Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides Induċu Apoptosi fiċ-Ċelloli Eca-109 permezz tal-Pathway dipendenti mill-Mitokondrija

Introduzzjoni

Il-kanċer tal-esofagu huwa wieħed mill-aktar tipi ta' kanċer komuni bil-11-il l-ogħla rata ta' morbożità u s-6 l-ogħla rata ta' mortalità globalment, u kkawża ~439,000 mortalità fl-2015. L-inċidenza tal-kanċer tal-esofagu tvarja notevolment bejn ir-reġjuni differenti, bil-Lvant L-Asja u l-Afrika tal-Lvant u tan-Nofsinhar urew l-ogħla rati ta' inċidenza u l-Afrika tal-Punent wriet l-inqas rati fl-2012. Fiċ-Ċina, il-każijiet u l-mortalitajiet stmati tal-kanċer esophageal kienu 477,000 u 375,000, rispettivament , fl-2015. Għalkemm ir-rata ta 'morbidità tal-kanċer esophageal naqset f'pajjiżi ta' indiċi soċjodemografiku medju u medju għoli bejn l-2005 u l-2015, ir-rata ta 'mortalità tibqa' għolja minħabba l-pronjosi fqira. Il-kombinazzjoni ta’ risezzjoni kirurġika ma’ kimoterapija jew radjuterapija ntużat biex tikkura l-kanċer esophageal, madankollu, ġie rrappurtat li bejn l-2003 u l-2014 ir-rata ta’ sopravivenza ta’ 5-sena baqgħet<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studywera liCistanche tubulosa phenylethanoid glycosides(CTPG) jistgħu jrażżnu t-tkabbir taċ-ċelluli tal-melanoma B16-F10 in vitro u in vivo (24). Madankollu, is-solubilità fqira fl-ilma ta 'CTPG użat qabel tillimita l-iżvilupp tad-droga. Għalhekk, intuża CTPG solubbli fl-ilma (CTPG-W) u ġie investigat l-effett antitumorali fuq iċ-ċelloli tal-kanċer esophageal (Eca-109). Ġie determinat li CTPG-W jista' jinibixxi l-vijabbiltà taċ-ċelloli Eca-109 b'mod dipendenti fuq id-doża permezz tal-induzzjoni tal-apoptożi permezz ta' mogħdija dipendenti mill-mitokondrija.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

materjali u metodi

Annimali.

Ġrieden nisa C57BL/6 (6-8 ġimgħat, ~25 g) inxtraw miċ-Ċentru ta’ Riċerka dwar l-Annimali tal-Laboratorju ta’ Beijing (Beijing, iċ-Ċina) u miżmuma f’temperatura kkontrollata (25˚C), ċiklata bid-dawl (12/ 12) Faċilità tal-Annimali tal-Università ta 'Xinjiang (Urumqi, iċ-Ċina). L-annimali kollha rċevew ilma u ikel mingħajr patoġeni.

Linja taċ-ċelluli u kultura.

Il-linja taċ-ċelluli tal-karċinoma esophageal uman (Eca-109) ġiet ippreservata mil-Laboratorju Ewlenin ta' Xinjiang tar-Riżorsi Bijoloġiċi u l-Inġinerija Ġenetika (Kulleġġ tax-Xjenza u t-Teknoloġija tal-Ħajja, l-Università ta' Xinjiang, Urumqi, iċ-Ċina) u kkultivata f'RPMI{{1} } medju (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) supplimentat b'10% serum bovin fetali inattivat bis-sħana (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China), 1% L -glutamina (100 mM), 100 U/ml peniċillina u 100 µg/ml streptomycin f'37˚C f'atmosfera umidifikata li fiha 5% CO2.

Kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja (HPLC).

CTPG-W (cat. nru SGJG20170410) inxtara minn Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, iċ-Ċina). Il-komposti ewlenin ta 'CTPG kienu kkwalifikati u kkwantifikati mill-HPLC skont l-istudju preċedenti tagħna (24). Fil-qosor, HPLC sar fuq Kolonna ZORBAX SB-C18 (250x4.6 mm; 5 µm) f'30˚C u eluwit b'soluzzjoni ta' 0.2% ta' aċidu formiku u gradjent ta' metanol li jibda minn 23%, hekk kif 1 ml kien miżjud kull min. għal 45 min sakemm tilħaq 31%. Total ta' kampjun ta' 10 µl ġie injettat u skopert fi 330 nm. L-istandard echinacoside inxtara minn Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, iċ-Ċina), u l-istandard acteoside inxtara minn Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, il-Ġermanja). L-istandards intużaw biex janalizzaw il-komponenti ta 'CTPG-W.

