Effett Ta' Estratti ta' Cistanche Tubulosa Fuq il-Funzjoni Riproduttiva Male fi Firien Dijabetiċi Indotti minn Streptozotocin–Nicotinamide-Ⅰ

1. Introduzzjoni

Id-dijabete mellitus (DM) hija kundizzjoni li fiha jiżdiedulivelli ta' glucosefid-demm minħabba l-ineffiċjenza tal-frixa biex tipproduċi biżżejjed insulina, jew l-inkapaċità tal-ġisem li jużaha b'mod effettiv. Skont id-WHO, in-numru ta’ nies bid-dijabete żdied minn 108 miljun fl-1980 għal 422 miljun fl-2014 [1]. Hemm erba’ kategoriji ewlenin: pre-dijabete (stadju qabel id-dijabete), tip 1 (fejn il-frixa jonqos milli tipproduċi l-insulina), tip 2 (il-ġisem jonqos milli juża l-insulina), u dijabete tat-tqala (li sseħħ waqt it-tqala). L-istress ossidattiv iseħħ minħabba l-iżbilanċ bejn il-produzzjoni ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) u antiossidanti [2] finalment iwassal għall-kundizzjoni dijabetika. Il-kumplikazzjonijiet tad-dijabete jinkludu insuffiċjenza tal-kliewi, ħsara fin-nervituri, għama, puplesija, attakk tal-qalb, mewt tal-fetu u infertilità. [1]. Studji juru li n-nuklei tal-isperma, l-aċidu deossiribonuklejku (DNA), u l-mitokondrija kienu mħassra b'mod sinifikanti f'pazjenti dijabetiċi rġiel [3]. L-istress ossidattiv waqt it-trasport tal-isperma se jbiddel il-proċess tas-sistema riproduttiva maskili [4,5].

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Il-proċess tal-ispermatoġenesi huwa kkontrollat ​​mill-assi ipotalamu-pitwitarja-gonadi (HPG). L-ormon li jirrilaxxa l-gonadotropin (GnRH) prodott mill-ipotalamu jistimula l-produzzjoni tal-ormon luteinizing (LH) u l-ormon li jistimula l-follikulu (FSH). Iċ-ċelloli Leydig jinstabu ħdejn it-tubuli seminiferous ujipproduċu testosteronetaħt il-kontroll ta 'LH. L-FSH iqanqal il-produzzjoni tal-proteina li torbot l-antiġen (ABP) li tgħin biex tgħaddi l-ormon maskili. Għalhekk, l-infertilità u problemi oħra jinqalgħu prinċipalment minħabba t-tfixkil li jseħħ fl-assi HPG. L-għoti tal-kombinazzjoni ta 'streptozotocin–nicotinamide jinduċi d-dijabete fil-firien sperimentali. Streptozotocin huwa kompost kimiku tossiku għaċ-ċelloli li jipproduċu l-insulina fil-frixa u n-nikotinamide hija vitamina li tinħall fl-ilma li tipproteġi ċ-ċelloli minn ħsara sħiħa [6].

Cistanche tubulosa hija speċi ta' pjanti tad-deżert magħrufa wkoll bħala "Rou Cong-Rong" [7]. Hija pjanta parassitika mhux klorofillika li tikber prinċipalment fuq l-għerq tas-siġra Calotropis procera u hija mqassma b'mod wiesa 'fl-art niexfa ta' Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolja, Iran u Indja. L-isem komuni ta 'Cistanche tubulosa huwa "Desert Hyacinth". Huwa aċċettat b'mod wiesa 'fil-mediċina tradizzjonali Ċiniża u ngħata l-isem "Ġinseng tad-Deżert". Huwa użat ħafna fil-qasam mediċinali biex jikkura lewkorrea morboża, metrorraġija abbundanti, mard kroniku tal-kliewi, stitikezza, impotenza u infertilità. Kostitwenti kimiċi ta'Cistanche tubulosa tikkonsisti minn phenylethanoid glycosides mhux volatili(PHGs), iridojdi, lignans, żjut volatili, alditols, oligosaccharides, u polysaccharides [8]. Studji juru liechinacosideminn din il-ħaxix jipproteġi l-fibroblast bil-ħsara billi jirregola l-livelli ta 'ROS [9]. Dan il-kompost jipproduċi attivitajiet antiossidanti, vasorelaxation, u anti-infjammatorji flimkien man-newroprotezzjoni u l-prevenzjoni tal-osteoporożi [10,11].

