Klonazzjoni, Identifikazzjoni Funzjonali U Analiżi ta' Espressjoni Ta' Chalcone Synthase Minn Cistanche Tubulosa Ⅱ

3 Riżultati u analiżi

3.1 Klonazzjoni tal-ġene CtCHS

Erba' sekwenzi annotati bħala "chalcone synthase" ġew skrinjati bl-użu tad-dejta tat-traskriptome tal-fjuri Cistanches tubulosa. Permezz tat-tqabbil Blast ta 'NCBI, instab li sekwenza waħda biss kellha t-tul sħiħ tal-ġene CHS u kellha FPKM akbar minn 10. Primers speċifiċi ġew iddisinjati bbażati fuq din is-sekwenza, u framment ta' madwar 1200 bp inkiseb permezz ta' amplifikazzjoni PCR bl-użu. CDNA tal-fjura ta 'Cistanches tubulosa bħala mudell (Figura 1). Il-prodott PCR ġie rkuprat ġel u konness mal-vettur pCE2TA/Blunt-Zero. Ir-riżultati tas-sekwenzjar kienu konsistenti mal-analiżi tat-traskriptome. Il-ġene kien jismu CtCHS. It-tul tas-sekwenza huwa 1173 bp u jikkodifika 390 aċidu amminiku.

Servizz ta 'Appoġġ Ta' Wecistanche-L-akbar esportatur ta' cistanche fiċ-Ċina:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Shop Għal Aktar Speċifikazzjonijiet Dettalji:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

3.2 Analiżi bijoinformatika tas-CtCHS

3.2.1 Proprjetajiet fiżiċi u kimiċi CtCHS u analiżi tad-dominju transmembrana

Is-softwer onlajn ProtParam intuża biex janalizza l-proprjetajiet fiżiċi u kimiċi tal-proteina kodifikata mill-ġene CtCHS. CtCHS tikkodifika 390 amino acids, il-formula molekulari hija C1908H3041N511O562S22, il-massa molekulari relattiva hija 42 836.54, il-punt isoelettriku teoretiku huwa 5.85, u huwa instabbli. Il-koeffiċjent II huwa 43.24, li hija proteina instabbli, u l-idrofiliċità medja ġenerali (GRAVY) hija -0.052, li hija proteina idrofilika. L-għodda onlajn Prot Scale intużat aktar biex tanalizza l-idrofiliċità/idrofobiċità tal-proteini. Ir-riżultati tal-analiżi wrew li l-valur massimu tal-idrofiliċità/idrofobiċità tal-proteina CtCHS kien 2.422 (342) u l-valur minimu kien -2.489 (119). Il-katina tal-peptide tal-aċidu amminiku kkodifikata mill-ġene CtCHS għandha aktar residwi ta 'aċidu amminiku idrofiliku minn residwi ta' aċidi amminiċi idrofobiċi, għalhekk hija proteina idrofilika. Is-softwer onlajn TMHMM intuża biex ibassar l-istruttura transmembrana tal-proteina. Il-proteina CtCHS m'għandha l-ebda dominju transmembrane.

Fig. 1 Amplifikazzjoni tal-PCR tal-ġene CtCHS

3.2.2 Tbassir tal-istruttura sekondarja u l-istruttura terzjarja tal-proteina CtCHS

L-għodda onlajn SOPMA intużat biex tbassar l-istruttura sekondarja tal-proteina. Ir-riżultati huma murija fil-Figura 2-A. 44.87% -helizes, 31.03% coils każwali, 15.64% ktajjen estiżi u 8.46% -folji jikkostitwixxu l-istruttura sekondarja tal-proteina CtCHS. struttura tal-livell. Is-softwer ta 'analiżi onlajn SWISS-MODEL intuża biex ibassar l-istruttura terzjarja tal-proteina, u l-istruttura tal-kristall tar-ross CHS1 intużat bħala mudell biex tbassar l-istruttura tridimensjonali tal-proteina CtCHS. Ir-riżultati huma murija fil-Figura 2-B. Il-konsistenza bejn Cistanche tubulosa CtCHS u ross CHS1 hija 83.55%.

