Parassiti, Infezzjonijiet, U Inokulazzjoni f'Ċelloli Minimi Sintetiċi

ASTRATT: Ċelloli minimi sintetiċi jipprovdu mudell kontrollabbli u inġinerija għal proċessi bijoloġiċi. Filwaqt li ħafna aktar sempliċi minn kwalunkwe ċellula naturali ħajja, iċ-ċelloli sintetiċi joffru xażi għall-investigazzjoni tal-pedamenti kimiċi ta 'proċessi bijoloġiċi ewlenin. Hawnhekk, aħna nuru sistema ta 'ċelluli sintetiċi b'ċelloli ospitanti, li jinteraġixxu ma' parassiti u għaddejjin minn infezzjonijiet ta 'severità differenti. Aħna nuru kif l-ospitant jista 'jiġi mfassal biex jirreżisti l-infezzjoni, ninvestigaw l-ispiża metabolika ta' ġarr ta 'reżistenza, u nuru inokulazzjoni li timmunizza lill-ospitant kontra patoġeni. Ix-xogħol tagħna jespandi l-kaxxa tal-għodda tal-inġinerija taċ-ċelluli sintetiċi billi juri interazzjonijiet host-patoġenu u mekkaniżmi għall-akkwist tal-immunità. Dan iġib is-sistemi taċ-ċelluli sintetiċi pass eqreb biex jipprovdu mudell komprensiv ta 'ħajja kumplessa u naturali.

benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni

INTRODUZZJONI

Fl-aħħar għexieren ta 'snin, il-qasam tal-bijoloġija sintetika sploda, li jippermetti l-kostruzzjoni ta' ċelloli sintetiċi li jixbħu u jimmudellaw aspetti tal-ħajja bijoloġika naturali. L-immudellar tal-mogħdijiet u l-imġieba ċellulari fiċ-ċelloli sintetiċi joffri ħafna vantaġġi fuq ċelloli ħajjin bħal ambjent ta’ reazzjoni aktar simplifikat u definit, kontroll sħiħ fuq l-għamla proteomika u kimika taċ-ċellula, il-kapaċità li jiġu kompartimentalizzati mogħdijiet u proċessi bijoloġiċi li jinterferixxu, kif ukoll iż-żamma. sistemi bijoloġiċi importanti li huma assenti fis-sistemi ta’ reazzjoni in vitro.1,2 Dawn l-assi uniċi ta’ teknoloġiji ta’ ċelluli sintetiċi diġà ppermettew is-simulazzjoni ta’ kundizzjonijiet u mogħdijiet bijoloġiċi fi ħdan bijoreattur in vitro simili għall-ħajja (ċellula sintetika) u ġabu fehim aħjar għal ħafna oqsma ta 'studju, inkluż iffullar molekulari,3 dinamika tal-proteini tal-lipidi,4 metaboliżmu minimu,5 u ħafna aspetti kritiċi oħra tal-ħajja bijoloġika.2 Dawn iċ-ċelloli sintetiċi li jixbħu lill-ħajja bl-assi uniċi tagħhom qed isiru malajr mudelli aħjar u jitfgħu aktar dawl fuq il-ħidma interna misterjuża tal-ħajja ċellulari.6,7 Dawn il-skoperti mhumiex limitati għal proċessi ta 'ċellula waħda; interazzjonijiet ta 'inġinerija bejn popolazzjonijiet ta' liposomi wrew teknoloġija qawwija wkoll. Pereżempju, id-disinn ta’ sistema ċellulari sintetika li timita relazzjoni predatur-priża ġie żviluppat bl-użu tad-dawl bħala s-sinjal bejn dawn il-popolazzjonijiet taċ-ċelluli sintetiċi. li jippermetti li l-fluworexxenza tinfirex b'mod spazjali fost il-popolazzjoni.9 Minbarra l-interazzjonijiet taċ-ċelluli sintetiċi-ċelluli sintetiċi, kien hemm avvanzi reċenti fl-interfaces taċ-ċelluli sintetiċi-ċelluli ħajjin ukoll. Pereżempju, intwera li ċellula sintetika ddisinjata biex tgħaqqad ma’ ċellula staminali newrali hija kapaċi li tinduċi differenzjazzjoni newrali kif ukoll taġixxi bħala chassis ġeneralizzata li kapaċi tinterfaċċa ma’ tipi oħra ta’ ċelluli.10 Kien hemm għadd kbir ta’ avvanzi fl-iżvilupp. tal-propagazzjoni tas-sinjali u ċ-ċelloli sintetiċi li jaġixxu bħala interfaces, li ħafna minnhom huwa esplorat fir-reviżjonijiet li ġejjin.11-13 Fil-qosor, hemm oqsma sħaħ ta 'riċerka kkonċernati li jimitaw l-interazzjonijiet ta' popolazzjonijiet ċellulari fis-sistema mudell ta 'ċelloli sintetiċi. Minkejja dan, ma kienx hemm studju li juża ċelloli sintetiċi biex jimmudella infezzjoni, parassitiżmu, jew inokulazzjoni. Hekk kif iċ-ċelloli sintetiċi huma komunement użati biex jimmudellaw proċessi bijoloġiċi kumplessi b'mod simplifikat u kkontrollat, jeżisti l-potenzjal li jkunu jistgħu jimmudellaw dawn l-interazzjonijiet interorganiżmi kumplessi. L-importanza ta 'dan tista' tidher fl-istudju innovattiv li pproduċa b'suċċess partiċelli phage attivi fi ħdan pjattaforma ta 'espressjoni ta' proteina mingħajr ċelluli. ġenoma ta’ ċellula ospitanti, bħalma jagħmlu viruses u parassiti ħajjin. Li tkun kapaċi tapplika u tfassal ċelloli sintetiċi biex timmudella dawn l-imgieba tal-mard se tipprovdi għodda siewja lill-komunità xjentifika.

F'dan ix-xogħol, aħna juru s-sistema tagħna għall-immudellar tal-mard taċ-ċelluli sintetiċi. Inġinejna ċellula ospitanti li tista 'tgħaddi minn infezzjoni mit-tieni popolazzjoni ta' ċelloli sintetiċi parassitiċi u investigajna l-kompetizzjoni tar-riżorsi, il-ħtif tal-ġenoma, u r-ripurposing metaboliku li jseħħ waqt infezzjoni bħal din. Aħna wkoll jimmudellaw metodu li jippermetti s-salvataġġ ta 'l-ospitanti wara l-infezzjoni kif ukoll mezz ta' tilqim li jippermetti li l-ospitant jirreżisti l-infezzjoni taċ-ċelloli sintetiċi li jikkawżaw il-mard. Fil-qosor, aħna nippreżentaw chassis ġdid ta 'mudell ta' mard u infezzjoni għal ċelloli sintetiċi. B'din it-teknoloġija, iċ-ċelloli sintetiċi jistgħu jibdew jintużaw bħala mudelli rudimentali għall-mard, l-infezzjoni u t-tilqim (Figura 1).

Figura 1. Parassita, infezzjoni, u sistema ta 'tilqim f'ċelloli minimi sintetiċi. (a) Il-"host" hija ċellula sintetika li tesprimi proteina fluworexxenti ħadra (GFP). Fuq il-wiċċ tal-membrana ta 'barra, l-ospitant iġorr tikketti ssDNA. L-uniċi proteini tradotti f'ospitant b'saħħtu huma l-proteini tal-ospitant stess mill-plasmidi li l-ospitant inħoloq bihom. (b) Il-"parassita" huwa liposoma mimli b'DNA tal-plasmid li jikkodifika ġene għall-proteina fluworexxenti mCherry, u l-wiċċ tal-liposoma tal-parassita huwa mżejjen b'tikketta ssDNA (komplimentari għat-tikketta fuq il-wiċċ ospitanti). L-"infezzjoni" tibda b'fużjoni tal-liposomi ospitanti u tal-parassiti, medjata mit-tikketti tad-DNA komplementari fuq il-wiċċ tagħhom. Wara l-infezzjoni, l-ospitant jesprimi kemm il-ġene ospitanti oriġinali (GFP) kif ukoll il-ġene tal-parassita (mCherry). (c) L-"infezzjoni" tibda b'liposomi "patoġeniċi" li jġorru ġene għall-enżima ta' restrizzjoni MunI li tgħaqqad mal-liposomi ospitanti. Il-ġene patoġeniku MunI huwa espress mill-ospitant u l-enzima ta' restrizzjoni MunI tiddiġerixxi d-DNA ospitanti. Dan jirriżulta li l-ġenoma ospitanti nattiv jiġi diġerit, u ddawwar il-biċċa l-kbira tal-espressjoni tal-proteina ospitanti minn GFP għall-proteina kodifikata tal-patoġenu, MunI. (d) L-"infezzjoni letali" hija fużjoni tal-liposoma ospitanti (bil-ġenoma GFP) mal-liposoma patoġeniku li fih il-ġene li jikkodifika aHL, proteina tal-membrana. Wara l-infezzjoni, l-ospitant jesprimi aHL, li joħloq pori tal-membrana, li jikkawża tnixxija ta 'nutrijenti ospitanti u effettivament jagħlaq il-metaboliżmu tal-ospitant. (e) "Ttilqim" hija l-inkubazzjoni tal-host b'ssDNA li jkun fiha sekwenza kompatibbli mat-tikketti tal-fużjoni fuq il-wiċċ tal-liposomi ospitanti. Id-DNA immunizzanti joħloq duplex b'tikketti tad-DNA ospitanti, li jipprevjeni l-ibridizzazzjoni ta 'oligos tad-DNA oħra għal dawn it-tikketti. Dan jipprevjeni l-fużjoni ta 'kwalunkwe liposomi patoġeniċi mal-ospitant. Din hija figura ta 'prova ta' kunċett, u l-graffs huma għal skopijiet illustrattivi, li jirrappreżentaw ammonti relattivi ta 'proteini espressi mill-ospitanti u diversi patoġeni. Dejta reali għal kull sistema hija pprovduta f'ċifri sussegwenti.