Dan l-istudju kellu l-għan li jinvestiga l-effett taEstratt ta' Cistanche tubulosali jkun fih ECH fuq id-disfunzjoni riproduttiva tal-far dijabetiku indott minn streptozotocin–nicotinamide.

2. Materjali u Metodi

2.1. Materjali

ECH u CTE inxtraw minn Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Tajwan). Il-prodotti finali tal-glikazzjoni avvanzata (AGEs) inxtraw minn Biovision (San Francisco, CA, USA). Il-linji taċ-ċelluli LC-540 u TM3 inxtraw mill-Istitut tar-Riċerka u l-Iżvilupp tal-Industrija tal-Ikel (Hsinchu, Tajwan). Firien maskili Sprague-Dawley (SD) ta 'ħames ġimgħat inxtraw miċ-Ċentru Nazzjonali tal-Annimali tal-Laboratorju (Taipei, Tajwan). Feed Lab Diet® inxtara minn PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Tajwan). 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) inkiseb minn Sigma (St. Louis, MO, USA). Metanol u 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) inxtraw ukoll mingħand Sigma. Dulbecco's modifikat Eagle medium/F12 u trypsin-EDTA nkisbu minn GIBCO (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-il)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), dimethyl sulfoxide (DMSO), u nitroblue tetrazolium (NBT) inxtraw minn Sigma. Kitts enżimatiċi tal-glukożju nkisbu minn Kyokutoseiyaku, Tokyo, Ġappun. Kitts ELISA ta 'l-insulina nxtraw minn Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, l-Isvezja). T-PER Tissue Protein Estrazzjoni Reaġent ġie akkwistat minn Thermo Scientific (Chicago, IL, USA). Antikorpi poliklonali NF-κB kontra l-bniedem/Ġurdien/Firien fattur nukleari-kappa B inxtraw minn Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA. Antikorpi poliklonali anti-Ġurdien/Frien għal prodotti finali ta' glikazzjoni avvanzata (RAGE), antikorpi poliklonali anti-Bniedem/Ġurdien/Rat StAR, u antikorpi monoklonali anti-Bniedem/Ġurdien/Frien Cytochrome P450 17A1 kienu mixtrija minn Gene Tex (Irvine, CA, l-Istati Uniti). Antikorpi poliklonali CYP11A1 Kontra l-Bniedem/Ġurdien/Firien inkisbu minn Cell Signaling Technology (Beverly, PA, USA). Ir-reaġent Easy-Blue inxtara minn Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). Agarose u markatur tad-DNA 100 bp inkisbu minn Promega, Corporation (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit inxtara minn QIAGEN, Hilden, il-Ġermanja.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Metodi

2.2.1. Analiżi in vitro

LC{{0}} u TM3 Cell Culture: Il-linji taċ-ċelluli LC-540 ġew ikkultivati ​​f'37 ◦C f'medju ta' Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) supplimentat b'bikarbonat tas-sodju (1.5 g/L), L-glutamina (2 mM), aċidi amminiċi mhux essenzjali (0.1 mM), sodium pyruvate (1.0 mM), u serum bovin tal-fetu (FBS) (10%) f' 5% CO2 inkubatur (CO2 inkubatur, Napco 5410, Tajwan). Il-linja taċ-ċelluli TM3 ġiet ikkultivata fil-mezz Eagle modifikat ta' Dulbecco (DMEM) supplimentat b'glukożju (4.5 g/L), piruvat tas-sodju (0.5 mM), L-glutamina (2.5 mM), bikarbonat tas-sodju (1.2 g/L), {{ 28}}(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES, 15 mM), u serum tal-għoġol tal-fetu (FCS, 10%) jew serum taż-żiemel (5%) f'37 ◦C f'5% inkubatur tas-CO2.

Determinazzjoni tal-Vijabilità taċ-Ċellola ta'Echinacoside (ECH): Reaġent 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) intuża għall-assaġġ tal-vijabbiltà taċ-ċelluli. Il-konċentrazzjoni taċ-ċellula ġiet aġġustata għal 2 × 105 ċelluli / mL fi 96-platt bir-reqqa. Imbagħad, 20 µL ta 'ECH (dilwit fi 2% tal-medju) ġew miżjuda u inkubati għal 24 siegħa f'37 ◦C f'inkubatur ta' 5% CO2. Aktar tard, 100 µL ta 'reaġent MTT ġew miżjuda u inkubati għal 4 sigħat f'37 ◦C taħt kundizzjonijiet mudlama. L-assorbiment tkejjel f'570 nm (qarrej ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, l-Isvizzera).

