PartⅡ:Iżolament Iggwidat minn Dereplication Ta Diglycosides Ġodda Sostituti bil-Phenylpropanoid Minn Cistanche Salsa U l-Attività Inibitorja Tagħhom fuq L-EBDA Produzzjoni f'Macrophage

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Lura għall-Parti Ⅰ

Grupp 3-methylbutenyl, sottostruttura ta 'aglycone, kien issuġġerit mill-korrelazzjonijiet COSY ta' H-2 ma' H-1a u H-1b u l-korrelazzjonijiet HMBC bejn H{{ 4}} u H-5 u l-karbonju olefinic, f'kC 120.7 (C-2) ​​u 136.4 (C-3). Żewġ partijiet taz-zokkor ġew stabbiliti mill-analiżi tal-ispettra NMR u l-analiżi tal-ispettra HPLC tal-idrolisat tal-aċidu, b'mudell tal-framment MS. Il-konfigurazzjoni assoluta tagħhom ġiet determinata li hija D-glucose u L-rhamnose bl-użu ta 'analiżi HPLC ta' l-idrolizzat ta 'l-aċidu [17]. Dawn il-moeties taz-zokkor ġew definiti bħala a-glukożju u a-rhamnose billi l-kostanti tal-akkoppjar tal-protoni anomeriċi. L-ispettru 1H-1H COZY wera korrelazzjonijiet sekwenzjali minn H-13 sa H-63 u minn H{-133 sa H-633 (Figura 4).

A proton tal-glukożju downshifted f'kH 4.70 (H-43) issuġġerixxa sostitut-aċil fuq il-glukożju. Mill-ispettru HMBC, il-korrelazzjoni bejn H-43 u C{-9333 ikkonfermat il-pożizzjoni tas-sostituent caffeoyl. Il-korrelazzjonijiet HMBC bejn H-13 u C-1 (kC 64.5) u bejn H{-33 (kH 3.68) u C{-133 (kC 101.2) issuġġerew il-pożizzjonijiet ta' kull sostituent . Għaldaqstant, l-istruttura ta' 6 ġiet iddeterminata bħala 3-methylbutenyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D- glucose-pyranoside u msemmi cistansalside B.

Cistansalside C (12), trab amorfu kannella, ġie determinat li għandu formula molekulari ta' C26H38O13 minn ( plus )-HR-ESI-QTOF-MS, li wera quċċata f'm/z 581.2213 [M plus Na] plus (calcd . għal C26H38O13Na, 581.2205). Jon karatteristiku f'm/z 163 issuġġerixxa li kien jeżisti sostitut tal-caffeoyl fl-istruttura. Il-jonji tal-frammenti f'm/z 325 u m/z 471 issuġġerew l-eżistenza ta 'unità rhamnose u unità ta' glukożju.

It-tqabbil tal-ispettri NMR ta '12 ma' dawk ta '6 wera li kienu simili ħlief għall-istruttura tal-aglycone. Fl-ispettri NMR ta' 12, ġew osservati żewġ karbonju paraffiniċi f'kC 38.0 (C-2) u 24.4 (C-3) ​​minflok żewġ karbonju olefiniċi f'kC 12{{16 }}.7 (C-2) u 136.4 (C-3) fl-aglycone ta' 6. Il-gruppi tal-metil ġerminali (kH 0.88) fl-aglycone ta' 12 ġew imċaqalqa 'l fuq. relattiv għal H-4 u H-5 (kH 1.71 u 1.63) fl-aglycone ta' 6 (Tabella 2). L-aglycone ta' 12 ġie ssuġġerit li jkun grupp 3-methyl butyl, li ġie kkonfermat mill-ispettri 1H u COSY NMR. Il-qċaċet tal-grupp 3-methyl butyl kienu osservati fi 3.81 (1H, m, H-1a), 3.48 (1H, m, H{-1b), 1.71 (1H, m). , H-3), 1.44 (2H, m, H-2), u 0.88 (H{-4, 5).

Żewġ porzjonijiet taz-zokkor ġew affermati mill-ġdid mill-analiżi HPLC tal-idrolizzat tal-aċidu u l-analiżi tal-ispettra NMR kif ukoll il-mudell tal-framment MS. Il-konfigurazzjonijiet assoluti taz-zokkor ġew identifikati bħala D-glucose u L-rhamnose bl-użu ta' analiżi HPLC ta' l-idrolizzat ta' l-aċidu [17]. A -moety ta' glukożju u a-rhamnose moety ġew ikkonfermati mill-kostanti ta' akkoppjar tal-protoni anomeriċi. L-ispettru 1H-1H COZY wera korrelazzjonijiet sekwenzjali minn H-13 għal H-53, minn H-133 għal H-333, u minn H{{11} } sa H-433 (Figura 4).

Il-pożizzjoni tas-sostituenti ġiet ikkonfermata permezz tal-analiżi HMBC. Fl-ispettru HMBC, il-korrelazzjonijiet bejn H-13 u C-1 (kC 67.2), bejn H-33 (kH 3.68) u C-133 (kC 101.2) u bejn Instabu H-43 (kH 4.70) u C-9333 (kC 165.7). Konsegwentement, l-istruttura ta' 12 ġiet stabbilita bħala 3-methyl butyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucose-pyranoside u jismu cistansalside C.