3.2.3 Tqabbil tas-sekwenza u analiżi u applikazzjoni tas-siġar filoġenetika

Is-softwer DNAMAN iwettaq paragun ta' omoloġija bejn CtCHS u s-sekwenzi ta' aċidi amminiċi CHS ta' speċi oħra. Ir-riżultati huma murija fil-Figura 3-Ċ. Is-sekwenza tal-aċidu amminiku CtCHS hija konsistenti ma' Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) u Antirrhinum majus L. (P06515. 1), Mazus pumilus (NL Burman) Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1 ) u Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). Is-sekwenzi ta 'aċidu amminiku ta' CHS huma simili ħafna, bix-xebh ikun 90.93%, 90.68%, 90.18%, 89.42%, 89.42%, u 81.61%.

ESTRAT TA' CISTANCHE ORGANIKU NATURALI B'30% ECHINACOSIDE U 12% ACTEOSIDE

Barra minn hekk, allinjament ta 'sekwenza multipla wera wkoll li CtCHS ikkonserva residwi katalitiċi Cys164, His303, u Asn336. Sabiex tifhem aktar il-pożizzjoni evoluzzjonarja ta 'Cistanche tubulosa CtCHS fil-familja CHS tal-pjanti, intuża softwer MEGA-X biex tinbena siġra filoġenetika bejn proteini CtCHS u CHS ta' pjanti oħra. Ir-riżultati huma murija fil-Figura 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS huwa relatat mill-qrib.

3.3 CtCHS espressjoni prokarjotika u purifikazzjoni

Il-plażmid tal-pET-28a-CtCHS ġie ttrasformat f'razza ta' espressjoni ta' E. coli BL21 (DE3), u l-espressjoni tal-proteina ġiet indotta minn IPTG f'temperatura baxxa. Il-proteina ġiet ippurifikata bl-użu ta 'kolonna kromatografika ta' affinità tal-jone tan-nikil, u l-proteina purifikata ġiet skoperta b'10% SDSPAGE. Ir-riżultati huma murija fil-Figura 3. Il-faxxa tal-proteina CtCHS dehret qrib 40,000, li hija konsistenti mal-massa molekulari relattiva tal-proteina CtCHS ta '42,800.

3.4 Analiżi tal-attività tal-enzima CtCHS

Biex tiġi identifikata l-funzjoni ta 'CtCHS, il-proteina CtCHS purifikata ġiet inkubata b'malonyl-CoA, 4-coumaroyl-CoA u l-prodotti ġew skoperti bl-użu ta' HPLC u MS. Taħt kundizzjonijiet naturali, naringenin-chalcone huwa instabbli fis-soluzzjoni u huwa faċilment ċiklizzat f'naringenin. Għalhekk, naringenin-chalcone u naringenin intgħażlu bħala kontrolli standard.

Ir-riżultati tat-test HPLC huma murija fil-Figura 4-A u B. Il-ħin ta 'ritenzjoni tal-prodott ta' reazzjoni tal-enżimi huwa simili għal dak tal-istandard naringenin. It-tnejn għandhom assorbiment massimu f'289 nm fl-ispettru ta 'assorbiment UV, li huwa differenti mill-ħin ta' żamma ta 'naringenin-chalcone. Il-ħin u l-ispettri ta 'assorbiment UV kienu differenti, iżda bħala kontroll negattiv, il-prodott wara l-inkubazzjoni tal-proteina CtCHS inattivata f'temperatura għolja mas-sottostrat ma kienx fih naringenin, chalcone u naringenin. Aktar skoperta permezz tal-ispettrometrija tal-massa, l-ispettru tal-massa tal-ewwel livell (Figura 4-C, D) wera li l-prodott tar-reazzjoni tal-enżima għandu [MH]-peak m/z271.060 97, filwaqt li naringenin għandu [MH] ]-quċċata m/z 271.060 91.

Meta wieħed iqabbel l-ispettri tal-MS2 (Figura 5-E, F), il-prodott tar-reazzjoni tal-enżimi CtCHS u n-naringenin it-tnejn għandhom qċaċet karatteristiċi tal-frammenti f'm/z 107, 151, u 177, li huwa konsistenti mar-rapport tal-letteratura [19], li jindika li CtCHS għandu kumpless chalcone. Attività enżimatika, tista' tikkatalizza r-reazzjoni ta' malonyl-CoA u 4-coumaroyl-CoA f'naringenin-chalcone.

