Profili Immuni Lonġitudinali Jikxef Epitopi Dominanti li Medjaw Immunità Umorali fit-Tul f'Individwi konvalexxenti COVID-19

Sfond: Il-koronavirus 2 tas-sindromu respiratorju akut sever (SARS-CoV-2) huwa koronavirus patoġeniku ħafna u kontaġjuż li kkawża pandemija globali b'5.2 miljun mwiet sal-lum. Mistoqsijiet dwar il-karatteristiċi seroloġiċi tal-immunità fit-tul, speċjalment l-epitopi dominanti li jimmedjaw ir-risponsi tal-antikorpi dejjiema wara l-infezzjoni tas-SARS-CoV-2, għad iridu jiġu eluċidati.

Għan: Kellna l-għan li nissekkaw il-kinetika u l-lonġevità tar-risponsi immuni f'pazjenti tal-marda tal-koronavirus 2019 (COVID-19), kif ukoll l-epitopi responsabbli għal immunità umorali sostnuta fit-tul kontra SARS-CoV-2.

Metodi: Aħna vvalutajna d-dinamika immuni tas-SARS-CoV-2 sa 180 sa 220 jum wara l-bidu tal-marda f'31 individwu li fil-biċċa l-kbira esperjenzaw sintomi moderati ta' COVID-19, imbagħad wettaqna profiling madwar il-proteome ta' epitopi dominanti responsabbli għal risponsi immuni umorali persistenti.

Riżultati: Analiżi lonġitudinali żvelat antikorpi sostnuti għal SARS-CoV-2 spike proteini speċifiċi u antikorpi newtralizzanti f'pazjenti COVID-19, flimkien ma 'attivazzjoni tal-produzzjoni taċ-ċitokini fi stadji bikrija wara l-infezzjoni SARS-CoV-2. Epitopi reattivi ħafna li kienu kapaċi jimmedjaw risponsi ta 'antikorpi fit-tul intwerew li jinsabu fil-proteini spike u ORF1ab. Epitopi ewlenin tal-proteina spike SARS-CoV-2 ġew immappjati mad-dominju N-terminal tas-subunità S1 u s-subunità S2, bi gradi differenti ta’ omoloġija ta’ sekwenza fost koronavirus umani endemiċi u identità ta’ sekwenza għolja bejn is-SARS- bikrija. CoV-2 (Wuhan-Hu- 1) u varjanti kurrenti li jiċċirkolaw.

cistanche suppliment benefiċċji-kif tissaħħaħ is-sistema immuni

Konklużjoni: L-infezzjoni SARS-CoV-2 tinduċi immunità umorali persistenti f'individwi konvalexxenti COVID-19 billi timmira epitopi dominanti li jinsabu fil-proteini spike u ORF1ab li jimmedjaw risponsi immuni fit-tul. Is-sejbiet tagħna jipprovdu triq biex tgħin id-disinn razzjonali tal-vaċċini u l-iżvilupp dijanjostiku. (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)

Kliem ewlieni:

SARS-CoV-2, COVID-19, rispons immuni fit-tul, immunità umorali, mikroarray ta' peptidi madwar il-proteome, epitope dominanti

Is-sindromu respiratorju akut sever koronavirus 2 (SARS-CoV- 2), il-patoġenu kawżattiv tal-pandemija tal-marda tal-koronavirus tal-2019 (COVID-19) li għaddejja, jappartjeni għall-ġeneru Betacoronavirus, li jinkludi 2 bnedmin oħra magħrufa patoġeniċi ħafna koronaviruses: koronavirus tas-sindromu respiratorju akut sever (SARS) u s-sindromu respiratorju tal-Lvant Nofsani (MERS).1 Sa mill-bidu tal-ewwel każ irreġistrat lejn l-aħħar ta’ Diċembru 2019, l-infezzjoni SARS-CoV-2 rriżultat f’aktar minn 263 miljun każijiet ikkonfermati u 5.2 miljun mewta madwar id-dinja minn Novembru 2021, li jaffettwaw 220 pajjiż u reġjun madwar 5 kontinenti.2 Wara l-infezzjoni, preżentazzjonijiet kliniċi jvarjaw ħafna, inklużi infezzjonijiet bla sintomi, sintomi ħfief jew moderati, jew saħansitra pnewmonja severa ta’ theddida għall-ħajja.3 Minkejja l- disponibbiltà ta’ diversi tipi ta’ approċċi ta’ vaċċin, ħafna pajjiżi għadhom qed jitħabtu biex iżommu mewġiet ġodda ta’ infezzjonijiet, b’varjanti ta’ virus emerġenti li jidhru li juru aktar trażmissibbiltà u reżistenza għal risponsi immuni antivirali. Rispons immuni umorali effettiv medjat minn antikorpi newtralizzanti għandu jkollu immunità adattiva qawwija u indispensabbli biex jimblokka l-infezzjoni u jelimina l-patoġeni virali. Wara l-infezzjoni SARS-CoV-2, rata għolja ('il fuq minn 90 %) ta' serokonverżjoni robusta fost individwi infettati kienet osservata minn 7 sa 14-il jum wara l-bidu tal-marda.4-6 Il-produzzjoni ta' IgA, IgG, speċifiċi għall-antiġen, u IgM li jirrikonoxxi l-proteina spike (S) u l-proteina nukleokapsid (N) tas-SARS-CoV-2 kienet skoperta matul il-fażi akuta tal-marda u l-istadju bikri tal-konvalexxenza.4,5,7 Il-kobor tal-antikorpi newtralizzanti deher li ikunu assoċjati mal-età, infezzjoni sintomatika, u s-severità tal-marda. Pazjenti anzjani u individwi li juru sintomi severi tal-COVID-19 għandhom it-tendenza li jiżviluppaw livelli ogħla ta' antikorpi newtralizzanti.4,8-10 Bosta studji dwar il-lonġevità tar-risponsi tal-antikorpi wrew li minkejja telf ta' reattività tas-serum/plażma għall-virus antiġeni u titli ta’ antikorpi newtralizzanti li qed jonqsu maż-żmien f’xi każijiet COVID-19 sintomatiċi, kien osservat livell sostnut ta’ immunità umorali fit-tul ġenerali sa 8 sa 12-il xahar wara l-infezzjoni f’individwi konvalexxenti tal-COVID-19 .10-13 Barra minn hekk, in-numru ta' ċelluli B tal-memorja speċifika għall-antiġen tas-SARS-CoV-2 baqa' stabbli għal mill-inqas 6 sa 12-il xahar,12,13 flimkien ma' għażla u akkumulazzjoni kontinwa ta' kloni taċ-ċelluli B li jesprimu antikorpi newtralizzanti,12,14 li jindikaw iż-żamma ta 'immunità umorali persistenti wara infezzjoni SARSCoV-2.

cistanche suppliment benefiċċji-żieda l-immunità

L-antikorpi newtralizzanti għandhom rwol fundamentali fid-difiżi tal-host kontra l-infezzjoni virali. Ġie identifikat panel ta' antikorpi monoklonali qawwija ħafna ta' SARS-CoV-2,15-17 primarjament immirati lejn epitopi li jinsabu fid-dominju li jgħaqqad ir-riċettur tal-proteina S li jinġabru fi trimeri fuq il-wiċċ tal-virjoni u jiffaċilitaw id-dħul tal-virus u fużjoni fuq l-ingaġġ tar-riċettur ta 'l-enzima li jikkonvertu angiotensin 2.18 Reġjuni oħra ta' proteina S, inkluż id-dominju N-terminal (NTD) tas-subunità S1 u s-subunità S2, fihom ukoll epitopi immunoġeniċi li huma kapaċi jinduċu antikorpi newtralizzanti.16 ,19,20 Minbarra n-newtralizzazzjoni, l-antikorpi ta' SARS-CoV-2 jistgħu jagħtu protezzjoni in vivo permezz ta' funzjonijiet effettur medjati minn Fc, bħal fagoċitożi dipendenti fuq l-antikorpi attivata minn ċelloli killer naturali u ċitotossiċità dipendenti fuq l-antikorpi minn monoċiti jew makrofaġi. 21,22 Minbarra l-ġlieda kontra l-infezzjonijiet virali, l-antikorpi ġġenerati minn infezzjoni naturali jew tilqim jistgħu jiffaċilitaw il-patoġenesi tal-virus, jew permezz ta’ attivazzjoni akbar tal-infjammazzjoni jew infettività mtejba tal-virus permezz ta’ formazzjoni ta’ kumpless immuni ta’ antiġen/antikorpi jew b’funzjonijiet dipendenti fuq Fc,23-25 għalkemm l-infezzjoni virali msaħħa ma ġietx osservata fil-kuntest ta' SARS-CoV-2 in vivo. Dawn ir-rwoli diverġenti ta' risponsi ta' antikorpi jeħtieġu karatterizzazzjoni sistematika ta' epitopi SARSCoV-2, kif ukoll proprjetajiet ta' antikorpi fit-tul li jimmiraw epitopi newtralizzanti jew mhux newtralizzanti. Minkejja l-progress reċenti dwar il-kinetika u t-tul tar-risponsi tal-antikorpi wara l-infezzjoni SARS-CoV-2, l-analiżi lonġitudinali rigward epitopi prominenti li jsostnu risponsi immuni umorali fit-tul għadha limitata. Studji preċedenti pprofilaw epitopi tar-rispons tal-antikorpi f'individwi infettati minn COVID-19 prinċipalment bl-użu ta' analiżi bbażati fuq ELISA, approċċi bbażati fuq phage jew display batterjali,28-31 u teknoloġiji bbażati fuq microarray.30,{{ 38}} Ġew identifikati diversi epitopi immunodominanti tal-proteina SARS-CoV-2 S; ir-reġjuni misjuba l-aktar frekwentement kienu mmappjati qrib jew li jkopru l-peptide tal-fużjoni (FP) tas-subunità S2, it-tieni eptad jirrepeti fi ħdan is-subunità S2 u fuq id-dominju C-terminal tas-subunità S1.26,28-30, 32,33 Barra minn hekk, screening seroloġiku żvela wkoll epitopi li jinsabu fi proteini oħra madwar il-proteoma SARS-CoV-2, inkluż proteina N, proteina tal-membrana (M), u ORF1ab, ORF3a, u ORF7a.28-30, 34,35 Għalkemm studji preċedenti pprovdew ħarsa importanti dwar l-epitopi antiġeniċi, dawn l-istudji ffukaw fil-biċċa l-kbira fuq il-profil tal-epitopi tal-pazjenti COVID-19 fil-fażi bikrija tal-konvalexxenza. L-epitopi eżatti li jimmedjaw risponsi ta' antikorpi speċifiċi għal SARS-CoV-2 kif ukoll id-dinamika tar-rikonoxximent tal-epitopi għad iridu jiġu eluċidati. Hawnhekk, biex tinkiseb fehim aktar profond tal-kinetika u l-lonġevità tar-risponsi immuni umorali f'pazjenti COVID-19, speċjalment epitopi responsabbli għal immunità sostnuta fit-tul kontra SARS-CoV-2, għamilna analiżi lonġitudinali komprensiva ta' profili immuni f'31 pazjent COVID-19 sa 180 sa 220 jum wara l-bidu tas-sintomi. Ibbażat fuq l-evalwazzjoni ta 'antikorpi li jorbtu l-antiġen u newtralizzanti kif ukoll il-livelli ta' ċitokini fis-serum, aħna identifikajna ulterjorment panel ta 'epitopi li jinsabu fil-proteini ORF1ab, S, u N ta' SARSCoV-2 li jimmedja risponsi immuni umorali persistenti bl-użu ta 'peptide mikroarray li jinkludi l-proteome komplut tas-SARS-CoV-2. Ir-riżultati tagħna jitfgħu dawl fuq il-karatteristiċi tal-immunità fit-tul biex tingħeleb l-infezzjoni virali u se jgħinu biex jinfurmaw disinn razzjonali tal-vaċċin u l-iżvilupp ta 'għodod dijanjostiċi seroloġiċi mtejba.

