Ultra 14.0 u ChemBio 3D Ultra 14.0. Il-pakkett AutoDockTools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu) kien użat biex jiġġenera l-fajls tad-dħul tad-docking. Il-grilja tat-tfittxija ta 'AR ġiet identifikata bħala ċentru x: 36.141, ċentru y: 8.513, u ċentru z:

21.304 b'dimensjonijiet daqs x: 15, daqs y: 15, u daqs z: 15. Il-valur tal-eżawriment ġie stabbilit għal 20. Għad-docking vina, il-parametri default intużaw jekk ma ssemmietx. Il-pożizzjoni tal-aħjar punteġġ kif iġġudikata mill-punteġġ tad-docking Vina intgħażlet u ġiet analizzata viżwalment bl-użu tas-softwer PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org).

Analiżi tad-dejta u metodi statistiċi. Id-dejta ġiet analizzata bl-użu ta 'softwer statistiku SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). ANOVA f'direzzjoni waħda kienet impjegata għat-tqabbil fost il-gruppi. It-testijiet ta 'tqabbil ta' Tukey ta 'differenzi sinifikanti fost il-gruppi ġew determinati. Ir-riżultati ġew espressi bħala medja ± devjazzjoni standard (SD) bl-użu tas-softwer Graph Pad Prism v.7 (Software GraphPad, Inc, California, USA).

Approvazzjoni tal-etika u kunsens għall-parteċipazzjoni. L-approvazzjoni etika għal dan l-istudju nkisbet mill-Kumitat tal-Etika tal-Istitut tat-Teknoloġija ta 'Anyang.

Referenzi

1. Cano, S. N., Misra, M. &Ackerman, K. E. Eżerċizzju, taħriġ, u l-assi ipotalamiċi-pitwitarju-gonadali fl-irġiel u n-nisa. Quddiem. Horm. Riż. 47, 27–43 (2016).

2. Papadopoulos, V. &miller, W. L. Role of mitochondria in steroidogenesis. Best Pract. Res. Cl. En. 26, 771–790 (2012).

3. Rone, M. B. et al. Identifikazzjoni ta 'kumpless dinamiku tal-proteina mitokondrijali li jmexxi l-importazzjoni, it-traffikar u l-metaboliżmu għal ormon sterojdi. Mol. Endocrinol. 26, 1868–1882 (2012).

4. Shibari, S., Ylonen, H. &Palme, R. Eskrezzjoni u kejl tal-metaboliti tal-kortikosteron u tat-testosterone fil-voles bankarji (Myodes glareolus). Ġen Comp. Endocrinol. 243, 39–50 (2017).

5. O'Hara, L. et al. Is- sinjalar tar- riċettur pitwitarju androgen jirregola l- prolactin iżda mhux il- gonadotrofini fil- ġurdien maskili. PloS wieħed. 10, e0121657 (2015).

6. Amador, A. G., Parkening, T. A., Beamer, W. G., Bartke, A. &Collins, TJ Riċetturi testikulari LH u livelli ta 'ormoni li jiċċirkolaw fi tliet mudelli tal-ġrieden għal mard li jintiret (Tfm / y, mixgħul / mixgħul u hyt / hyt). Endocrinol. Exp. 20, 349–58 (1986).

7. Bulldan, A., Dietze, R., Shihan, M. &Scheiner-Bobis, G. Sinjalar mhux klassiku tat-testosterone medjat permezz taż-ZIP9 jistimula l-espressjoni tal-claudin u l-formazzjoni stretta tal-junction fiċ-ċelloli Sertoli. Ċelloli. Sinjal. 28, 1075–85 (2016).

8. Walker, W. H. Sinjalazzjoni tat-testosterone u r-regolazzjoni ta 'spermatoġenesi. Spermatoġenesi. 1, 116–20 (2011).

9. Cao, C. &Serċ, K. Il-Kimika Mediċinali tal-Ispeċijiet tal-Echinacea (ed. Kindscher, K.) 127–145 (Springer, 2016).

10. Jiang, Z. H., Jian, W., Li, X. P. &zhang, X. Y.EchinacosideUCistanche tubulosa (Schenk) R. Wight ameliorate bisfenol A-indotta ta 'ħsara fit-testikulari u l-isperma fil-firien permezz ta' enzimi sterojdi regolati mill-assi gonad. J. Ethnopharmacol. 193, 321–328 (2016).