Vijabilità relattiva taċ-ċelluli (%)=[(Kampjun f'570 nm − Ablank f'570 nm)]/[(Acontrol f'570 − Ablank f'570)] × 100.

Nitroblue Tetrazolium (NBT) Reduction Assay u 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Assay: In-numru ta' ċelloli ġie aġġustat għal 1× 1{{10}}6 ċelluli/ mL. Imbagħad, ġew miżjuda 5 0 mg/mL ta 'ECH, resveratrol (RES), u prodotti finali ta' glikazzjoni avvanzata (AGEs) (kontroll) u kkultivati ​​flimkien għal 18-il siegħa f'37 ◦C. Imbagħad, 0.3 mL ta 'soluzzjoni NBT (0.1 mg/mL NBT, 5% FBS, u 3% dimethyl sulfoxide (DMSO) maħlul f'10 mL DMEM) ġiet miżjuda u inkubata f'37 ◦C f'5% CO2 għal siegħa. Wara ċ-ċentrifugazzjoni (f'800 × g għal 3 min) is-supernatant tneħħa u 200 µL DMSO ġie miżjud u mħawwad għal 5 min f'oxxillatur ultrasoniku (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Tajwan). L-assorbiment tkejjel f'630 nm. Għall-assaġġ radikali DPPH, Trolox (f'alkoħol 95%) ittieħed bħala l-istandard. Imbagħad, 75 µL ta’ soluzzjoni DPPH 0.5 mM tħalltu ma’ 25 µL ta’ kampjuni u tħallew jirreaġixxu f’temperatura ambjentali f’post mudlam għal 30 min. It-taħlita tħawwad u l-assorbiment tkejjel f'517 nm.

Analiżi tal-Kontenut tal-Speċi tal-Ossiġenu Reattiv (ROS): In-numru taċ-ċellula ġie aġġustat għal 2 × 105 ċelluli/mL fi 12-pjanċa tal-bir li fiha 2% FBS. Imbagħad, 50 µL/mL ta 'ECH, RES, u AGEs ġew miżjuda mal-pjanċa u inkubati f'37 ◦C għal 24 siegħa. Wara 24 siegħa, 20,70 -dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) ġie miżjud u inkubat f'37 ◦C għal 30 min. Wara ċ-ċentrifugazzjoni (400 × g, 5 min), is-supernatant tneħħa u ċ-ċelloli ġew maħsula darbtejn b'salina buffered phosphate (PBS). Wara, iċ-ċelloli ġew sospiżi f'1 mL ta 'PBS u l-livelli ta' ROS ġew determinati bl-użu ta 'ċitometru tal-fluss (Ċitometru tal-Fluss, Becton Dickinson, CA, USA).

Identifikazzjoni u Analiżi Kwantitattiva tal-Proteina: Proteini ġew estratti bl-użu ta 'reaġent ta' estrazzjoni tal-proteini (T-PER). Id-densità taċ-ċellula ġiet aġġustata għal 2 × 105 ċelluli/mL fi 12-pjanċa bir-bir u 50 µL/mL ta’ ECH, RES, u riċettur għall-antagonist tal-prodott finali tal-glikazzjoni avvanzata (RAGE), u AGEs ġew miżjuda u inkubati f'37 ◦C f'inkubatur ta' 5% CO2 għal 24 siegħa. Wara, ġew miżjuda 400 µL ta 'T-PER, mibruxa miċ-ċelloli, u ċentrifugati f'125,000× g għal 20 min (4 ◦C). Is-supernatant inġabar u maħżun f'-80 ◦C (-80 ◦C friża, Nuaire, Plymouth, MN, USA) għal aktar analiżi. Kit ta 'aċidu bicinchoninic (BCA) intuża għall-kwantifikazzjoni tal-proteini. Imbagħad, 10 µL ta’ soluzzjoni standard taċ-ċelluli u 200 µL ta’ reaġent BCA ġew miżjuda mal-pjanċi ta’ 8-bjar u inkubati f’37 ◦C f’inkubatur ta’ 5% CO2 għal 30 min. L-assorbiment tkejjel f'562 nm. Analiżi ta 'identifikazzjoni tal-proteini saret permezz ta' elettroforesi tas-sodium dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide gel (SDS-PAGE). Il-kampjuni ġew ippreparati billi żżid proteina lysate ma 'proteini loading buffer u saret analiżi tal-western blot biex tiskopri l-proteini speċifiċi.