Cistansalside D (17), trab kannella amorfu, ġie determinat li għandu formula molekulari ta 'C31H38O14 bil-mod pożittiv ta' riżoluzzjoni għolja ESI-QTOF-MS, li wera quċċata ta 'jone adduct f'm/z 657.2147 [M flimkien ma' Na] plus (ikkalkolat għal C31H38O14Na, 657.2154). Framment ta' joni inkluż [M plus H x Aglycone x Rha x Acetyl Glc] flimkien ma' jone f'm/z 147, [M flimkien ma' H x Aglycone x Rha] flimkien ma' jone f'm/z 351 u [M plus H x Aglycone] plus jone f'm/z 497 ġew skoperti wkoll. Jon karatteristiku f'm/z 147 issuġġerixxa li sostituent coumaroyl kien preżenti fl-istruttura tiegħu. Il-jonji tal-frammenti f'm/z 351 u m/z 497 issuġġerew l-eżistenza ta 'unità rhamnose u unità ta' glukożju sostitwit bl-aċetil.

Cistansalside minncistanche herb

L-ispettru 13C-NMR żvela l-preżenza ta '31 atomu tal-karbonju. Żewġ protoni anomeriċi f'kH 4.61 (1H, m, H-13) u 4.60 (1H, s, H{{1{0}}) ġew osservati fl-ispettri 1H u HSQC . L-ispettru 1H-NMR indika l-preżenza ta' grupp tal-metil f'1.97 (3H, s, acetyl-CH3), trans-olefin f'kH 7.55 (1H, d, J=15.9 Hz, H{{ 25}}) u 6.34 (1H, d, J=15.9 Hz, H{-8333) u żewġ ċrieki tal-benżin para-sostituti f'kH 7.53 (2H, d, J=6. 9 Hz, H-3333, 5333) u 6.79 (2H, d, J=6.9 Hz, H{-2333, 6333)/ kH 6.98 (2H, d, J {{5 0}}.0 Hz, H-2, 6) u 6.65 (2H, d, J=8.0 Hz, H{-3, 5) (Tabella 2) . Mill-ispettru HMBC NMR, il-korrelazzjonijiet bejn karbonil karboniku f'kc 165.5 (C-9333) u H-8333 u bejn H{-2333, 6333, u C-7333 (kc 145.4) issuġġerixxa grupp (E)-coumaroyl. Il-korrelazzjoni HMBC bejn quċċata ta 'methyl proton u carbonyl carbon f'kc 169.0 ikkonfermat il-preżenza ta' grupp acetyl.

Ġie ssuġġerit grupp 4-hydroxyphenyl ibbażat fuq il-korrelazzjonijiet HMBC bejn H-3, 5, u karbonji aromatiċi kwaternarji f'kC 155.6 (C-4) u 128.6 (C{-1) . Grupp etil idrossilat ġie kkonfermat mis-sinjali COSY NMR f'kH 2.66 (2H, t, J=6.1 Hz, H{-7), 3.90 (1H, m, H-8a ) u 3.54 (1H, m, H-8b). Il-korrelazzjonijiet HMBC bejn H-7 u C-1 (kC 128.6) u C-2, 6 (kC 129.7) issuġġerew grupp 4-hydroxyphenylethyl, bħala sottostruttura ta 'aglycone.

Żewġ porzjonijiet taz-zokkor, issuġġeriti mill-mudell tal-framment MS, ġew ikkonfermati mill-ġdid bl-analiżi HPLC tal-idrolizzat tal-aċidu u l-ispettri NMR. D-glucose u L-rhamnose ġew spjegati bl-użu ta 'analiżi HPLC ta' l-idrolizzat ta 'l-aċidu [17]. A -moety tal-glukożju u a-rhamnose miety ġew stabbiliti mill-kostanti tal-akkoppjar tal-protoni anomeriċi. L-ispettru 1H-1H COZY wera korrelazzjonijiet sekwenzjali minn H-13 sa H-53 u minn H-133 sa H-633 (Figura 4).

Mill-ispettru 1H-NMR, iċ-ċaqliq 'l isfel fil-kamp ta' H-23 (kH 4.69) u H-43 (kH 4.8{0) issuġġerixxa l-pożizzjoni sostitwita bl-aċil fuq il-glukożju. Il-konnessjonijiet bejn il-glukożju u żewġ gruppi aċil ġew ikkonfermati mill-korrelazzjonijiet HMBC bejn H-43 (kH 4.80) u C-9333 u bejn H{-23 u karbonil karboniku ta' grupp aċetil (kC 169.0) ). Il-pożizzjonijiet ta' aglycone u rhamnose ġew mogħtija mill-korrelazzjonijiet HMBC bejn H-33 (kH 3.95) u C-1333 u bejn H-8 u C-13. Għaldaqstant, l-istruttura ta' 17 ġiet assenjata bħala 4-hydroxyphenylethyl-2-O-acetyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)- cumaroyl- -D-glucopyranoside u msemmi cistansalside D.

Cistansalside E (18) kien iżolat bħala trab kannella amorfu. Il-formula molekulari tagħha ġiet iddeterminata li hija C31H38O14 permezz ta 'dejta 13C-NMR u l-ogħla modalità ESI-QTOF-MS b'riżoluzzjoni għolja f'm/z 657.2166 [M plus Na] plus (kalkut. għal C31H38O14Na, 657.2154). Barra minn hekk, jonji framment li jinkludu jone caffeoyl f'm/z 163, [M plus H x Aglycone x Rha] flimkien ma jone f'm/z 367 u [M plus H x Aglycone]jon f'm/z 513 ġew ukoll skoperti. Il-jonji tal-frammenti ssuġġerew l-eżistenza ta 'unità rhamnose u unità ta' glukożju sostitwit bl-aċetil.

