Cistanche Tubulosa Tħares in-Newroni Dopaminerġiċi Permezz tar-Regolamentazzjoni tal-Apoptożi U Fattur Newrotrofiku Derivat Miċ-Ċelloli Gliali: in Vivo U in Vitro-Ⅰ

INTRODUZZJONI

Il-marda ta 'Parkinson (PD) hija marda newrodeġenerattiva komuni li sseħħ f'nies anzjani bil-manifestazzjonijiet patoloġiċi ta' telf ta 'newroni dopaminerġiċi fis-substantia nigra (SN) minħabba deġenerazzjoni. Is-severità tal-marda hija korrelatata mat-telf taċ-ċelluli newronali tad-dopamina (DA) fl-SN, li hija konsistenti mal-fehma li n-newrodeġenerattivil-proċess jimxi fuq ħafna snin qabel ma jidhru xi sintomi (Sawle u Myers, 1993). In-natura progressiva tal-marda tissuġġerixxi possibbiltajiet interessanti għal intervent terapewtiku billi jimblokka l-proċess newrodeġenerattiv sottostanti. It-tfittxija għal azzjonijiet qawwija u speċifiċi indotti mit-terapija ta 'fatturi newrotrofiċi fuq is-sopravivenza tan-newroni DA hija għalhekk ta' interess konsiderevoli.

TUBULOSA TA' CISTANCHE NATURALI GĦALL-PROTEĠĠ NEURONI DOPAMINERĠIĊI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Fatturi newrotrofiċi huma proteini essenzjali, inkluż fattur ta 'tkabbir tan-nervituri (NGF), fattur newrotrofiku derivat mill-moħħ (BDNF), u fattur newrotrofiku derivat minn ċelluli gliali (GDNF), li jippromwovu t-tkabbir tan-nervituri, żvilupp newroloġiku, gwida assonali u funzjoni newronali. Fost il-fatturi newrotrofiċi kollha li jipproteġu u jippromwovu t-tiswija tan-newroni dopaminerġiċi, il-GDNF għandu l-aktar effetti b'saħħithom (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). Ġie muri li GDNF għandu effetti newrotrofiċi qawwija fuq in-newroni DA in vitro (Lin et al., 1993) u li jeżerċita effetti newroprotettivi in ​​vivo. GDNF intwera li jsalva n-newroni nigrali DA minn mewt taċ-ċelluli kkaġunata minn leżjoni wara assotomija kirurġika jew indotta mit-tossini fil-firien (Beck et al., 1995; Kearns and Gash, 1995; Sauer et al., 1995) u parzjalment ukoll wara amministrazzjoni sistemika taN-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)fil-ġrieden (Tomac et al., 1995). Iż-żieda fl-inċidenza ta 'apoptożi newronali u l-effetti protettivi mnaqqsa ta' fatturi newrotrofiċi, potenzjalment attivati ​​minn diversi fatturi patoloġiċi, huma l-bażi tad-deġenerazzjoni ta 'newroni dopaminerġiċi (Holden et al., 2006).

C. tubulosa hija mediċina tal-ħxejjex li toriġina minn diversi pjanti tal-ġeneru Cistanche. Hija għażla terapewtika ewlenija għas-sindromu ta 'defiċjenza tal-kliewi li hija relatata mill-qrib ma' ormoni androġeniċi fil-mediċina tradizzjonali Ċiniża (TCM). Sal-lum, ħafna riċerka klinika u bażika fuq C. tubulosa wriet l-attivitajiet ta 'mard newrodeġenerattiv. L-identifikazzjoni ta' preskrizzjonijiet tat-tonifikazzjoni tal-kliewi tat-TCM fit-trattament tal-PD tista' għalhekk tipprovdi trattament kliniku alternattiv għall-PD.Echinacoside (ECH)huwa komponent bijoattiv ewlieni misjub fil-ħaxix mediċinali C. tubulosa. Studji wrew l-effetti terapewtiċi ta 'glycosides ta' Cistanche u ECH,Verbascoside(VER), u icariin (ICA) fuq il-marda ta 'Alzheimer (AD), PD, u pazjenti oħra ta' dimenzja vaskulari (Urano u Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wu et al. (2014) issuġġerixxa li estratti ta 'C. tubulosa li kien fihom biżżejjed ECH u acteoside tejbu d-disfunzjoni konjittiva kkawżata minn A -42 permezz tal-imblukkar tad-depożizzjoni tal-amilojde u r-rivers tal-funzjoni newronali dopaminerġika kolinerġika u hippocampal. Tao et al. (2015) sabu liphenylethanoid glycosidesminn C. tubulosa (Ph Gs-Ct) ipprevjeniet edema ċerebrali ta 'altitudni għolja billi tnaqqas l-espressjoni tal-proteina u mRNA ta' AQP4 fit-tessut tal-moħħ ta 'mudelli tal-firien.