2.2.2. Analiżi In Vivo

Disinn tal-Mudell tal-Annimali: Sittin firien maskili Sprague–Dawley (SD) ta' {{0}}ġimgħa nxtraw miċ-Ċentru Nazzjonali tal-Annimali tal-Laboratorju (Taipei, Tajwan). Kull far kien jinżamm individwalment f'gaġeġ ta 'l-istainless steel diżinfettant taħt temperatura kkontrollata (23 ± 1 ◦C) u umdità (40-60%) b'ċiklu ta' 12 h dawl / 12 h skur. L-ikel u l-ilma ġew ipprovduti ad libitum. Kull far kien domestikat fl-ewwel ġimgħa u ngħatat dieta tal-gerriema tal-laboratorju 5001 bħala d-dieta ewlenija. Il-proċeduri kollha segwew l-istandard tal-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali (Approvazzjoni IACUC Nru 101026) tal-Università Nazzjonali tal-Oċean tat-Tajwan, it-Tajwan. Wara d-domestikazzjoni, il-firien ġew maqsuma f'żewġ gruppi: il-grupp ta 'kontroll (Con) li kien mitmugħ dieta tal-laboratorju 5001, u l-grupp dijabetiku li kien mitmugħ dieta b'ħafna xaħam (HFD, 40%) għall-esperiment kollu. Wara li ġew mitmugħa bl-HFD għal 4 ġimgħat, il-firien tal-grupp dijabetiku ġew injettati bi streptozotocin (65 mg/kg) (STZ) biex jinduċu dijabete mellitus (DM). Fi żmien 15-il minuta mill-injezzjoni ta 'STZ, injettat nikotinamide (230 mg/Kg Piż tal-Ġisem). Ġimgħa wara l-injezzjoni, sar test tat-tolleranza tal-glukożju orali (OGTT) biex jiddetermina l-induzzjoni b'suċċess tad-dijabete mellitus (DM). Wara dan, l-annimali ġew maqsuma f'sitt gruppi: il-kontroll (mitmugħa b'dieta tal-laboratorju 5001); Grupp DM (DM + 45% HFD); Grupp DMR (DM + rosiglitazone: 0.571 mg/kg BW) + 45% HFD; Grupp DME1 (DM + CTE: 80 mg/kg BW) + 45% HFD; Grupp DME2 (DM + CTE: 160 mg/kg BW) + 45% HFD; u grupp DME4 (DM + CTE: 320 mg/kg BW) + 45% HFD. Rosiglitazone (RSG) ittieħed bħala l-kontroll pożittiv. Intużaw tliet dożi ta 'CTE (80, 160, u 320 mg/kg) skont ir-rakkomandazzjoni tal-linji gwida tal-evalwazzjoni funzjonali tal-ikel tas-saħħa tal-Amministrazzjoni tal-Ikel u d-Droga tat-Tajwan (TFDA). It-trattamenti ngħataw sa tmiem l-esperiment. Il-firien sperimentali kollha ġew sagrifikati wara 6 ġimgħat. Id-demm miġbur mill-firien ġie ċentrifugat fi 3000 rpm għal 15-il minuta f'4 ◦C. Is-supernatant ġie eżaminat għall-analiżi li ġejja:

Determinazzjoni Totali tal-Glukożju, Trigliċeridi, u Kolesterol: Id-determinazzjoni tal-glukożju twettqet minn kits enżimatiċi tal-glukożju. Imbagħad, 20 µL ta 'kampjuni tal-plażma tad-demm ġew miżjuda mar-reaġenti u miżmuma f'37 ◦C għal 5 min. It-trigliċeridi totali u l-konċentrazzjoni totali tal-kolesterol ġew determinati bl-użu ta 'kits enżimatiċi tat-trigliċeridi u tal-kolesterol. Imbagħad, 10 µL ta 'plażma tad-demm ġew miżjuda mar-reaġenti u l-esperiment sar skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. L-assorbiment tkejjel f'510 nm.

Glukożju/trigliċeridi/kolesterol totali fil-plażma (mg/dL)=(Kampjun - ABblank)/(Astandard - ABblank) × 200.

Asample: Assorbance ta 'kampjuni tad-demm, ABlank: Valur ta' assorbiment ta 'kits mingħajr kampjun, Astandard: Valur ta' assorbiment tar-reaġent standard, 200: reaġenti standard f'konċentrazzjoni ta '200 mg/dL.