Assaġġ MTT.

Il-proliferazzjoni taċ-ċelluli kienet imkejla b'assaġġ MTT. Iċ-ċelluli Eca{{{0}} ġew imlaqqma fi 96-pjanċi tal-bir f'densità ta' 5x1{03 ċelluli f'100 µl RPMI{{5 }} medju/tajjeb u kkultivat f'37˚C għal 24 siegħa, imbagħad ittrattat b'konċentrazzjonijiet differenti (0, 200, 400, 600, u 800 µg/ml) ta' CTPG-W jew 0.4% dimethyl sulfoxide (DMSO) għal 24, 48 u 72 h. DMSO intuża bħala kontroll tas-solvent (800 µg/ml CTPG-W li fih 0.4% DMSO). Cisplatin (20 µg/ml) intuża bħala l-kontroll pożittiv. Sussegwentement, is-supernatant ġie mormi wara ċentrifugazzjoni f'225 xg għal 5 min f'temperatura tal-kamra u 100 µl soluzzjoni MTT (0.5 mg/ml f'medja RPMI-1640 mingħajr FBS) ġiet miżjuda ma 'kull bir u inkubata f'37˚C għal 3. h. Il-kristalli formazan iffurmati ġew maħlula f'200 µl DMSO. Il-valuri tad-densità ottika (OD) ġew imkejla f'wavelength ta' 490 nm minn 96-qarrej tal-mikroplate sew (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Il-vijabilità relattiva taċ-ċelluli ġiet ikkalkolata skond il-formula: Vijabbiltà taċ-ċelluli (%)=(ODtrattat/ODmhux trattat)x100%. Il-morfoloġija taċ-ċelloli Eca-109 ġiet osservata b'mikroskopju fluworexxenti maqlub (ingrandiment, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tokyo, Ġappun).

Għall-proliferazzjoni ta 'splenocytes, ġrieden C57BL / 6 ġew ewtanizzati permezz ta' dislokazzjoni ċervikali, u l-milsa ġew iżolati. Is-suspensjoni ta’ ċellula waħda saret u l-isplenoċiti ġew miżrugħa fi 96-pjanċi ta’ bir f’densità ta’ 1x105 ċelluli/bir f’100 µl RPMI-1640 medium, u mbagħad ittrattati b’konċentrazzjonijiet differenti (0, 200, 400, 600, u 800 µg/ml) ta’ CTPG-W għal 24, 48 u 72 siegħa f’37˚C b’5% CO2. Il-proliferazzjoni ta 'splenocytes ġiet imkejla b'assaġġ MTT, skond il-protokoll imsemmi hawn fuq. Indiċi stimulatorju=ODtrattat/ODmhux trattat.

Kejl tal-apoptożi u ċ-ċiklu taċ-ċelluli. Iċ-ċelloli Eca{{{0}} ġew ikkultivati ​​f'dixxijiet ta' 6{0 mm b'densità ta' 2.5x105 ċelluli/dixx għal 24 siegħa u ttrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ({{31} }, 200, 400, 600, u 800 µg/ml) ta’ CTPG-W jew 0.4% DMSO għal 24 siegħa f’37˚C b’5% CO2. Iċ-ċelloli nġabru u mtebbgħin b'kitt ta 'Sejbien ta' Apoptosi ta 'Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/Propidium iodide (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China), skond il-protokolli tal-manifattur. Il-kampjuni nġabru permezz ta 'ċitometrija tal-fluss (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) u analizzati minn FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). Biex tanalizza l-effett ta 'CTPG-W fuq iċ-ċiklu taċ-ċelluli, 2.5x105 Eca-109 ċelluli ġew miżrugħa f'platti tal-kultura ta' 60 mm u ttrattati b'CTPG-W (0, 100, 200, u 400 µg/ml) jew 0.4 % DMSO għal 24 siegħa f'37˚C b'5% CO2. Iċ-ċelloli kollha ġew maħsuda u maħsula darbtejn b'PBS kiesaħ bis-silġ (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), imbagħad iffissati f'70% etanol kiesaħ fis-silġ f'4˚C għal 30 min. Wara l-ħasil darbtejn b'PBS kiesaħ bis-silġ, iċ-ċelloli ġew sospiżi mill-ġdid fi 300 µl buffer tat-tbajja' PI/RNase (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) għal 10 minuti f'temperatura tal-kamra. Id-distribuzzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli ġiet analizzata bis-softwer ModFit LT 3.0 permezz ta 'ċitometrija tal-fluss (BD FACSCalibur).