METODI

Parteċipanti ta 'studju u ġbir ta' kampjuni

Biex tiġi evalwata b'mod lonġitudinali l-kinetika tar-risponsi immuni diretti tas-SARS-CoV-2, inġabru 101 kampjun tas-serum minn 31 individwu infettat bis-SARS-CoV{-2-li ddaħħlu fit-Tielet Sptar ta' Nantong Affiljat mal-Università ta' Nantong (Nantong , iċ-Ċina) bejn Jannar u Marzu 2020. Il-pazjenti kollha ġew iddijanjostikati b'infezzjoni konfermata minn SARS-CoV-2 permezz ta' ttestjar PCR kwantitattiv ta' traskrizzjoni inversa; is-severità tal-marda kienet definita bħala COVID minn ħafifa għal moderata (mhux severa) jew severa COVID-19 skont il-verżjoni 7 tal-Protokoll tad-Djanjożi u t-Trattament għall-Pnewmonja tal-Coronavirus Ġdid maħruġ mill-Kummissjoni Nazzjonali tas-Saħħa tar-Repubblika Popolari taċ-Ċina.36 Il-pazjenti ġew segwiti lonġitudinali għal 4 sa 8 xhur wara l-irkupru minn infezzjoni akuta. Inġabru kampjuni tad-demm b’mod lonġitudinali minn 4 sa 219-il jum wara l-bidu tas-sintomi għal 20 pazjent fost 31 parteċipant fl-istudju (medjan ta’ 4.5 kampjuni għal kull individwu, li jvarjaw minn 2 sa 8), filwaqt li twettqu kampjuni f’punt ta’ ħin wieħed għal kull wieħed mill- 11-il individwu ieħor li kienu f'fażi ta' mard konvalexxenti tard (jiem 122 sa 214 wara l-bidu tal-marda). Għaldaqstant, is-sera (n 5 20) minn donaturi b'saħħithom imqabbla skont l-età u s-sess ġew inklużi wkoll bħala l-grupp ta' kontroll. L-ebda parteċipant fl-istudju ma kellu infezzjoni preċedenti dokumentata b'SARS jew MERS.

L-istudju ġie approvat mill-kumitat etiku ta 'Nantong Third Hospital affiljat ma' Nantong University (approvazzjoni EL2020006). Inkiseb kunsens infurmat bil-miktub minn kull wieħed mill-parteċipanti fl-istudju. Is-serum kien separat mid-demm periferali f'tubi tal-ġel tas-serum permezz ta 'ċentrifugazzjoni, iffurmat f'alikwoti, u maħżun f'2808C qabel l-użu.

Linji taċ-ċelluli

Iċ-ċelloli HEK293T u Huh7 ġew ikkultivati ​​f'mezz Eagle modifikat b'Dulbecco (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass) supplimentat b'10% serum bovin fetali inattivat bis-sħana (Gibco), 100 U/mL peniċillina (Gibco), u 100 mg/ mL streptomycin (Gibco) f'378C b'5% CO2.

benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Sejbien ta' antikorp IgG permezz ta' ELISA

Il-livelli ta' antikorpi IgG li jorbtu ma' l-antiġen f'kampjuni tas-serum uman ġew determinati b'ELISA. Pjanċi ELISA ta' sitta u disgħin bir (Corning, Corning, NY) ġew miksija minn qabel bil-proteina nukleokapsid SARS-CoV-2 (Sino Biological, Beijing, iċ-Ċina, katalgu nru 40588-V08B , 50 ng kull bir) jew spike protein (Sino Biological, 40589-V08B1, 100 ng kull bir), SARS-CoV spike protein (Sino Biological, 40634-V08B, 100 ng kull bir) sew), jew MERS-CoV spike protein (Sino Biological, 40069-V08B, 50 ng kull bir) matul il-lejl f'48C. Wara l-imblukkar b'5% ħalib bla xaħam f'salina b'buffer bil-fosfat (PBS) li jkun fih 0.05% Tween 20 (PBS-T) għal sagħtejn f'378C, 3-darbiet kampjuni tas-serum inattivati ​​bis-sħana dilwiti serjali f'dilwizzjoni tal-bidu ta' 1 :200 ġew miżjuda fi pjanċi miksija minn qabel għal sagħtejn f'378C. Il-bjar ġew maħsula 3 darbiet bejn kull pass b'PBS-T. Ir-reazzjonijiet ġew viżwalizzati permezz ta' inkubazzjoni b'antikorp IgG kontra l-bniedem konjugat ma' horseradish peroxidase (Abcam, Cambridge, ir-Renju Unit, 1:100, 000 dilwizzjoni) għal siegħa f'378C, segwit biż-żieda ta' substrat ta' tetramethylbenzidine (Life Technologies, Carlsbad , Kalif). Ir-reazzjonijiet li qed jiżviluppaw twaqqfu b'2 mol H2SO4, u l-assorbiment tkejjel f'450 nm bil-wavelength ta' korrezzjoni stabbilit f'630 nm (OD450 2 OD630). Għall-kalkolu tat-titer tal-endpoint tal-antikorpi li jorbtu, id-dejta ġiet linearizzata billi tpinġi l-log10 tad-dilwizzjonijiet tas-serum kontra l-valuri kkoreġuti tad-densità ottika (OD) (OD450 2 OD630) fil-porzjon lineari tal-kurva (y 5 kx 1 b , r2 > 0.99), u d-dilwizzjoni tas-serum li fiha l-valur OD aġġustat (OD450 2 OD630) 5 0 kien ikkalkulat biex jagħti titer tal-endpoint. Antikorpi IgG speċifiċi għall-antiġen fil-ġrieden immunizzati bil-peptidi ġew evalwati b'ELISA ibbażat fuq il-peptidi. Fil-qosor, 96-pjanċi ELISA sew (Thermo Fisher Scientific) ġew miksija b'1 mg għal kull bir ta '4 peptidi mħallta (peptidi 318, 356, 510, u 530) f'buffer karbonat (pH 9.6) matul il-lejl f'48C. Wara l-imblukkar b'PBS-T li fih 5% ħalib bla xaħam, il-bjar ġew inkubati b'kampjuni tas-serum dilwiti f'1:40 għal siegħa f'378C. Sussegwentement, il-pjanċi ġew maħsula u inkubati b'antikorp IgG kontra l-ġurdien konjugat bil-perossidasi taż-żwiemel (Abcam). Ir-reazzjonijiet ġew viżwalizzati b'sottostrat ta 'tetramethylbenzidine (Life Technologies), u l-assorbiment f'450 nm tkejjel wara li twaqqaf ir-reazzjonijiet b'2 mol H2SO4.

Produzzjoni u titrazzjoni ta' psewdovirus

Il-ġene ottimizzat bil-kodon li jikkodifika SARS-CoV-2 (NC_045512) jew SARS-CoV (AY291315.1) spike protein bi tħassir C-terminal 19 aa, jew MERS-CoV (JX{{10 }}) spike proteina maqtugħa b'C-terminal 16 aa ġiet ikklonata f'vettur pcDNA3.1(1), rispettivament. Iċ-ċelloli HEK 293T ikkultivati ​​f'dixx tal-kultura tat-tessuti ta' 100 mm ġew kotrasfettati b'1mg ta' proteina spike li tikkodifika l-plasmid u 15 mg ta' sinsla li tesprimi l-luċiferażi, defiċjenti ta' env (pNL4-3.luc.RE) bl-użu ta' polyethyleneimine (Polysciences). , Warrington, Pa). Supernatanti tal-kultura taċ-ċelluli li fihom psewdovirus inġabru fi 48 siegħa wara t-trasfezzjoni, iffiltrati, u maħżuna f'2808C f'alikwoti. Għad-determinazzjoni tat-titri tal-virus (50% doża infettiva tal-kultura tat-tessuti), ġew miżjuda dilwizzjonijiet serjali ta' psewdoviruses maċ-ċelluli 1 3 104 Huh7 miżrugħa minn qabel fi 96-pjanċi tal-bir. Wara 12-il siegħa ta 'infezzjoni, il-mezz li kien fih il-virus ġie sostitwit b'mezz ta' tkabbir frisk, u ċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​għal 48 siegħa addizzjonali. L-attività tal-luċiferażi tal-liżi taċ-ċelluli tkejlet b’Sistema ta’ Assaġġ ta’ Luciferase Steady-Glo (Promega, Madison, Wisc) bl-użu ta’ qarrej tal-mikroplate (BioTek Instruments, Winooski, Vt), u ġew ikkunsidrati bjar li jipproduċu unitajiet ta’ luminixxenza relattiva ogħla minn 10 darbiet il-valur medju fl-isfond pożittiv.

Psewdoviassaġġ tan-newtralizzazzjoni tar-rus

Kampjuni tas-serum inattivati ​​bis-sħana minn pazjenti COVID-19 jew donaturi b'saħħithom ġew 2-darbiet serjali dilwiti u inkubati b'200 pseudoviruses f'doża infettiva ta' kultura tat-tessuti ta' 50% għal siegħa f'378C. It-taħlitiet imbagħad ġew applikati biex jinfettaw ċelluli Huh7 miżrugħa minn qabel fi 96-pjanċi tal-bir f'żewġ kopji. Il-bjar ġew riforniti b'mezz ta 'tkabbir frisk fi 12-il siegħa wara l-infezzjoni, u l-attività tal-luċiferażi taċ-ċelloli ġiet iddeterminata 48 siegħa wara. It-titri ta' newtralizzazzjoni ta' 50% (NT50) kontra pseudoviruses SARS-CoV-2 u SARS-CoV ġew ikkalkulati permezz ta' rigressjoni mhux lineari bl-użu tas-softwer GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, La Jolla, Calif); u l-NT50 tal-psewdovirus MERS-CoV ġie definit bħala l-ogħla dilwizzjoni tas-serum li rriżultat fi tnaqqis ta '50% ta' unitajiet ta 'luminexxenza relattiva meta mqabbla mal-kontroll tal-virus mingħajr ma jiġu applikati kampjuni tas-serum.

Sejbien taċ-ċitokini bbażati fuq mikroarray tal-proteini

Il-kejl kwantitattiv ta' ċitokini multipli (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10 , IL-13, MCP-1, IFN-g, u TNF-a) fil-kampjuni tas-serum twettqu bl-użu ta 'firxa ELISA multiplex (RayBiotech, Peachtree Corners, Ga) skond il-protokoll tal-manifattur. Fil-qosor, slides tal-ħġieġ miksija minn qabel b'antikorpi speċifiċi għaċ-ċitokini ġew imblukkati b'dilwent tal-kampjun f'temperatura tal-kamra għal 30 minuta, segwiti biż-żieda ta 'kampjuni tas-serum dilwit ta' 60 mL 2-darbiet jew dilwizzjonijiet standard taċ-ċitokini. Wara inkubazzjoni matul il-lejl f'48C, pjastri ġew maħsula 5 darbiet u mtebbgħin b'80 mL cocktail ta 'antikorpi ta' detezzjoni bijotinilat u mbagħad streptavidin konjugat biż-żebgħa ekwivalenti Cy3 f'temperatura tal-kamra għal siegħa. L-intensità tal-fluworexxenza ġiet skoperta mill-iskaner microarray InnoScan 300 (Innopsys, Chicago, Ill) f'532 nm, u d-dejta ġiet analizzata permezz ta 'softwer Q-Analyzer (RayBiotech).

Sintesi tal-peptidi u konjugazzjoni ma' albumina tas-serum bovin

Total ta' 515-il peptide (15 aa fit-tul, li jikkoinċidu bi 11 aa) li jkopru l-proteoma SARS-CoV-2 ġew sintetizzati minn GL Biochem (Shanghai, iċ-Ċina) fuq il-bażi tas-sekwenza ta' amino acids ta' SARS-CoV -2 razza Wuhan-Hu-1. Il-peptidi ġew konjugati mal-albumina tas-serum bovin (BSA) bl-użu tal-crosslinker Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Fil-qosor, Sulfo-SMCC ġie miżjud f'{11}}darbiet żejjed molar għal BSA, segwit minn dijaliżi għal PBS. Sussegwentement, il-peptide li fih iċ-ċisteine ​​ġie miżjud fi proporzjon ta '1:1 (wt/wt) inkubat għal sagħtejn, u djalizzat aktar b'PBS biex jiġu eliminati peptidi ħielsa.