Valutazzjoni tal-Mudell għall-Insulina, Leptina u Omeostatika – Determinazzjoni tar-Reżistenza għall-Insulina (HOMA-IR):Il-livell ta' insulina kien iddeterminat permezz ta' kits ELISA ta' l-insulina. Hawnhekk, 25µL ta 'plażma tad-demm ġiet miżjuda mal-reaġenti, u l-assorbanza kienet imkejla f'450 nm. Il-kontenut totali ta' leptina ġie determinat bl-użu ta' akit tal-assaġġ immunometriku tal-enżimi tal-leptin.Imbagħad, 100µL ta 'plażma ġiet analizzata u l-assorbimenttkejjel f'450 nm bl-użu ta' qarrej ELISA. L-esperiment kollu sar skondl-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-valur HOMA-IR ġie determinat mill-mudell tal-omeostażiekwazzjoni ta' valutazzjoni=Konċentrazzjoni ta' insulina fil-plażma waqt is-sawm (mg/mL)× glukożju fil-plażma waqt is-sawmkonċentrazzjonijiet (mmol/L)/22.5.

Perossidazzjoni tal-Lipidi tal-Plażma: Hawnhekk, {{0}}.5 mL ta' plażma tad-demm tħallat ma' 1 mL ta' reaġent (15%, w/v trichloroacetic acid fi {{{0}.25 N aċidu idrokloriku (HCl ) u 0.375%, w/v thiobarbituric acid f'0.25 N HCl) u mqiegħda f'banju ta' l-ilma (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Switzerland) f'100 ◦C għal 15-il minuta. Wara t-tkessiħ, ġie miżjud 1 mL ta 'n-butanol, ħawwad b'mod vigoruż, u ċentrifugat f'1500 × g għal 10 min. Is-supernatant inġabar u l-assorbiment tkejjel f'532 nm [12].

Konċentrazzjoni tal-malondialdehyde (MDA) (nM/mL)=[(Kampjun f'532 nm − Ablank f'532 nm)/ (A standard f'532 nm − Ablank f'532 nm)] × 5.

standard f'532 nm − Ablank f'532 nm)] × 5. Determinazzjoni tal-Livelli ta 'Testosterone fil-Plażma u Ormon Luteinizzanti (LH): Il-kit ELISA ta' testosterone intuża biex ikejjel il-livell ta 'testosterone fil-plażma tad-demm. Kit RIA intuża biex jiddetermina l-konċentrazzjoni LH. Imbagħad, ġew miżjuda 50 µL ta' plażma u l-kalkoli kienu bbażati fuq il-konċentrazzjoni tal-ormon LH-RP-3 (standard). Il-passi ulterjuri twettqu skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.

Determinazzjoni tal-Fattur tan-Nekrożi tat-Tumur (TNF)- u Interleukin-6 (IL-6) Konċentrazzjoni: L-antikorp maqbud ġie dilwit 250 darba f'buffer tal-kisi, miżjud ma' 96- pjanċa sew (100 µL/bir), u miżmuma f'4 ◦C għal lejl. Is-supernatant ġie aspirat u maħsul ħames darbiet b'buffer tal-ħasil (1 darba PBS, 0.05% Tween 20). Wara l-inkubazzjoni (1 h) b'200 µg ta' dilwent tal-assaġġ, iċ-ċelloli ġew maħsula 5 darbiet b'buffer tal-ħasil u 100 µL ta' soluzzjoni standard ta' TNF jew kampjuni tat-test ġew miżjuda ma' kull bir u inkubati għal 2 h. Wara l-ħasil, ġew miżjuda 100 µL ta' antikorpi IL-6-skoperti u inkubati għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Is-supernatant ġie aspirat u maħsul 5 darbiet. Imbagħad, ġew miżjuda 480 µL ta 'enżima avidin-horseradish peroxidase (HRP) u inkubati għal 30 min f'temperatura tal-kamra. Is-supernatant ġie aspirat u maħsul ħames darbiet b'buffer tal-ħasil. Imbagħad, ġew miżjuda 100 µL ta’ soluzzjoni ta’ substrat u inkubati għal 15-il minuta f’temperatura tal-kamra. Aktar tard, 50 µL ta 'soluzzjoni ta' waqfien (aċidu fosforiku 1M) ġew miżjuda ma 'kull bir u l-assorbiment tkejjel f'450 nm.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TISWIJA TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiżi ta' l-Isperma u l-Parametri tat-Testikoli

Ġbir ta 'kampjuni ta' l-isperma: Il-ġbir tal-kampjun ta 'l-isperma sar skond il-metodu rrappurtat qabel f'[13]. L-isperma nġabret mis-supernatant u ntużat għal aktar analiżi.