NATURALI CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT SNACKS ITEJBU IL-MEMORJA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Studji preċedenti wrew li l-komposti tal-ħxejjex Ċiniżi, inklużi t-tliet ingredjenti ta 'C. tubulosa, epimedium, u rhizoma polygonati, naqqsu l-ħsara lin-newroni dopaminerġiċi u żiedu l-livelli ta' dopamine billi rregolaw l-espressjoni ta 'fatturi newrotrofiċi (Wu et al., 2013). Għalhekk, għadu mhux magħruf jekk l-effetti newroprotettivi indotti minn C. tubulosa humiex fit-tul u sa liema punt is-salvataġġ ta 'newroni nigral DA bl-amministrazzjoni ta' GDNF jistax jaffordja preservazzjoni sinifikanti ta 'imgieba motoriċi ta' rilevanza għas-sintomatoloġija ta 'annimali PD. Dan l-istudju uża riċetta tat-tonifikazzjoni tal-kliewi TCM, C. tubulosa nanopowder, li rċeviet privattiva nazzjonali (numru tal-privattiva: 2011103028541) fiċ-Ċina u qabel wera ċertu effett terapewtiku fil-PD. L-istudju preżenti, għalhekk, kien iddisinjat biex jeżamina l-effetti newroprotettivi u riġenerattivi tat-trattament ta 'C. tubulosa u biex jinvestiga l-apoptożi fuq iċ-ċelloli MES23.5 u l-firien definittivi tal-imġieba, u r-regolamentazzjoni tal-GDNF, kif imkejla minn batterija ta' testijiet fil-mira .

MATERJALI U METODI

Materjali, Reaġenti, u Tagħmir

C. tubulosa inxtara minn Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Beijing, iċ-Ċina. ECH, VER, u ICA ġew mill-Istituti Nazzjonali għall-Kontroll tal-Ikel u d-Droga, iċ-Ċina. Il-linja taċ-ċelluli newronali dopaminerġiċi MES23.5 kienet rigal mill-Professur Biao Chen, Laboratorju ta 'Newrobiology, Capital Medical University, Beijing, iċ-Ċina. Ħamsin ġrieden maskili C57BL/6 (li jiżnu 20-25 g kull wieħed) inxtraw minn Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (numru tal-liċenzja: SCXK 2012-0002), Shanghai, iċ-Ċina.

MPP +, MTT, u glutamina nxtraw minn Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA); Medji DMEM/F12 u serum bovin tal-fetu nxtraw minn Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA); u l-MPTP, l-istandard DA u l-istandard tal-aċidu homovanillic (HVA) inxtraw minn Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). -actin, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF familja riċettur alfa (GFR 1) u antikorpi Ret kienu mixtrija minn Cell Signaling Technology, Inc (Beverly, MA, USA); Il-kit tar-reaġent tat-tbajja '3,3'-diaminobenzidine (DAB) inxtara minn Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, iċ-Ċina); u kit ta 'preparazzjoni ta' kampjuni tal-ġel SDS-PAGE, kit ta 'detezzjoni ta' kimiluminixxenza mtejba ultrasensittiva (ECL) u assay ta 'aċidu bicinchoninic (BCA) inxtraw minn Beyotime Institute of Biotechnology (Beijing, iċ-Ċina).