Fabbrikazzjoni tal-mikroarray tal-peptidi

Biex tipprepara l-mikroarray tal-peptidi, peptidi ta' SARS-CoV-2, kif ukoll il-kontroll negattiv (BSA) u kontrolli pożittivi (antikorpi IgG kontra l-bniedem u IgM kontra l-bniedem; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) , ġew immobilizzati fuq slides tas-sottostrat PATH (Grace Bio-Labs, Bend, Ore) fi tliet kopji bl-użu ta 'printer Super Marathon (Arrayjet, Edinburgh, Scotland, Renju Unit). Imbagħad microarrays peptidi ġew ippreservati f'2808C għal aktar użu.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Immappjar tal-epitopi bbażat fuq Microarray

Analiżi tas-serum ibbażata fuq Microarray saret bħala Li et al,37 b'modifiki minuri. Sabiex jinħolqu kmamar individwali għas-subbarrays identiċi, ġiet immuntata siegla tal-gomma 14-chamber fuq kull slide microarray tal-peptidi. L-arrays ta 'slajds ġew imsaħħan għat-temperatura tal-kamra qabel l-użu, imbagħad imblukkati bi 3% BSA f'PBS-T għal 3 sigħat. Il-kampjuni tas-serum minn pazjenti COVID-19 jew serum miġbura minn 20 donaturi b'saħħithom (grupp ta' kontroll) ġew dilwiti f'1:200 f'PBS-T għall-biċċa l-kbira tal-kampjuni u mbagħad inkubati ma' kull subbarra għal sagħtejn f' 48C. Il-matriċi ġew maħsula b'PBS-T, u inkubati b'IgG anti-bniedem tal-mogħoż konjugat Cy3-u Alexa Fluor 647– konjugat donkey anti-human IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa) f'dilwizzjoni 1:1000 kull wieħed għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Wara l-inkubazzjoni, l-arrays ġew maħsula b'PBS-T u mbagħad imnixxfa kompletament permezz ta 'ċentrifugazzjoni f'temperatura tal-kamra. Sussegwentement, l-arrays ġew skannjati bl-użu ta 'skaner tal-mikroarray LuxScan 10K-A (CapitalBio, Beijing, iċ-Ċina), u d-dejta tal-intensità tal-fluworexxenza FL inkisbet u ġiet analizzata minn softwer GenePix Pro 6.0 (Apparat Molekulari, Sunnyvale, Calif).

FIG 1. Dinamika lonġitudinali tar-risponsi tal-antikorpi f'pazjenti COVID-19. Skematika tad-disinn tal-istudju. Total ta’ 31 individwu infettat b’SARS–CoV–2 u 20 donatur b’saħħtu ġew irreġistrati fl-istudju. Il-ġbir tal-kampjuni tas-serum sar b'mod lonġitudinali f'diversi punti ta' ħin għal 20 pazjent fost 31 individwu infettat b'SARS-CoV-2, filwaqt li t-teħid ta' kampjuni f'punt wieħed ta' ħin sar għall-11-il pazjent l-oħra. In-numru ta' parteċipanti u kampjuni tas-serum użati f'diversi analiżi huma elenkati. B u C, Total ta' 101 kampjun tas-serum minn 31 pazjent COVID-19 ġew ittestjati b'ELISA għal antikorpi IgG li jorbtu lill-proteini N (B) u proteina S (C) SARS-CoV-2 f'punti ta' ħin differenti wara l-bidu tas-sintomi (jiem 1-30, n 5 37; jiem 31-61, n 5 18; jiem 100-150, n 5 21; jiem {{21 }}, n 5 25). Kampjuni tas-serum minn 20 donatur b'saħħithom ġew inklużi bħala l-grupp ta 'kontroll. D, NT50 kontra l-psewdoviruses tas-SARS-CoV-2 matul iż-żmien ġie kkalkulat permezz ta' rigressjoni mhux lineari. E, Id-distribuzzjoni tal-attività newtralizzanti tas-serum f'pazjenti COVID-19 f'punti ta' ħin indikati wara l-bidu tal-marda huma ppreżentati. Kampjuni b'titru NT50 taħt l-20 ġew definiti bħala l-ebda newtralizzanti

Analiżi tad-dejta tal-mikroarray tal-peptidi

Id-dejta IgG u IgM ġiet analizzata rispettivament. L-intensità tas-sinjal ta 'kull spot kienet definita bħala t-tagħrif miksub nieqes l-isfond u medja ta' spots tripli għal kull peptide. Il-valur tal-qtugħ għar-rispons pożittiv tal-peptidi tal-kampjuni tal-COVID-19 ġie stabbilit bħala d-doppju tal-intensità tas-sinjal tal-kontroll tad-donatur b'saħħtu. Peptidi b'rati pożittivi 'l fuq minn 80% fost kampjuni ttestjati fit-3 punti kollha ta' ħin ta' kampjunar (jiem 10-60, 100-150, u 180-220 wara l-bidu tal-marda) kienu definiti bħala peptidi u peptidi dominanti u persistenti bi frekwenza ta' rispons pożittiv 'il fuq minn 60% fil-{7}}punti kollha ta' ħin kienu kkunsidrati bħala subdominanti u persistenti. Ġiet ikkalkulata l-intensità medja tas-sinjal ta 'kull peptide fi 3 gruppi ta' punti ta 'żmien ta' kampjunar; Intgħażlu wkoll peptidi li juru intensità għolja tas-sinjal ('il fuq mill-medja 1 SD tal-intensitajiet tas-sinjali tal-kampjuni kollha ttestjati). L-ipproċessar u l-analiżi tad-dejta saru permezz ta 'softwer R v3.6.3 (https://www.r-project.org/), u bidliet sinifikanti fl-intensità tas-sinjal fost gruppi differenti ta' punti ta 'żmien ta' kampjunar ġew evalwati abbażi ta 'Limma. Differenzi b'P <.05 tqiesu statistikament sinifikanti.

Tilqim tal-ġrieden

Ġrieden femminili BALB/c ta 'età ta' 6 sa 8 ġimgħat inxtraw minn Beijing Vitalstar Biotechnology (Beijing, iċ-Ċina). Il-ġrieden kollha kienu miżmuma f'faċilitajiet speċifiċi ħielsa mill-patoġeni, u l-istudju fuq l-annimali ġie approvat mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Università Medika ta 'Tianjin (Tianjin, iċ-Ċina). Għall-immunizzazzjoni, gruppi ta 'ġrieden (n 5 5) ġew injettati ġol-muskoli b'25 mg għal kull doża ta' kull peptide (peptidi 318, 356, 510, u 530 rispettivament) imħallta ma '50 mg alum (InvivoGen, San Diego, Calif) u 10 mg adjuvants CpG, u msaħħa darbtejn b'50 mg għal kull doża ta' peptidi fil-preżenza ta' adjuvants f'intervalli ta' 2-ġimgħa. It-tilqim b'adjuvants waħedhom serva bħala l-kontroll negattiv. Sera nġabru minn ġrieden immunizzati fil-jum 10 jew jum 14 wara t-tieni u t-tielet tilqim.

Analiżi statistiċi u strutturali

Il-graffs kollha ġew ippjanati minn GraphPad Prism. Paraguni statistiċi bejn il-gruppi f'Fig 1, 2, u 4 saru permezz ta' 1-mod ANOVA b'paragun multiplu ta' Tukey. Korrelazzjonijiet murija fil-Fig 1 Fig E9 u Fig E10 fir-Repożitorju Online disponibbli fuq www.jacionline.org ġew determinati mill-analiżi ta 'korrelazzjoni Pearson. Differenzi b'P <.05 tqiesu statistikament sinifikanti. L-istrutturi tas-SARS-CoV-2 spike protein (Protein Data Bank [PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX u PDB ID: 6ZGI) u d-dominju tad-dimerizzazzjoni tas-SARS-CoV{{ 13}} proteina nukleokapsid (PDB ID: 6YUN) ġew utilizzati biex jiddissezzjonaw id-dettalji strutturali ta 'epitopi identifikati li jinsabu fuq il-proteina spike u d-dominju tad-dimerizzazzjoni tal-proteina nukleokapsid. L-allinjament tas-sekwenza u l-analiżi tal-omoloġija fost diversi koronavirus umani saru mill-algoritmu Clustal W fis-softwer MEGA v10.1.6.

RIŻULTATI

L-infezzjoni tas-SARS-CoV-2 tinduċi antikorpi sostnuti li jgħaqqdu u newtralizzanti speċifiċi għall-antiġen