In-Numru ta 'Sperm, Motilità ta' l-Isperma, u Sperm Anormali: In-numru ta 'sperma ġie kkalkulat bl-użu ta' l-emoċitometru u s-soluzzjoni trypan blue. Imbagħad, 100 µL ta 'likwidu ta' l-isperma tħalltu ma 'soluzzjoni ta' trypan blue u n-numru ta 'sperma, motilità, u sperma anormali ġew ikkalkulati bl-użu ta' emoċitometru u mikroskopju [14].

Nitro blu Tetrazolium NBT Tnaqqis u Perossidazzjoni tal-Lipidi ta 'Sperm u Testi: Il-perossidazzjoni tal-lipidi u t-tnaqqis NBT ġew analizzati skond l-istess proċedura ta' analiżi tal-plażma.

Determinazzjoni ta 'Superoxide Dismutase (SOD) u Attività Catalase: L-attività ta' Superoxide dismutase (SOD) ġiet analizzata bl-użu tal-kit RANSEL. Hawnhekk, {{0}}.05 mL ta' omoġenati testikolari ġew miżjuda ma' 1.7 mL ta' soluzzjoni ta' reazzjoni (0.05 mM xanthine, 0.025 mM 2-({ {9}}jodophenyl)- 3-(4-nitrofenol)-5-phenyltetrazolium chloride (INT)). Wara t-taħlit, ġie miżjud 0.25 mL xanthine oxidase (80 U/L) u rreaġixxa f'temperatura tal-kamra għal 30 s. L-assorbanza kienet imkejla f'505 nm. Il-konċentrazzjoni tal-proteina tal-omoġenat testikolari ġiet iddeterminata permezz tal-kit tal-analiżi tal-proteina Bio-Rad DC u l-attività speċifika tagħha (proteina U/mg) ġiet ikkalkulata. L-attività tal-catalase (CAT) ġiet iddeterminata skont metodu rapportat qabel [15].

Tbajja ta' H&E (Hematoxylin u Eosin).

It-testikoli kien mxarrba f'10% ta 'formalin għal 24 siegħa u maħżun f'4 ◦C. It-tessuti kienu fid-daqs mikro u mwaħħla mal-pjastra. Wara l-iffissar (95% metanol + 5% aċidu aċetiku), il-pjastri ġew mgħaddsa f'ematoxylin għal 3 min, maħsula b'ilma ġieri għal 5 minuti, u mbagħad imxarrba b'50%, 70%, u 90% alkoħol għal minuta. Wara dan, il-pjastri kienu mtebbgħin bl-eosin għal 10 s u mxarrba f'alkoħol 100% għal minuta sakemm faded. Fl-aħħarnett, il-pjastra kienet mxarrba fil-xylene għal minuta. Aktar tard, il-pjastra kienet imnixxfa bl-arja u ssiġillata. It-tubu mtebba tqiegħed f'mikroskopju tal-kuntrast tal-fażi invertita (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokyo, Ġappun) biex tosserva l-morfoloġija.

Analiżi tal-Ipotalamu

Il-ġrieden KISS1, G-protein coupled receptor (GPR) 54, suppressor ta 'cytokine signaling 3 (SOCS-3), u sirtuin 1(SIRT1) sekwenzi tal-ġeni ġew identifikati mid-database tal-ġeni NCBI (Ċentru Nazzjonali għall-Informazzjoni dwar il-Bijoteknoloġija) u primer speċifiku ġie ddisinjat bl-użu ta' Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Il-primers użati fl-esperiment huma elenkati fit-Tabella 1.