CISTANCHE TUBULOSA NATURALIKontra l-GħejaIpproteġi l-Fwied PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiżi tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali (Δψm) u speċi ta 'ossiġnu reattiv (ROS).Biex tanalizza l-Δψm, iċ-ċelluli Eca{{0}} ġew ittrattati b'CTPG-W (0, 400, 600, u 800 µg/ml) jew 0.4% DMSO għal 24 siegħa f'37˚C b'5% CO2, u mtebbgħin bil-kit tal-assaġġ tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali b'JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, iċ-Ċina), skont il-protokoll tal-manifattur, għal 20 min f'37˚ Ċ. Wara l-ħasil darbtejn b'buffer tal-ħasil JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology), il-kampjuni ġew sospiżi mill-ġdid b'300 µl buffer tal-ħasil JC-1 u analizzati b'ċitometrija tal-fluss (BD FACSCalibur). Il-fluworexxenza taż-żebgħa JC-1 fiċ-ċelloli Eca-109 ġiet osservata wkoll b'mikroskopju ta 'fluworexxenza maqluba (ingrandiment, x200; Nikon Eclipse Ti-E). Għall-analiżi ta' ROS, iċ-ċelloli Eca-109 ġew ittrattati b'CTPG-W (0, 400, 600, u 800 µg/ml) għal 2, 4, 6, 12 u 24 siegħa, u mtebbgħin b'Assaġġ tal-Ispeċi tal-Ossiġenu Reattiv kit (Beyotime Institute of Biotechnology), skond il-protokoll tal-manifattur, għal 20 min f'37˚C. Wara l-ħasil tliet darbiet b'PBS kiesaħ bis-silġ, inġabru kampjuni permezz ta 'ċitometrija tal-fluss (BD FACSCalibur) u analizzati bis-softwer FlowJo 7.6.

Figura 1. Il-kontroll kwalifikat ta 'CTPG-W. Il-komponenti ta 'CTPG-W ġew analizzati kwalitattivament u kwantitattivament minn kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja u mqabbla mal-istandards ta 'echinacoside u acteoside. CTPG-W, phenylethanoid glycosides solubbli fl-ilma taC. tubulosa.

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Attività ta' tneħħija radikali. L-attività ta 'scavenging radikali ħielsa ta' CTPG-W ġiet iddeterminata b'assaġġ ta 'radikali ħielsa DPPH skond il-protokoll ippubblikat b'modifika minuri, peress li l-metanol ġie sostitwit b'etanol biex jinħall DPPH (25,26). Għal kejl fi stat fiss, 150 µl DPPH (100 mmol/l) fl-etanol tħallat ma' konċentrazzjonijiet differenti ta' CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 u 600 µg/ml) f'50 µl PBS, u inkubat fid-dlam għal 30 minuta f'temperatura tal-kamra. L-assorbenza f'517 nm ġiet skoperta fil-preżenza u l-assenza ta 'CTPG-W. Total ta' 50 µl Vitamina Ċ intuża bħala l-kontroll pożittiv. L-attività ta' scavenging radikali DPPH ġiet ikkalkulata bl-użu tal-formula: Scavenging (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, fejn Ablank huwa l-assorbiment tal-kontroll (mingħajr DPPH), Asample hija l-assorbiment tal-kampjun u A0 hija l-assorbiment tal-PBS b'DPPH.