L-ispettru 1H-NMR issuġġerixxa l-preżenza ta' żewġ protoni anomeriċi f'kH 4.63 (1H, d, J=8.2 Hz, H-13) u 4.60 (1H, s, H-133 ) u żewġ protoni tal-glukożju sostitwiti bl-aċil f'kH 4.71 (1H, dd, J=8.9, 8.2 Hz, H{-23) u 4.81 (1H, dd, J=9}.7 , 9.5 Hz, H-43). L-ispettri 1H u HMBC issuġġerew l-eżistenza ta' grupp aċetil f'kH 1.94 (3H, s, acetyl-CH3), frazzjoni (E)-caffeoyl f'kH 7.48 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7333), 7.02 (1H, d, J=1.6 Hz, H{-2333), 6.98 (1H, dd, J {= 8.1, 1.6 Hz, H-6333), 6.76 (1H,d, J=8.1 Hz, H{-5333) u 6.21 (1H, d, J=15.9 Hz, H{ {67}}) u ċirku tal-benżin mono-sostitwit f'kH 7.29 (2H, m, H-3, 5), 7.21 (2H, m, H-2, 6) u 7.20 (1H, m, H-4) (Tabella 2). Grupp fenilmetil, sottostruttura ta' aglycone, ġie ssuġġerit mill-korrelazzjonijiet HMBC bejn H-7 (2H, kH 2.80, m) u C-1 (kC 138.8) u bejn H-7 u C -2, 6 (kC 128.9) u s-sinjali COSY NMR ta' H-7 b'H-8a (1H, kH 3.99, m) u H{-8b (1H, kH 3.63, m).

Żewġ partijiet taz-zokkor ġew affermati mill-ġdid bl-analiżi HPLC tal-idrolizzat tal-aċidu u l-analiżi tal-ispettra NMR. Il-konfigurazzjonijiet assoluti taz-zokkor ġew spjegati bl-użu ta' analiżi HPLC tal-idrolisat tal-aċidu, li ġew ikkonfermati li huma D-glucose u L-rhamnose [17]. A -moety tal-glukożju u an -rhamnose miety ġew stabbiliti mill-kostanti tal-akkoppjar tal-protoni anomeriċi. L-ispettru 1H-1H COZY wera korrelazzjonijiet sekwenzjali minn H-13 għal H-53, minn H-133 għal H-233, u minn H{{11} } sa H-333 (Figura 4).

Mill-ispettru HMBC, il-korrelazzjonijiet bejn H{{0}} u C-8 (kC 69.4), bejn H-23 u karbonil karboniku ta' grupp aċetil (kC 169.1), bejn H-33 (kH 3.95) u C-133 (kC 102.0) u bejn H{-43 (kH 4.81) u C-9333 (kC 165.6) ikkonfermaw il-pożizzjoni tas-sostituenti fi l-istruttura. Għalhekk, l-istruttura ta' 18 ġiet iddeterminata li hija phenylethyl-2-O-acetyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucopyranoside u jismu cistansalside E.

Ħafna mis-sostituenti trans-cinnamoyl kienu isomerizzati għall-isoform cis in vitro. Ġie rrappurtat li d-dawl jikkonverti derivattivi tal-aċidu trans-ċinnamiku f'cis-isoforms [18,19]. L-ekwilibriju tal-konverżjoni trans-cis tas-sostituenti cinnamoyl kien osservat li jżomm madwar 70 fil-mija tal-iżolati fit-trans-isoform. Għall-protoni olefin tal-forma cis, il-quċċata ta' madwar 6.90 ppm (d, J=12~13 Hz, H{-7333) u 5.80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) kienu assenjati fl-ispettri 1H-NMR, filwaqt li l-quċċati f'madwar 7.55 ppm (d, J=15.8 Hz, H{-7333) u 6.40 ppm (d, J {{ {28}}.8 Hz, H-8333) ġew osservati għal trasformazzjoni [20]. Fl-ispettru 1H-NMR ta 'taħlitiet trans-cis, qċaċet għal żewġ protoni olefinic (H-7333 u H{-8333) kienu osservati fil-proporzjon ta' 7:3 (trans:cis). Il-qċaċet 13C-NMR tal-forma cis kienu simili għal dawk tat-trasformazzjoni.

Ingredjenti effettivi minn cistanche: acteosides

L-iżolati kollha ġew ittestjati għall-effetti inibitorji tagħhom fuq il-produzzjoni ta 'NO indotta minn LPS f'RAW

L-iżolati kollha ġew ittestjati għall-effetti inibitorji tagħhom fuq il-produzzjoni ta 'NO indotta minn LPS f'ċelluli RAW 264.7. Dexamethasone intuża bħala kontroll pożittiv u l-IC50 tiegħu kien 7.0 uM. Mill-komposti ttestjati, il-komposti 5 (IC50 42.7 o 6.6 uM), 11 (IC{50 37.3 o 2.2 uM), 13 (IC{50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) u 18(IC{50 27.9 o 0.8 uM) wrew attivitajiet inibitorji moderati fuq NO synthase li jinduċibbli, filwaqt li l-komposti l-oħra kienu inattivi f'dan l-assaġġ (IC50 valuri > 100 uM). Biex tivverifika jekk dawn il-komposti kellhomx ċitotossiċità, il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet imkejla bl-użu tal-assaġġ MTT. Bħala riżultat, ħadd minnhom ma wera ċitotossiċità sinifikanti (Figura Supplimentari S6-1). Dawn l-erba 'komposti ġew magħżula biex jevalwaw l-attività inibitorja tagħhom kontra l-passaġġ NF-λB ​​f'ċelluli RAW 264.7 stimulati minn LPS. L-istimulazzjoni ta 'ċelluli RAW 264.7 b'LPS indotta l-fosforilazzjoni ta' I入B u NF-入B (p65) wara 0.5 sigħat ta 'inkubazzjoni. Il-fosforilazzjoni ta 'NF-入 B (p65) tnaqqset b'mod sinifikanti permezz ta' trattament minn qabel bil-komposti 11, 13 u 18 kif muri mill-analiżi tal-western blot (Figura 5). Għalhekk, il-komposti 11, 13 u 18 jistgħu jeżerċitaw effetti anti-infjammatorji permezz tal-inibizzjoni ta 'NF-入B fil-makrofaġi.

