Parti 1 Effetti newroprotettivi ta' Phenylethanoid Glycosides f'Mudell in Vitro tal-Marda ta' Alzheimer
Mar 10, 2022
L-effett newroprotettiv ta 'Cistanche huwa reali?
JIANHUA YANG1*, BOWIE JU1,2*, YAO YAN1, HUAN HUAN XU1,
SHANSHAN WU1, DANDAN ZHU1, DANDAN CAO1, u JUMPING HU2
1 Dipartiment tal-Ispiżerija, L-Ewwel Sptar Affiljat; 2 Dipartiment tal-Mediċini Naturali,
Kulleġġ tal-Ispiżerija, Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang 830011, PR Ċina
Riċevuta fit-8 ta’ Jannar, 2016; Aċċettat fis-6 ta’ Jannar 2017
Astratt.
L-istudju preżenti kellu l-għan li jinvestiga l-effetti newroprotettivi ta 'phenylethanoid glycosides(PhGs) fuq H2O2- u -amyloid peptide (A )1-42-ikkaġunat ħsara taċ-ċelloli PC12 bħala mudell in vitro tal-marda ta' Alzheimer (AD). L-aħjar kundizzjonijiet ta 'induzzjoni ġew stabbiliti permezz ta' screening ta 'diversi ħinijiet u konċentrazzjonijiet ta' inkubazzjoni. Iċ-ċelloli PC12 ġew ittrattati b'0.5 µM A 1-42 u H2O2 fil-preżenza ta' PhGs għal 24 siegħa u l-vijabbiltà taċ-ċelluli mbagħad ġiet evalwata b'assaġġ MTT; Ġew imkejla wkoll ir-rilaxx tal-lactate dehydrogenase (LDH) u l-kontenut tal-malondialdehyde (MDA). L-aħjar kundizzjonijiet biex jiġi stabbilit il-mudell AD kienu t-trattament taċ-ċelluli PC12 bi 0.5 µM A 1-42 għal 48 siegħa, jew b'25 µM H2O2 maħlul f'DMEM b'PBS. PhGs f'konċentrazzjonijiet ta' 5, 25, u 50 µg/ml żiedu l-vijabbiltà u naqqsu r-rilaxx ta' LDH u MDA minn ċelluli PC12 midruba b'A 1-42 jew H2O2. Bħala konklużjoni, il-mudell ta' ħsara taċ-ċelluli PC12 indotta A 1-42- u H2O2- ġie stabbilit b'suċċess. Il-PhGs intwerew li għandhom effett newroprotettiv sinifikanti kontra l-ħsara taċ-ċelluli kkaġunata minn A 1-42- jew H2O2-.
Għal aktar informazzjoni jekk jogħġbok ikkuntattja:joanna.jia@wecistanche.com
Cistanche deserticola għandha ħafna effetti, ikklikkja hawn biex tkun taf aktar
Introduzzjoni
Il-marda ta 'Alzheimer (AD), disturb newrodeġenerattiv bil-karatteristiċi kliniċi ta' telf progressiv tal-memorja u indeboliment tal-funzjoni konjittiva (1), hija l-aktar kawża komuni ta 'dimenzja madwar id-dinja (2). L-ispejjeż finanzjarji huma enormi minħabba l-prevalenza tal-AD (3). Għalhekk, huwa urġenti li jiġu żviluppati mezzi xierqa għall-ġestjoni u l-prevenzjoni tal-AD.