RIŻULTATI U DISKUSSJONI

F'dan ix-xogħol, nużaw il-kliem: ospitanti, parassita, infezzjoni, fatali, vaċċin, u tilqim kollha fil-kuntest ta 'sistemi ta' ċelluli sintetiċi mhux ħajjin. B'infezzjoni "fatali", nifhmu tnaqqis notevoli fit-traduzzjoni fil-popolazzjoni ta 'ċelluli sintetiċi. L-esperimenti kollha f'dan ix-xogħol saru fuq ċelloli sintetiċi li mhumiex ħajjin, ma jirreplikawx lilhom infushom, u ma jevolvux. Din hija sistema mudell għal proprjetajiet u proċessi bijoloġiċi naturali.

cistanche suppliment benefiċċji-żieda l-immunità

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Infezzjoni ta 'Ċellula Sintetika b'Ċellola Sintetika Parassitika Hijacks Riżorsi Ospitanti.

Biex nittestjaw il-kunċett ta 'sistema ta' ċelluli sintetiċi li timita infezzjoni, bdejna billi nibnu sistema mudell għal parassita. Aħna użajna l-iktar kunċett sempliċi ta 'parassita possibbli biex nirrikostitwixxu f'din is-sistema bijokimika mhux ħajja: parassita li hijacks xi wħud mir-riżorsi tal-ospitanti. F'dan il-każ, il-metaboliżmu ospitanti huwa rappreżentat mill-espressjoni tal-proteina GFP, u l-parassita huwa rappreżentat mill-espressjoni tal-proteina mCherry. Għal din is-sistema, użajna l-fenomenu muri qabel ta 'rendiment ta' espressjoni ta 'proteini lineari dipendenti fuq il-konċentrazzjoni tal-mudell tad-DNA fi TxTl. il-proporzjon tal-fluworexxenza osservata minn dawn il-proteini. Aħna arbitrarjament assenjat il-ġene GFP bħala l-"ospitanti" u l-ġene mCherry bħala l-"parassita". Dawn l-ismijiet ma jfissru xejn speċjali f'dan l-esperiment partikolari iżda se jindikaw l-ospitanti u l-parassita f'esperimenti sussegwenti taċ-ċelluli sintetiċi. Hawnhekk, nużaw dawn l-ismijiet biex nagħmluha aktar faċli biex nirrelataw dawn l-esperimenti ta 'prova ta' kunċett ma 'esperimenti sussegwenti ta' infezzjoni taċ-ċelluli sintetiċi bl-użu tal-istess plasmidi. Imħallta plasmidi GFP u mCherry, biż-żewġ ġeni taħt il-kontroll tal-promotur T7 f'proporzjonijiet ta 'plasmid li jvarjaw u konċentrazzjoni totali ta' plasmidi fil-kampjuni 1, 5, 10, jew 15 nM (Figura 2b). Ir-riżultati segwew ir-relazzjoni kważi lineari mistennija bejn il-konċentrazzjoni tal-plażmid u l-intensità tal-fluworexxenza rreġistrata, bl-aħjar tqabbil bejn il-proporzjonijiet tal-konċentrazzjoni tal-fluworexxenza u l-plażmid osservata f'total ta '10 nM plasmid. Ir-relazzjoni osservata tindika li l-plażmidi, bil-proteini jkunu simili fid-daqs u l-kompożizzjoni tal-aċidu amminiku (Figura S1), jikkompetu għall-istess ġabra ta 'riżorsi TxTl għall-espressjoni tagħhom. Il-bidla tal-konċentrazzjoni relattiva taż-żewġ plasmidi tirriżulta f'bidliet fl-effiċjenza tal-espressjoni bejn wieħed u ieħor proporzjonali għall-proporzjon tal-plażmidi. Dan jindika li jkun mudell tajjeb li jimita l-infezzjoni tal-parassiti: il-ġenoma tal-parassiti (plasmid mCherry) se jikkompeti mal-ġenoma ospitanti (plasmid GFP). Sussegwentement, iddeċidejna li nittestjaw każ fejn wieħed mill-plażmidi kien taħt il-kontroll ta 'promotur aktar b'saħħtu, u b'hekk nimitaw xenarju ta' allokazzjoni ta 'riżorsi preġudikata. Biex inżommu l-aspett tal-kompetizzjoni tar-riżorsi tal-esperimenti futuri ta 'infezzjoni "parassita", żammejna ż-żewġ ġeni taħt l-istess promotur tal-RNA polymerase (il-T7 RNA polymerase, T7 RNAP) iżda varjaw is-saħħa tiegħu. Aħna użajna promotur T7 RNAP qawwi T7Max, li juri rendiment ta 'traskrizzjoni ogħla b'mod sinifikanti, li jirriżulta f'rendimenti ta' traduzzjoni ogħla b'mod korrispondenti, f'TxTl.17 Ittestjajna s-setup tar-reazzjoni identika għal dik deskritta qabel: żewġ plasmidi f'proporzjonijiet differenti, ittestjati f'total finali li jvarja. konċentrazzjonijiet ta' plasmidi. Wieħed mill-plażmidi kien taħt il-kontroll tal-promotur T7Max qawwi, filwaqt li l-ieħor kien taħt il-promotur T7 kanoniku. Fiż-żewġ każijiet tat-test, l-espressjoni tal-plasmid T7Max kienet b'saħħitha biżżejjed li l-fluworexxenza tal-proteina minn ġene taħt T7Max ma żdiedx b'mod sinifikanti mal-konċentrazzjoni totali miżjuda tal-plasmid (Figura 2c, 2d). Ma jidhirx li jimpurtax jekk T7Max kienx qed isuq GFP jew mCherry, iż-żewġ proteini rrispondew għall-promotur aktar b'saħħtu b'żieda relattiva simili. Dan ipprovda mudell promettenti għal infezzjoni b'parassita "aktar b'saħħitha" (parassita li jġorr ġene taħt T7Max f'ospitant taħt T7) u reverse, host aktar b'saħħtu li jirreżisti parassita aktar dgħajfa (host b'ġenoma taħt T7Max u parassita li jġorr ġene T7). Imħeġġa minn dawn l-esperimenti tal-prova tal-prinċipju, aħna mxejna għal esperimenti ta 'ċelluli sintetiċi.

L-"infezzjoni," fil-każijiet kollha, hija l-fużjoni ta 'ċellula sintetika ospitanti u parassita. Il-fużjoni hija ffaċilitata minn tikketti tad-DNA fuq il-wiċċ tal-liposomi, bl-użu tas-sistema ta 'fużjoni li tinġibed mid-DNA deskritta qabel.18 Fil-qosor, iċ-ċelloli sintetiċi nħolqu b'Escherichia coli TxTl ġewwa membrana ta' POPC u kolesterol, u l-fuljett ta 'barra kien imżejjen. b'DNA single stranded ankrat mal-membrana b'modifika tal-kolesterol. Jekk jiltaqgħu par ta' liposomi b'tikketti komplementari, it-tikketti tad-DNA jinibridu, u jġibu l-membrani flimkien u jibdew il-fużjoni tal-membrana, li hija segwita minn taħlit tal-lumen. Fl-esperimenti tagħna, iċ-ċellula sintetika ospitanti hija l-liposoma li fih TxTl b'T7 RNAP minbarra l-ġenoma ta 'GFP kodifikat bil-plasmid. Il-monitoraġġ tal-fluworexxenza tal-GFP iservi bħala prokura għas-"saħħa" tal-metaboliżmu ospitanti. Il-parassita deħlin fih ġenoma fil-forma ta 'plasmid li jikkodifika mCherry, is-sistema ta' traduzzjoni sħiħa, iżda l-ebda polimerażi RNA T7. Dan jiżgura li kwalunkwe bidla osservata fil-metaboliżmu ospitanti tirriżulta mill-ġeni miġjuba mill-parassita u mhux mill-fużjoni tal-parassita u l-liposomi ospitanti, iddilwixxi ċ-ċitoplasma ospitanti. L-esperimenti ta 'infezzjoni tal-parassiti twettqu bil-membrana ospitanti ttikkettjata b'Marina Blue DHPE, żebgħa tal-lipidi tal-membrana blu. Dan ippermetta li ninnormalizzaw il-fluworexxenza tal-ġene ospitanti u tal-parassiti osservati għall-fluworexxenza blu, innormalizzaw ir-riżultati għall-ammont totali ta 'fluworexxenza tal-membrana ospitanti preżenti fil-kampjun. Dan jammonta għad-dilwizzjonijiet tal-volum totali tal-kampjun wara ż-żieda tal-liposomi tal-parassiti. Il-membrani tal-parassiti ma kinux ittikkettjati b'mod fluworexxenti. L-esperimenti kollha kienu akkumpanjati minn kampjun ta 'kontroll, fejn popolazzjoni waħda biss kienet preżenti l-ospitanti, iżda bil-plasmid mCherry, biex juru l-livelli teoretiċi massimi possibbli espressjoni mCherry jekk kien l-uniku ġene fil-popolazzjoni. Fl-ewwel sett ta 'esperimenti, aħna ħallat l-ospitanti u l-parassita ma' ġeni t-tnejn taħt il-kontroll tal-promotur T7 regolarigħalhekk kemm il-ġeni ospitanti kif ukoll il-ġeni tal-parassiti kienu ugwalment "qawwija." Aħna ħallat l-ospitanti mal-parassita sabiex il-parassita kien f'25, 50, jew 75% tal-popolazzjoni totali tal-liposomi. Fil-każijiet kollha, il-fluworexxenza GFP ospitanti naqset fil-preżenza tal-parassita, biż-żieda korrispondenti tal-fluworexxenza mCherry tal-parassita (Figura 2e). Kampjuni bil-parassita biss u l-ebda ospitanti ma pproduċew l-ebda fluworexxenza ta' l-ebda kulur, kif mistenni. Fil-każijiet kollha, il-fużjoni tal-liposomi medjata mid-DNA mhijiex 100% effiċjenti;18,19 Għalhekk, it-tnaqqis relattiv fil-fluworexxenza tal-ospitanti u ż-żieda fil-fluworexxenza tal-parassiti ma kinux kbar daqs il-valur teoretiku mistenni bbażat fuq il-proporzjon ta 'ospitanti għal parassita. Fi kliem ieħor, l-infezzjoni ma kinitx 100% effiċjenti. Din il-kwalità serendipitous tas-sistema ta 'fużjoni indotta mid-DNA kienet, f'dan il-każ, karatteristika ta' benefiċċju tas-sistema. Bħal fil-każ ta 'infezzjoni naturali, l-infezzjoni medjata mill-fużjoni taċ-ċelluli sintetiċi ma affettwatx lill-ospiti kollha u mhux il-parassiti kollha sabu ospitanti. Sussegwentement, investigajna żewġ każijiet, fejn l-ospitant u l-parassita ma kinux imqabbla b'mod ugwali fis-saħħa tal-ġenomi tagħhom. F'każ wieħed, il-ġenoma ospitanti kien taħt il-kontroll tal-promotur T7 filwaqt li l-ġenoma tal-parassita kien taħt il-promotur T7Max (Figura 2f), u fix-xenarju oppost, il-ġenoma ospitanti kien taħt T7Max u l-ġenoma tal-parassita kien taħt il-promotur T7 (Figura 2g). Fil-każ tal-host aktar dgħajjef attakkat minn parassita aktar b'saħħitha, iż-żieda relattiva fil-fluworexxenza mCherry parassitika u t-tnaqqis korrispondenti fil-fluworexxenza GFP ospitanti kienu ħafna aktar b'saħħithom milli fil-każ preċedenti ta 'host u parassita mqabbla b'mod ugwali. Kif mistenni, meta l-ospitant kien aktar b'saħħtu mill-parassita, l-oppost kien minnu: il-livelli ta 'fluworexxenza mCherry kienu aktar baxxi u t-tnaqqis relattiv fil-fluworexxenza tal-GFP kien aktar baxx milli fil-każ imqabbel b'mod ugwali. Dan jiġi illustrat l-aħjar billi jitqabbel punt ta 'dejta wieħed taħt l-istess kundizzjonijiet ta' infezzjoni: f'proporzjon ta 'parassita ta' 75%. Popolazzjonijiet ta' ospitanti u parassiti mqabbla b'mod ugwali jirriżultaw fi fluworexxenza tal-parassiti kemmxejn akbar mill-ospitanti. Meta l-parassita tkun aktar b'saħħitha, il-fluworexxenza tal-parassita hija ogħla b'mod sinifikanti mill-ospitant. U meta l-ospitant ikun aktar b'saħħtu, il-fluworexxenza tal-parassita hija kemmxejn aktar baxxa mill-ospitant. Dawn il-punti tad-dejta enfasizzati huma mmarkati bi stilla safra fil-Figura 2e−g. Aħna wettaqna l-esperiment ta 'kontroll ta' ospitanti infettat b'parassita "asintomatika" parassita li ġġorr plasmid bil-promotur T7 iżda l-ebda sekwenza ta 'kodifikazzjoni tal-proteini (neħħejna l-cassette mCherry mill-plasmid) (Figura 2h). Il-fluworexxenza tal-GFP ospitanti tonqos minimament f'livelli ogħla tal-parassiti, li jindika li xi ammont żgħir ta 'riżorsi ospitanti huma ddedikati għat-traskrizzjoni tal-RNA qasir mhux kodifikanti mill-plasmid tal-parassiti. Din id-dejta tikkonferma wkoll li l-piż metaboliku ewlieni tal-infezzjoni tal-parassiti fuq l-ospitant jinsab fl-użu tar-riżorsi translazzjonali, mhux traskrizzjonali. Din l-osservazzjoni taqa’ f’konformità ma’ osservazzjonijiet preċedenti ta’ traduzzjoni li hija l-aktar riżors varjabbli u li jillimita fis-sistemi ħielsa minn ċelluli.20 B’mod ġenerali, dawn l-esperimenti jipprovdu mudell għal infezzjoni b’parassita li jaħtfu r-riżorsi metaboliċi tal-ospitanti, b’imġieba taċ-ċelluli sintetiċi li jimitaw. aspetti ta’ relazzjoni naturali host-parassita.