3.5 Analiżi tal-lokalizzazzjoni subċellulari

Sabiex jiġi studjat ir-rwol tal-proteina CtCHS fiċ-ċelloli, il-plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS inbena u ttrasforma fi protoplasti ta' Arabidopsis thaliana biex josservaw il-lokalizzazzjoni subċellulari tiegħu. Ir-riżultati huma murija fil-Figura 5. Bħala kontroll, il-proteina pCAMBIA1300-35S-GFP tqassmet fin-nukleu u ċ-ċitoplasma, filwaqt li l-proteina tal-fużjoni pCAMBIA{1300-35S-GFP-CtCHS kienet imqassma prinċipalment f' iċ-ċitoplasma, li tindika li l-proteina CtCHS tista 'taħdem fiċ-ċitoplasma taċ-ċelloli tal-pjanti. Funzjoni.

3.6 Analiżi tal-mudell tal-espressjoni CtCHS

qRT-PCR intuża biex jinstab l-espressjoni relattiva ta 'CtCHS fil-fjuri Cistanche deserticola bi tliet kuluri: abjad, vjola u aħmar. Ir-riżultati huma murija fil-Figura 6. L-espressjoni ta 'CtCHS fil-fjuri vjola u ħomor kienet ogħla b'mod sinifikanti minn dik fil-fjuri bojod. kwantità. Meta mqabbel mal-fjuri bojod, il-livell ta 'espressjoni ta' CtCHS fi fjuri vjola huwa 8.44 darbiet ogħla, u l-livell ta 'espressjoni ta' CtCHS fi fjuri ħomor huwa 3.21 darbiet ogħla. Dawn ir-riżultati jindikaw li bidliet fil-livelli ta 'espressjoni CtCHS jistgħu jkunu relatati mad-differenza fil-kulur tal-fjuri ta' Cistanche deserticola. Iktar ma jkun għoli l-livell tal-espressjoni, iktar ikun skur il-kulur tal-fjura. , iktar ma jkun baxx il-livell ta 'espressjoni, eħfef il-kulur tal-fjura.

****P＜0.000 1Fig. 6 Livell ta' espressjoni relattiva ta' CtCHS fi fjuri b'kuluri differenti

4 Diskussjoni

CHS huwa aenzima ewlenija fil-mogħdija bijosintetika tal-flavonojdiu huwa relatat ma 'the regolament tal-kulur tal-fjurif'ħafna pjanti. Per eżempju, il-kulur tal-fjura taDianthus chinensisL.[20] u Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] huma kollha affettwati mis-CHS. kontroll.Cistanches tubulosaprinċipalment għandha tliet kuluri tal-fjuri: abjad, aħmar u vjola, iżda l-mekkaniżmu ta 'regolazzjoni tal-kulur tal-fjuri tiegħu għadu ma ġiex irrappurtat. F'dan l-istudju, ġene CtCHS ġie kklonat permezz ta' RT-PCRAnaliżi tad-dejta tat-traskriptome tal-fjuri Cistanches tubulosa...., u tagħha

Analiżi tal-bijoinformatikasar, u r-riżultati wrew li CtCHS għandu xebh għoli u relazzjoni ġenetika mill-qrib mas-sekwenza ta 'aċidu amminiku ta' ElCHS ta 'Physalis nigra (AHJ80976.1). CHS huwa polyketide synthase tat-tip III (PKSIII), u studji sabu li CHS għandu trijade katalitika Cys-His-Asn konservata [23]. F'dan l-istudju, l-analiżi ta 'l-allinjament tas-sekwenza ta' l-aċidu amminiku wriet li CtCHS ikkonserva residwi katalitiċi Cys164, His303, u Asn336, li jindika li CtCHS jista 'jkollu funzjoni tipika ta' chalcone synthase.

kapaċi. L-analiżi tal-attività tal-enżimi saret bl-użu ta' espressjoni prokarjotika tal-proteina CtCHS f'Escherichia coli u misjuba minn HPLC u MS. Instab li l-proteina CtCHS tista' tikkatalizza 4-coumaroyl-CoA u malonyl-CoA biex tipproduċi naringenin-chalcone.