Biex jiġu vvalutati b'mod lonġitudinali r-risponsi tal-antikorpi wara l-infezzjoni SARS-CoV-2, inġabru 101 kampjun tas-serum minn 31 individwu b'infezzjoni SARS-CoV-2 ikkonfermata bil-PCR (Fig 1, A). Il-parteċipanti fl-istudju kienu jinkludu 26 pazjent b'COVID-19 moderat, 1 bi preżentazzjoni bla sintomi, 2 b'mard ħafif, u 2 b'sintomi severi (ara Tabella E1 fir-Repożitorju Online disponibbli fuq www.jacionline.org). Il-pazjenti rreġistrati f'dan l-istudju varjaw minn 17 sa 66 sena (età medjana, 45 sena), b'distribuzzjoni bejn wieħed u ieħor ugwali ta' suġġetti rġiel (51.6%) u nisa (48.4%). L-aktar sintomi komuni fost il-parteċipanti fl-istudju kienu jinkludu deni (83.9%), sogħla (67.7%), mijalġja (22.6%), u tertir (22.6%), b'tul medjan tal-mard ta '15-il jum. Total ta' 90 kampjun tas-serum minn 20 pazjent COVID-19 inġabru waqt l-isptar u l-ħruġ wara l-irkupru f'diversi punti ta' ħin sa 219-il jum wara l-bidu tas-sintomi (Fig 1, A, u ara Tabella E2 fir-Repożitorju Online). It-teħid ta 'kampjuni mill-11-il parteċipant l-ieħor sar f'punt ta' ħin wieħed matul konvalexxenza tard (jiem 122 sa 214 wara l-bidu tas-sintomi). Barra minn hekk, kampjuni minn 20 donatur b'saħħithom b'distribuzzjoni ta 'età u sess li jaqblu ġew inklużi bħala grupp ta' kontroll (Tabella E1). Antikorpi IgG speċifiċi għall-antiġen f'kampjuni tas-serum ġew ikkwantifikati b'ELISA miksija minn qabel bi proteina SARS-CoV-2 N jew proteina S. Meta mqabbla ma’ donaturi b’saħħithom, kemm antikorpi IgG anti-N kif ukoll anti-S ġew żviluppati f’pazjenti COVID-19 fi żmien 30 jum wara l-bidu tas-sintomi, b’titer tal-endpoint medju ġeometriku ta’ 4.10 (log10 anti-N IgG) u 4.20 (log10 anti-S IgG) (Fig 1, B u C; u ara Tabella E3 fir-Repożitorju Online fuq www.jacionline.org; Fig E1, A u B; u Fig E2), bi qbil ma’ osservazzjonijiet preċedenti li serokonverżjoni iseħħ minn ġimgħatejn sa ġimagħtejn wara l-infezzjoni tas-SARS-CoV-2.5,38 Wara, it-titri tal-antikorpi li jgħaqqdu l-antiġeni naqsu fi gradi differenti matul iż-żmien. Li jonqsu b'mod rapidu u drammatiku fil-livelli ta' antikorpi IgG anti-N ġew osservati f'pazjenti COVID-19, filwaqt li livelli ogħla ta' titri IgG anti-S inżammu sa 180 sa 220 jum wara l-bidu tal-marda meta mqabbla ma' donaturi b'saħħithom (Fig 1, B , u C). Analiżi ta 'korrelazzjoni wriet korrelazzjoni sinifikanti bejn it-titri IgG anti-N log10 u titri IgG anti-S (r 5 0.50 u P <.001; Fig 1, F). Minbarra l-kwantifikazzjoni tal-antikorpi li jorbtu, id-dinamika tal-antikorpi newtralizzanti funzjonali f'individwi b'COVID-19 ġiet determinata aktar bl-użu ta' SARS-CoV psewdotipat-2. Aktar minn 95% tal-kampjuni tas-serum tal-pazjent (35/37) miġbura bejn 4 u 30 jum wara l-bidu tas-sintomi kellhom attivitajiet newtralizzanti robusti kontra SARS-CoV-2, u proporzjon kbir ta' kampjuni esibiti moderat (NT50 80-320 ) għal attività newtralizzanti qawwija (NT50 > 320) (Fig 1, D u E). Ta' min jinnota, 2 kampjuni mingħajr titri newtralizzanti jew baxxi (NT50 f'dilwizzjoni minima tas-serum ta' 1:20) inġabru f'perjodu bikri wara infezzjoni virali (f'jum 4 u jum 11 wara l-bidu tas-sintomi) qabel ma ħarġu antikorpi newtralizzanti qawwija (Fig. 1, D, u Fig E1, C). Minkejja li jonqsu l-livelli ta’ antikorpi newtralizzanti SARS-CoV-2 f’pazjenti COVID-19 matul iż-żmien, il-biċċa l-kbira tal-kampjuni tas-serum tal-pazjenti (24/25) miksuba matul 180 sa 220 jum wara l-bidu tas-sintomi sostnew pożittività għan-newtralizzazzjoni kontra SARS- CoV-2, bi tnaqqis ta' 2.8-darbiet fit-titri medji ġeometriċi NT50 (Fig 1, D u E; Tabella E3; Fig E3). Kif mistenni, meta mqabbel ma' antikorpi IgG anti-N, ġiet identifikata korrelazzjoni aktar b'saħħitha bejn it-titri ta' IgG li jorbtu SARS-CoV-2 S u titri ta' antikorpi newtralizzanti (r 5 0.61 u P < .001; Fig 1; , G u H), konsistenti mas-sejbiet li l-proteina SARS-CoV-2 S hija l-mira ewlenija tal-antikorpi newtralizzanti. Il-proteina S ta' SARS-CoV-2 taqsam xebh għoli ta' sekwenza ma' SARS-CoV virulenti ħafna (76% identità ta' sekwenza) u turi omoloġija ta' sekwenza baxxa għal MERS-CoV (34% identità ta' sekwenza). Ġiet irrappurtata cross-reattività seroloġika fost il-koronavirus;8,10,28,29 madankollu, id-dejta dwar l-evalwazzjoni ta’ segwitu lonġitudinali tar-reattività inkroċjata ta’ antikorpi kontra SARS-CoV-2 lejn koronavirus oħra tibqa’ limitata. Aħna ddeterminajna antikorpi cross-binding u cross-newtralizzanti f'serum lonġitudinali minn individwi infettati bis-SARS-CoV-2. Ir-riżultati wrew li aktar minn 80% tal-kampjuni tas-serum tal-pazjent marbuta ma 'proteini S ta' SARS-CoV u/jew MERS-CoV fi żmien xahar wara l-bidu tas-sintomi, b'27% tal-kampjuni li juru reattività inkroċjata doppja (Fig 1, I). Ir-reattività għall-proteina S SARS-CoV kellha proporzjon akbar (73%) minn MERS-CoV (35%) fost kampjuni ttestjati f'perjodu bikri (1-30 jiem wara l-bidu tal-marda) (Fig 1, I). L-antikorpi cross-binding doppji u SARS-CoV urew tnaqqis gradwali maż-żmien, b'8% biss cross-binding doppju u 20% SARS-CoV kampjuni cross-binding singolu f'180 sa 220 jum wara l-bidu tal-marda (Fig 1 , I; fir-Repożitorju Online disponibbli fuq www.jacionline.org, ara Fig E4, A; Fig E5, A; u Fig E6 fir-Repożitorju Online ta’ dan l-artikolu fuq www.jacionline.org). B'mod intriganti, il-pożittività tal-antikorpi reattivi għall-proteini MERS-CoV S baqgħet relattivament kostanti matul iż-żmien (Fig 1, I). Differenti mill-kapaċità ta' crossbinding għolja, numru żgħir biss ta' kampjuni ta' serum tal-pazjenti cross-newtralizzaw pseudoviruses SARS-CoV u/jew MERS-CoV (Fig 1, I; Fig E4, B; Fig E5, B; u ara Fig E7 fil- Repożitorju onlajn). Madwar 27% tal-kampjuni miġbura minn 1 sa 30 jum wara l-bidu tas-sintomi ppreżentaw attività cross-newtralizzanti, u dan in-numru niżel għal 20% f'180 sa 220 jum, b'bidliet aktar drammatiċi fl-attività cross-newtralizzanti tas-SARS-CoV (Fig 1, I ). Proporzjon ogħla ta' kampjuni cross-newtralizzaw SARSCoV minn MERS-CoV fi żmien 30 jum wara l-bidu tal-marda. Ta’ min jinnota li minkejja proporzjonijiet simili ta’ kampjuni li juru cross-newtralizzazzjoni ta’ SARS-CoV u MERS-CoV, il-valuri NT50 għal MERS-CoV kienu ħafna aktar baxxi minn dawk ta’ SARSCoV fost kampjuni ta’ serum li kienu pożittivi għan-newtralizzazzjoni inkroċjata (Fig E4, B; Fig E5, B; Fig E7).

sistema immunitarja li żżid il-pjanti cistanche

L-infezzjoni SARS-CoV-2 tirriżulta fl-attivazzjoni tal-produzzjoni taċ-ċitokini

Biex nikkaratterizzaw b'mod komprensiv il-bidliet immunoloġiċi wara l-infezzjoni tas-SARS-CoV-2, aħna vvalutajna aktar il-bidliet fid-dinamika fil-livelli taċ-ċitokini fis-serum ta' pazjenti COVID-19. Ħamsa u ħamsin kampjun tas-serum lonġitudinali li nġabru fl-ewwel xahrejn tal-bidu tas-sintomi ntużaw għall-iskoperta tal-produzzjoni taċ-ċitokini minn microarray ibbażat fuq il-proteini. Livelli miżjuda fis-serum ta’ ċitokini multipli kienu osservati matul l-ewwel xahar ta’ mard, inklużi IL-1a (proinfjammatorji), IL-6 (proin-infjammatorji), u IL-10 (anti-infjammatorji). ), li ġew marbuta mas-sindromu tar-rilaxx taċ-ċitokini f'każijiet severi ta' COVID-19,39,40 kif ukoll IFN-g (tip TH1) u IL-4 (tip TH2) (Fig 2, A, u Fig E8 fir-Repożitorju Online disponibbli fuq www.jacionline.org). Speċifikament, il-livelli fis-serum ta' IL-6, IL{-10, u IFN-g żdiedu fi żmien 15-il jum wara l-bidu tas-sintomi fil-pazjenti u naqsu f'fażijiet aktar tard, filwaqt li r-rilaxx ta' IL-1 a u IL-4 intwera li żdied b'mod notevoli matul 16 sa 30 jum mill-bidu tal-marda, u waqa' malajr għan-normal wara (Fig 2, A). Analiżi ta' korrelazzjoni indikat assoċjazzjoni dgħajfa jew l-ebda lineari bejn risponsi ta' antikorpi speċifiċi għall-antiġen u produzzjoni ta' ċitokini wara l-infezzjoni SARS-CoV-2, għalkemm kienet osservata sinifikat statistiku bejn il-livelli ta' IL-10 u SARS-CoV{{{ 34}} N antikorp li jorbot mal-proteini (r 5 0.321 u P < .05), bejn il-produzzjoni ta' IL-1b u l-antikorp li jorbot mal-proteini S (r 5 20.335 u P<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.

L-immappjar tal-epitopi mal-proteome kollu jidentifika epitopi dominanti li jimmedjaw risponsi immuni umorali persistenti f'pazjenti COVID-19

Biex nikkaratterizzaw aħjar il-karatteristiċi distintivi tal-immunità umorali għal SARS-CoV-2 matul iż-żmien, applikajna mapping tal-epitopi madwar il-proteome kollha bl-użu ta 'mikroarrays ibbażati fuq peptidi. Librerija tal-peptidi li tkopri l-proteome SARS-CoV-2 ġiet ġġenerata u immobilizzata fuq slides, li fiha kull peptide kien 15 aa fit-tul b'koinċidenza 11 aa. Total ta' 51 kampjun ta' serum lonġitudinali minn 19-il pazjent bi jew bla sintomi (n 5 1) jew ħafif (n 5 2) għal moderat (n 5 15) jew sever (n 5 1 ) Ġew ittestjati infezzjonijiet SARS-CoV-2 (Tabella I). Biex jinkisbu numri ta' kampjuni, intervalli u punti ta' ħin relattivament ibbilanċjati, inġabru kampjuni b'mod sekwenzjali f'2 jew 3 punti ta' ħin minn kull parteċipant COVID-19 li jvarjaw minn 16 sa 219-il jum wara l-bidu tas-sintomi. Il-maġġoranza tal-pazjenti (18/19) ġġeneraw antikorpi newtralizzanti wara infezzjoni virali, ħlief għall-individwu wieħed b'infezzjoni bla sintomi (Tabella I). Skont il-punti differenti tal-ħin tat-teħid tal-kampjuni, il-kampjuni ġew maqsuma fi 3 gruppi: jiem 10-60 (n 5 18), jiem 100-150 (n 5 18), u jiem {{28 }} (n 5 15). Twettqet valutazzjoni lonġitudinali tal-profili tal-epitopi tal-virus f'pazjenti COVID-19 kemm għall-antikorpi IgG u IgM fis-serum, b'serum miġbur minn 20 donatur b'saħħtu użat bħala kontroll negattiv. Bl-użu tal-mikroarray tal-proteome SARS-CoV-2, il-kinetika tar-risponsi tal-antikorpi li jgħaqqdu l-peptidi ġew iddeterminati u analizzati għal (1) intensità tas-sinjal tal-irbit, u (2) perċentwal ta’ kampjuni reattivi pożittivi (rata pożittiva) għal kull peptide . Ibbażat fuq il-valur ta' qtugħ għal rispons pożittiv ta' rbit ta' peptidi, li ġie stabbilit bħala d-doppju tal-intensità tas-sinjal tal-kontroll negattiv, identifikajna total ta' 460 peptide pożittiv għal IgG u 479 peptide pożittiv għal IgM li kienu reattivi b'mill-inqas pazjent 1 kampjun tas-serum. In-numri tal-peptidi pożittivi u d-distribuzzjoni tar-risponsi f'qafas ta' qari miftuħa (ORFs) differenti ta' SARS-CoV-2 kienu relattivament stabbli fost gruppi ta' kampjuni differenti, b'tendenza ta' tnaqqis żgħir fin-numri ta' peptidi pożittivi maż-żmien (Fig 3, A). L-aktar reattività ġiet identifikata fir-replikase polyprotein ORF1ab, li hija l-akbar ORF, li tinkludi aktar minn żewġ terzi tal-ġenoma kollu (Fig 3, A). Interessanti, osservajna gradi moderati għal qawwija ta’ korrelazzjoni bejn risponsi pożittivi li jorbtu mal-peptidi u livelli ta’ ċitokini fis-serum kmieni wara l-infezzjoni SARS-CoV-2 (jiem 10-60 wara l-bidu tal-marda; ara Fig E10 fir-Repożitorju Online fuq www.jacionline.org). In-numru ta' peptidi li jorbtu pożittivi għal IgM intwera li huwa assoċjat ma' livelli fis-serum ta' IL-6 u IL-10; bl-istess mod, l-intensità medja tas-sinjal tal-peptidi reattivi totali u dik tal-peptidi li jorbtu ORF1ab għal IgM ippreżentaw assoċjazzjonijiet pożittivi mal-produzzjoni ta' IL-6 u IFN-g f'kampjuni tas-serum. Din id-dejta tissuġġerixxi li bidliet fil-livelli taċ-ċitokini wara l-infezzjoni SARS-CoV-2 jistgħu jinfluwenzaw il-kobor u l-wisa 'ta' epitopi rikonoxxuti minn reazzjonijiet umorali speċifiċi għall-antiġen. Ibbażat fuq l-identifikazzjoni ta’ epitopi pożittivi, aħna għażilna aktar l-aktar epitopi komuni li b’mod konsistenti baqgħu reattivi f’aktar minn 80% tal-kampjuni COVID-19 fost kull wieħed mit-3 gruppi ta’ kampjunar (imsejħa epitopi dominanti u persistenti). Ir-riżultati wrew li dawn l-epitopi dominanti ħafna li kapaċi jimmedjaw risponsi immuni umorali fit-tul kienu jinsabu fil-poliproteina SARS-CoV-2 ORF1ab u proteina S, b'aktar epitopi rikonoxxuti minn antikorpi IgM (n 5 33) milli Antikorpi IgG (n 5 10) (Fig 3, B, u Tabella II; ara Fig E11 u Fig E12 fir-Repożitorju Online fuq www.jacionline.org). Il-poliproteina ORF1ab kellha n-numru massimu ta' epitopi dominanti li jimmedjaw risponsi fit-tul, u l-epitopi kienu mqassma b'mod wiesa' fuq ir-reġjuni ta' proteini mhux strutturali (nbsp) 2-5, nbsp 8-10, nbsp 12-14, u nbsp 16 (Tabella II). Notevolment, identifikajna epitope immunodominanti wieħed, 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), li seta' jiġi rikonoxxut minn antikorpi IgG u IgM minn 100% tal-pazjenti COVID-19, irrispettivament mill-punti ta' ħin tat-teħid tal-kampjuni tas-serum (Fig. 3, B, u Tabella II; ara Fig E13 u Fig E14 fir-Repożitorju Online). Dan il-peptide reattiv ħafna jinsab fir-reġjun helicase (nsp 13) tal-poliproteina ORF1ab, li hija essenzjali għat-tħollija ta' mudelli ta' RNA bi stranded doppju waqt replikazzjoni ta' SARS-CoV-2.41 Fost peptidi magħżula ta' ORF1ab, 2 peptidi immunodominanti bl-ogħla intensitajiet medji tas-sinjali rikonoxxuti mill-antikorpi IgG, in-numru 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) u n-numru 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), it-tnejn jinsabu fuq nsp 13. Għal risponsi IgM, peptide 685 (ORF1ab, aa 249-263) fuq nsp 2 u peptide 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) fuq nsp 13 ippreżentaw l-intensitajiet ta 'rbit l-aktar robusti (Fig 3, B). Meta wieħed iqis il-varjazzjoni fis-sinjali tal-linja bażi (sera miġbura minn donaturi b'saħħithom) għal peptidi differenti (Fig 3, B), aħna kkalkulajna aktar bidliet darbiet ta 'intensitajiet tas-sinjali fir-rigward ta' kull peptide ewlieni, relattiv għall-grupp ta 'kontroll b'saħħtu. Ir-riżultati wrew li l-peptide 2073 (irbit ta 'IgG) u l-peptide 1985 (irbit ta' IgM) li jinsabu fuq ir-reġjun nsp 13 sostnew l-intensitajiet ta 'l-irbit ta' peptide ta 'fuq (bidla darbiet) fost serum tal-pazjenti miġbura sa 180 sa 220 jum (Fig E13 u Fig E14).