Figura 2. Infezzjoni tal-parassiti hijacks ir-riżorsi tal-ospitant. (a) Il-liposoma taċ-ċelluli sintetiċi ospitanti fih sistema ta 'traduzzjoni mingħajr ċelluli u plasmid li jikkodifika GFP. Il-wiċċ tal-host huwa mżejjen b'tikketti ssDNA. Il-liposoma tal-parassita fih plasmid li jikkodifika mCherry, b'sistema ta 'traduzzjoni iżda l-ebda polimerażi RNA (għalhekk il-parassita ma jistax jesprimi mCherry). Il-wiċċ tal-parassita huwa mżejjen b'tikketti ssDNA kumplimentari għat-tikketti fuq il-wiċċ tal-ospitant. It-tikketti tad-DNA jiffaċilitaw il-fużjoni tal-host u l-liposomi tal-parassiti u l-host jesprimi kemm il-GFP ġenomika tiegħu kif ukoll il-ġenoma parassitiku li fih mCherry. (b-d) Prova tal-prinċipju għall-ġenomi ospitanti (GFP) u parassiti (mCherry) li jikkompetu għall-istess riżorsi taċ-ċelluli sintetiċi. Dawn l-esperimenti jsiru f'soluzzjoni TxTl, mhux fil-liposomi. Żewġ plasmidi, li jikkodifikaw GFP u mCherry, tħalltu fil-proporzjon indikat mill-ikoni tal-plasmid fuq ix-xellug tal-mappa tas-sħana, bil-konċentrazzjoni totali tad-DNA tal-kampjun indikata fir-ringiela ta 'fuq il-mappa tas-sħana. Il-fluworexxenza kienet imkejla f'kanali ħodor (GFP) u ħomor (mCherry). Kull plasmid ġie ttestjat f'żewġ varjanti b'promoturi ta 'qawwiet differenti: b'T7 u bil-promotur T7Max aktar b'saħħtu. Id-dejta individwali għall-mapep tas-sħana kollha hija pprovduta fil-Figuri S2−S4. Korsijiet tal-ħin individwali rappreżentattivi għall-espressjoni tal-proteina tal-host T7 u l-parassita huma pprovduti fil-Figuri S5-S7 u għall-parassita T7Max fil-Figuri S8-S10. (e−g) Infezzjoni tal-host bil-parassita. F'kull esperiment, liposomi ospitanti huma mħallta ma 'liposomi parassiti. Il-fużjoni tal-parassita mal-host tagħti DNA mCherry parassitiku, li huwa espress flimkien mal-host GFP DNA. Proporzjonijiet differenti ta 'l-ospitanti għall-parassita ġew ittestjati, kif indikat mill-ikoni taħt il-bar graphs. Il-ġenoma ospitanti taħt il-promotur T7 kien infettat b'parassita bil-ġenoma tiegħu taħt il-pannell tal-promotur T7 (e) u b'parassita bil-ġenoma tiegħu taħt il-pannell tal-promotur T7Max (f), l-ospitant sar ukoll b'ġenoma T7Max u infettat mal-parassita b'pannell tal-ġenoma T7 (g). Korsijiet ta' ħin individwali rappreżentattivi għall-espressjoni tal-proteini huma pprovduti fil-Figura S11. Esperimenti simili f'konċentrazzjonijiet totali ta 'lipidi ogħla u aktar baxxi huma pprovduti fil-Figura S12. It-traċċi tal-purifikazzjoni tal-esklużjoni tad-daqs li juru l-istabbiltà tal-vesikula wara l-fużjoni huma pprovduti fil-Figura S13. (h) Infezzjoni b'parassita inkompatibbli: il-parassita iġorr il-promotur T7 iżda DNA mhux kodifikanti. Il-vireg tal-iżball jindikaw SEM, n=3. Il-valuri tal-fluworexxenza fil-pannelli (e-h) huma normalizzati għall-fluworexxenza blu ta 'żebgħa tal-membrana biex jiġu normalizzati r-riżultati għall-konċentrazzjoni taċ-ċelloli ospitanti. Is-serje kollha tal-kampjuni bit-tikketta "host GFP infettat" huma esperimenti, fejn l-ospitant u l-parassita kellhom tikketti tad-DNA komplementari fuq il-wiċċ, li jippermettu l-fużjoni tal-liposomi, imsejħa infezzjoni. Serje-tikketta "host GFP b'saħħithom" juru kampjuni, fejn l-ospitanti u l-parassita tħalltu fil-proporzjonijiet murija, iżda ma kienx fihom tikketti ta 'fużjoni komplementari, li jagħmlu l-infezzjoni impossibbli. Id-djamant fil-pannelli (e-h) jindika kundizzjoni ta 'infezzjoni partikolari waħda li turi l-aħjar id-differenzi fil-qawwiet tal-espressjoni tal-host u tal-parassiti f'pannelli (e-g) u l-benefiċċji tal-immunità tal-host fil-pannell (h). Tqabbil dirett tal-valuri ospitanti u tal-parassiti indikati mill-istilla huwa mogħti fil-Figura S14. Id-dejta għall-infezzjoni b'parassita mingħajr l-ebda plasmid tidher fil-Figura S15.

Infezzjoni ta 'Ċellula Sintetika Tista' Teqred il-Ġenoma Ospitanti.

Il-parassita deskritt hawn fuq kien qed jesprimi mCherry li jikkodifika l-ġenoma billi juża r-riżorsi tal-ospitant, iżda l-ospitant żamm ftit mill-metaboliżmu tiegħu u kompla jesprimi GFP minkejja l-infezzjoni. Sussegwentement, iddeċidejna li ninvestigaw sistema li fiha l-infezzjoni tirriżulta f'teħid sħiħ tal-metaboliżmu ospitanti mill-parassita permezz tal-qerda tal-ġenoma ospitanti (Figura 3a). Biex tfassal xenarju bħal dan, investigajna diġest ta 'enżimi ta' restrizzjoni ta 'plasmid f'TxTl. Fl-esperimenti tal-prova tal-prinċipju, enzima ta 'restrizzjoni MunI ġiet espressa f'TxTl mingħajr liposomi. Il-plasmid MunI tħallat ma' plasmid GFP fi proporzjonijiet differenti. Jekk il-plasmid tal-GFP ma fih l-ebda siti ta 'restrizzjoni MunI, it-tnaqqis relattivament żgħir fil-fluworexxenza tal-GFP osservata jista' jitqies mill-kompetizzjoni deskritta qabel bejn iż-żewġ plasmidi għar-riżorsi TxTl. Jekk il-plażmid tal-GFP għandu sit ta 'restrizzjoni MunI, il-fluworexxenza tal-GFP tonqos b'mod sinifikanti, u t-tnaqqis skalat proporzjonalment għal ammont dejjem jiżdied tal-plasmid li jikkodifika MunI (Figura 3b). L-espressjoni MunI ġiet immonitorjata permezz Western Blot u skalat proporzjonalment mal-konċentrazzjoni tal-plasmid (Figura 3c).