Analiżi Western blot. Iċ-ċelloli Eca{{0}} ġew ittrattati b'CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) jew 0.4% DMSO għal 24 siegħa f'37˚C b'5% CO2. Il-ħasil li ġej darbtejn b'PBS, ċelluli 

Figura 2. L-effett ta 'CTPG-W fuq it-tkabbir ta' ċelluli Eca-109 u splenoċiti. (A) Iċ-ċelloli Eca-109 ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'CTPG-W għal 24, 48, u 72 siegħa, u mbagħad instabet il-vijabbiltà taċ-ċelluli b'assaġġ MTT. (B) Il-bidliet morfoloġiċi taċ-ċelloli Eca-109 fuq trattament CTPG-W f'24 siegħa. (C) Splenocytes ta 'ġrieden C57BL / 6 ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' CTPG-W għal 24, 48, u 72 siegħa, u mbagħad il-proliferazzjoni ġiet analizzata b'assaġġ MTT.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

ġew lysed f'Radjuimmunoprecipitation Assay Lysis buffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, Ċina) għal 20 min fuq is-silġ. Wara ċ-ċentrifugazzjoni f'10,000 xg għal 10 min f'4˚C, inġabru s-supernatanti, u nstabu konċentrazzjonijiet ta 'proteini b'kit ta' aċidu bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific, Inc.) skond il-protokolli tal-manifattur. Analiżi Western blot saret skond id-deskrizzjoni preċedenti tagħna (24). L-antikorpi kontra caspase-7 (cat. nru. D120077), caspase-8 (kat. nru. D155240), caspase-9 (kat. nru. D220078), limfoma taċ-ċelluli B{{ {13}} (Bcl-2) assoċjati ma' X (Bax) (nru tal-kat. D220073) u Bcl-2 (nru tal-kat. D260117), u IgG-perossidażi tar-ravanell kontra l-ġurdien (HRP ) (kat. Nru. D111050) u IgG-HRP kontra l-fenek (kat. Nru. D110058) inxtraw minn BBI Life Sciences (Shanghai, iċ-Ċina). L-antikorpi kontra caspase-3 (kat. nru. E-AB-10050) u caspase attiva-3 (kat. nru. E-AB{-22115) inxtraw minn Elabscience ( Wuhan, iċ-Ċina). Antikorpi oħra kontra caspase-7 (kat. nru. 9492), poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (kat. nru. 9542), cytochrome c (kat. nr. AC909), c-Jun NH{ {37}}terminal kinase (JNK) (kat. nru. 9252S) u -actin (kat. nru. 58169) inkisbu minn Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). L-antikorpi primarji u sekondarji kollha ġew dilwiti f'1:1,000. L-antikorpi primarji ġew inkubati f'4˚C matul il-lejl u l-antikorpi sekondarji ġew inkubati f'37˚C għal siegħa.

Figura 3. L-apoptożi taċ-ċelloli Eca-109 indotta minn CTPG-W. Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'CTPG-W għal 24 siegħa. (A) Iċ-ċelloli Eca-109 apoptotiċi u nekrotiċi ġew analizzati permezz ta 'ċitometrija tal-fluss. Il-pannell ta 'fuq juri l-plots tal-punti individwali u l-pannell ta' isfel juri d-dejta fil-qosor. * P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

Il-proteini fil-mira ġew skoperti bl-użu ta 'kit tal-assaġġ ta' kimiluminixxenza msaħħa (Beyotime Institute of Biotechnology), skont il-protokoll tal-manifattur.

Analiżi statistika. Is-sinifikat statistiku ġie kkalkulat b'analiżi one-way tal-varjanza mat-test post hoc ta 'Tukey u r-riżultati ġew analizzati bl-użu ta' GraphPad Prism 5.0 softwer (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) fost il-gruppi ta 'trattament u kontroll. Id-dejta kollha ġiet ippreżentata bħala l-medja ± devjazzjoni standard. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

ESTRAT TA' CISTANCHE TUBULOSA GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI TAL-KLIEWA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Riżultati

CTPG-W irażżan it-tkabbir taċ-ċelloli Eca-109.