Il-patoġenesi ta 'AD hija assoċjata mill-qrib ma' l-akkumulazzjoni ta 'tħabbil newrofibrillari u plakek senile (SPs) f'reġjuni tal-moħħ affettwati (4,5). -amyloid peptide (A ), il-komponent ewlieni ta 'SPs, ġie rrappurtat li għandu rwol kawżattiv fil-progressjoni ta' AD peress li għandu effett tossiku fuq iċ-ċelloli newronali (6). Frammenti A, inklużi A 1-40, A 25-35, u A 1-42, ġew iġġenerati permezz tal-qsim tal-proteina prekursur tal-amilojde (7). In-newrotossiċità ta' A 1-42 instabet li kienet ogħla b'mod sinifikanti minn dik ta' A 25-35 u A 1-40, u A 1-42 kapaċi jinduċi mudell AD (1,{ {13}}). L-istress ossidattiv jista' jkun involut fil-patoġenesi ta' l-AD u huwa l-mekkaniżmu ewlieni sottostanti newrotossiċità indotta minn A (11-13). Diversi studji ssuġġerew li A 1-42 ikkawża akkumulazzjoni intraċellulari ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS), li wassal għal ossidazzjoni tal-lipidi u proteini, ħsara lid-DNA, u attivazzjoni ta 'sinjalazzjoni tal-punt ta' kontroll taċ-ċiklu taċ-ċelluli (1,14,15). Ammonti eċċessivi ta 'H2O2 jistgħu jwasslu għal ħsara ossidattiva u jinduċu apoptosi taċ-ċelloli PC12 (16). Għalhekk, l-immirar tal-istress ossidattiv jista 'jkun approċċ promettenti għall-iżvilupp ta' strateġiji terapewtiċi għall-inibizzjoni tan-newrotossiċità indotta minn A fl-AD. Herba (H.)Cistanche, mediċina tal-ħxejjex Ċiniża użata komunement fiċ-Ċina kontinentali għat-trawwim tal-kliewi u timla l-essenza u d-demm, intużat biex tikkura telf ta 'memorja u stitikezza senile (17).Phenylethanoid glycoside(PhG), wieħed mill-kostitwenti ewlenin f'H.Cistanche, itejjeb l-indeboliment tal-apoptożi newronali kkawżata minn A 25-35 permezz tal-effetti anti-ossidanti tagħha (18,19). Studju preċedenti identifika ħames komponenti ewlenin minn PhGs totali, jiġifieriacteoside, 2'-acetylatteoside, echinacoside, cistanosides, uisoacteoside(20). Fost dawn il-komponenti,acteosideuechinacosideġew irrappurtati li għandhom effetti newroprotettivi fuq newrotossiċità indotta minn A 25-35- jew H2O2- (21-23). Per eżempju, Wu et al (24) issuġġerew liacteosideuechinacosidedisfunzjoni konjittiva mtejba kkawżata minn A 1-42. L-istudju preżenti kellu l-għan li jinvestiga l-effetti protettivi tal-PhGs f'mudell ta 'ċelluli tal-firien in vitro ta' AD.
materjali u metodi
PreparazzjonitaPhGs. PhGs totali ġew estratti minnH. Cistanchekif deskritt qabel (25). Iz-zokk imnixxef bl-arja taH. Cistanche kien trab u estratt permezz ta 'perkolazzjoni bi 80 fil-mija EtOH. Il-perkolat ġie evaporat taħt imnaqqas
pressjoni, segwita minn sospensjoni mill-ġdid f'ammont xieraq ta 'H2O2(100 µmol/l). It-taħlita ġiet iżolata fuq kolonna tar-reżina makroporuża SP-825 (Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japan) u eluwata b'0, 30, 50, 70, u 90 fil-mija EtOH fl-ilma. Biex tinkiseb il-frazzjoni b'ħafna PhG, il-{8}} fil-mija tal-eluwenti EtOH ġew ikkonċentrati u mnixxfa taħt pressjoni mnaqqsa. Twettqet spettrofotometrija ultravjola (UV) biex tiddetermina l-PhG totali. Il-kontenut ta'echinacosideuacteosideġie determinat permezz ta' kromatografija likwida bi pressjoni għolja skont protokoll preċedenti (26). Kolonna Hypersil ODS-2 (4.6x250 mm, 5 µm; Dalian Elite Analytical Instruments, Co., Ltd., Dalian, iċ-Ċina) ġiet użata u miżmuma f'temperatura ambjentali. Il-fażijiet mobbli kienu methyl cyanides u ilma li fihom 0.4 fil-mija aċidu fosforiku (v/v; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, il-Ġermanja). Ir-rata tal-fluss kienet 0.75 ml/min u l-wavelength kien issettjat għal 333 nm.