Dan l-istudju uża l-istrumenti li ġejjin: ELX800 microplate reader (Bio Tek Winooski, VT, USA); inkubatur tas-CO2 (Heraeus, Hanau, il-Ġermanja); Sistema ta 'analiżi tal-immaġini tal-ġel DOC 2000, ċellula tal-elettroforeżi u tank tal-elettroforeżi (Bio-Rad, Hercules, CA, USA); analizzatur tal-proteini DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA); 5417R ċentrifuga refriġerata b'veloċità għolja (Eppendorf, Hamburg, il-Ġermanja); Mitħna tal-ballun planetarju doppju SXQM (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, iċ-Ċina); Mitħna mixer MM400 (Retsch GmbH, Haan, il-Ġermanja); Kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja Agilent 1200 (HPLC; Teknoloġiji Agilent, Santa Clara, CA, USA); Elettroforeżi PowerPac Bażika, sistema ta 'trasferiment transmembrana PowerPac Bażika, Universal Hood II chemiluminescence imager, S1000 Thermal Cycler RNA reverse trascription system (Bio-Rad); Sistema ta 'analiżi tat-tessuti u l-immaġni taċ-ċelluli Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, iċ-Ċina).

Preparazzjoni taC. tubulosaNanotrab

C. tubulosa ġie miżun, imbagħad purifikat u deidratat. Wara l-polverizzazzjoni konvenzjonali, trab fin ta' C. tubulosa ġie mgħoddi minn għarbiel 200-malji u mnixxef bil-friża. Intużaw mitħna tal-ballun b'vakwu kkontrollat ​​b'temperatura u b'enerġija għolja biex tipprepara n-nanotrab ta 'C. tubulosa. L-ewwel, C. tubulosa nanopowder mhux maħdum tqiegħed f'tank tat-tħin tal-ballun bil-vakwu li kien mgħobbi bi blalen tat-tħin tal-karbur. Il-proporzjon bejn il-blalen tat-tħin u C. tubulosa nanopowder varja minn 15:1 sa 5:1. Biex tikseb trab fin, il-veloċità u t-tul tal-mitħna tal-ballun b'enerġija għolja ġew issettjati għal 300 rpm u 20 min, rispettivament. It-trab fin kien miżun għall-ipproċessar ta 'materjali nanoskala u pproċessat fil-mitħna tal-mixer bi frekwenza ta' 25/s u oxxillazzjoni ta '20s għal tliet repetizzjonijiet. PBS intuża biex jinħall u jipprepara soluzzjoni stokk ta '25 mg/mL, segwit minn 30 min ta' ultrasonikazzjoni, awtoklavi, u finalment ħażna f'-20◦C.

Kontroll tal-Kwalità tal-Komponenti Attivi ta'C. tubulosamill-HPLC

L-ECH u VER kien fihom elużjoni tal-gradjent b'silika magħquda b'octadecylsilane bħala mili, metanol bħala fażi mobbli A, u 0.1% soluzzjoni ta 'aċidu formiku bħala fażi mobbli B. Il-wavelength ta' skoperta kien 330 nm. L-ICA kien fih elużjoni tal-gradjent b'silika magħquda b'octadecylsilane bħala mili u acetonitrile-ilma (30:70) bħala l-fażi mobbli. Il-wavelength ta 'skoperta kien 270 nm. Il-kampjun, il-kontroll, u l-kontroll negattiv tkejlu bħala 10 µL kull wieħed għat-test.

Il-Kultura taċ-Ċelloli u l-Assaġġ MTT biex Tkejjel il-Vijabilità tal-MPP+-Ċelloli Ittrattati