FIG 2. Kinetika tal-produzzjoni taċ-ċitokini f'pazjenti COVID-19. A, Il-livelli tal-produzzjoni taċ-ċitokini f'55 kampjun tas-serum miġbura minn 16-il pazjent COVID-19 matul il-fażi akuta u stadju bikri ta' konvalexxenza ġew skoperti permezz ta' ELISA ibbażata fuq il-mikroarrays ta' proteini (jiem 1-15, n 5 11; jiem 16-30, n 5 26; jiem 31-61, n 5 18; donaturi b'saħħithom, n 5 20). Kull tikka tirrappreżenta kampjun tas-serum individwali; linji bit-tikek jindikaw il-limitu ta 'skoperta. Is-sinifikat statistiku ġie determinat permezz ta' 1-mod ANOVA b'paraguni multipli ta' Tukey. *P <.05, **P <.01, u ****P <.0001. B, Titwi bidla ta 'kull livell ta' produzzjoni ta 'ċitokini f'pazjenti COVID-19 murija f'(A) meta mqabbla mal-valuri medji ta' 20 kampjun minn donaturi b'saħħithom. Kull kolonna tindika kampjun distint tas-serum miġbur minn punti taż-żmien indikati wara l-bidu tas-sintomi; kull ringiela tirrappreżenta ċitokine individwali ttestjat.

TABELLA I. Karatteristiċi tal-pazjenti COVID-19 u koorti tal-kampjuni fl-immappjar tal-epitopi

FIG 3. Rikonoxximent IgM u IgG ta' epitopi dominanti li jikkontribwixxu għal reazzjonijiet ta' antikorpi fit-tul f'individwi infettati b'SARS-CoV-2. Analiżi lonġitudinali tar-rikonoxximent tas-serum ta 'epitopi f'19-il individwu b'COVID-19 bl-użu ta' mikroarray ta 'peptidi li jkopri l-proteome ta' SARS-CoV-2. Il-valur ta' qtugħ għar-rispons pożittiv tat-twaħħil tal-peptidi fil-kampjuni tal-pazjenti (n 5 51) ​​ġie stabbilit bħala d-doppju tal-intensità tas-sinjal tas-sera miġbura minn 20 donatur b'saħħtu. A, Għadd ta' peptidi u distribuzzjoni ta' peptidi li jorbtu pożittivi li kienu skoperti f'kampjun wieħed jew aktar miġbura fi 10-60 ijiem (n 5 18), 100-150 ijiem (n 5 18), u 180- 220 jiem (n 5 15) wara l-bidu tal-marda. In-numri jindikaw it-total ta' epitopi IgG u IgM identifikati minn kull ORF. B, Intensitajiet tas-sinjal ta 'epitopi IgG u IgM dominanti u persistenti (assi x) li kienu reattivi b'mod sostenibbli f'aktar minn 80% tal-kampjuni fit-3 punti ta' żmien ta 'kampjunar. Kull tikka tindika s-serum miġbura minn donaturi b'saħħithom (fuq) jew kampjun distint tas-serum tal-pazjent miġbur minn punti taż-żmien indikati wara l-bidu tas-sintomi. E, Proteina tal-pakkett.

TABLE II. Epitopes with >Rata pożittiva ta' 80% fit-3 punti tal-ħin tat-teħid tal-kampjuni kollha

Epitopi dominanti u persistenti tal-proteina SARS-CoV-2 S jinsabu fis-subunitajiet NTD u S2

Ġew identifikati total ta’ 4 epitopi dominanti u persistenti mill-proteina SARSCoV-2 S: peptide 318 (S, aa 45-59) u peptide 356 (S, aa 197-211), li jinsabu fi ħdan ir-reġjun NTD; peptide 510 (S, aa 813-827), li jkopri s-sit tal-qsim S2' u partijiet tal-FP tas-subunità S2, u peptide 530 (S, aa 893-907), li jinsab fir-reġjun ta' konnessjoni bejn FP u l-ewwel reġjun ripetut heptad tas-subunità S2 (Fig 3, B, u Tabella II). Fost dawn il-peptidi ewlenin tal-proteina S li għażilna, il-peptide 318, li jinsab fl-NTD tal-proteina S, kellu l-aktar intensità ta 'rbit robusta (bidla darbiet relattiva għall-kontroll; Fig E13 u Fig E14). Analiżi strutturali wrew li dawn l-epitopi huma kompletament esposti fuq il-wiċċ tal-proteina S monomerika; madankollu, xi residwi ta 'epitopi għall-peptidi 318, 356, u 530 huma moħbija taħt il-wiċċ tal-proteina S trimerika (Fig 4, A u B), li jissuġġerixxi li kemm l-istrutturi monomeru S u trimer huma rikonoxxuti b'mod effiċjenti mis-sistema immuni ospitanti taħt ċerti. ċirkostanzi. Biex inkunu speċifiċi, 2 segmenti loop tal-peptide 318 (aa 45-46 u aa 56-59) huma esposti fuq il-proteina S trimerika, bil-linja b ċentrali midfuna ġewwa; u l-biċċa l-kbira tar-residwi tal-peptide 356 huma aċċessibbli fuq il-wiċċ, inkluż il-qalba b-strand (aa 203-209) u segment tal-linja (aa 210-211). Peptide 510 fih sit ta' qsim S2' u helix ċentrali ta' FP, li t-tnejn huma ppreżentati bis-sħiħ fuq il-wiċċ tal-proteina S; ir-residwi tal-peptide 530 huma l-aktar kriptiċi, b'frazzjoni żgħira biss tal-linja (aa 893-895) esposta fuq il-proteina S trimerika (Fig 4, C). Analiżi ta 'l-omoloġija tas-sekwenza fost 7 koronavirus umani komuni żvelat li 2 epitopi li jinsabu fis-subunità S2 (peptidi 510 u 530) jaqsmu identità ta' sekwenza għolja ma 'koronavirus oħra, li tissuġġerixxi reattività inkroċjata seroloġika li timmira dawn l-epitopi fost koronavirus umani (Fig 4, D). Is-sekwenza tal-peptide 318 uriet xebh għoli ma 'SARSCoV, filwaqt li livell baxx ta' omoloġija ta 'sekwenza għall-peptide 356 intwera fost il-koronavirus, li jissuġġerixxi risponsi ta' antikorpi speċifiċi għal SARS-CoV-2 li jimmiraw għal dan ir-reġjun (Fig 4, D). Meta wieħed iqis varjanti ġodda ta' SARS-CoV-2 li qed jitfaċċaw u li jiċċirkolaw globalment, wettaqna aktar allinjament tas-sekwenza fir-rigward ta' epitopi ewlenin tal-proteina S bejn ir-razza bikrija tas-SARS-CoV-2 (Wuhan-Hu{{52} }) u 5 varjanti ta' tħassib (Alpha, Beta, Gamma, Delta, u Omicron), kif ukoll 2 varjanti ta' interess (Lambda u Mu), skont il-klassifikazzjoni tal-Organizzazzjoni Dinjija tas-Saħħa ta' viruses varjanti (aġġornata fit-30 ta' Novembru 2021). ). Ir-riżultati wrew li s-sekwenzi ta 'dawn l-epitopi dominanti u persistenti huma kważi identiċi fost il-varjanti analizzati, ħlief għal mutazzjoni waħda N211I identifikata fil-varjant Omicron il-ġdid (Fig 4, E). Din id-dejta tindika li l-antikorpi ġġenerati minn razez bikrija ta' SARS-CoV-2 jistgħu jirrikonoxxu b'mod konsistenti varjanti kurrenti li jiċċirkolaw u li dawn l-epitopi dominanti jistgħu jkunu kapaċi jimmedjaw risponsi sostnuti tal-antikorpi fit-tul fuq infezzjoni ta' SARS-CoV-2 varjanti. Biex tiddetermina aktar il-karatteristiċi immunoloġiċi ta 'epitopi identifikati fuq il-proteina S, u biex tinvestiga aktar il-valur potenzjali ta' dawn l-epitopi tal-proteina S bħala kandidati għall-vaċċin tal-peptidi, għamilna studju ta 'immunizzazzjoni tal-ġrieden bl-użu ta' peptidi magħżula. Ġrieden BALB/c ġew inokulati 3 darbiet b'kull peptide fil-preżenza ta 'alum u adjuvants CpG (Fig 4, F). Fost l-4 peptidi magħżula, it-tilqim bil-peptide 356 wassal għal antikorpi speċifiċi għall-antiġeni wara t-tieni u t-tielet dożi (Fig 4, G). Ir-riżultati tal-assaġġ tan-newtralizzazzjoni tas-serum wrew li l-immunizzazzjoni b'peptidi lineari ma ġġeneratx livelli sinifikanti ta 'antikorpi newtralizzanti kontra SARS-CoV-2 (Fig 4, H), li jissuġġerixxu li dawn il-peptidi lineari jaħdmu ħażin biex jinduċu risponsi robusti ta' antikorpi newtralizzanti.