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Imħeġġa minn dawn ir-riżultati, waqqafna esperiment ta 'infezzjoni b'ċelloli sintetiċi. L-ospitant iġorr il-plasmid GFP u l-patoġenu ġarr il-plasmid MunI. Il-konċentrazzjoni tal-plażmidi GFP u MunI ġiet issettjata għal 2 mM, ferm taħt il-konċentrazzjoni tas-saturazzjoni tal-plażmidi għal TxTl.21 Aħna ħsibna li nibqgħu taħt il-konċentrazzjoni totali tal-plasmidi li fiha l-espressjoni tal-ospitanti u tal-parassiti tkun għolja biżżejjed biex tikkompeti direttament għal riżorsi limitati ( bħal fil-każ deskritt hawn fuq ta 'parassita sempliċi), minflok bi ħsiebu jkejjel l-aktar l-effett tal-enzima tal-parassita li teqred b'mod attiv il-ġenoma ospitanti. Bħal fl-esperimenti tal-parassiti deskritti qabel, l-ospitant kien fih TxTl batterjali u T7 RNA polymerase, il-patoġenu wettaq biss estratt taċ-ċelluli mingħajr T7 RNA polymerase, u kemm l-ospitanti kif ukoll il-patoġenu kienu ttikkettjati b'tikketti komplementari tal-fużjoni tad-DNA. Il-membrana ospitanti ġiet ittikkettata b'Marina Blue DHPE biex jiġu normalizzati r-riżultati tal-fluworexxenza għall-konċentrazzjoni tal-liposomi ospitanti. L-ospitanti u l-patoġenu tħalltu fi proporzjonijiet li jvarjaw, bil-patoġenu jkun 25, 50, jew 75% tal-popolazzjoni totali. Il-fluworexxenza tal-ospitant "infettat", fejn l-ospitant u l-patoġenu kien fihom tikketti ta 'fużjoni komplementari, naqsu b'ammont dejjem jiżdied ta' patoġenu. Il-fluworexxenza tal-GFP mill-ospitant "b'saħħtu", fejn il-patoġenu ma kienx fih tikketti tal-fużjoni komplementari, ma naqsitx fil-preżenza ta 'xi ammont ta' patoġenu. Kampjuni bil-patoġenu biss irriżultaw fl-ebda fluworexxenza li tista' titkejjel (Figura 3d). L-espressjoni patoġenika tal-proteina MunI ġiet ikkwantifikata bl-użu ta 'analiżi Western Blot, b'dejta murija għas-serje ta' kampjuni tal-ospitant infettat (Figura 3e). Sussegwentement, investigajna l-infezzjoni fil-każ ta 'host immuni għall-patoġenu: il-plasmid GFP ospitanti ma kellux sit ta' restrizzjoni MunI (Figura 3f). Il-fluworexxenza tal-ospitanti wara l-infezzjoni naqset iżda ma kienet daqshekk sinifikanti daqs fil-każ preċedenti ta 'host b'sit MunI fil-ġenoma. Il-proteina patoġenika MunI kienet espressa f'livelli komparabbli ma 'esperimenti ta' infezzjoni preċedenti (Figura 3g), għalhekk it-tagħbija metabolika fuq l-ospitant kienet simili. It-tnaqqis tal-fluworexxenza ospitanti infettat f'dawn l-esperimenti huwa kkawżat minn xi wħud mir-riżorsi ospitanti li jkunu maħtufa mill-patoġenu li jesprimi MunI, iżda minħabba li l-konċentrazzjoni totali tal-plasmid hija ħafna aktar baxxa milli fl-esperimenti ta 'patoġenu sempliċi preċedenti, it-tnaqqis tal-fluworexxenza ospitanti huwa inqas sinifikanti. Dan l-esperiment jikkonferma wkoll li t-tnaqqis fil-fluworexxenza tal-ospitant b'sit MunI (Figura 3d) kien ikkawżat minn korsijiet tal-ħin tal-espressjoni tal-proteini pprovduti fil-Figura S22. (g) L-espressjoni ta 'MunI ġiet segwita permezz ta' analiżi tal-western blot permezz tal-esperiment għall-kampjuni murija fis-serje "GFP infettat" fil-pannell (f). Il-vireg tal-iżbalji fuq il-pannelli kollha jindikaw SEM, n=3. Il-valuri tal-fluworexxenza fil-pannelli (d, f) huma normalizzati għall-fluworexxenza blu taż-żebgħa tal-membrana użata biex jiġu normalizzati r-riżultati għall-konċentrazzjoni taċ-ċelloli ospitanti. Il-fluworexxenza fil-pannell (b) hija normalizzata għal 0 mM MunI plasmid għal kull serje ta' kampjuni. Is-simboli tad-djamanti fil-pannelli (d, f) jenfasizzaw kundizzjoni partikolari waħda li turi bl-aħjar mod id-differenzi fir-risponsi għall-infezzjoni minn ospitanti suxxettibbli għall-pannell tal-patoġenu (d) u ​​immuni għall-pannell tal-patoġenu (f). Is-serje tal-kampjuni kollha ttikkettjati "GFP infettati" huma esperimenti, fejn l-ospitanti u l-patoġenu kellhom tikketti tad-DNA komplementari fuq il-wiċċ, li jippermettu l-fużjoni tal-liposomi, imsejħa infezzjoni. Is-serje bit-tikketta "GFP b'saħħithom" turi kampjuni, fejn l-ospitant u l-patoġenu tħalltu fil-proporzjonijiet murija iżda ma kienx fihom tikketti ta 'fużjoni komplementari, li jagħmlu l-infezzjoni impossibbli.

Figura 3. L-infezzjoni teqred il-ġenoma ospitanti u taqta’ r-riżorsi ospitanti. (a) Iċ-ċelloli ospitanti fihom plasmid li jikkodifika GFP, b'żewġ siti ta' restrizzjoni MunI; il-patoġenu fih plasmid li jikkodifika l-enzima ta' restrizzjoni MunI. Wara l-fużjoni ta 'l-ospitanti u l-patoġenu, l-ospitanti TxTl jesprimi l-enżima ta' restrizzjoni MunI, li mbagħad tiddiġerixxi l-ġenoma ospitanti. (b) L-esperimenti tal-prova tal-prinċipju għall-infezzjoni: plasmid GFP ġie ppreparat b'siti ta 'restrizzjoni MunI u mingħajrhom. Plasmid GFP ġie mħallat ma plasmid MunI u l-espressjoni GFP ġiet irreġistrata. Dawn l-esperimenti saru f'soluzzjoni TxTl mingħajr liposomi. Il-prova tal-prinċipju għall-esperiment tal-infezzjoni, bl-enzima MunI miżjuda esternament minflok ma tiġi espressa f'TxTl, tidher fil-Figuri S16 u S17. Korsijiet rappreżentattivi tal-ħin tal-espressjoni tal-proteini huma pprovduti fil-Figura S18. (c) L-espressjoni MunI ġiet immonitorjata permezz ta' analiżi tal-western blot; l-intensità tal-medda MunI ġiet kwantifikata fl-istess kampjuni bħar-riżultati tal-fluworexxenza murija fil-pannell (b) għas-serje "MunI sit assenti". Fil-Figura S19 hemm ipprovdut western blot rappreżentattiv tal-enżima ta' restrizzjoni MunI. (d) Fluworexxenza tal-GFP tal-host imħallat ma' liposomi patoġeniċi fil-proporzjon muri taħt il-grafika tad-dejta. Il-plasmid GFP ospitanti għandu żewġ siti ta' restrizzjoni MunI. Korsijiet rappreżentattivi tal-ħin tal-espressjoni tal-proteini huma pprovduti fil-Figura S20. Id-dejta għal esperimenti ta 'infezzjoni b'tikketti ta' fużjoni inkompatibbli hija pprovduta fil-Figura S21. (e) L-espressjoni ta 'MunI ġiet segwita permezz ta' analiżi tal-western blot permezz tal-esperiment għall-kampjuni murija fis-serje "GFP infettat" fil-pannell (d). (f) Fluworexxenza tal-GFP tal-host imħallat ma' liposomi patoġeniċi fil-proporzjon muri taħt il-grafika tad-dejta. Il-GFP ospitanti m'għandu l-ebda sit ta 'restrizzjoni MunI, u jagħtiha immunità għall-proteina patoġenika. Korsijiet rappreżentattivi tal-ħin tal-espressjoni tal-proteini huma pprovduti fil-Figura S22. (g) L-espressjoni ta 'MunI ġiet segwita permezz ta' analiżi tal-western blot permezz tal-esperiment għall-kampjuni murija fis-serje "GFP infettat" fil-pannell (f). Il-vireg tal-iżbalji fuq il-pannelli kollha jindikaw SEM, n=3. Il-valuri tal-fluworexxenza fil-pannelli (d, f) huma normalizzati għall-fluworexxenza blu taż-żebgħa tal-membrana użata biex jiġu normalizzati r-riżultati għall-konċentrazzjoni taċ-ċelloli ospitanti. Il-fluworexxenza fil-pannell (b) hija normalizzata għal 0 mM MunI plasmid għal kull serje ta' kampjuni. Is-simboli tad-djamanti fil-pannelli (d, f) jenfasizzaw kundizzjoni partikolari waħda li turi bl-aħjar mod id-differenzi fir-risponsi għall-infezzjoni minn ospitanti suxxettibbli għall-pannell tal-patoġenu (d) u ​​immuni għall-pannell tal-patoġenu (f). Is-serje tal-kampjuni kollha ttikkettjati "GFP infettati" huma esperimenti, fejn l-ospitanti u l-patoġenu kellhom tikketti tad-DNA komplementari fuq il-wiċċ, li jippermettu l-fużjoni tal-liposomi, imsejħa infezzjoni. Is-serje bit-tikketta "GFP b'saħħithom" turi kampjuni, fejn l-ospitant u l-patoġenu tħalltu fil-proporzjonijiet murija iżda ma kienx fihom tikketti ta 'fużjoni komplementari, li jagħmlu l-infezzjoni impossibbli.