Iċ-ċelloli MES23.5 ġew imlaqqma b'5% serum tal-għoġol tal-fetu, 1% glutamina, 2% 50× soluzzjoni Sato, u DMEM/F12 medium b'2% penicillin/streptomycin. Ġew inkubati f'37◦C f'inkubatur ta '5% CO2 b'umdità saturata. Iċ-ċelloli ġew iżolati u mgħoddija b'0.25% trypsin u s-sospensjoni taċ-ċelluli ġiet maħsuda fil-fażi tat-tkabbir logaritmiku. Ċelloli iżolati b'densità ta' 1 × 105 ġew miżrugħa fi pjanċi ta' 96-bjar miksija bil-polylysine, segwiti biż-żieda ta' konċentrazzjonijiet finali differenti (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 u 800 µmol/L ) tal-midja MPP+. Ċelloli MES23.5 li ġew inkubati b'medja ta 'kultura normali għal 24 siegħa u 48 siegħa ntużaw bħala kontrolli negattivi fl-esperimenti in vitro. Iċ-ċelloli mill-gruppi ta 'trattament differenti ġew inkubati b'reaġent MTT għal 4 sigħat. Is-soluzzjoni fil-bjar ġiet sussegwentement mormija u ġew miżjuda 150 µL ta 'DMSO u oxxillat għal 10 min. L-assorbiment ta 'kull kampjun f'wavelength ta' 570 nm ġiet imkejla bl-użu ta 'qarrej awtomatiku tal-mikroplate. Il-perċentwal tal-vijabbiltà taċ-ċelluli (%)=assorbenza medja tal-grupp sperimentali/assorbenza medja tal-grupp ta 'kontroll negattiv × 100%.

Konċentrazzjonijiet rilevanti ta' medium MPP+ ġew miżjuda għat-trattament ta' 24-siegħa fiċ-ċelloli MES23.5 bl-użu tal-istess approċċ bħal għall-kultura in vitro. Wara t-trattament, is-soluzzjoni fil-bir ġiet mormija. Mezzi li fihom konċentrazzjonijiet differenti (10, 50, 100, 200, 250, 500, u 1000 µg/mL) ta 'C. tubulosa nanopowder ġie miżjud maċ-ċelloli MES23.5 fi bjar differenti u jitħalla jinkuba għal 24 siegħa u 48 siegħa. Iċ-ċelloli MES23.5 li ġew inkubati b'medja ta 'kultura normali għal 24 siegħa u 48 siegħa intużaw bħala kontrolli negattivi. Iċ-ċelloli MES23.5 li ġew inkubati b'mezz MPP + intużaw bħala l-vettura. Il-kejl sar fi tliet kopji għal kull kampjun. L-assorbiment tal-gruppi ta 'trattament u ta' kontroll korrispondenti tkejjel biex tiġi kkalkulata l-vijabbiltà taċ-ċelluli.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT ANTI FATIGUE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Espressjoni TH Mkejla mill-Immunoċitokimika