Kultura taċ-ċelluliutrattament tad-droga.Il-linja taċ-ċelluli tal-feokromoċitoma tal-far PC12 ġiet ipprovduta minn Dr He Chunhui, l-Iskola Medika, l-Università Medika ta 'Xinjiang (Urumqi, iċ-Ċina). Iċ-ċelluli ġew ikkultivati f'mezz ta' Eagle modifikat ta' Dulbecco b'livell għoli ta' glukożju (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) li kien fih 10 fil-mija serum tal-fetu bovin (Sangon Biotech Co. Ltd., Shanghai, China), 100 U/ml peniċillina, u 100 U/ml streptomycins f'inkubatur f'37˚C li fih 5 fil-mija CO2u 95 fil-mija arja. Malli laħqu 80 fil-mija ta' konfluwenza, iċ-ċelluli ġew ittrattati b'0.25 fil-mija trypsin u mgħoddija.
Sabiex tiġi eliminata l-interferenza tal-mediċina nnifisha fuq it-tkabbir taċ-ċelloli PC12, sar esperiment ta 'tossiċità. Fil-qosor, ċelluli PC12 (3x104ċelluli/ml) ġew miżrugħa fi 96-pjanċi bir-bir f'100 µl/bir u inkubati f'37˚C matul il-lejl. Wara li twarrab is-supernatant, ġew miżjuda 200 µl DMEM komplut fil-grupp vojt, filwaqt li ċ-ċelloli fil-gruppi ta’ intervent ġew ittrattati minn PhGs f’dożi varji (5, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, u 200 µg/). ml). Wara l-inkubazzjoni taċ-ċelloli f'37˚C għal 48 siegħa, 20 µl soluzzjoni MTT (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) ġiet miżjuda ma' kull bir. Wara l-inkubazzjoni għal 4 sigħat, is-supernatant ġie mormi u 150 µl dimethylsulfoxide ġie miżjud għal kull bir, segwit minn aġitazzjoni għal 10 min. Il-valuri tad-densità ottika (OD) f'490 nm ġew skoperti bl-użu ta 'qarrej tal-pjanċa ELISA.
A 1‑ 42‑indottaPC12korriment taċ-ċelluli.Peptide 1-42 mixtri minn Bioss Biotech (Beijing, iċ-Ċina) ġie maħlul fl-ilma (100 µg/ml). Sussegwentement, it-taħlita ġiet inkubata f'37˚C għal 4 ijiem u maħżuna f'4˚C qabel l-użu.
Iċ-ċelloli PC12 ġew miżrugħa fi 96-pjanċi tal-bir (3xl04ċelluli f'100 µl kull bir). Wara l-kultura għal 24 siegħa għal aderenza, 50 µl A 1-42 f'diversi konċentrazzjonijiet finali (0, 0.25, 0.5, 1, 1.5 jew 2 µM) maħlul f'DMEM mingħajr serum ġie miżjud, segwit minn inkubazzjoni għal 24, 48, 72 jew 96 siegħa. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet evalwata b'assaġġ MTT. L-aħjar konċentrazzjoni A 1-42 kienet 0.5 determinata li tkun µM. Ċelloli PC12 (3xl04ċelluli għal kull bir) ġew ittrattati b’dożi varji ta’ PhGs ({{0}}, 0.5, 5, 25, jew 50 µg/ml) fil-preżenza ta’ 0.5 µM A {{8 }} għal 24 siegħa. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet evalwata b'assaġġ MTT.
H2O2‑indottaPC12korriment taċ-ċelluli. Iċ-ċelloli PC12 ġew ibbanjati miżrugħa fi 96-pjanċi tal-bir (3xl04ċelluli f'100 µl kull bir). Wara l-kultura
għal 24 siegħa għal aderenza, 100 µl H2O2f'diversi konċentrazzjonijiet finali ({{0}}, 25, 50, 100, 200, 300, 400 u 500 µM) maħlul f'DMEM bi jew mingħajr PBS (0.01 mol/l) ġie miżjud, segwit minn inkubazzjoni għal 24 h. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet evalwata b'assaġġ MTT. L-aħjar H2O2konċentrazzjoni u solvent ġew determinati biex jistabbilixxu l-in vitromudell ta’ AD.
Ċelloli PC12 (3xl04ċelluli għal kull bir) ġew ittrattati b’dożi varji ta’ PhGs ({{0}}, 0.5, 5, 25, u 50 µM). Wara l-kultura għal 24 siegħa għal aderenza, iċ-ċelloli PC12 ġew ittrattati b'100 µl H2O2maħlul f'DMEM ma 'PBS fil-preżenza ta' PhGs għal 24 siegħa. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet evalwata b'assaġġ MTT.