Figura 5.Effett ta 'erba' komposti fuq fosforilazzjoni ta 'I入B u NF-入B (p65) f'ċelluli RAW 264.7 stimulati bl-LPS. (A) Il-western blots saru f'LPS u ċelluli RAW 264.7 ittrattati bil-kampjun; (B, C) Is-sinjali immunoblot ġew ikkwantifikati bl-użu ta 'software ta' densitometrija Molecular Analyst/PC (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Analiżi densitometrika ta' iżoformi fosforilati hija rrappurtata. NF-入 B fiċ-ċellula RAW 264.7 kien normalizzat għall-kontenut ta '-actin.

3. Materjali u Metodi

3.1. Esperiment Ġenerali Proċedura

Ir-rotazzjoni ottika tkejjel b'polarimetru diġitali Jasco P-2000 (Jasco, Tokyo, Ġappun). L-ispettri tal-UV ġew irreġistrati fuq spettrometru ta' Chirascan plus Circular Dichroism (Chirascan, APL, UK). L-ispettri IR ġew irreġistrati bl-użu ta' spettrofotometru Jasco FT/IR-4200. Spettrometrija tal-massa quadrupole-time-of-flight (HR-ESI-qTOF-MS) ta 'jonizzazzjoni elettrospray b'riżoluzzjoni għolja saret fuq Q-TOF LC/MS Agilent 6530 Accurate-Mass mgħammra b'serje Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, USA), u l-kolonna użata kienet kolonna Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id 150 4.6 mm, 5 um). MassHunter Workstation Software intuża għall-akkwist tad-dejta.

L-ispettri NMR 1D (1H u 13C) u 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) inkisbu b'Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Japan), Bruker AVANCE-400, Bruker Spettrometri AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 u Bruker AVANCE 800 HD flimkien ma' cryoprobe (Bruker, Ettlingen, il-Ġermanja). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, In Cistanche Andover, MA, USA) intuża bħala solvent NMR u qċaċet ta 'referenza (kH 2.50 u kC 39.5). Il-kromatografija tal-kolonna (CC) saret bl-użu ta' Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, l-Isvezja) jew Kieselgel 60 silica gel (40–63 um, 230–400 malja, Art. 9385; Merck, Darmstadt , il-Ġermanja). Il-kromatografija ta 'saff irqiq (TLC) saret fuq pjanċi Kieselgel 60 silica gel F254 miksija minn qabel (Art. 5715; Merck). Spots fuq TLC ġew skoperti bl-użu ta 'lampa UV f'254 nm u 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Franza). Il-kromatografija likwida bi pressjoni medja (MPLC) saret fuq kolonna tal-flash tas-silika RediSep 120 g (Isco, Lincoln, NE, USA) u ġel tas-silika Kiesegel 60 (40–63 um, 230–400 malja, Art. 9385; Merck) bl-użu ta’ ġel tas-silika. Kumpannija Combiflash (Isco). Is-sistema ta’ kromatografija likwida bi pressjoni għolja (HPLC) kienet Gilson HPLC mgħammra b’pompa Gilson 321 u detector UV.VIS 151 (Gilson, Middleton, WI, USA), bl-użu ta’ kolonni ODS semi-preparattivi (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, il-Ġermanja; Inno C18 kolonna 120 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea). Is-sistema analitika RP-HPLC kienet sistema ta 'alleanza Waters 2695 b'ditekter a996 Photodiode Array (PDA) (Waters Corp, Milford, MA, USA), u l-kolonna użata kienet kolonna Hypersil™ BDS C18 (130 Å, id 150: 4.6). mm, 5 um, Thermo Scientific™). L-aċidu formiku nxtara minn Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seoul, Korea). Is-solventi tal-grad HPLC inxtraw minn Fisher Scientific Korea Ltd. (Seoul, Korea). H2SO4, Na2CO3, u solventi tal-ewwel grad għall-estrazzjoni, il-frazzjonament, u l-iżolament inxtraw minn Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seoul, Korea). L- u D-cysteine ​​methyl ester hydrochloride u o-tolylisothiocyanate nxtraw minn Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Ġappun).

3.2. Pjanta Materjal

Il-pjanti kollha taSalsa Cistanche, li nġabru mix-Shinjang Uyghur, ġew importati permezz ta' Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Korea). Ġew identifikati mill-Prof. Dr. Jehyun Lee (Università Dongguk, Seoul, Korea). Il-kampjun tal-vawċer (SNUPH2016-03) ġie depożitat fl-Erbarju tal-Ġnien tal-Pjanti Mediċinali, il-Kulleġġ tal-Farmaċija, l-Università Nazzjonali ta' Seoul.