Infezzjoni ta 'Ċellula Sintetika Tista' tkun "Fatali", Tnaqqis tar-Riżorsi taċ-Ċellola Ospitanti, u Infezzjonijiet bħal dawn Jistgħu jiġu "Ttrattati" għall-Funzjoni ta 'Salvataġġ.

L-esperimenti ta 'parassiti u patoġeni ta' hawn fuq wrew li ċ-ċelloli sintetiċi jistgħu jintużaw bħala mudell għall-infezzjoni, fejn patoġenu jaħtaf ir-riżorsi tal-ospitant. Sussegwentement, iddeċidejna li ninvestigaw xenarju li fih l-infezzjoni tikkawża li l-metaboliżmu tal-host jieqaf jaħdem wara l-espressjoni tal-proteina patoġenika. F'dan il-każ, il-patoġenu huwa komparabbli ma 'infezzjoni b'batterju li jesprimi tossina fatali nieqes l-aspett ta' replikazzjoni tal-ospitant jew tal-parassita peress li dawn iċ-ċelloli sintetiċi ma jirreplikawx (Figura 4a). Biex tfassal din is-sistema, għażilna hemolysin (aHL), tossina naturali u proteina tal-membrana użata ħafna fl-inġinerija taċ-ċelluli sintetiċi biex toħloq pori mhux speċifiċi tal-membrana.22,23 Napprezzaw l-ironija ta 'din l-għażla peress li l-aHL hija espressa b'mod naturali minn Staphylococcus aureus bħala a tossina, u l-proteina aktar tard ġiet approprjata biex tfassal it-trasport tal-membrana u ttawwal il-metaboliżmu taċ-ċelluli sintetiċi.24 Hawnhekk, nerġgħu nerġgħu nużaw aHL għar-rwol naturali tiegħu bħala tossina ta 'ħsara prodotta minn infezzjoni. Eżempju notevoli ieħor relatat mal-inġinerija taċ-ċelluli sintetiċi tal-użu tat-tossiċità tal-aHL biex jikkawża mewt taċ-ċelluli naturali ġej mill-applikazzjoni ta 'ċelluli sintetiċi bħala teknoloġija ta' terapija tal-kanċer. jirriżulta fi tnixxija tal-kontenut taċ-ċelluli u tnaqqis sinifikanti fl-espressjoni tal-GFP ġewwa ċ-ċellula. Dan l-effett jista 'jinqaleb jekk in-naħa ta' barra tal-liposomi jkun fiha l-molekuli żgħar kollha meħtieġa għal TxTl (Figura 4b). Fis-sistema tagħna tal-mudell tal-host-patoġenu, l-ospitant fih plasmid li jikkodifika GFP u l-patoġenu fih plasmid li jikkodifika aHL. Id-disinn kollu tal-esperimenti tal-infezzjoni huwa simili għax-xenarji tal-parassiti u l-patoġeni deskritti hawn fuq, bil-patoġenu ma jġorr l-ebda T7 RNAP u kemm l-ospitanti kif ukoll il-patoġenu mżejna b'tikketti tal-fużjoni tad-DNA. Interessanti, osservajna li f'konċentrazzjonijiet ta 'patoġenu aktar baxxi (il-patoġenu huwa 25 jew 50% tal-popolazzjoni totali), il-fluworexxenza ospitanti tonqos biss ftit. Madankollu, iż-żieda tal-konċentrazzjoni tal-patoġenu għal 75% tirriżulta fi tnaqqis sinifikanti fil-fluworexxenza GFP ospitanti (Figura 4c). Aħna nispekulaw li dan ir-riżultat jista 'jkun ikkawżat mit-tnixxija relattivament bil-mod ta' nutrijenti minn ċelloli sintetiċi f'konċentrazzjoni aktar baxxa ta 'aHL. Il-fluworexxenza tal-GFP ġiet imkejla biss wara 12-il siegħa ta 'inkubazzjoni u GFP hija proteina stabbli ħafna. Għalhekk, huwa possibbli li fil-każ ta 'konċentrazzjonijiet aktar baxxi ta' aHL (ammont aktar baxx ta 'patoġenu), it-tnixxija ta' nutrijenti kkawżata mill-aHL kienet bil-mod biżżejjed li ċ-ċelloli ospitanti akkumulaw ammonti sinifikanti ta 'GFP qabel ma l-effetti tat-tnixxija indotta mill-aHL saru tfixkel għal il-metaboliżmu. Biex tiddiżakkoppja r-riżultati ta 'kompetizzjoni sempliċi għar-riżorsi bejn il-ġenomi ospitanti u tal-parassiti, għamilna esperimenti ta' "infezzjoni b'salvataġġ" li fihom il-buffer ta 'barra kien fih il-molekuli żgħar kollha li jikkomponu l-enerġija TxTl, l-aċidu amminiku u t-taħlitiet tal-melħ. Dan ġie stabbilit b'mod simili għall-kundizzjoni ta '"nutrijenti barra" ttestjata fil-Figura 4b. It-tnaqqis fil-fluworexxenza ospitanti f'dawn l-esperimenti kien simili għall-kampjuni ta '"infezzjoni mingħajr salvataġġ" preċedenti b'livelli ta' 25 u 50% tal-patoġenu. It-tnaqqis tal-fluworexxenza ospitanti f'75% tal-patoġenu kien iżgħar b'mod sinifikanti mit-tnaqqis osservat f'kampjuni mingħajr salvataġġ (Figura 4d). Id-differenza kbira fir-riżultati għall-esperiment b'75% tal-parassita, b'punti tad-dejta fil-pannelli tal-Figura 4 (c, d) enfasizzati bi stilla, tidher li tappoġġja l-ipoteżi tagħna li konċentrazzjonijiet ogħla ta 'aHL jikkawżaw ħsara kmieni fir-reazzjoni. F'konċentrazzjoni aktar baxxa ta 'patoġenu, it-tnixxija hija bil-mod biżżejjed li l-GFP ospitanti jakkumula (kif jidher kemm b'nutrijenti ta' salvataġġ kif ukoll mingħajr), għalhekk il-fluworexxenza tal-GFP osservata tonqos wara l-infezzjoni l-aktar minħabba l-kompetizzjoni għar-riżorsi. F'konċentrazzjonijiet ogħla ta 'patoġenu, il-fluworexxenza tal-GFP f'kampjuni b'nutrijenti esterni tonqos l-aktar minħabba l-kompetizzjoni tar-riżorsi. Dawn l-esperimenti juru li nistgħu nħeġġu ċelloli sintetiċi biex jimmudellaw l-infezzjoni, li jirriżultaw f'żewġ riżultati differenti: il-penali metabolika tal-infezzjoni nnifisha (tnaqqis tal-GFP minħabba l-kompetizzjoni tar-riżorsi) u infezzjoni aktar "fatali" li tirriżulta mill-abolizzjoni tal-espressjoni tal-proteini tal-ospiti. Imħeġġa minn din l-osservazzjoni, iddeċidejna li ninvestigaw sistema li fiha ċ-ċelloli sintetiċi jistgħu jirreżistu b'mod attiv infezzjoni patoġenika u ninvestigaw il-penali metabolika ta 'tali rispons.

benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni

Iċ-Ċelloli Sintetiċi Jistgħu Jiddefendu kontra l-Infezzjoni Bl-Użu ta' Strateġija Ispirata mill-Batterji.

Ispirati mill-funzjoni magħrufa sew tal-endonukleażi ta' restrizzjoni biex jissalvagwardjaw il-batterji kontra d-DNA barrani, fittixna li nimpjegaw din l-istrateġija fi ħdan iċ-ċelloli sintetiċi. Aħna espandew fuq is-sistema tal-parassiti ppreżentata fil-Figura 2: minbarra l-GFP, żidna plasmid li fih MunI mal-ospitant. Il-parassita kien fih mCherry, bħal f'esperimenti preċedenti. Il-plasmid mCherry fih sit ta' restrizzjoni MunI (Figura 5a). L-ewwel, wettaqna esperimenti ta 'prova tal-prinċipju biex nivvalutaw it-tagħbija metabolika li tesprimi MunI fuq l-ospitant. F'dawn l-esperimenti TxTl mhux inkapsulati, aħna mmonitorjajna l-espressjoni ta 'GFP u l-espressjoni ta' mCherry, kull waħda mħallta ma 'ammont dejjem jikber ta' plasmid MunI jew EcorI. Il-ġeni kollha kienu taħt il-kontroll tal-istess promotur T7. Il-ġene GFP kellu EcorI iżda mhux sit ta' restrizzjoni MunI u l-ġene mCherry kellu sit ta' restrizzjoni MunI iżda mhux EcorI. Meta l-plasmid ta' l-enżima ta' restrizzjoni tħallat ma' plasmid ta' proteina fluworexxenti mingħajr sit ta' rikonoxximent għal dik l-enzima ta' restrizzjoni, l-espressjoni tal-proteina fluworexxenti naqset proporzjonalment għaż-żieda tal-plasmid ta' l-enżima ta' restrizzjoni, li tindika kompetizzjoni bejn iż-żewġ plasmidi għar-riżorsi TxTl, kif muri qabel għal GFP u mCherry fil-Figura 2. Dawn il-pari noncutting kienu GFP ma MunI (Figura 5b) u mCherry ma EcorI (Figura 5e). Meta proteina fluworexxenti kienet imqabbla ma 'enzima ta' restrizzjoni li kapaċi taqta 'l-ġene għal dik il-proteina fluworexxenti, il-fluworexxenza naqset b'mod sinifikanti għal kważi livelli ta' sfond f'konċentrazzjonijiet ogħla ta 'plasmid ta' enzimi ta 'restrizzjoni. Dawn il-pari tat-tqattigħ kienu GFP b'EcorI (Figura 5c) u mCherry b'Muni (Figura 5d). Dan indika tnaqqis fil-fluworexxenza b'mod sinifikanti lil hinn mill-kompetizzjoni sempliċi għar-riżorsi u simili għax-xenarju ta 'infezzjoni muri fil-Figura 3. L-espressjoni MunI fil-preżenza ta' GFP tnaqqas l-espressjoni tal-GFP. Jekk nużaw GFP bħala prokura għall-metaboliżmu "linja bażi" ospitanti, allura MunI jista 'jitqies bħala tagħbija metabolika fuq l-ospitant.