Meta C. tubulosa nanotrab kien f'100, 200, u 250 µg/ml, ir-rata ta 'sopravivenza taċ-ċelluli żdiedet b'mod sinifikanti (Figura 2G). Għalhekk, f'esperimenti sussegwenti, ittestjajna t-tliet konċentrazzjonijiet: gruppi ta 'doża baxxa, doża medja u doża għolja. Tliet repliki ġew ittestjati għal kull wieħed mill-gruppi ta 'C. tubulosa. Coverslips sterilizzati, miksija bil-polylysine tpoġġew fi 6-pjanċi tal-bir. Sussegwentement, 5 × 104 ċelluli ġew miżrugħa f'kull bir u inkubati għal 24 siegħa. Medja friska konvenzjonali ġiet sostitwita fil-grupp ta 'kontroll normali u konċentrazzjoni finali ta' 100 µmol/L MPP+ medium ġiet sostitwita fil-gruppi ta 'trattament li kien fadal biex tiġi inkubata għal 24 siegħa. Mezzi friski konvenzjonali mbagħad ġew sostitwiti fil-gruppi ta 'kontroll u vetturi normali, u konċentrazzjonijiet finali ta' 100, 200, u 250 µg/mL C. tubulosa nanopowder ġew inkubati maċ-ċelloli għal 24 siegħa fid-doża baxxa, moderata u għolja. Gruppi ta 'trattament ta' C. tubulosa, rispettivament. Iċ-ċelloli MES23.5 fil-gruppi differenti ġew maħsula tliet darbiet f'PBS biex jitneħħew is-supernatant u ffissati aktar f'4% paraformaldehyde għal 15-il minuta. Wara l-ħasil bil-PBS, iċ-ċelluli ġew inkubati b'imblokkatur tal-perossidasi f'37◦C għal 30 min u mbagħad jerġgħu jinħaslu bil-PBS. Soluzzjoni ta' 0.2% Triton X-100 intużat għall-permeabilizzazzjoni taċ-ċelluli għal 10 min, segwit minn ħasil bil-PBS. Serum normali tal-mogħoż ġie miżjud ma 'kull kampjun u inkubat f'temperatura tal-kamra għal 30 min. Is-serum normali tal-mogħoż imbagħad tneħħa u l-antikorp primarju dilwit 1:400 f'PBS ġie miżjud ma 'kull kampjun u inkubat f'4◦C matul il-lejl. Iċ-ċelloli fil-grupp ta 'kontroll negattiv ġew inkubati b'PBS f'4◦C matul il-lejl. Wara l-ħasil bil-PBS, iċ-ċelloli ġew inkubati b'antikorpi sekondarji ttikkettjati bil-bijotina fil-kamra tal-umdità f'37◦C għal 20 min. Kull kampjun imbagħad ġie maħsul f'PBS u ttikkettjat b'konjugati tal-peroxidase-streptavidin horseradish (soluzzjoni tax-xogħol C) f'37◦C għal 20 min. Wara l-ħasil bil-PBS, iċ-ċelloli kienu mtebbgħin b'reaġent DAB fid-dlam għal madwar 1-10 min u l-iżvilupp ta 'kulur kannella ġie mmonitorjat taħt mikroskopija tad-dawl. Kull kampjun imbagħad inħasel darbtejn f'ilma distillat għal 1-2 min u n-nuklei ġew counterstained b'soluzzjoni ta 'ematoxylin għal 0.5-1 min. Wara li tlaħlaħ sewwa kull kampjun fl-ilma, iċ-ċelloli ġew mgħaddsa f'alkoħol ta 'aċidu idrokloriku 1% għad-divrenzjar u 1% ammonja milwiema, segwit minn ħasil bir-reqqa taċ-ċelloli fl-ilma. Iċ-ċelloli minn kull kampjun imbagħad ġew deidrati f'70% etanol għal 2 min, 80% etanol għal 2 min, 90% etanol għal 2 min darbtejn, 95% etanol għal 2 min darbtejn, u 100% etanol għal 2 min darbtejn. Iċ-ċelloli mbagħad ġew mgħaddsa f'soluzzjoni ta 'xylene għal 2 min darbtejn u mmuntati fuq slide tal-ħġieġ b'reżini newtrali. Taħt mikroskopija tad-dawl, kull kampjun għadda minn ġbir ta’ immaġni u għażla każwali ta’ 5-10 kampijiet viżwali effettivi biex tiddetermina l-espressjoni ta’ proteini magħżula fin-newroni dopaminerġiċi indikati mill-intensità tal-partiċelli kannella u biex semi-kwantifika l-kontenut ta’ proteina bil-valur griż medju tiegħu. .

Rata ta' apoptożi taċ-ċelluli MES23.5 imkejla b'ċitometrija tal-fluss

Iċ-ċelloli aderenti ġew maħsula darba bil-PBS. Għall-iżolament taċ-ċelluli, ammont xieraq ta 'soluzzjoni ta' trypsin mingħajr EDTA ġie miżjud f'temperatura tal-kamra u s-soluzzjoni ġiet ippattjata bil-pipetta biex tippermetti li ċ-ċelloli aderenti jinqalgħu. Medju tal-kultura taċ-ċelluli mbagħad ġie miżjud biex iwaqqaf it-tripsinizzazzjoni. It-taħlita ġiet trasferita għal tubu ċentrifugu ġdid u mbagħad ċentrifugata għal 5 min f'1500 rpm biex tiġbor iċ-ċelloli iżolati. Wara li twarrab is-supernatant, il-pellet taċ-ċelluli ġie sospiż mill-ġdid bil-mod bl-użu tal-PBS, u ċ-ċelloli ġew magħduda. Madwar 1 × 105 sa 5 × 105 ċelluli sospiżi mill-ġdid ġew ċentrifugati għal 5 min f'1500 rpm u s-supernatant ġie mormi. Ħames mikrolitri ta' soluzzjoni li torbot Annexin V-FITC ġew miżjuda mal-pellet taċ-ċelluli biex issospendu mill-ġdid iċ-ċelloli bil-mod. Ġew miżjuda 5 µL oħra ta' Annexin V-FITC u mħallta sewwa. Ħames mikrolitri ta 'soluzzjoni ta' jodur tal-propidju ġew użati għat-tbajja taċ-ċelluli billi inkubaw f'temperatura tal-kamra għal 10 minuti ftit qabel iċ-ċitometrija tal-fluss.