3.3. Estrazzjoni u Iżolament

Il-pjanti sħaħ imnixxfa taSalsa Cistanche(5.7 kg) ġew imqattgħin u estratti tliet darbiet b'MeOH (20 L) f'temperatura tal-kamra bl-ivvibrar għal 99 min. Wara t-tneħħija tas-solvent fil-vakwu, L-estratt mhux raffinat (1.35 kg) ġie sospiż f'H2O (5 L), imbagħad maqsum b'EtOAc (5 L). Ir-residwu tal-EtOAc (55.3 g) ġie separat f'16-il frazzjoni (E01-16) fuq kromatografija tal-ġel tas-silika elużi b'CHCl3/MeOH (50:1-0:1, sistema ta' grad ta' pass).

E08 (611.7 mg) kien soġġett għal kromatografija likwida ta' pressjoni medja tal-ġel tas-silika (25 g) u eluwit b'CHCl3/MeOH (18:1–0:1, sistema ta' gradjent ta' pass) u ta 11-il frazzjoni (E08a-k). Minn E08g, il-komposti 13 (0.7 mg) u 18 (0.6 mg) ġew purifikati bl-użu ta 'kolonna Luna 5 um HPLC u eluzzjoni iżokratika bi 28 fil-mija aq. MeCN. Il-purifikazzjoni HPLC (Hypersil GOLD, 25 fil-mija aq. MeCN) ta 'E08h (138.5 mg) fornita komposti 7 (10.6 mg), 8 (17.2 mg), 14 (13.4 mg) u 17 (4.9 mg).

E{8}}9 (1.15 g) kien ippurifikat aktar fuq kolonna tas-silika-MPLC (2{0 g) elużjoni b'CHCl3/MeOH (10:1–0:1, pass- sistema ta’ gradjent) biex tagħti 11-il subfrazzjoni (E09a-k). E09e (398.7 mg) kien soġġett għal Sephadex LH-20 (MeOH) u ta tmien subfrazzjonijiet (E09e1-8). E09e6 sussegwentement ġie purifikat bl-użu ta 'kolonna Hypersil GOLD HPLC (22 fil-mija aq. MeCN) biex jagħti l-kompost 11 (0.4 mg). Minn E09e7, il-kompost 5 (0.6 mg) ġie purifikat b'eluzzjoni iżokratika minn kolonna Luna 5 um HPLC b'40 fil-mija aq. MeOH.

E10 (1.20 g) ġie separat f'disa' frazzjonijiet (E10ai) fuq kolonna Sephadex LH-20 elużjoni b'MeOH. Minn E10g (147.5 mg), il-komposti 4 (13.4 mg), 9 (8.0 mg) u 15 (5.0 mg) ġew iżolati b'separazzjoni HPLC (Inno, 23 fil-mija aq. MeCN). Il-frazzjoni E10h (470.0 mg) ġiet ippurifikata fuq kolonna Hypersil GOLD b'eluzzjoni isokratika (40 fil-mija aq. MeOH) biex tagħti l-komposti 1 (3.8 mg), 10 (42.1 mg) u 16 (3.0 mg).

E11 (2.96 g) kien soġġett għal Sephadex LH-20 elużjoni b'MeOH biex jagħti disa' frazzjonijiet (E11a-i). E11e kien separat mill-iskartoċċ Sep-Pak C18 elużjoni pass pass b'10 fil-mija, 20 fil-mija, 30 fil-mija, 50 fil-mija u 100 fil-mija aq. MeOH biex jagħti seba' frazzjonijiet (E11e1-7), segwit minn Luna 5 um HPLC (28 fil-mija aq. MeCN) biex jagħti komposti 3 (3.4 mg), 6 (1.4 mg) u 12 (1.2 mg).

E12 (19.0 g) kien suġġett għal silika MPLC (120 g) bl-użu ta' sistema ta' gradient ta' CHCl3/MeOH biex tagħti sitt frazzjonijiet (18:1–0:1 , E12a-f). E12f ġie kromatografat fuq kolonna Sephadex LH-20 (MeOH), li ta seba' frazzjonijiet (E12f1-7). Purifikazzjoni HPLC (Hypersil GOLD, 25 fil-mija aq. MeCN) ta 'E12f7 fornut kompost 2 (3.3 mg). Is-solventi kollha użati għall-HPLC kienu buffer ta 'aċidu formiku ta' 0.05 fil-mija. Ir-rata ta' fluss komuni għall-kromatografija HPLC u MPLC kienet ta' 3 u 40 mL/min, rispettivament.

3.4.Karatterizzazzjoni

Cistansalside A (5): trab amorfu kannella; [ |20 x33.7 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3.18); IR (pulita) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; Data 1H-NMR (800 MHz) u 13C-NMR (200 MHz), ara Tabella 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M flimkien ma' Na] flimkien ma' 645.2146 (kalkoli għal C30H38O14Na, 645.2154).

Cistansalside B (6): trab amorfu kannella; [ |20 x72.9 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3.32); IR (pulita) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; Data 1H-NMR (500 MHz) u 13C-NMR (125 MHz), ara Tabella 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M flimkien ma' Na] flimkien ma' 579.2054 (kalkoli għal C26H36O13Na, 579.2048).

Cistansalside C (12): trab amorfu kannella; [ |20 x61.6 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3.25); IR (pulita) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; Data 1H-NMR (800 MHz) u 13C-NMR (200 MHz), ara Tabella 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M flimkien ma' Na] flimkien ma' 581.2213 (kalkoli għal C26H38O13Na, 581.2205).