Is-CHS huwa involut fis-sintesi tal-flavonoids f'ħafna pjanti, iżda l-post subċellulari tiegħu huwa differenti fi speċi differenti. Pereżempju, Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. EaCHS[26] jinsabu kollha fiċ-ċitoplasma, filwaqt li Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], il-brunġiel Solanum melongena L. SmCHS [28] jinsab fiċ-ċitoplasma u n-nukleu, u fl-għeneb Vitis vinifera L. VvCHS jinsab fiċ-ċitoplasma, in-nukleu u l-ħajt taċ-ċelluli [29]. F'dan l-istudju, il-plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS intuża biex jittrasforma l-protoplasti ta' Arabidopsis thaliana u ġie osservat li l-proteina CtCHS kienet lokalizzata prinċipalment fiċ-ċitoplasma, u tista' tikkatalizza l-produzzjoni ta' naringenin-chalcone fiċ-ċitoplasma biex jippromwovu l-akkumulazzjoni ta 'flavonoids.

Il-mogħdija tal-fenilpropanoid tinfirex minn 4-coumaroyl-CoA fil-mogħdija tas-sintesi tal-flavonojdi u l-mogħdija tal-bijosintesi tal-lignan. Is-CHS jikkatalizza 4-coumaroyl-CoA u malonyl-CoA biex jiġġenera naringenin u chalcone biex jibdew il-flavonoids. Il-mogħdija bijosintetika ta 'komposti bħal komposti hija l-ewwel enzima ewlenija f'din il-mogħdija [30]. Għalhekk, CHS espress ħafna huwa ta 'benefiċċju għall-pjanti biex jakkumulaw livelli ogħla ta' flavonoids u jipproduċu fjuri jiskuraw. Pereżempju, il-livell ta 'espressjoni ta' CHS f'varjetajiet ta 'fjuri vjola ta' Hosta plantaginea (Lam.) Aschers huwa ogħla minn dak ta 'varjetajiet ta' fjuri bojod. Hosta HpCHS jinbidel f'tabakk biex jinkiseb Meta mqabbel mat-tabakk tat-tip selvaġġ, il-pjanti ta 'espressjoni eċċessiva għandhom petali aktar skuri u kontenut totali ogħla ta' anthocyanin [31].

F'dan l-istudju, il-livell ta 'espressjoni tal-ġene CtCHS huwa relatat mal-kulur tal-fjuri ta' Cistanches tubulosa. Huwa espress ħafna fi fjuri vjola aktar skur u fjuri ħomor, u huwa baxx fil-fjuri bojod ta 'kulur ċar. Id-differenza tal-espressjoni ta 'CtCHS tista' tkun dovuta għad-differenza fil-fjuri ta 'Cistanches tubulosa. Waħda mir-raġunijiet biex ikollok ilbiesi u kuluri differenti. Fil-qosor, dan l-istudju kklona ġene CtCHS mill-fjuri Cistanche deserticola u wettaq analiżi bijoinformatika fuqha. Il-proteina rikombinanti CtCHS inkisbet b'espressjoni eżoġena f'Escherichia coli. L-analiżi ta' l-attività ta' l-enżima wriet li l-proteina CtCHS tista' tikkatalizza 4-coumaroyl coenzyme. A u malonyl-coenzyme A jiġġeneraw naringenin-chalcone. Instab li l-ġene CtCHS huwa espress ħafna fi fjuri vjola u ħomor u baxx fil-fjuri bojod. Dawn ir-riżultati jindikaw li l-ġene CtCHS jista 'jirregola l-produzzjoni ta' kuluri differenti tal-fjuri f'Cistanche deserticola, li huwa ta 'benefiċċju għal aktar riċerka dwar il-mekkaniżmu regolatorju tal-kulur tal-fjuri Cistanche tubulosa u jipprovdi referenza għal riċerka sussegwenti dwar ir-rwol ta' CtCHS fir-regolamentazzjoni ta ' kulur tal-fjuri f'Cistanche deserticola.