Figura 4. L-ospitant huwa suxxettibbli għal infezzjoni "fatali", iżda l-ospitant jista 'jiġi salvat. (a) L-ospitant fih plasmid GFP, u l-patoġenu fih plasmid li jikkodifika l-kanal tal-membrana hemolysin (aHL). Wara l-infezzjoni, l-ospitant jesprimi aHL, li joħloq pori fil-membrana, li jikkawża tnixxija ta 'nutrijenti u jirriżulta fi tnaqqis fl-attività metabolika tal-ospitant. (b) Prova tal-prinċipju għal aHL li jesprimi l-host (l-ebda infezzjoni, l-ospitant inħoloq kemm b'5nM GFP kif ukoll bl-ammont indikat ta 'aHL plasmid). L-ospitanti ġie inkubat f'buffer b'nutrijenti jew mingħajrhom (il-komponenti kollha tat-taħlita ta 'enerġija, melħ u aċidi amminiċi użati biex jippreparaw is-sistema ta' traduzzjoni bla ċelluli ospitanti). L-aħjar konċentrazzjoni ta 'nutrijenti ta' salvataġġ ġiet stabbilita b'mod sperimentali, id-dejta murija fil-Figura S23. (c) Infezzjoni ta' l-ospitanti bil-patoġenu, b'ammonti varji ta' patoġenu għal kull ċellula ospitanti. It-tnixxija ta 'molekuli żgħar miċ-ċelloli "b'saħħithom" u "infettati" kienet imkejla direttament bl-użu ta' żebgħa ta 'molekula żgħira, id-dejta tidher fil-Figuri S24 u S25. (d) Esperimenti simili għal dawn huma murija fil-pannell (c), iżda l-buffer ta 'barra fih nutrijenti ta' molekula żgħira simili għal kundizzjonijiet sperimentali ta '"nutrijenti barra" murija fil-pannell (b). Il-vireg tal-iżbalji fuq il-pannelli kollha jindikaw SEM, n=3. Il-valuri tal-fluworexxenza fil-pannelli (b-d) huma normalizzati għall-fluworexxenza blu taż-żebgħa tal-membrana użata biex tinnormalizza s-sinjal għall-konċentrazzjoni taċ-ċelloli ospitanti. Is-simboli tad-djamanti fil-pannelli (ċ, d) jenfasizzaw kundizzjoni partikolari waħda li turi bl-aħjar mod id-differenzi fir-rispons għall-infezzjoni minn ospitanti mingħajr panel ta 'nutrijenti barra (c) u immuni għall-patoġenu minħabba l-preżenza ta' panel nutrijenti barra (d). Għall-pannelli (c, d), is-serje "GFP infettat" hija l-ospitanti mgħaqqda mal-patoġenu li jġorr il-proteina aHL, u "GFP b'saħħtu" huwa l-ospitanti mgħaqqad mal-patoġenu li ma jġorr l-ebda plasmid.

Nipproċedu għall-esperimenti ta 'infezzjoni, ħallat l-ospitanti (bil-plasmidi GFP u MunI) ma' parassita (bil-plasmid mCherry). Bħal qabel, investigajna xenarji b'ammont dejjem jikber ta 'parassiti fil-popolazzjoni (Figura 5f). Il-kontroll pożittiv ta 'mCherry li jesprimi l-host biss (b'EcorI minflok MunI biex jibbilanċja t-tagħbija metabolika) ħoloq punt ta' referenza għall-ammont massimu teoretiku ta 'proteina patoġenika li tista' tiġi espressa fl-ospitant (Figura 5f). Hekk kif l-ammont ta 'parassita żdied, il-fluworexxenza tal-GFP tal-ospitanti naqset, iżda t-tnaqqis fil-fluworexxenza tal-host infettat kien iżgħar b'mod sinifikanti mit-tnaqqis tal-espressjoni tal-GFP osservat f'esperimenti preċedenti bl-istess parassita. Il-fluworexxenza tal-GFP u l-parassita mCherry ta 'dan il-Muni infettat li jesprimi l-ospitant (punt tad-dejta ttikkettjat bi stilla fil-Figura 5f) tista' titqabbel direttament ma 'hosts ta' infezzjoni simili mingħajr MunI (punt tad-dejta mmarkat bi stilla fil-Figura 2e). Fl-ospitant li jesprimi MunI, il-GFP ospitanti beda b'livell assolutament aktar baxx waqt li kien b'saħħtu (minħabba li xi riżorsi huma devjati biex jesprimu MunI) iżda wara l-infezzjoni, it-tnaqqis tal-fluworexxenza ospitanti huwa ħafna inqas sinifikanti, u l-ospitant jagħmel ħafna inqas proteina mCherry parassita. milli fil-każ li l-ospitant ma jesprimix MunI. Dan l-esperiment juri l-benefiċċju li l-ospitant jonfoq xi riżorsi fuq id-difiża kontra l-parassiti. Din is-sistema tista 'titqies bħala mudell bijokimiku sempliċi ħafna għal organiżmi li jesprimu proteini biex jiddefendu kontra infezzjonijiet futuri jew saħansitra fatturi ambjentali ta' ħsara. L-ospitant oriġinarjament huwa inqas robust (jekk nieħdu l-espressjoni tal-GFP bħala punt ta 'referenza għas-saħħa tal-host), iżda f'każ ta' infezzjoni, ir-riżorsi addizzjonali li l-ospitant nefaq biex jesprimi proteini difensivi jħallsu, u jipprovdu protezzjoni kontra l-parassita li jinfetta. Għalhekk, f'din iċ-ċellula sintetika sempliċi mhux ħajja, aħna rikostitwijna eżempju ta 'tellieqa għall-armi bijoloġika fundamentali.

Figura 5. Ċelloli ospitanti jiddefendu kontra l-infezzjoni. (a) Iċ-ċelloli ospitanti fihom żewġ plasmidi: wieħed li jikkodifika GFP (mingħajr sit ta 'restrizzjoni MunI) u l-ieħor li jikkodifika l-enzima ta' restrizzjoni MunI (il-ġene "reżistenza għall-parassiti"). Il-parassita fih plasmid mCherry, f'sistema simili għal esperimenti murija fil-Figura 2. L-infezzjoni hija medjata minn fużjoni permezz ta 'tikketti tad-DNA fuq il-wiċċ ta' l-ospitant u l-parassita. Wara l-infezzjoni, il-plasmid mCherry introdott mill-parassita jiġi diġerit mill-enzima ta' restrizzjoni MunI tal-host. (b-e) Il-kejl tal-ispiża metabolika tal-espressjoni tar-reżistenza tal-parassiti. L-esperimenti huma f'sistema TxTl bl-ingrossa, mhux inkapsulati f'vesikuli. F'kull esperiment, il-plasmid tal-proteina fluworexxenti (GFP jew mCherry) tħallat ma 'plasmid tal-enżimi ta' restrizzjoni (MunI jew EcorI) fil-proporzjon indikat fuq l-assi x għall-konċentrazzjoni totali tal-plasmid ta '10 mM. GFP għandu sit ta' restrizzjoni EcorI iżda mhux sit MunI, u mCherry għandu sit ta' restrizzjoni MunI iżda mhux EcorI. Il-linja tax-xejra hija gwida viżwali iżda mhux data fit. Il-vireg tal-iżball jindikaw SEM, n=3. Esperimenti ta 'kontroll b'enzimi ta' restrizzjoni purifikati, minflok jesprimuhom minn plasmid, huma pprovduti fil-Figura S26. Ġiet imkejla wkoll l-istabbiltà tal-liposomi b'ammont akbar ta 'plasmid tal-parassiti, dejta murija fil-Figura S27. (f) Infezzjoni ta 'l-ospitanti b'ammont dejjem jiżdied ta' parassita. "Ospitanti GFP b'saħħithom" hija l-espressjoni ta 'GFP minn ċelloli ospitanti mdewba mal-parassita mingħajr ebda plasmid. "Host GFP infettat" huwa l-host imdewweb mal-parassita li jġorr l-mCherry. Il-fluworexxenza ħamra hija fluworexxenza mCherry mill-parassita mdewba mal-ospitant (id-dejta biss mill-ospitant infettat hija disponibbli. Il-kampjuni tal-ospitanti b'saħħithom ma ġarrewx plasmid mCherry). Il-vireg tal-iżbalji fuq il-pannelli kollha jindikaw SEM, n=3. Il-valuri tal-fluworexxenza huma normalizzati għall-fluworexxenza blu taż-żebgħa tal-membrana użata biex jiġu normalizzati r-riżultati għall-konċentrazzjoni taċ-ċelloli ospitanti. Is-simbolu tad-djamant jindika l-espressjoni tal-proteina tal-parassita taħt kundizzjonijiet ta 'infezzjoni partikolari, direttament komparabbli mal-punt tad-dejta enfasizzat bi stilla fil-Figura 2e esperiment taħt l-istess kundizzjonijiet, iżda bl-ospitanti nieqes mill-ġene tar-reżistenza MunI.