Cistansalside D (17): trab amorfu kannella; [ |20 x51.1 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3.53), 315 (3.52); IR (pulita) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; Data 1H-NMR(400 MHz) u 13C-NMR (75 MHz), ara Tabella 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M flimkien ma' Na] flimkien ma' 657.2147 (kalkoli għal C31H38O14Na, 657.2154).

Cistansalside E (18): trab amorfu kannella; [ |20 x59.2 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3.22); IR (pulita) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; Data 1H-NMR (800 MHz) u 13C-NMR (200 MHz), ara Tabella 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M flimkien ma' Na] flimkien ma' 657.2166 (kalkoli għal C31H38O14Na, 657.2154)

3.5.HPLC-QTOF-MS Analiżi

L-analiżi tal-ispettrometrija tal-massa kromatografika saret fuq sistema LC tas-serje Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc., USA). Il-kolonna analitika kienet kolonna SFCpak Crest C18T-5 (id 15{{10}} : 4.6 mm, 5 um, Jasco, il-Ġappun). Il-fażi mobbli kienet tikkonsisti f'0.1 fil-mija (v/v) aċidu formiku f'MeCN (A) u ilma (B) bl-użu ta' elużjoni tal-gradjent ta' 0-35 min (23 fil-mija A), 35-45 min ( 23–28 fil-mija A), 45–75 min (28 fil-mija A) u 75–80 min (90 fil-mija A). Ir-rata tal-fluss inżamm f'0.3 mL/min. L-assorbanza kienet imkejla f'320 nm. Il-kundizzjonijiet tas-sors ESI kienu kif ġej: rata tal-fluss tal-gass tat-tnixxif (N2), 10 L/min; temperatura tal-gass tat-tnixxif, 350 grad; nebulizzatur, 30 psig; rata tal-fluss tal-gass għant, 12.0 L/min; temperatura tal-gass għant, 350 grad; kapillari, 4000 V; skimmer, 60 V; octapole RF, 750 V; vultaġġ tal-frammentatur, 180 V; mod pożittiv. Is-sistema kienet operata taħt is-software tal-istazzjon tax-xogħol Masshunter. Il-firxa tal-massa ġiet issettjata f'm / z 50-1000.

3.6.Aċidu Idroliżi

Il-komposti ġew idrolizzati bl-użu ta' 1 N H2SO4 (100 uL) imsaħħan b'banju ta' l-ilma f'90 gradi għal 2 sigħat, imbagħad newtralizzati b'soluzzjoni ta' Na2CO3 akweja saturata. Wara li s-soluzzjonijiet ġew imnixxfa taħt nixxiegħa ta 'N2, il-prodotti u zokkor standard (D-Glc, L-Glc, L-Rha) ġew maħlula f'pyridine (100 uL) li fih L-cysteine ​​methyl ester hydrochloride (0.5 mg). Kampjun ta 'L-rhamnose ġie maħlul f'pyridine (100 uL) li kien fih id-D-cysteine ​​methyl ester hydrochloride (0.5 mg). Wara dan, ġew imsaħħna f'60 grad għal 1 h. Is-soluzzjonijiet ġew ittrattati b'1 uL (1.11 mg) ta 'o-tolylisothiocyanate, li reġgħu ġew imsaħħna f'60 grad għal siegħa. Kull taħlita finali ġiet analizzata direttament b'RP-HPLC analitiku (kolonna Hypersil™ BDS C18, 17 fil-mija aq. MeCN, 0.8 mL/min, 40 min, 35 grad). It-tR tal-quċċata f'21.9 u 40.4 min ikkoinċida ma 'dak tad-derivattiv ta' thiocarbamoyl thiazolidine ta 'D-glucose u L-rhamnose, rispettivament.

3.7. Ċellula Kultura

Makrofaġi murini, RAW 264.7, inkisbu mill-Istitut tar-Riċerka Koreana tal-Bijoxjenza u l-Bijoteknoloġija (Daejeon, Korea), u mkabbra f'medja RPMI li fiha 10 fil-mija serum bovin tal-fetu u 100 U/mL penicillin/streptomycin sulfate. Iċ-ċelloli ġew inkubati f'atmosfera umidifikata ta' 5 fil-mija CO2 f'37 grad.

3.8.Drogi u Kimiċi

RPMI, peniċillina u streptomycin inxtraw minn HyClone (Logan, UT, USA). L-albumina tas-serum bovin u l-LPS inxtraw minn Sigma (St. Louis, MO, USA).

3.9.Kejl tal-Produzzjoni NO

Il-konċentrazzjoni tan-nitrit fil-medju tal-kultura kienet imkejla bħala indikatur tal-produzzjoni ta 'NO skont ir-reazzjoni ta' Griess. Iċ-ċelloli ġew miżrugħa f'2: 105 ċelluli/bir fi 96-pjanċi ta' kultura ta' bir. Wara l-inkubazzjoni minn qabel taċ-ċelloli RAW 264.7 għal 18-il siegħa, iċ-ċelloli ġew ittrattati minn qabel b'komposti (50 uM, 10 uM, 5 uM, jew 1 uM) u stimulati b'LPS (500 ng/mL) għal 24 h. Komposti tat-test maħlul f'DMSO. Iċ-ċelloli ġew ittrattati wkoll b'0.05 fil-mija DMSO bħala kontroll tal-vettura. Ċelloli RAW 264.7 (2: 105 ċelluli/bir) ġew ikkultivati ​​fi 96-pjanċi ta 'bir bl-użu ta' RPMI mingħajr aħmar fenol u ttrattati minn qabel b'kampjuni għal 0.5 sigħat. Il-produzzjoni ta' NO ċellulari kienet indotta biż-żieda ta' 500 ng/mL konċentrazzjoni finali LPS u inkubazzjoni ta' 24 siegħa. Wara l-inkubazzjoni, 100 uL ta 'midja kondizzjonata tħalltu ma' l-istess volum ta 'reaġent Griess u inkubati għal 15-il minuta. L-assorbiment tat-taħlita f'540 nm ġiet imkejla b'qarrej tal-mikroplate ELISA (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA). Il-valuri miksuba tqabblu ma 'dawk ta' konċentrazzjonijiet standard ta 'nitritu tas-sodju maħlul f'RPMI, u ġew ikkalkulati l-konċentrazzjonijiet ta' nitrit fil-midja kondizzjonata ta 'ċelluli trattati bil-kampjun.