Il-proteina N tas-SARS-CoV-2 m'għandhiex l-aktar epitopi reattivi li jimmedjaw risponsi ta' antikorpi dejjiema wara infezzjoni virali

Għadd ta' studji spjegaw l-antiġeniċità qawwija tal-proteina SARS-CoV-2 N.4,11,12 Madankollu, aħna naqsu milli nidentifikaw epitopi dominanti u persistenti li jinsabu fil-proteina N fuq il-bażi tal-kriterji tal-għażla attwali ('il fuq minn 80% rata pożittiva fit-3 punti ta 'żmien ta' kampjunar). Għal evalwazzjoni lonġitudinali tal-profili tal-epitopi tal-proteina N f'individwi b'COVID-19, wettaqna t-tieni rawnd ta' screening tal-epitopi li kien ibbażat fuq dejta miksuba mill-mikroarray tal-peptidi għall-għażla ta' epitopi sottodominanti li b'mod konsistenti baqgħu reattività pożittiva. f'aktar minn 60% tal-kampjuni tal-COVID-19 għal kull wieħed mit-3 punti ta' żmien ta' kampjunar (imsejħa epitopi subdominanti u persistenti). Ġew identifikati total ta’ 4 epitopi subdominanti u persistenti tal-proteina SARS-CoV-2 N, fosthom il-peptide 2455 (N, aa 213-227) ippreżenta reattività kemm għall-antikorpi IgG kif ukoll IgM fil-COVID{{16} }} pazjenti, b'livelli relattivament ogħla ta 'intensità tas-sinjal (Fig 5, A u B, u ara Tabella E4 fir-Repożitorju Online fuq www.jacionline.org). Iż-żewġ peptidi li jikkoinċidu, il-peptide 2455 (N, aa 213-227) u l-peptide 2456 (N, aa 217-231), jinsabu fir-reġjun linker b'ħafna Ser/Arg bejn id-dominju tal-irbit tal-RNA N-terminal u dominju ta' dimerizzazzjoni C-terminal tal-proteina N. Peptide 2482 (N, aa 321-335) u peptide 2491 (N, aa 357-371) jinsabu kompletament jew parzjalment fid-dominju tad-dimerizzazzjoni tal-proteina N (Tabella E4). Minħabba n-nuqqas ta' 3-D strutturi rigward il-konformazzjoni intatta tal-proteina N, għamilna biss analiżi strutturali ta' 2 epitopi identifikati fuq l-istruttura dimerika tad-dominju ta' dimerizzazzjoni C-terminal. Residwi tal-peptide 2482 jiffurmaw linji 2 b li huma rranġati b'mod antiparalleli fl-interfaces tad-dimerizzazzjoni, filwaqt li aa 357-364 tal-peptide 2491 jiffurmaw strutturi bbażati fuq helix li jinsabu fi truf opposti tad-dimer (Fig 5, C) . L-allinjament tas-sekwenza bejn SARS-CoV-2 bikri (razza Wuhan-Hu{-1) u 7 varjanti emerġenti żvelat aktar li s-sekwenzi ta’ dawn l-epitopi subdominanti u persistenti fil-proteina N huma kważi identiċi fost il-varjanti li jiċċirkolaw kurrenti, b’ sostituzzjoni waħda G215C tal-peptide 2455 li sseħħ fil-varjant Delta u mutazzjoni waħda G214C tal-peptide 2455 identifikata fil-varjant Lambda, li tissuġġerixxi li l-antikorpi li jimmiraw dawn il-peptidi potenzjalment jirrikonoxxu l-antiġen tal-varjanti emerġenti tas-SARS-CoV-2 (Fig 5, D ).

FIG 4. Epitopi dominanti tal-proteina spike tas-SARS-CoV-2 f'termini ta' medjazzjoni ta' risponsi immuni umorali durabbli. A u B, Postijiet tal-epitopi dominanti u persistenti fuq 3-D strutturi tal-proteina S monomerika (A) u trimerika (B) (PDB ID: 6VXX). Epitopi huma enfasizzati bl-aħdar (peptide 356, aa 197-211), aħmar (peptide 318, aa 45-59), blu (peptide 510, aa 813-827), u vjola (peptide 530, aa 893-907), rispettivament. It-tliet monomeri S f'konformazzjoni magħluqa huma murija bil-griż, roża u cyan, rispettivament. C, Analiżi dettaljata tal-istruttura tal-epitopi dominanti fil-proteina S SARS-CoV-2 fuq l-istat magħluq tat-trimer S (PDB ID: 6VXX). D, Allinjament tas-sekwenza ta 'epitopi identifikati fost koronavirus umani komuni. Ir-residwi tal-epitopi li huma kkonservati bejn SARS-CoV-2 u koronavirus umani oħra huma sfumaturi bil-griż. E, Analiżi tal-konservazzjoni tal-epitopi tas-SARS-CoV-2 bikrija (razza Wuhan-Hu-1) u 7 varjanti emerġenti. It-tikek suwed jirrappreżentaw residwi identiċi bejn ir-razza Wuhan-Hu-1 u dik indikata.

FIG 5. Epitopi subdominanti li jinsabu fil-proteina tan-nukleokapsid tas-SARS-CoV-2 huma kapaċi jimmedjaw risponsi persistenti tal-antikorpi. Frekwenzi ta 'rikonoxximent A, IgG, u IgM ta' peptidi subdominanti (reattivi dejjiema f'aktar minn 60% kampjuni) fost kampjuni ta 'serum tal-pazjent miġbura f'diversi punti ta' ħin wara l-bidu tal-marda. B, Kinetika ta' intensità tas-sinjal ta' epitopi subdominanti identifikati matul iż-żmien. Kull tikka tirrappreżenta kampjun distint tas-serum tal-pazjent miksub minn pazjenti COVID-19 f'punti ta' ħin indikati wara l-bidu tas-sintomi. Linji orizzontali bit-tikek jindikaw valuri ta' qtugħ ta' rispons pożittiv għal kull peptide. C, Analiżi dettaljata tal-istruttura tal-epitopi fuq id-dominju tad-dimerizzazzjoni C-terminal tal-proteina N (PDB ID: 6YUN). L-epitopi huma ttikkettjati bil-blu (peptide 2482, aa 321-335) ​​u kannella (peptide 2491, aa 357-364). Iż-żewġ strutturi monomeriċi huma murija bil-griż u ċjan, rispettivament. D, Analiżi tal-allinjament tas-sekwenza tal-epitopi tal-proteini N identifikati bejn is-SARS-CoV-2 bikrija (razza Wuhan-Hu-1) u 7 varjanti emerġenti. It-tikek suwed jindikaw sekwenzi identiċi bejn ir-razza Wuhan-Hu-1 u l-varjant indikat. Bidliet fis-sekwenza tal-aċidi amminiċi huma enfasizzati bl-aħmar.

FIG 6. Epitopi tal-inforra b'intensità għolja ta' rbit u frekwenzi reattivi li qed jonqsu maż-żmien, rikonoxxuti minn individwi infettati b'SARS-CoV-2. A u B, Analiżi lonġitudinali u distribuzzjoni ta 'peptidi identifikati li juru intensità għolja tas-sinjal ta' rbit (fuq il-medja 1 SD ta 'intensitajiet tas-sinjal tal-kampjuni ttestjati kollha) iżda rata pożittiva li tonqos maż-żmien. Il-frekwenza tar-rikonoxximent (A) u l-intensità tas-sinjal (B) tal-epitopi ġew impinġa bi 3 punti ta 'żmien ta' kampjunar wara l-bidu tas-sintomi. Kull tikka f'(B) tirrappreżenta kampjun individwali tas-serum tal-pazjent miġbur f'punti ta' ħin indikati wara l-bidu tas-sintomi; linji orizzontali bit-tikek jindikaw valuri cutoff tal-pożittività għal kull peptide. Twettqet analiżi tas-sinifikat statistiku bbażata fuq is-softwer Limma of R v3.6.3. *P < .05 u **P < .01. C, Tqabbil tal-post u tas-sekwenza ta' 2 epitopi adjaċenti, peptide 510 (dominanti u persistenti) u peptide 511 (intensità għolja tas-sinjal u pożittività li tonqos maż-żmien), fuq struttura tal-proteina SARS-CoV-2 S (PDB ID: 6ZGI) . Ir-reġjuni li jikkoinċidu bejn iż-2 epitopi huma enfasizzati bl-aħdar; sekwenzi uniċi huma mmarkati bl-aħmar u blu.

Analiżi seroloġika lonġitudinali tidentifika epitopi b'intensità għolja tas-sinjal iżda li jonqos ir-reattività maż-żmien

Minbarra l-epitopi reattivi ħafna magħżula li huma responsabbli għal risponsi immuni umorali sostnuti msemmija hawn fuq, aħna identifikajna u kkaratterizzajna ulterjorment panel ta’ 9 peptidi pożittivi li wrew intensitajiet ta’ rbit robusti ('il fuq mill-medja 1 SD ta' intensitajiet tas-sinjali tal-kampjuni ttestjati kollha) b' xejra ta' reattività li tonqos (rata pożittiva tinbidel 'il fuq minn 20%) fost kampjuni ta' serum minn pazjenti COVID-19 maż-żmien, skont tendenza ġenerali ta' tnaqqis fir-risponsi immuni umorali. Dawn l-epitopi huma pożizzjonati fi ħdan it-3 antiġeni dominanti: proteini ORF1ab, S, u N (Fig 6, A; u ara Tabella E5 fir-Repożitorju Online fuq www.jacionline.org). Barra minn hekk, kien osservat tnaqqis sinifikanti fl-intensitajiet tas-sinjali ta’ 4 peptidi minn proteini ORF1ab (peptidi 784-IgG, 1617-IgM, u 1986-IgM) u N (peptide 2457-IgG) bejn kampjuni minn perijodu bikri ta’ punti ta’ ħin ta’ teħid ta’ kampjuni (jiem 10-60 wara l-bidu tal-marda) u l-fażi aktar tard ta’ punti ta’ ħin ta’ teħid ta’ kampjuni (jiem 100-150 jew jiem 180-220 wara l-bidu tas-sintomi) (Fig 6 , B). Notevolment, minkejja li l-biċċa l-kbira jikkoinċidu ma 'xulxin, 2 peptidi tal-peptide tal-proteina S 510 (dominanti u persistenti; Fig 3, B) u peptide 511 (intensità għolja tas-sinjal u rata pożittiva li tonqos maż-żmien; Fig 6, A) urew mudelli differenti ta' reattività fost il-kampjuni tas-serum tal-pazjent matul iż-żmien. Analiżi tas-sekwenza u tal-post indikat li l-peptide 510 fih sit ta' qsim S2' u aċidi amminiċi addizzjonali ta' 813-SKRS-816, filwaqt li l-peptide 511 huwa kompletament fi ħdan l-FP b'828-LADA{{29 estiż. }} residwi li huma kompletament esposti fuq il-wiċċ tal-proteina S trimerika (Fig 6, C). Dawn ir-riżultati żvelaw karatteristiċi ġodda tal-epitopi li fl-aħħar mill-aħħar jistgħu jikkontribwixxu għal immunità umorali aktar b'saħħitha kontra SARS-CoV-2.

DISKUSSJONI

Karatterizzazzjoni sistematika tar-risponsi immuni fit-tul għall-infezzjoni SARS-CoV-2 hija kritika għall-iżvilupp ta' dijanjostiċi mtejba, interventi terapewtiċi effettivi, u vaċċini. Fl-istudju attwali, għamilna analiżi lonġitudinali komprensiva ta 'pazjenti COVID-19 fuq segwitu ta' 180 sa 220 jum, li wrew risponsi immuni umorali persistenti u produzzjoni ta 'ċitokini attivata wara infezzjoni virali.