Il-komponenti ta 'CTPG-W kienu kkwalifikati u kkwantifikati mill-HPLC (Fig. 1), li kienu mqabbla mal-istandards ta' echinacoside u acteoside. Skont il-ħinijiet tal-ogħla żamma u ż-żoni tal-quċċata, CTPG-W kien fih 39.16% ta 'echinacoside u 2.44% ta' acteoside. L-ewwelnett, l-effett ta' CTPG-W fuq il-vijabbiltà taċ-ċelloli Eca-109 ġie determinat b'assaġġ MTT. CTPG-W ġie maħlul f'DMSO f'200 mg/ml u dilwit b'medja RPMI-1640 li kien fih 10% FBS inattivat bis-sħana għal konċentrazzjonijiet indikati. Iċ-ċelloli Eca-109 ġew ittrattati b'CTPG-W u l-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet analizzata b'assaġġ MTT fil-punti taż-żmien indikati. It-trattament CTPG-W naqqas b'mod sinifikanti l-vijabbiltà taċ-ċelloli Eca-109 b'mod dipendenti mid-doża u l-ħin (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Figura 4. L-effett ta 'CTPG-W fuq id-distribuzzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli fiċ-ċelloli Eca-109. Intużaw konċentrazzjonijiet differenti ta' CTPG-W biex jittrattaw ċelluli Eca-109 għal 24 siegħa u d-distribuzzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli ġiet analizzata permezz ta' ċitometrija tal-fluss. * P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

CTPG-W jinduċi apoptożi fiċ-ċelloli Eca-109. Biex jiġi investigat jekk CTPG-W irażżanx it-tkabbir taċ-ċelluli Eca-109 permezz tal-induzzjoni ta 'apoptożi jew nekrożi, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' CTPG-W. Wara 24 siegħa, l-apoptożi u n-nekrożi taċ-ċelluli Eca-109 ġew skoperti bit-tbajja’ ta’ Annexin V/PI. Kif muri fil-Fig. 3A, Annexin V- / PI + ċelluli kienu gated bħala ċelluli nekrotiċi, u Annexin V + / PI + u Annexin V + / PI- ċelluli kienu gated bħala ċelluli apoptotic. CTPG-W primarjament indotta l-apoptożi taċ-ċelloli Eca-109 b'mod dipendenti mid-doża, għalkemm iċ-ċelluli Eca-109 nekrotiċi żdiedu wkoll b'mod sinifikanti taħt it-trattament ta' 600 u 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W jinduċi arrest taċ-ċiklu taċ-ċelluli fil-fażi S fiċ-ċelloli Eca-109. It-tfixkil taċ-ċiklu taċ-ċelluli tal-kanċer se jrażżan it-tkabbir taċ-ċelluli u jippromwovi l-apoptożi (27). Id-distribuzzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli fiċ-ċelloli Eca-109 ġiet skoperta bi tbajja 'PI wara trattament CTPG-W għal 24 siegħa. Ġie osservat li ċ-ċelloli fil-fażi S żdiedu u ċ-ċelloli fil-fażijiet G0/G1 indikaw tnaqqis sinifikanti ġenerali mat-trattament CTPG-W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W inaqqas Δψm u jinduċi r-rilaxx ta 'cytochrome c. L-apoptosi tista' tiġi indotta minn mogħdija dipendenti fuq il-mitokondrija (28,29). Il-membri pro- u anti-apoptotic tal-familja tal-proteini BCL-2 jaqdu rwoli importanti fir-regolamentazzjoni tal-integrità tal-membrana mitokondrijali (30,31). Wara t-trattament CTPG-W għal 24 siegħa, il-Δψm ġie vvalutat bl-użu ta 'tbajja' JC-1. L-aggregat JC-1 (fluworexxenza ħamra misjuba f'FL-2) se jiddiżintegra f'monomeru (fluworexxenza ħadra misjuba f'FL-1) meta Δψm qed jonqos (32). Kif muri f'Fig. 5A, il-frekwenzi taċ-ċelloli FL-1+ FL{-2-/+ żdiedu b'mod sinifikanti b'mod dipendenti fuq id-doża, li jindika li l-Δψm taċ-ċelloli Eca-109 naqas. Il-bidliet fil-fluworexxenza fiċ-ċelloli Eca-109 ġew osservati wkoll b'mikroskopju tal-fluworexxenza maqluba (Fig. 5B). Bil-konċentrazzjonijiet dejjem jiżdiedu ta 'CTPG-W, il-fluworexxenza ħamra naqset u l-fluworexxenza ħadra żdiedet, li hija konsistenti mad-dejta miċ-ċitometrija tal-fluss. Ġie osservat ukoll li l-livell ta 'ċitokromu ċ fiċ-ċitosol żdied notevolment (Fig. 5C), li huwa riżultat ta' tnaqqis ta 'Δψm. Dan isaħħaħ il-konklużjoni meħuda mill-għadd miżjud ta 'ċelluli FL-1+ FL{-2-/+ li Δψm naqas bħala riżultat tat-trattament CTPG-W. Ġie rrappurtat li JNK jista' jirregola l-attivazzjoni tal-familja tal-proteini BCL-2 li tikkawża r-rilaxx taċ-ċitokromu ċ (33-35). Ġie determinat ukoll li l-livell ta 'JNK kien notevolment upregulated wara trattament CTPG-W (Fig. 5C). Ir-riżultati indikaw li CTPG-W jista' jinduċi l-apoptosi taċ-ċelluli Eca-109 permezz ta' mogħdija dipendenti mill-mitokondrija.