3.10.3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide (MTT) Assay għall-Vijabilità taċ-Ċelloli

Iċ-ċelloli ġew miżrugħa fi pjanċi ta' {{0}}bir b'densità ta' 5: 104 ċelluli/bir u inkubati b'medja ħielsa mis-serum fil-preżenza ta' kampjuni. Komposti tat-test maħlul f'DMSO. Iċ-ċelloli ġew ittrattati wkoll b'0.05 fil-mija DMSO bħala kontroll tal-vettura. Wara l-inkubazzjoni għal 24 siegħa, ġew miżjuda 10 uL MTT (5 mg/mL fis-salina) u l-inkubazzjoni kompliet għal 4 sigħat oħra. Mitochondrial succinate dehydrogenase fiċ-ċelloli ħajjin jikkonverti MTT fi kristalli formazan viżibbli waqt l-inkubazzjoni. Il-kristalli tal-formazan imbagħad ġew solubilizzati f'dimethyl sulfoxide u l-assorbiment tkejjel f'540 nm bl-użu ta 'qarrej tal-mikroplate assay immunosorbent marbut ma' enżimi (ELISA) (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). Il-vijabbiltà relattiva taċ-ċelluli ġiet ikkalkulata meta mqabbla mal-assorbiment tal-grupp ta 'kontroll mhux ittrattat. L-esperimenti kollha saru fi tliet kopji.

3.11.Analiżi Immunoblot

L-espressjoni tal-proteina ġiet evalwata permezz ta 'western blotting skont proċeduri standard. Fil-qosor, ċelluli RAW264.7 ġew ikkultivati ​​f'platti ta' kultura ta' 6{{2{0}} mm (2: 1{06/mL), segwiti minn trattament minn qabel ta' 5{{0 uM ta' komposti . Iċ-ċelloli ġew maħsula darbtejn f'PBS kiesaħ bis-silġ (pH 7.4), il-gerbub taċ-ċelluli ġew sospiżi mill-ġdid f'liżi buffer fuq is-silġ għal 15-il minuta, u l-fdalijiet taċ-ċelluli mbagħad tneħħew permezz ta 'ċentrifugazzjoni. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet iddeterminata bl-użu ta' reaġent tal-assaġġ tal-proteini Bio-Rad skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-proteina (20–30 ug) tħallat 1:1 ma' 2: buffer tal-kampjun (20 fil-mija gliċerol, 4 fil-mija SDS, 10 fil-mija 2- ME, 0.05 fil-mija bromophenol blu, u 1.25 M Tris [pH 6.8]), mgħobbija fuq ġels SDS-PAGE ta '8 jew 15 fil-mija, u taħdem f'150 V għal 90 min. Proteini ċellulari ġew trasferiti fuq membrani Immunoblot polyvinylidene difluoride (Bio-Rad) bl-użu ta 'sistema ta' trasferiment semi-dry Bio-Rad skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-membrani mbagħad ġew inkubati matul il-lejl bl-antikorpi primarji p-NF-入B, NF-入B, pI入B u -actin rispettivi (Abcam, Cambridge, UK) f'salina buffered Tris li fiha 5 fil-mija ħalib xkumat u 0.1 fil-mija Tween 20. L-għada, il-blots ġew maħsula tliet darbiet b'salina buffered Tris (0.1 fil-mija Tween 20) u inkubati għal siegħa b'antikorp sekondarju kontra l-IgG konjugat bl-HRP (dilwit 1:2000-1). :20,000). Il-blots reġgħu ġew maħsula tliet darbiet b'salina buffered Tris (0.1 fil-mija Tween 20), u meded immunoreattivi ġew żviluppati bl-użu tas-sottostrat kimiluminixxenti ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).

3.12.Analiżi Statistika

Id-dejta sperimentali hija ppreżentata bħala l-medja o SEM. Il-livell ta' sinifikat statistiku kien determinat b'analiżi tal-varjanza (ANOVA) segwit mit-test t ta' Dunnett għal paraguni multipli.p Valuri inqas minn 0.05 tqiesu sinifikanti.