Estrazzjoni ta 'aċidu Ribonuklejku (RNA) mill-Ipotalamu. L-estrazzjoni ta 'RNA mill-ipotalamu tal-moħħ twettqet bl-użu tar-RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. L-mRNAs miksuba kienu mkejla kwantitattivament permezz ta 'traskrizzjoni inversa (RT) u reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR). Id-DNA tal-kompliment miksub mill-analiżi RT inħażen f'-20 ◦C għal użu aktar tard. Id-DNA estratt kien soġġett għal analiżi ta 'reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR) bl-użu ta' Taq polymerase. Imbagħad, ittieħdu 5 ~ 10 µL tal-prodott PCR u ġew analizzati permezz ta 'elettroforeżi fuq kollojde ta' agar 1.5%. L-immaġni ttieħdet f'sistema tal-immaġni UVP BioDoc-It. Ittieħed l-aċidu deossiribonuklejku komplementari traskritt b'lura (cDNA) u sar PCR bl-użu tal-IQ SYBR Green Supermix Kit. Aktar tard, ġie analizzat b'iQTM 5 Software tas-Sistema Ottika. Proteini ġew estratti bl-użu ta 'reaġent estrazzjoni proteina (T-PER). Imbagħad, ġew miżjuda 20 mg ta' omoġenat testikolari ma' 400 µL ta' T-PER u ċentrifugati (Ċentrifuga ta' Veloċità Għolja, Hettich CR-12, Tuttlingen, il-Ġermanja) f'4 ◦C (125,000× g ) għal 20 min. Il-metodu li ġej kien simili għal "analiżi ta 'identifikazzjoni u kwantifikazzjoni ta' proteina" fl-analiżi in vitro.

2.3. Analiżi Statistika

Ir-riżultati sperimentali ġew espressi bħala l-medja ± devjazzjoni standard (Media ± SD) u d-dejta ġiet analizzata bl-użu ta’ Software Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Id-differenzi bejn il-gruppi ġew analizzati b'analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda (ANOVA). Paraguni multipli ta 'gruppi differenti ġew analizzati bit-test ta' Duncan fil-valur ta 'p <0.05 bħala l-livell sinifikanti.

3. Riżultati

3.1. Analiżi in vitro

3.1.1. Tqabbil ta 'Attivitajiet Antiossidanti ta' ECH, CTE, u RES

fit-tul hL-istress ossidattiv għoli u l-infjammazzjoni kronika huma l-kawżi ewlenin tad-dijabetekumplikazzjonijiet [16]. CTEs fihom diversiphenylethanoid glycosides bħal echinacoside(ECH) u acteoside, bil-potenzjal għal attività antiossidanti [17]. DPPH tneħħija radikaliTwettaq analiżi biex tiġi evalwata l-attività antiossidanti ta 'ECH. Trolox u resveratrol(3,5,4'-trihydroxystilbene, RES) ittieħdu bħala l-kontroll standard u pożittiv rispettivament. Kif murifil-Figura1, ECH wera attività ta 'scavenging radikali aħjar u l-attività kienet ogħla b'mod sinifikantiminn dak tal-kontroll pożittiv (RES).

3.1.2. Il-Vijabilità taċ-Ċelluli ta' ECH fuq Ċelloli Leydig LC-540 u TM3

Assaġġ MTT sar biex jevalwaw il-vijabbiltà taċ-ċelluli ta 'konċentrazzjonijiet differenti ta' ECH. Iċ-ċelloli Leydig LC-540 u ċ-ċelloli Leydig TM3 wrew aktar minn 80% ta 'vijabbiltà wara li ġew ittrattati bl-ECH (Figura 2). Meta mqabbla mal-konċentrazzjonijiet l-oħra, konċentrazzjoni ta' 100-µM (dilwizzjonijiet ta' 100 µM f'2% FBS) ta' ECH uriet vijabbiltà aħjar taċ-ċelluli fiċ-ċelloli TM3 Leydig. Ir-riżultat indika li l-konċentrazzjoni miżjuda ta 'ECH ma tikkontribwixxi l-ebda tossiċità sinifikanti għaċ-ċelloli.

3.1.3. Effett ta' ECH fuq il-Produzzjoni ta' Superossidu Indotta mill-AGE permezz ta' Assaġġ NBT fiċ-Ċelloli Leydig LC-540 u TM3