Figura 6. L-inokulazzjoni tipprovdi difiża kontra l-infezzjonijiet. (a) L-ospitant fih plasmid GFP. Il-patoġenu f'dawn l-esperimenti huwa wieħed mit-tliet skemi ta 'infezzjoni murija f'dan id-dokument: parassita (kif muri fil-Figura 2), patoġenu bl-enzima ta' restrizzjoni MunI li jiddiġerixxi l-ġenoma GFP tal-ospitant (kif muri fil-Figura 3), jew patoġenu iġorr il-kanal tal-membrana aHL li jikkawża tnixxija ta 'nutrijenti mill-ospitanti (kif muri fil-Figura 4). F'kull każ, l-ospitanti u l-patoġenu fihom tikketti komplementari tal-fużjoni tad-DNA. Qabel ma jintroduċi l-patoġenu, l-ospiti jiġi "inokulat": inkubat b'oligos ssDNA żejda komplementari għat-tikketti tad-DNA tal-fużjoni fuq il-wiċċ tal-ospitant (tikketti identiċi għal dawn fuq il-patoġenu nieqes il-parti tal-kolesterol użata biex tiġi ankrata t-tikketta mal-membrana ta ' il-patoġenu). L-inokulazzjoni tikkawża li t-tikketti tal-fużjoni fuq il-wiċċ ta 'l-ospitant isiru double-stranded, u b'hekk il-fużjoni mal-patoġenu tkun impossibbli. (b) Il-prova tal-prinċipju għall-iskema ta' tilqim. Il-popolazzjoni ta 'liposomi li jġorru GFP taħt il-kontroll tal-promotur T7 RNA, iżda mingħajr T7 RNA polymerase, hija mgħaqqda ma' liposomi li fihom T7 RNA polymerase. Il-proteina GFP tista' tiġi espressa biss jekk iż-żewġ popolazzjonijiet jingħaqdu. Wieħed jew it-tnejn mis-sieħba tat-taħlit ġew "inokulati" permezz ta 'inkubazzjoni b'tikketta tad-DNA kompatibbli mat-tikketti tal-fużjoni fuq il-wiċċ tal-liposoma, u b'hekk it-tikketti tal-fużjoni kienu doppji u għalhekk inkompatibbli mal-fużjoni. Kors tal-ħin rappreżentattiv għall-espressjoni tal-proteini huwa muri fil-Figura S28. Esperimenti ta 'kontroll mingħajr ebda tikketti ta' fużjoni huma f'Figura S29, u kontrolli b'tikketti ta 'fużjoni inkompatibbli huma pprovduti f'Figura S30. Il-konċentrazzjoni tal-oligo ta 'l-inokulazzjoni ġiet stabbilita b'mod sperimentali, id-dejta murija fil-Figura S31. (c) Esperimenti ta' infezzjoni tal-parassiti. Ospitanti li jġorr GFP ġie mgħaqqad ma 'parassita li jġorr mCherry, kif deskritt fil-Figura 2. L-ospitant u l-parassita tħalltu bi proporzjon li jvarja tal-ospitant mal-parassita; ċelluli ospitanti jew ġew imlaqqma (b'tikketti ta' fużjoni tad-DNA double-stranded mhux kompatibbli mal-fużjoni) jew mhux imlaqqma (b'hekk suxxettibbli għall-fużjoni mal-parassita). Il-fluworexxenza mCherry hija rrappurtata biss għal kampjuni bl-ospitanti mhux imlaqqma minħabba li ma kien hemm l-ebda fluworexxenza mCherry li tista' titkejjel fil-kampjuni ospitanti mlaqqma. Inokulazzjoni maqluba ġiet ittestjata billi tlaqqam il-parassita minflok l-ospitanti, dejta murija fil-Figura S32. (d) Esperimenti ta 'infezzjoni bil-ġenoma ospitanti suxxettibbli għall-patoġen li jġorr l-enzima ta' restrizzjoni MunI, kif deskritt fil-Figura 3. Is-serje ta 'dejta infettata tirrappreżenta ospitanti mingħajr tilqim, u s-serje ta' dejta inokulata tirrappreżenta kampjuni bl-ospitanti inkubati b'oligos ta 'inokulazzjoni, għalhekk mhux suxxettibbli għall-fużjoni mal-patoġenu. (e) Esperimenti ta' infezzjoni bil-patoġenu li jġorr il-ġene aHL, jirriżultaw f'kanali aHL li jnixxu nutrijenti miċ-ċelluli ospitanti wara l-infezzjoni, kif deskritt fil-Figura 4. Is-serje ta' dejta infettata tirrappreżenta l-ospitant mingħajr tilqim u s-serje ta' dejta inokulata tirrappreżenta kampjuni bil- ospitanti inkubati b'oligos ta' inokulazzjoni, u għalhekk mhux suxxettibbli għall-fużjoni mal-patoġenu. Il-vireg tal-iżbalji fuq il-pannelli kollha jindikaw SEM, n=3. Il-valuri tal-fluworexxenza fil-pannelli (c−e) huma normalizzati għall-fluworexxenza blu taż-żebgħa tal-membrana użata biex jiġu normalizzati r-riżultati għall-konċentrazzjoni taċ-ċelloli ospitanti. Xi dejta murija f'din il-figura hija esperimenti b'setup identiku għall-esperimenti murija f'ċifri preċedenti (kif indikat f'kull caption). Dawn l-esperimenti ġew ripetuti għal din iċ-ċifra biex tipproduċi dejta bl-użu tal-istess lott ta 'TxTl biex jitqabblu direttament ir-riżultati, telimina l-varjabilità minn lott għal lott ta' preparazzjonijiet TxTl.

Inokulazzjoni ta 'Ċelloli Sintetiċi Prevenzjoni Infezzjoni.

Fl-eżempju deskritt hawn fuq, urejna li l-ospitant jiddefendi kontra l-influwenza tal-ġenoma ta 'patoġenu billi esprima proteina żejda. Sussegwentement, staqsejna jekk huwiex possibbli li jiġi mmudellat xenarju, fejn xi intervent jagħmel ospitanti li qabel kienu suxxettibbli immuni għall-infezzjoni fl-ewwel lok. Sejħulu mudell ta’ inokulazzjoni. Filwaqt li nirrikonoxxu li dan huwa 'l bogħod minn analoġija perfetta, l-aspett li ffukajna fuqu huwa li ċ-ċellula sintetika ospitanti ma tonfoq l-ebda riżorsi biex tiġġenera l-immunità. Fil-mudell ta 'immunizzazzjoni tagħna, iddisinjajna trattament li jibdel iċ-ċellula sintetika ospitanti li hija suxxettibbli għall-infezzjoni f'ċelloli li ma jistgħux jingħaqdu ma' patoġenu. Is-sistema tal-fużjoni taċ-ċelluli sintetiċi użata f'dan id-dokument tiddependi fuq tikketti tad-DNA single-stranded biex tinduċi fużjoni tal-membrana tal-liposomi. Biex inokula kontra l-fużjoni b'patoġenu, inkubajna ċ-ċelloli b'oligonukleotide tad-DNA kumplimentari għall-oligo tal-fużjoni fuq il-wiċċ taċ-ċelloli (Figura 6a). L-ewwel, kellna nikkonfermaw li t-tilqim b'inkubazzjoni b'oligo kumplimentari taħdem biex tabolixxi l-fużjoni. Fl-esperimenti tal-prova tal-prinċipju, ġew ippreparati żewġ popolazzjonijiet ta 'liposomi: popolazzjoni waħda kellha TxTl bi plasmid li jikkodifika GFP taħt il-kontroll tal-promotur T7 u l-popolazzjoni l-oħra kellha TxTl u T7 RNA polymerase iżda l-ebda plasmid. Wara l-fużjoni ta 'dawn iż-żewġ popolazzjonijiet, il-plasmid GFP imħallat ma' T7 RNA polymerase u indotta espressjoni GFP. Jekk iż-żewġ popolazzjonijiet kellhom tikketti ta 'fużjoni single-stranded u komplementari, seħħet fużjoni u nstabet fluworexxenza GFP. Jekk popolazzjoni waħda jew iż-żewġ popolazzjonijiet kienu inkubati b'oligonukleotide kumplimentari għat-tikketta tal-fużjoni, il-fużjoni tal-liposoma ma seħħitx u l-GFP ma kienx espress (Figura 6b). Wara li stabbilixxa s-sistema ta 'tilqim, ipproċedejna biex nintroduċu t-tilqim biex nipproteġu ċ-ċelloli sintetiċi ospitanti fi tlieta mix-xenarji ta' infezzjoni deskritti aktar kmieni f'dan ix-xogħol. L-ewwel, użajna x-xenarju tal-parassita deskritt fil-Figura 2. Iċ-ċelloli ospitanti, li fihom ġenoma GFP, ġew imlaqqma b'oligo kumplimentari għat-tikketta tal-fużjoni fuq il-wiċċ tal-ospitant, u l-ospitant tħallat mal-parassita mCherry. Aħna ħallat l-ospitanti mal-parassita fi proporzjonijiet differenti. Taħt il-kundizzjonijiet kollha ta 'infezzjoni, il-fluworexxenza tal-parassita mCherry ma kinitx tista' tinkixef jekk l-ospitant kien imlaqqam u l-fluworexxenza tal-GFP tal-ospitant inokulat ma naqsitx. L-esperimenti ta 'kontroll bl-ospitanti mhux imlaqqma wrew tnaqqis fl-espressjoni GFP ospitanti u żieda fis-sinjal tal-parassita mCherry, kif mistenni (Figura 6c). Sussegwentement, applikajna s-sistema ta’ inokulazzjoni għall-każ ta’ ospitanti infettat b’patoġenu li jġorr enzima ta’ restrizzjoni MunI li tikkodifika l-ġenoma li kapaċi tiddiġerixxi l-ġenoma tal-GFP tal-ospiti, bħal f’esperimenti murija fil-Figura 3. L-ospitant imlaqqam ma weriex tnaqqis fil-fluworexxenza GFP wara t-taħlit ma 'ammonti dejjem jiżdiedu tal-patoġenu, filwaqt li l-ospitanti mhux innokulat kien infettat u l-fluworexxenza GFP ospitanti naqset proporzjonalment mal-ammont dejjem jiżdied ta' patoġenu (Figura 6d). L-inokulazzjoni kienet effettiva wkoll kontra l-patoġenu aHL. L-ospiti inokulati ma wrew l-ebda tnaqqis fil-fluworexxenza mat-taħlit mal-patoġenu, filwaqt li l-fluworexxenza GFP tal-host mhux imlaqqam naqset b'mod sinifikanti bl-infezzjoni (Figura 6e). Fil-każijiet kollha, din il-proċedura ta 'tilqim sempliċi, li tinkuba l-ospitanti b'oligo tad-DNA kumplimentari għall-oligo tal-fużjoni fuq il-wiċċ tal-ospitant, kienet biżżejjed biex tabolixxi l-abbiltà taċ-ċelloli sintetiċi patoġeniċi li jinfettaw iċ-ċelloli ospitanti. Għalhekk, urejna mudell fiżikokimiku sempliċi ta 'intervent li jipproteġi ċ-ċelloli ospitanti mill-infezzjoni.

benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni

KONKLUŻJONIJIET

F'dan id-dokument, aħna nuru metodi għall-użu ta 'ċelluli minimi sintetiċi biex jimmudellaw infezzjonijiet parassiti u patoġeniċi. Il-motivazzjoni wara x-xogħol tagħna kienet doppja. Ridna nibdew imġieba kumplessa, li tixbah il-ħajja f'ċelloli sintetiċi, li tiffaċilita l-għan ta 'inġinerija ta' ċelloli sintetiċi li jixbħu aktar ċelloli ħajjin naturali. Ridna wkoll nieħdu vantaġġ mis-sistema taċ-ċelluli sintetiċi sempliċi u kontrollabbli biex timmudella l-proprjetajiet bażiċi tal-proċessi ta 'infezzjoni, inokulazzjoni u reżistenza. Filwaqt li ċ-ċelluli sintetiċi ma jevolvux jew jirreplikaw lilhom infushom, din is-sistema tippermetti l-istudju tad-dinamika tal-infezzjoni f'mudell sempliċi u faċli biex tiġi analizzata. Nittamaw li l-prinċipji tal-infezzjoni deskritti hawn jgħinu biex jinħolqu mudelli prattiċi u applikabbli għal patoġeni differenti u mitigazzjoni tal-infezzjoni. L-istudju ta 'din is-sistema ta' ċelluli sintetiċi simplifikata enfasizza l-interazzjonijiet fundamentali bejn il-parassita u l-patoġenu. Filwaqt li ċ-ċelloli sintetiċi mhumiex (għadhom) ħajjin, u m'għandhomx il-kapaċità li jgħaddu minn evoluzzjoni Darwinjana, din is-sistema tippermettilna nosservaw l-interazzjonijiet tal-patoġenu u tal-ospitanti mingħajr il-ħila li niżviluppaw immunità naturali jew nibdlu l-virulenza tal-patoġenu. Filwaqt li d-dinamika tal-infezzjoni ospitanti ppreżentata hawn tutilizza ċelloli sintetiċi bbażati fuq il-batterja, din is-sistema mhijiex limitata b'mod inerenti għal TxTl batterjali. Ikun saħansitra possibbli li wieħed jimmaġina li tuża s-sistema ppreżentata hawn biex timmudella d-dinamika ta 'infezzjoni f'popolazzjonijiet li jixbħu ekosistemi naturali, billi tieħu vantaġġ mis-sempliċità inerenti għaċ-ċelloli sintetiċi biex tikkontrolla u tistudja bis-sħiħ l-interazzjonijiet bejn membri differenti ta' popolazzjonijiet kbar.

REFERENZI

(1)Applikazzjonijiet. Mater. Illum 2016, 19, 516−532.

(2) Gaut, NJ; Adamala, KP Elementi Ċelloli Naturali li jirrikostitwixxu f'Ċelloli Sintetiċi. Adv. Biol. 2021, 5, Nru 2000188.

(3) Tan, C.; Saurabh, S.; Bruchez, MP; Schwartz, R.; Leduc, P. Molecular Crowding Formes Espressjoni tal-Ġene f'Nanosistemi Ċellulari Sintetiċi. Nat. Nanoteknoloġija. 2013, 8, 602−608.

(4) Glantz, ST; Berlew, EE; Chow, BY Interfaces tal-membrana simili taċ-ċelluli sintetiċi għall-Probing Dynamic Protein-Lipid Interactions, l-1 ed.; Elsevier Inc, 2019; Vol. 622.

(5) Zhao, J.; Zhang, Y.; Zhang, X.; Li, C.; Du, H.; Sønderskov, SM; Mu, W.; Dong, M.; Han, X. Jimitaw il-Metaboliżmu Ċellulari f'Ċelloli Artifiċjali: Trasport Universali tal-Molekula tul il-Membrana permezz tal-Fużjoni tal-Veżiku. Anal. Chem. 2022, 94, 3811−3818.

(6) Damiano, L.; Stano, P. Dwar il-"Life-Likeness" ta 'Ċelloli Sintetiċi. Quddiem. Bioeng. Bijoteknoloġija. 2020, 8, Nru 953.

(7) Salehi-Reyhani, A.; Ces, O.; Elani, Y. Mimiċi taċ-Ċelloli Artifiċjali bħala Mudelli Simplifikati għall-Istudju tal-Bijoloġija taċ-Ċelloli. Exp. Biol. Med. 2017, 242, 1309−1317.

(8) Chakraborty, T.; Wegner, SV Ċellula għal Ċellula Sinjali permezz tad-Dawl fil-Komunitajiet taċ-Ċelloli Artifiċjali: Predatur Glowing Lures Priża. ACS Nano 2021, 15, 9434−9444.

(9) Dupin, A.; Simmel, FC Sinjali u Differenzjazzjoni f'Ċirkwiti tal-Ġene Vitro Ibbażati fuq Emulsjoni Multi-kompartimentalizzati. Nat. Chem. 2019, 11, 32−39.

(10) Toparlak, OD; Zasso, J.; Bridi, S.; Serra, MD; Macchi, P.; Conti, L.; Baudet, M.-L.; Mansy, Ċelloli Artifiċjali SS Drive Differenzjazzjoni Neural. Sci. Adv. 2020, 6, Nru eabb4920.

(11) Robinson, AO; Venero, OM; Adamala, KP Lejn Ħajja Sintetika: Komunikazzjoni taċ-Ċelluli Sintetiċi Bijomimetiċi. Curr. Opinja. Chem. Biol. 2021, 64, 165−173.

(12) Smith, JM; Chowdhry, R.; Booth, MJ Kontroll tal-Komunikazzjoni Ċellula-Ċellula Sintetika. Quddiem. Mol. Biosci. 2022, 8, Nru 1321.

(13) Elani, Y. Interfacing Living and Synthetic Cells bħala Frontiera Emerġenti fil-Bijoloġija Sintetika. Angew. Chem., Int. Ed. 2021, 60, 5602− 5611.

(14) Rustad, M.; Eastlund, A.; Jardine, P.; Noireaux, V. Sintesi ta 'TXTL Ħieles Miċ-Ċelluli ta' Batterjofagi Infettiv T4 f'Reazzjoni ta' Tubu tat-Test Uniku. Synth. Biol. 2018, 3, Nru ysy002.

[15] Marshall, R.; Noireaux, V. Immudellar Kwantitattiv ta 'Traskrizzjoni u Traduzzjoni ta' All-E. coli Sistema Ħieles Miċ-Ċelluli. Sci. Rep 2019, 9, Nru 11980.

(16) Garamella, J.; Marshall, R.; Rustad, M.; Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2. 0: Pjattaforma għall-Bijoloġija Sintetika Ħielsa Ċelluli. ACS Synth. Biol. 2016, 5, 344−355.

(17) Deich, C.; Flus kontanti, B.; Sato, W.; Sharon, J.; Aufdembrink, L.; Gaut, NJ; Heili, J.; Stokes, K.; Engelhart, AE; Adamala, Sistema ta' Traskrizzjoni KP T7Max. 2021, 1−28.

(18) Gaut, NJ; Gomez-Garcia, J.; Heili, JM; Flus kontanti, B.; Han, Q.; Engelhart, AE; Adamala, KP Fużjoni programmabbli u Differenzjazzjoni ta 'Ċelloli Minimi Sintetiċi. ACS Synth. Biol. 2022, 11, 855− 866.

(19) Stengel, G.; Zahn, R.; Höök, F. Fużjoni Programmabbli Indotta mid-DNA tal-Veżiċi Fosfolipidi. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 9584− 9585.

(20) Chizzolini, F.; Forlin, M.; Yeh Martín, N.; Berloffa, G.; Cecchi, D.; Mansy, SS It-Traduzzjoni Ħieles Miċ-Ċelluli Hija Aktar Varjabbli minn Traskrizzjoni. ACS Synth. Biol. 2017, 6, 638−647.

(21) Shin, J.; Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Applikazzjoni għal Ċirkwiti Ġeni Sintetiċi u Ċelloli Artifiċjali. ACS Synth. Biol. 2012, 1, 29−41.

(22) Noireaux, V.; Libchaber, A. A Bijoreattur Vesicle bħala Pass lejn Assemblea Ċellula Artifiċjali. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 17669−17674.

(23) Adamala, KP; Martin-Alarcon, DA; Guthrie-Honea, KR; Boyden, ES Engineering Interazzjonijiet Ċirkwiti Ġenetiċi fi ħdan u bejn Ċelloli Minimi Sintetiċi. Nat. Chem. 2017, 9, 431−439.

(24) Noireaux, V.; Bar-Ziv, R.; Godefroy, J.; Salman, H.; Libchaber, A. Lejn Ċellula Artifiċjali Ibbażata fuq l-Espressjoni tal-Ġene f'Veżiċi. Phys. Biol. 2005, 2, P1−P8.

(25) Krinsky, N.; Kaduri, M.; Zinger, A.; Shainsky-Roitman, J.; Goldfeder, M.; Benhar, I.; Hershkovitz, D.; Schroeder, A. Ċelloli Sintetiċi Sintetizza Proteini Terapewtiċi ġewwa Tumuri. Adv. Kura tas-Saħħa Mater. 2018, 7, Nru 1701163.

(26) Kwon, YC; Jewett, MC Metodi ta 'Preparazzjoni ta' Produttività Għolja ta 'Estratt mhux raffinat għal Sinteżi ta' Proteina Ħielsa Miċ-Ċelluli Robusta. Sci. Rep 2015, 5, Nru 8663.

(27) Sun, ZZ; Hayes, CA; Shin, J.; Caschera, F.; Murray, RM; Noireaux, V. Protokolli għall-Implimentazzjoni ta 'Sistema ta' Espressjoni Ħieles Miċ-Ċelloli TXTL Ibbażata fuq Escherichia Coli għall-Bijoloġija Sintetika. J. Vis. Exp. 2013, 79, 1−15.

[28] Fujii, S.; Matsuura, T.; Sunami, T.; Nishikawa, T.; Kazuta, Y.; Yomo, T. Liposome Display għal Għażla in Vitro u Evoluzzjoni tal-Proteini tal-Membrana. Nat. Protoc. 2014, 9, 1578−1591.

(29) Löffler, PMG; Ries, O.; Rabe, A.; Okholm, AH; Thomsen, RP; Kjems, J.; Vogel, S. Kaskata tal-Fużjoni tal-Liposomi Programmat bid-DNA. Angew. Chem., Int. Ed. 2017, 56, 13228−13231.