Estratt tas-salsa ta' Cistanche

4. Konklużjonijiet

F'dan l-istudju, iżolajna u spjegajna l-istrutturi ta 'ħames phenylpropanoid-sostituti glycosides ġodda, imsejħa cistansalside AE ​​(5, 6, 12, 17, u 18), minbarra li iżolaw u jidentifikaw 13 komposti magħrufa, bl-użu ta 'strateġija ta' dereplication. Il-komposti magħrufa ġew determinati li huma lipedoside AI (1) [21], 23-acetylatteoside (2) [22], isocistanoside C (3) [15], osmanthuside B (4) [21], epimeridinoside A ( 7) [15], cistanoside D (8) [23], salsaside B (9) [6], tubuloside E (10) [16], cistanoside M (11) [15], isomartynoside (13) [24], salsaside C (14) [6], jionoside C (15) [25] u salsaside F (16) [6]. L-istrutturi tagħhom ġew stabbiliti permezz tal-analiżi ta 'dejta spettroskopika estensiva u b'paragun ma' dejta rrappurtata fil-letteratura. Ġie kkonfermat li l-istrutturi mbassra b'mod tentattiv ta' glikożidi sostitwiti bil-fenilpropanoid kienu mqabbla b'mod korrett mal-istrutturi reali tagħhom.

Benefiċċju ta 'estratt Salsa Cistanche

Referenzi

1. Shimamura, H.; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Soppressjoni ta 'Attività li Induċi SOS ta' Trp-P -1 minn Aċidi Xaħmin minn Salsa Cistanche fit-Test tas-Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261–265. [CrossRef]

2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Effetti Kontra l-Proliferazzjoni ta 'Cistanches salsa fuq il-Progressjoni ta' Iperplażja Beninja tal-Prostatika. Can. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]

3.Xu, C.; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Sun, S. Diskriminazzjoni Rapida ta 'Herba Cistanches permezz ta' makro-marki infra-aħmar f'diversi stadji flimkien ma 'mudellar indipendenti artab ta' analoġija tal-klassi (SIMCA). Spectrochim. Acta Parti A Mol. Bijomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]

4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Differenzjar ta 'Herba Cistanches bil-marki tas-swaba' bi kromatografija likwida ta 'prestazzjoni għolja-setezzjoni ta' array dajowd-spettrometrija tal-massa. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]

5. Kobayashi, H.; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Studji dwar il-Kostitwenti ta 'Cistanchis Herba. V. Iżolament u Strutturi ta 'Żewġ Phenylpropanoid Glycosides Ġodda, Cistanosides E u F. Chem. Pharm. Bull. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]

6.Lei, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Glycosides ġodda minn Salsa Cistanche. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79–85. [CrossRef]

7. Kartbaeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II Studju tal-kompożizzjoni ta 'komposti fenoliċi ta' Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck, li qed jikber fir-Repubblika tal-Każakstan. J. Chem. Pharm. Riż. 2015, 7, 120–122.

8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Akkumulazzjoni mtejba ta 'phenylethanoid glycosides permezz ta' għalf ta 'prekursur għal kultura ta' sospensjoni ta 'Cistanche salsa. Biochem. Inġ. J. 2007, 33, 88–93. [CrossRef]

9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; Tachibana, l-estratt tas-salsa ta 'H. Cistanche jaġixxi b'mod simili għal marbut mal-proteini

polysaccharide-K (PSK) fuq diversi tipi ta 'linji ta' ċelluli. J. Tradit. Med. 2008, 25, 166–169.

10. Tian, ​​X.-F.; Pu, X.-P. Phenylethanoid glycosides minn Cistanches salsa jinibixxi l-apoptosi indotta minn jone tal-1-metil-4-phenylpyridinium fin-newroni. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]

11.Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Kunċetti Ġodda, Approċċi Sperimentali, u Strateġiji ta 'Dereplication għall-iskoperta ta' Fitoestroġeni Ġodda minn Sorsi Naturali. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]

12.De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Dereplication-iggwidata iżolament ta 'depsides theaflavins ST u lecanora DF mill-fungus endophytic Setophoma sp. Phytochemistry 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]

13.Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodnik, C.; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Għolja, R.; TenDyke, K.; Shen, Y.; et al. Komposti antiproliferattivi u antiplasmodial minn speċi Streptomyces magħżula. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]

14.Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Iżolament iggwidat minn dereplikazzjoni ta’ saponini triterpenojdi epatoprotettivi ġodda minn Celosiae Semen permezz ta’ kromatografija likwida ta’ prestazzjoni għolja flimkien ma’ spettrometrija tal-massa ta’ jonizzazzjoni ta’ elettrospray tandem quadrupole–time-of-flight. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]

15.Zhang, J.; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. Strateġija bbażata fuq LTQ-Orbitrap għall-mediċina tradizzjonali Ċiniża mmirata għall-iskoperta tal-klassi, l-identifikazzjoni u r-riċerka omika tagħha: Studju ta 'każ dwar phenylethanoid glycosides fi tliet speċi differenti ta' Herba Cistanches. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]

16. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Il-Kostitwenti ta 'Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Iżolament u Strutturi ta 'Glycoside Phenylethanoid Ġdid u Glycoside Neolignan Ġdid. Chem. Pharm. Bull. 1990, 38, 1927–1930. [CrossRef]

17. Tanaka, T.; Nakashima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Diskriminazzjoni Faċili ta 'Enantiomers Aldose minn HPLCistancheChem ta' Fażi Maqluba. Pharm. Bull. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]

18. Wong, WS; Guo, D.; Wang, XL; Yin, ZQ; Xia, B.; Li, N. Studju ta 'aċidu cis-cinnamic f'Arabidopsis thaliana. Physiol tal-Pjanti. Biochem. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]

19.Kahnt, G. Trans-Cis-Equilibrium ta 'Aċidi Hydroxycinnamic waqt l-Irradjazzjoni ta' Soluzzjonijiet Ilmija f'pH Differenti. Phytochemistry 1967, 6, 755–758. [CrossRef]