L-AGEs jikkawżaw ħsara ossidattiva fil-ġisem minħabba l-ossidazzjoni tal-glukożju u l-formazzjoni ta 'radikali ħielsa bħal O2-, radikali hydroxyl, u gruppi karbonil [18]. Wara li ġew stimulati b'50 ug/mL ta 'AGEs, iċ-ċelloli LC -540 (Figura 3a) u TM3 (Figura 3b) ġew ittrattati b'ECH u RES (5 μM u 10 μM kull wieħed). Ir-riżultati wrew li l-produzzjoni ta 'anjoni superossidu żdiedet fil-grupp ta' kontroll (AGEs stimulati), iżda l-produzzjoni ta 'anjoni superossidu naqset wara l-grupp ta' kontroll (AGEs stimulati), iżda l-produzzjoni ta 'anjoni superossidu naqset wara tal-produzzjoni ta' superossidu u protetta iċ-ċelloli minn ħsara ossidattiva. Fil-każ taċ-ċelloli LC-540, 10 µM ECH wera attività kważi simili mal-grupp normali. Il-produzzjoni tas-superossidu fiż-żewġ ċelloli naqset b'żieda fil-konċentrazzjoni kemm ta 'ECH kif ukoll ta' RES.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. Effett ta' ECH fuq il-Produzzjoni ta' H2O2 f'Ċelloli Leydig LC-540 Stimolati mill-AGE

L-assaġġ DCFH-DA ġie eżegwit biex jinstab il-preżenza ta 'speċi ossidattivi. Wara li tidħol fiċ-ċelloli, iż-żebgħa fluworexxenti DCFH-DA tiġi ossidizzata minn H2O2 intraċellulari u tifforma dichlorofluorescein (DCF). Kif muri fil-Figura 4, kien hemm żieda sinifikanti fil-produzzjoni intraċellulari ta 'H2O2 fil-grupp stimulat mill-AGE (kontroll) filwaqt li ż-żieda ta' 10 µM ECH u RES naqqset b'mod sinifikanti l-produzzjoni ta 'H2O2 fiċ-ċelloli. Amministrazzjoni ta '10 µM ECH irriżulta biss f'madwar 47.1% tal-produzzjoni ta' H2O2, b'mod sinifikanti aktar baxx milli fil-grupp ta 'kontroll.

3.1.5. Effett ta' ECH fuq Livelli ta' Espressjoni ta' Proteina RAGE u NF-κB f'Ċelloli Leydig LC -540 Stimulati bl-AGE

Twettqet analiżi Western blot biex tikkonferma l-preżenza ta' RAGE fiċ-ċelloli LC-540 Leydig. L-effett ta 'ECH fuq il-livelli ta' espressjoni tal-proteini RAGE (Figura 5a) u NF-κB (Figura 5b) f'ċelloli Leydig stimulati minn AGEs intwerew fil-Figura 5. Ir-riżultati wrew li 50 µg/mL konċentrazzjoni ta 'AGEs indott RAGE u NF- ogħla. L-espressjoni κB fiċ-ċelluli LC-540 Leydig u konċentrazzjoni ta '10 µM ta' ECH u RES naqqsu b'mod sinifikanti l-espressjoni ta 'RAGE u NF-κB. L-espressjoni ta 'NF-κB kienet aktar baxxa b'mod sinifikanti f'RES u ECH milli f'antagonisti RAGE. Għalhekk, ir-riżultati kkonfermaw li l-ECH naqqas il-livell ta 'infjammazzjoni billi naqqas il-livell ta' RAGE u NF-κB.

3.1.6. Effett tal-ECH fuq il-mogħdija tas-Sinteżi tat-Testosterone fiċ-ċelloli Leydig LC-540 Stimulati mill-AGE.

Il-proċess tal-ispermatoġenesi u l-infertilità maskili jiddependi fuq il-preżenza ta 'testosterone. Kif muri fil-Figura 6, l-espressjonijiet tal-proteini StAR (Figura 6a), CYP11A1 (Figura 6b), CYP17A1 (Figura 6c), u HSD17 3 (Figura 6d) naqsu b'mod sinifikanti f'LC{{11} stimulati mill-AGE }} Ċelloli Leydig (grupp ta 'kontroll). L-espressjonijiet tal-proteini StAR, CYP11A1, CYP17A1, u HSD17 3 żdiedu b'mod sinifikanti meta ġew miżjuda l-antagonist RAGE, RES, u ECH. Iż-żieda fl-espressjoni tal-proteini StAR u CYP11A1 dehret kemm fil-gruppi ttrattati b'ECH kif ukoll b'RES. Il-livell ta' espressjoni ta' CYP17A1 kien kważi simili fil-gruppi RES u ECH. L-espressjonijiet tal-proteina HSD17 3 fiċ-ċelloli Leydig ittrattati bl-ECH kienu ħafna ogħla minn dawk taċ-ċelloli ttrattati bl-antagonisti RES u RAGE. Żieda fl-espressjoni ta' proteini StAR, CYP11A1, CYP17A1, u HSD17 3 indikat il-produzzjoni normali ta' testosterone.