Western Blot Analiżi għalin vitro

Iċ-ċelloli ġew maqsuma fi grupp normali, grupp ta 'trattament MPP+, b'doża baxxaC. tubulosagrupp ta 'trattament, grupp ta' trattament ta 'doża moderata ta' C. tubulosa, u grupp ta 'trattament ta' doża għolja ta 'C. tubulosa. L-espressjoni ta 'Bcl2 u Bax kienet imkejla f'kull wieħed. Total ta' ċelluli 1 × 105 għal kull bir fil-pjanċa tal-{5}}bir intuża għall-immudellar u t-trattament f'kull grupp qabel il-ħsad taċ-ċelluli. Lisat imħallat, li fih buffer RIPA, inibitur tal-protease, u inibitur tal-fosfatażi, ġie miżjud biex lyse iċ-ċelloli għal 30 min fuq is-silġ. Wara ċ-ċentrifugazzjoni, is-supernatant intuża għall-analiżi tal-proteini. Il-proteina totali ġiet ikkwantifikata bl-użu ta 'assaġġ BCA u separata b'10% SDS-PAGE. Il-proteini separati ġew trasferiti għal membrana u inkubati b'5% buffer li jimblokka l-ħalib xkumat f'temperatura tal-kamra għal 2 sigħat. Il-membrana mbagħad ġiet inkubata f'antikorp primarju (Bcl-2 0.34 mg/ml, Bax 0.11 mg/ml, dilwizzjoni 1:200) f'4◦C matul il-lejl. Wara pass tal-ħasil, il-membrana ġiet inkubata f'antikorp sekondarju (0.5 mg/ml, dilwizzjoni 1:5000) f'4◦C għal 1 siegħa u mbagħad fl-iżviluppatur ECL għal 2 min għal żvilupp konvenzjonali. Kwantità Intuża softwer wieħed għall-analiżi semi-kwantitattiva tal-espressjoni tal-proteini.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAL ANTI GĦEJA IPROTEJJA L-FWIED PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Immudellar ta 'Annimali Sperimentali u Amministrazzjoni tad-Droga

Ħamsin ġrieden maskili ta' ġimgħa ħielsa minn patoġeni speċifiċi ġew maqsuma b'mod każwali f'ħames gruppi: grupp normali, grupp ta' trattament MPTP (Vettura), grupp ta' trattament b'doża baxxa ta' C. tubulosa, trattament b'doża moderata ta' C. tubulosa grupp, u grupp ta 'trattament ta' doża għolja C. tubulosa. L-annimali kienu miżmuma f'20-22◦C b'aċċess ħieles għall-ikel u l-ilma. Il-ġrieden fil-grupp normali ġew injettati intraperitoneally b'volum ugwali ta 'salina normali għal sebat ijiem konsekuttivi. Il-ġrieden fil-gruppi ta 'trattament l-oħra ġew injettati intraperitonealment b'MPTP (30 mg/kg/d) għal sebat ijiem konsekuttivi biex jistabbilixxu vetturi.

Waqt l-immudellar tal-PD, il-ġrieden fil-gruppi ta’ trattament b’doża baxxa, doża moderata u doża għolja ta’ C. tubulosa ġew amministrati intragastrikament volumi kliniċi ekwivalenti ta’ 4 g/kg/d, 8 g/kg/d, u 16 g/ kg/dC. tubulosa nanotrab, rispettivament, għal 14-il jum konsekuttiv. Il-ġrieden fil-gruppi ta' kontroll u ta' vetturi ngħataw intragastrikament volumi ekwivalenti ta' salina normali għal 14-il jum konsekuttiv. Il-proċeduri sperimentali kollha ġew approvati mill-Kumitat Etiku tal-Università ta 'Fujian ta' TCM u twettqu skont il-prinċipji aċċettati internazzjonalment għall-użu u l-kura tal-annimali tal-laboratorju. Saru l-isforzi kollha biex tiġi minimizzata t-tbatija tal-annimali f'dan l-istudju.