B'mod sinifikanti, billi nieħdu vantaġġ mill-mikroarray bbażat fuq peptidi li jkopru l-proteome tas-SARS-CoV-2, aħna żvelajna aktar il-kinetika tar-rikonoxximent tal-epitopi u identifikajna panel ta 'epitopi dominanti li kapaċi jimmedjaw immunità umorali fit-tul. Is-sejbiet li nirrapportaw hawn dwar il-lonġevità tar-risponsi immuni umorali wara l-infezzjoni SARS-CoV-2 jikkonfermaw xi dejta ppubblikata preċedentement5,10,12,13,42 iżda jestenduhom billi twettaq profiling seroloġiku profond u screening tal-epitopi bl-użu ta’ kampjuni ta’ serum lonġitudinali minn individwi b'COVID-19 permezz tal-approċċ tal-microarray madwar il-proteome. F'dan l-istudju, identifikajna 4 epitopi dominanti (peptidi 318, 356, 510, u 530) fi ħdan il-proteina SARS-CoV-2 S li kienet kapaċi tirreaġixxi b'mod persistenti b'aktar minn 80% pazjent COVID-19 kampjuni ttestjati, sa 180 sa 220 jum wara l-bidu tas-sintomi. Peptide 510 (S, aa 813-827), li jinkludi s-sit tal-qsim S2 u l-FP tas-subunità S2, ġie identifikat b'mod komuni fi studji preċedenti ta' gruppi oħra.26,28,32-34 Analiżi funzjonali indikaw antikorpi li jimmira dan ir-reġjun jista 'juri qawwa ta' newtralizzazzjoni limitata kontra SARS-CoV -226, 33 minkejja li jkun espost ħafna fuq il-wiċċ tal-proteina S (Fig 4, AC). Fil-każ tal-peptide 530 (S, aa 893-907), li huwa pożizzjonat bejn l-FP u l-ewwel reġjun ripetut heptad tas-subunità S2, ir-residwi huma ġeneralment midfuna ġewwa l-istruttura trimerika tal-proteina S, li jagħmilha diffiċli biex taċċessaha permezz ta' antikorpi newtralizzanti robusti kontra SARS-CoV-2 (Fig 4, AC). Barra minn hekk, intgħażlu wkoll 2 peptidi diretti minn S1-NTD li jistgħu jimmedjaw risponsi ta' antikorpi fit-tul ta' SARS-CoV-2. Analiżi rigward is-sekwenza u l-post tal-peptidi indikaw li residwi ta’ dawn iż-żewġ peptidi—peptide 318 (S, aa 45-59) u peptide 356 (S, aa 197-211) — huma qrib ħafna tal-epitopi rrappurtati rikonoxxuti minn antikorpi li jsaħħu l-infezzjoni23,25 iżda minbarra s-siti ewlenin ta 'antikorpi newtralizzanti qawwija ħafna li jimmiraw NTD tas-subunità S1,16,19,43 li jissuġġerixxu l-possibbiltà ta' rikonoxximent tal-epitopi minn antikorpi mhux newtralizzanti lejn dawn iż-2 peptidi identifikati. Minbarra d-dettalji msemmija hawn fuq, l-immunizzazzjoni tal-ġrieden b'peptidi magħżula indikat aktar l-effikaċja baxxa ta 'dawn il-peptidi lineari tad-dominju li jorbtu ma' riċetturi biex jinduċu risponsi robusti ta' antikorpi newtralizzanti (Fig 4, G). B'mod kollettiv, din id-dejta tissuġġerixxi li epitopi lineari dominanti li jimmedjaw risponsi immuni umorali fit-tul fuq l-infezzjoni SARS-CoV-2 probabbilment jinduċu antikorpi b'potenza newtralizzanti limitata jew l-ebda. Fehim aktar sħiħ tal-pajsaġġ tal-epitopi tal-antikorpi SARS-CoV-2, speċjalment epitopi diretti lejn il-proteina S, jipprovdi għarfien ġdid dwar id-dissezzjoni funzjonali tal-antikorpi, li jiffaċilita aktar id-disinn tal-vaċċini innovattiv u razzjonali. Antikorpi newtralizzanti jagħtu protezzjoni biex jeliminaw infezzjonijiet virali, filwaqt li antikorpi li ma jinnewtralizzawx jista 'jkollhom rwol ta' benefiċċju, newtrali, jew saħansitra ta 'ħsara waqt it-tneħħija tal-virus. Antikorpi mhux newtralizzanti jipprovdu protezzjoni addizzjonali in vivo permezz ta' firxa ta' funzjonijiet effetturi medjati minn Fc fil-kuntest ta' fagoċitożi dipendenti mill-antikorpi u ċitotossiċità dipendenti mill-antikorpi. B'kuntrast, xi studji pproponew il-possibbiltà ta 'rwol patoġeniku ta' antikorpi mhux newtralizzanti fl-infezzjoni tal-koronavirus. Studji preċedenti li użaw diversi tipi ta’ kandidati għat-tilqim għal SARS-CoV u MERS-CoV osservaw immunopatoloġija mtejba f’annimali żgħar imlaqqma u primati mhux umani wara l-isfida tal-virus.24,44-50 Aktar reċentement, studji ta’ 2 gruppi rrappurtaw li mhux newtralizzanti antikorpi li jimmiraw NTD tal-proteina SARS-CoV-2 S kienu kapaċi jtejbu l-infezzjoni virali in vitro permezz ta’ mekkaniżmi indipendenti mir-riċettur Fcg,23,25 għalkemm antikorpi li jtejbu l-infezzjoni f’mudelli tal-annimali ġew murija li huma protettivi kontra s-SARS. -Infezzjoni tal-CoV-2 in vivo. Meta wieħed iqis ir-rwoli kontroversjali tal-antikorpi waqt l-infezzjoni tal-koronavirus, huma meħtieġa aktar investigazzjonijiet biex jivvalidaw ir-rwol potenzjali tal-antikorpi fir-rikonoxximent ta 'dawn l-epitopi dominanti u persistenti fil-ġlieda kontra l-infezzjoni virali in vivo. L-istadju li jmiss ta’ disinn razzjonali ta’ vaċċin għal SARS-CoV-2 jista’ jiġi maħsub billi jinħolqu antikorpi newtralizzanti qawwija ħafna u antikorpi protettivi mhux newtralizzanti, flimkien ma’ tnaqqis tal-preżentazzjoni ta’ epitopi li jsaħħu l-infezzjoni jew epitopi immunodominanti li m’għandhomx effetti ta’ benefiċċju. Għalkemm għadd ta’ studji preċedenti ffukaw biss fuq il-proteina S ta’ SARS-CoV-2 bil-għan li jiddelinejaw il-funzjonijiet tal-antikorpi fir-rigward tan-newtralizzazzjoni, għamilna mapping komprensiv tal-epitopi tal-proteome kollu u identifikajna panel ta’ epitopi fi ħdan il-poliproteina ORF1ab li kien rikonoxxut b’mod konsistenti minn proporzjon għoli ta’ kampjuni ta’ serum tal-pazjenti matul iż-żmien. Għalkemm dawn il-peptidi diretti mill-ORF1ab imqassma fuq il-proteini multipli mhux strutturali jistgħu ma jwasslux għal antikorpi funzjonali li jimmiraw lejn il-virion SARS-CoV-2, jistgħu jkunu applikabbli bħala għodda dijanjostika biex tgħin tiddifferenzja l-infezzjoni naturali mit-tilqim. Bl-għadd dejjem jikber ta’ riċevituri tal-vaċċin madwar id-dinja, it-testijiet seroloġiċi attwali bbażati fuq il-proteina S u l-proteina N qed jiffaċċjaw sfidi bħala approċċ effettiv biex jgħinu testijiet molekulari għad-detezzjoni tal-infezzjoni SARS-CoV-2, u wkoll għall- determinazzjoni tal-istatus immuni wara infezzjoni virali. Billi jittieħed vantaġġ mill-peptidi l-aktar komuni u persistenti reattivi fi ħdan l-ORF1ab fost individwi infettati minn COVID-19, id-dijanjosi seroloġika ta' infezzjoni naturali se titwettaq mingħajr ma jitqies l-istatus tat-tilqim li jinvolvi proteina S ibbażata fuq id-dominju ta' rbit tar-riċettur– approċċi bbażati fuq vaċċini bbażati, u inattivati ​​fuq virus. Studji futuri huma meħtieġa biex jevalwaw ir-reattività, is-sensittività u l-ispeċifiċità tal-peptidi ORF1ab identifikati f'koorti akbar li jinkludu kemm individwi infettati b'SARSCoV-2 kif ukoll riċevituri tal-vaċċin. Barra minn hekk, se tkun meħtieġa aktar evalwazzjoni tal-effiċjenza tas-sejbien permezz ta 'strateġiji ta' kombinazzjoni ta 'peptidi multipli biex tingħeleb is-sensittività aktar baxxa tal-peptidi meta mqabbla mal-proteina ta' tul sħiħ u r-reattività inkroċjata possibbli fost koronavirus umani komuni. Il-limitazzjonijiet ewlenin tal-istudju tagħna huma l-relattivament ftit kampjuni miksuba minn daqs żgħir ta’ koorti ta’ pazjenti, u l-maġġoranza tal-parteċipanti esperjenzaw mard COVID-19 mhux sever. Dawn jistgħu jillimitaw xi wħud mill-konklużjonijiet tagħna fir-rigward tal-frekwenza tar-rispons pożittiv u l-kobor tar-risponsi immuni, li jistgħu jvarjaw skont is-severità tal-marda. Madankollu, id-dejta ppreżentata f'dan l-istudju tipprovdi għarfien siewi dwar il-kinetika tar-risponsi immuni matul iż-żmien wara l-infezzjoni tas-SARS-CoV-2 u l-karatteristiċi tal-epitopi dominanti li kapaċi jimmedjaw immunità umorali sostnuta f'individwi b'COVID-19. Flimkien, dawn is-sejbiet joffru fehim aktar profond tal-lonġevità tal-immunità naturali indotta minn infezzjoni virali u għandhom implikazzjonijiet wesgħin għal strateġiji innovattivi ta 'tilqim u approċċi dijanjostiċi mtejba.

REFERENZI

1. Lu R, Zhao X, Li J, Niu P, Yang B, Wu H, et al. Karatterizzazzjoni ġenomika u epidemjoloġija tal-koronavirus ġdid tal-2019: implikazzjonijiet għall-oriġini tal-virus u t-twaħħil tar-riċetturi. Lancet 2020;395:565-74.

2. Organizzazzjoni Dinjija tas-Saħħa (WHO). Dashboard tal-koronavirus (COVID-19) tad-WHO, 2021. Disponibbli fuq: https://COVID19.who.int/. Aċċessat fit-30 ta’ Novembru, 2021.

3. Wu Z, McGoogan JM. Karatteristiċi ta' u lezzjonijiet importanti mit-tifqigħa tal-marda tal-koronavirus 2019 (COVID-19) fiċ-Ċina: sommarju ta' rapport ta' 72314 każ miċ-Ċentru Ċiniż għall-Kontroll u l-Prevenzjoni tal-Mard. ĠAMA 2020;323:1239-42.

4. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D, et al. Immunità adattiva speċifika għall-antiġen għal SARS-CoV-2 f'COVID-19 akut u assoċjazzjonijiet mal-età u s-severità tal-marda. Ċellula 2020;183:996-1012.e19.

5. Wu J, Liang B, Chen C, Wang H, Fang Y, Shen S, et al. L-infezzjoni SARS-CoV-2 tinduċi risponsi immuni umorali sostnuti f'pazjenti konvalexxenti wara COVID-19 sintomatiku. Nat Commun 2021;12:1813.

6. Long QX, Liu BZ, Deng HJ, Wu GC, Deng K, Chen YK, et al. Reazzjonijiet ta' antikorpi għal SARS-CoV-2 f'pazjenti b'COVID-19. Nat Med 2020;26:845-8.

7. Sterlin D, Mathian A, Miyara M, Mohr A, Anna F, Claer L, et al. IgA tiddomina r-rispons bikri tal-antikorpi newtralizzanti għal SARS-CoV-2. Sci Transl Med 2021;13: eabd2223.

8. Zhang J, Wu Q, Liu Z, Wang Q, Wu J, Hu Y, et al. Ċellula helper follikulari T taċ-ċirkolazzjoni speċifika għal spike u risponsi ta' antikorpi cross-newtralizzanti f'individwi konvalexxenti COVID-19. Nat Microbiol 2021;6:51-8.

9. Wang P, Liu L, Nair MS, Yin MT, Luo Y, Wang Q, et al. Ir-risponsi ta' antikorpi newtralizzanti tas-SARS-CoV-2 huma aktar b'saħħithom f'pazjenti b'mard sever. Emerg Microbes Infect 2020;9:2091-3.

10. Vanshylla K, Di Cristanziano V, Kleipass F, Dewald F, Schommers P, Gieselmann L, et al. Kinetika u korrelati tar-rispons tal-antikorpi newtralizzanti għall-infezzjoni SARSCoV-2 fil-bnedmin. Cell Host Microbe 2021;29:917-29.e4.