Laktatdeidroġenażi (LDH)assaġġ tar-rilaxx. Il-ħsara taċ-ċelluli ġiet evalwata billi tkejjel l-attività LDH fis-supernatant taċ-ċelluli PC12 bl-użu ta 'kit LDH skont il-protokoll tal-manifattur (cat. Nru 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, iċ-Ċina). Fil-qosor, H2O, {{0}}.2 µmol/ml aċidu piruviku, buffer tal-matriċi, u buffer tal-koenzima I ġew miżjuda f'sekwenza fi 48 siegħa wara t-trattament tad-droga. Wara inkubazzjoni f'37˚C għal 15-il minuta, ġie miżjud 2,4-dinitro-phenylhydrazine. Sussegwentement, 250 µl ta’ soluzzjoni ta’ NaOH 0.4 M ġew miżjuda ma’ kull bir. Is-supernatant inġabar wara inkubazzjoni għal 30 minuta f'temperatura tal-kamra. L-assorbiment f'450 nm imbagħad tkejjel b'microplate reader.
Kejltamalondialdehyde(MDA). L-MDA tkejjel fis-supernatant taċ-ċelluli PC12 bl-użu ta’ kit kummerċjali (nru tal-kat. 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) skont il-protokoll tal-manifattur Fil-qosor, alkoħol deidrat u reaġenti oħra ġew miżjuda fl-ordni, segwiti minn inkubazzjoni f’banju tal-ilma. f'95˚C għal 40 min. It-taħlita ġiet ċentrifugata f'1,006 xg u 25˚C għal 10 minuti wara t-tkessiħ. Is-supernatant imbagħad intuża biex jiddetermina l-kontenut tal-MDA. Sussegwentement, l-assorbenza ġiet imkejla b'microplate reader f'532 nm.
Valutazzjoni ta protettiva effetti ta echinacoside u acteoside kontra AD fi vitro. Iċ-ċelloli PC12 ġew miżrugħa b'densità ta' 3xl04ċelluli/bir fi {{0}}pjanċi tal-bir (100 µl/bir). Iċ-ċelloli ġew inkubati b'mediċini inklużi echinacoside (nru tal-kat 111670-200503; Istituti Nazzjonali għall-Kontroll tal-Ikel u tad-Droga, Beijing, iċ-Ċina) u acteoside (nru tal-kat 111530-200505; Istituti Nazzjonali għall-Kontroll tal-Ikel u tad-Droga) ) f'konċentrazzjonijiet varji (0.5, 25 u 50 µg/ml). Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'A 1-42 jew H2O2għal 24 siegħa u l-vijabbiltà taċ-ċelluli kienet imkejla b'assaġġ MTT.
Statistika analiżi. Il-valuri huma espressi bħala l-medja ± devjazzjoni standard. It-test t tal-istudent intuża għal tqabbil bejn il-gruppi. Analiżi statistiċi saru bl-użu ta' SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Riżultati
Kwantifikazzjoni ta 'PhGs minn H. Cistanches.L-ispettri UV tal-PhGs estratti kif ukoll soluzzjonijiet standard ta 'echinacosideu acteoside ġew irreġistrati, u r-riżultati wrew li l-ispettri UV kienu konsistenti (Fig. 1). spettrofotometrija UV
wera li l-kontenut PhG kien 87.6 fil-mija. Ir-riżultati tal-HPLC wrew li l-kontenuti ta 'echinacoside u acteoside kienu
37.7 u 17.8 fil-mija, rispettivament (Fig. 2).
DeterminazzjonitailidealiPhGkonċentrazzjoni. Meta mqabbel mal-grupp vojt, PhG f'75, 100, 125, 150, 175 u 200 µg/ml kellu effett inibitorju sinifikanti fuq iċ-ċelloli PC12 (P<0.05), while="" phg="" at="" 5,="" 25="" and="" 50="" µg/ml="" showed="" low="" toxicity="" on="" pc12="" cells,="" and="" the="" cell="" viability="" was="">80 fil-mija (Fig. 3). Għalhekk, PhGs f'konċentrazzjoni ta '5, 25, u 50 µg/ml intużaw għat-trattament taċ-ċelloli PC12 f'esperimenti sussegwenti minħabba li ma affettwawx il-vijabbiltà taċ-ċelluli.