11. Xiang T, Liang B, Fang Y, Lu S, Li S, Wang H, et al. Livelli ta' tnaqqis ta' antikorpi newtralizzanti kontra SARS-CoV-2 f'pazjenti konvalexxenti COVID-19 sena wara l-bidu tas-sintomi. Front Immunol 2021;12:708523.

12. Wang Z, Muecksch F, Schaefer-Babajew D, Finkin S, Viant C, Gaebler C, et al. Wisa' newtralizzanti mtejba b'mod naturali kontra SARS-CoV-2 sena wara l-infezzjoni. Natura 2021;595:426-31.

13. Dan JM, Mateus J, Kato Y, Hastie KM, Yu ED, Faliti CE, et al. Memorja immunoloġika għal SARS-CoV-2 vvalutata sa 8 xhur wara l-infezzjoni. Xjenza 2021;371:eabf4063.

14. Sokal A, Chappert P, Barba-Spaeth G, Roeser A, Fourati S, Azzaoui I, et al. Maturazzjoni u persistenza tar-rispons taċ-ċelluli B tal-memorja kontra s-SARS-CoV-2. Ċellula 2021; 184:1201-13.e14. 15. Ju B, Zhang Q, Ge J, Wang R, Sun J, Ge X, et al. Antikorpi li jinnewtralizzaw il-bniedem ikkawżati mill-infezzjoni SARS-CoV-2. Natura 2020;584:115-9.

16. Liu L, Wang P, Nair MS, Yu J, Rapp M, Wang Q, et al. Antikorpi newtralizzanti qawwija kontra epitopi multipli fuq spike tas-SARS-CoV-2. Natura 2020;584:450-6.

17. Zost SJ, Gilchuk P, Każ JB, Binshtein E, Chen RE, Nkolola JP, et al. Antikorpi umani li jistgħu jinnewtralizzaw u jipproteġu kontra SARS-CoV-2. Natura 2020; 584:443-9.

18. Xu C, Wang Y, Liu C, Zhang C, Han W, Hong X, et al. Dinamika konformazzjonali ta' SARS-CoV-2 trimeric spike glycoprotein f'kumpless mar-riċettur ACE2 żvelat minn cryo-EM. Sci Adv 2021;7:eabe5575.

19. McCallum M, De Marco A, Lempp FA, Tortorici MA, Pinto D, Walls AC, et al. L-immappjar antiġeniku tad-dominju N-terminal jiżvela sit ta' vulnerabbiltà għal SARSCoV-2. Ċellula 2021;184:2332-47.e16.

20. Sauer MM, Tortorici MA, Park YJ, Walls AC, Homad L, Acton OJ, et al. Bażi strutturali għan-newtralizzazzjoni wiesgħa tal-koronavirus. Nat Struct Mol Biol 2021;28:478-86.

21. Tortorici MA, Beltramello M, Lempp FA, Pinto D, Dang HV, Rosen LE, et al. Antikorpi umani ultrapotenti jipproteġu kontra l-isfida tas-SARS-CoV-2 permezz ta' mekkaniżmi multipli. Xjenza 2020;370:950-7.

22. Pinto D, Park YJ, Beltramello M, Walls AC, Tortorici MA, Bianchi S, et al. In-newtralizzazzjoni inkroċjata ta' SARS-CoV-2 minn antikorp uman monoklonali SARS-CoV. Natura 2020;583:290-5.

23. Liu Y, Soh WT, Kishikawa JI, Hirose M, Nakayama EE, Li S, et al. Sit li jtejjeb l-infettività fuq il-proteina spike tas-SARS-CoV-2 fil-mira ta' antikorpi. Ċellula 2021; 184:3452-66.e18.

24. Liu L, Wei Q, Lin Q, Fang J, Wang H, Kwok H, et al. L-IgG kontra l-ispike jikkawża ħsara severa fil-pulmun billi tfixkel ir-risponsi tal-makrofagi waqt infezzjoni akuta minn SARS-CoV. JCI Insight 2019;4:e123158.

25. Li D, Edwards RJ, Manne K, Martinez DR, Sch€afer A, Alam SM, et al. Funzjonijiet in vitro u in vivo ta' antikorpi li jtejbu u jinnewtralizzaw l-infezzjoni SARS-CoV-2. Ċellula 2021;184:4203-19.e32. 26. Poh CM, Carissimo G, Wang B, Amrun SN, Lee CY, Chee RS, et al. Żewġ epitopi lineari fuq il-proteina spike tas-SARS-CoV-2 iġibu antikorpi newtralizzanti f'pazjenti COVID-19. Nat Commun 2020;11:2806.

27. Zhang BZ, Hu YF, Chen LL, Yau T, Tong YG, Hu JC, et al. Tħaffir ta' epitopi fuq spike protein ta' SARS-CoV-2 minn pazjenti COVID-19. Cell Res 2020;30:702-4.

28. Stoddard CI, Galloway J, Chu HY, Shipley MM, Sung K, Itell HL, et al. Il-profil tal-epitopi jiżvela firem vinkolanti tar-rispons immuni tas-SARS-CoV-2 f'infezzjoni naturali u reattività inkroċjata ma' CoVs umani endemiċi. Cell Rep 2021;35: 109164.

29. Shrock E, Fujimura E, Kula T, Timms RT, Lee IH, Leng Y, et al. Profili tal-epitopi virali tal-pazjenti COVID-19 jiżvelaw reattività inkroċjata u korrelati ta' severità. Xjenza 2020;370:eabd4250.

30. Zamecnik CR, Rajan JV, Yamauchi KA, Mann SA, Loudermilk RP, Sowa GM, et al. ReScan, pipeline dijanjostiku multiplex, jagħmel serum umani għall-antiġeni SARS-CoV-2- 2. Cell Rep Med 2020;1:100123.

31. Haynes WA, Kamath K, Bozekowski J, Baum-Jones E, Campbell M, Casanovas Massana A, et al. Immappjar ta' epitopi b'riżoluzzjoni għolja u karatterizzazzjoni ta' antikorpi SARS-CoV-2 f'koorti kbar ta' suġġetti b'COVID-19. Commun Biol 2021;4:1317.

32. Li Y, Lai DY, Lei Q, Xu ZW, Wang F, Hou H, et al. Evalwazzjoni sistematika tar-risponsi IgG għal peptidi derivati ​​mill-proteini spike tas-SARS-CoV-2 għall-monitoraġġ tal-pazjenti COVID-19. Cell Mol Immunol 2021;18:621-31.

33. Li Y, Ma ML, Lei Q, Wang F, Hong W, Lai DY, et al. Pajsaġġ tal-epitopi lineari tal-proteina spike tas-SARS-CoV-2 mibni minn 1,051 pazjent COVID-19. Cell Rep 2021;34:108915.

34. Wang H, Wu X, Zhang X, Hou X, Liang T, Wang D, et al. SARS-CoV-2 Proteome Microarray għall-Immappjar ta' Interazzjonijiet ta' Antikorpi COVID-19 f'Riżoluzzjoni ta' Amino Acid. ACS Cent Sci 2020;6:2238-49.

35. Yi Z, Ling Y, Zhang X, Chen J, Hu K, Wang Y, et al. Immappjar funzjonali tal-epitopi lineari taċ-ċelluli B tas-SARS-CoV-2 fil-popolazzjoni konvalexxenti tal-COVID-19. Emerg Microbes Infect 2020;9:1988-96.

36. Kummissjoni Nazzjonali tas-Saħħa u Amministrazzjoni Nazzjonali tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża. Protokoll ta' Dijanjosi u Trattament għal Pnewmonja Ġdida tal-Coronavirus (Verżjoni ta' Prova 7). Chin Med J (Ingli) 2020;133:1087-95; https://doi.org/10.1097/ CM9.0000000000000819.

37. Li Y, Li CQ, Guo SJ, Guo W, Jiang HW, Li HC, et al. Il-profiling tar-repertorju tal-awtoantikorpi tas-serum lonġitudinali jidentifika bijomarkaturi assoċjati mal-kirurġija fl-adenokarċinoma tal-pulmun. EBioMedicine 2020;53:102674.

38. Zhao J, Yuan Q, Wang H, Liu W, Liao X, Su Y, et al. Risposti ta' antikorpi għal SARSCoV-2 f'pazjenti b'marda ġdida tal-koronavirus 2019. Clin Infect Dis 2020;71: 2027-34.

39. Lucas C, Wong P, Klein J, Castro TBR, Silva J, Sundaram M, et al. Analiżi lonġitudinali jiżvelaw misfiring immunoloġiku f'COVID sever-19. Natura 2020;584: 463-9.

40. Moore JB, Ġunju CH. Sindromu tar-rilaxx taċ-ċitokini f'COVID sever-19. Xjenza 2020;368:473-4.

41. Chen J, Malone B, Llewellyn E, Grasso M, Shelton PMM, Olinares PDB, et al. Bażi Strutturali għall-Ikkoppjar Helicase-Polymerase fil-Kumpless ta' Replikazzjoni-Traskrizzjoni ta' SARS-CoV-2. Ċellula 2020;182:1560-73.e13.

42. Wajnberg A, Amanat F, Firpo A, Altman DR, Bailey MJ, Mansour M, et al. Antikorpi newtralizzanti robusti għall-infezzjoni SARS-CoV-2 jippersistu għal xhur. Xjenza 2020; 370:1227-30.

43. Chi X, Yan R, Zhang J, Zhang G, Zhang Y, Hao M, et al. Antikorp uman newtralizzanti jingħaqad mad-dominju N-terminal tal-proteina spike tas-SARS-CoV-2. Xjenza 2020;369:650-5.

44. Tseng CT, Sbrana E, Iwata-Yoshikawa N, Newman PC, Garron T, Atmar RL, et al. It-tilqim bil-vaċċini tal-koronavirus tas-SARS twassal għal immunopatoloġija pulmonari fuq sfida bil-virus tas-SARS. PLoS One 2012;7:e35421.

45. Bolles M, Deming D, Long K, Agnihothram S, Whitmore A, Ferris M, et al. Vaċċin tal-koronavirus tas-sindromu respiratorju akut sever inattivat doppju jipprovdi protezzjoni mhux kompluta fil-ġrieden u jinduċi rispons pulmonari proinfjammatorju eosinofiliku miżjud mal-isfida. J Virol 2011;85:12201-15.

46. ​​Weingartl H, Czub M, Czub S, Neufeld J, Marszal P, Gren J, et al. Tilqim bil-virus vaccinia modifikat Vaċċin rikombinanti bbażat fuq Ankara kontra s-sindromu respiratorju akut sever huwa assoċjat ma' epatite msaħħa fl-inmsa. J Virol 2004;78:12672-6.

47. Yasui F, Kai C, Kitabatake M, Inoue S, Yoneda M, Yokochi S, et al. Immunizzazzjoni minn qabel b'proteina nukleokapsid tal-koronavirus (SARS-CoV) assoċjata mas-sindromu respiratorju akut sever (SARS) tikkawża pnewmonja severa fil-ġrieden infettati bis-SARS-CoV. J Immunol 2008;181:6337-48.

48. Deming D, Sheahan T, Heise M, Yount B, Davis N, Sims A, et al. Effikaċja tal-vaċċin fil-ġrieden senescent ikkontestati b'varjanti ta 'spike epidemija u żoonotika li jkollhom SARS-CoV rikombinanti. PLoS Med 2006;3:e525.

49. Wang Q, Zhang L, Kuwahara K, Li L, Liu Z, Li T, et al. Epitopi immunodominanti tal-koronavirus tas-SARS fil-bnedmin qanqlu effetti kemm li jtejbu kif ukoll newtralizzanti fuq l-infezzjoni fil-primati mhux umani. ACS Infect Dis 2016;2: 361-76.

50. Agrawal AS, Tao X, Algaissi A, Garron T, Narayanan K, Peng BH, et al. It-tilqim b'vaċċin inattivat tal-koronavirus tas-sindromu respiratorju tal-Lvant Nofsani jwassal għal immunopatoloġija tal-pulmun fuq sfida b'virus ħaj. Hum Vaccin Immunother 2016;12:2351-6.