A 1‑42‑indottaPC12korriment taċ-ċelluli.Meta mqabbla ma' dik fil-grupp ta' kontroll, il-vijabbiltà taċ-ċelluli fil-grupp ta' korriment 0.5 µM A 1-42 kienet 63 fil-mija (P<0.05). the="" cell="" viability="" was="" decreased="" by="" aβ1-42="" in="" a="" concentration-dependent="" manner,="" and="" the="" viability="" was=""><50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups="" (fig.="" 4).="" thus,="" treatment="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="">in vitroMudell AD.
Ġiet determinata wkoll l-attività taċ-ċelloli PC12 ittrattati b'0.5 µM A 1-42 fil-preżenza ta' dożi sikuri ta' PhGs (5, 25, u 50 µg/ml) għal 24 siegħa. Meta mqabbel mal-grupp mudell (P<0.01), phgs="" showed="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" rescued="" by="" phgs="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="">
H2O2‑indottaPC12korriment taċ-ċelluli. Il-vijabbiltà taċ-ċelloli PC12 ittrattati b'25 µM H2O2maħlul f'DMEM ma 'PBS kien 56.43 fil-mija. Il-vijabbiltà taċ-ċelloli PC12 ittrattati b'200 µM H2O2maħlul f'DMEM mingħajr PBS kien 71.64 fil-mija (Tabella I). Għalhekk, ċelluli PC12 ittrattati b'25 µM H2O2maħlul f'DMEM bil-PBS ġew magħżula bħala l-aħjar kundizzjoni biex jiġi stabbilit il-mudell AD.
Meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll, il-vijabbiltà taċ-ċelluli fil-grupp mudell kienet ta' 48.8 fil-mija (P<0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" phgs="" had="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" dose-dependently="" increased="">
PhGs u l-vijabbiltà ta 'ċelluli PC12 ittrattati b'PhGs f'konċentrazzjonijiet ta' 5, 25 u 50 µg/ml kienu 54, 57, u 64 fil-mija, rispettivament (Tabella II).
PhGs jinibixxu r-rilaxx ta 'LDH ikkawżat mill-ħsara miċ-ċelloli PC12. Meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll, il-kontenut ta' LDH tas-supernatant ta 'ċelluli PC12 midruba żdied, li kien inibit minn PhGs b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni. Dan ir-riżultat indika li PhGs għandhom effett newroprotettiv sinifikanti fuq iċ-ċelloli PC12 (Fig. 6).
inibit minn PhGs b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni. Dan ir-riżultat indika li PhGs għandu effett newroprotettiv sinifikanti fuq iċ-ċelloli PC12 (Fig. 7). PhG u l-komponenti tiegħu echinacoside u acteoside isalvaw il-vijabbiltà taċ-ċelluli PC12 midruba. Meta mqabbel mal-grupp mudell, it-trattament b'acteoside żied b'mod sinifikanti l-vijabbiltà taċ-ċelluli A 1-42-danneġġjati PC12 b'mod dipendenti mid-doża. PhGs u echinacoside żiedu wkoll b'mod sinifikanti l-vijabbiltà ta 'ċelluli A 1-42-danneġġjati PC12 fil-konċentrazzjonijiet kollha ttestjati (Fig. 8A).
Meta mqabbel mal-grupp mudell, l-acteoside żied b'mod sinifikanti l-vijabbiltà taċ-ċelloli PC12 ittrattati b'H2O2. PhGs żiedu wkoll il-vijabbiltà taċ-ċelloli PC12 ittrattati b'H2O2, filwaqt li l-effett ma kienx sinifikanti f'konċentrazzjonijiet ta '5 u 25 µg/ml (Fig. 8B). Barra minn hekk, echinacoside żied il-vijabbiltà taċ-ċelluli b'25 µg/ml.
Bħala konklużjoni, acteoside, PhGs u echinacoside eżerċitaw effetti newroprotettivi sinifikanti fuq ċelluli PC12 soġġetti għal korriment b'A 1-42 jew H2O2.