Figura 5. It-tnaqqis ta 'Δψm u upregulation ta' cytochrome c u JNK. Iċ-ċelloli Eca-109 ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' CTPG-W għal 24 siegħa. (A) Δψm ġie skopert permezz ta 'tbajja' JC-1 u kampjuni ġew analizzati permezz ta' ċitometrija tal-fluss. Il-plots tal-punti individwali juru l-bidliet fil-fluworexxenza JC-1. Il-frekwenzi taċ-ċelloli FL-1+ FL-2-/+ huma murija fil-pannell t'isfel. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Figura 6. Il-livelli ta 'ROS fiċ-ċelloli Eca-109 fuq trattament CTPG-W u l-attività antiossidant ta' CTPG-W. (A) Iċ-ċelloli Eca-109 ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'CTPG-W u l-livelli ta' ROS ġew analizzati permezz ta 'ċitometrija tal-fluss f'punti ta' ħin indikati. * P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

L-effett ta 'CTPG-W fuq il-ġenerazzjoni ta' ROS intraċellulari.ROS jista 'jnaqqas Δψm biex jinduċi apoptożi (36). Biex jiġi investigat jekk CTPG-W jistax iżid il-produzzjoni ta' ROS, iċ-ċelloli Eca-109 ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' CTPG-W. Iċ-ċelloli nġabru fil-punti taż-żmien indikati u mtebbgħin b'DCFH-DA. Il-produzzjoni ta' ROS intraċellulari fiċ-ċelloli Eca-109 kienet determinata permezz ta' ċitometrija tal-fluss. Kif muri f'Fig. 6A, 800 µg/ml CTPG-W żiedet b'mod sinifikanti l-produzzjoni ta' ROS minn 2-6 siegħa, u naqset minn 12-24 siegħa. Barra minn hekk, 400 µg/ml CTPG-W żiedet b'mod sinifikanti l-produzzjoni ta' ROS minn 12-24 h. Barra minn hekk, 200 µg/ml CTPG-W ma biddilx notevolment il-produzzjoni ROS. Il-bidliet dinamiċi fil-produzzjoni tal-ROS jistgħu jkunu assoċjati mal-apoptosi taċ-ċelluli Eca-109. Ġie determinat ukoll li CTPG-W kellu attività ta' tneħħija ta' radikali ħielsa (Fig. 6B), li tista' tkun assoċjata mal-produzzjoni mnaqqsa ta' ROS fiċ-ċelloli Eca-109 ittrattati b'800 µg/ml CTPG-W wara 12-il siegħa.

Figura 7. Il-livelli ta' cleaved-caspases u cleaved-PARP wara t-trattament CTPG-W. Proteini ġew iżolati miċ-ċelloli Eca-109 ittrattati b'CTPG-W għal 24 siegħa u l-livelli ta' cleaved-caspases u cleaved-PARP ġew skoperti b'analiżi tal-western blot. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, phenylethanoid glycosides solubbli fl-ilma taC. tubulosa; PARP, poly (ADP-ribose) polymerase.

CTPG-W jirregola l-attività ta' caspase-3, caspase-7, caspase-9 u PARP. Ir-rilaxx ta 'cytochrome c minħabba tnaqqis Δψm jista' jattiva l-proteases caspase biex jinduċi apoptożi (29,30,37). Wara t-trattament CTPG-W għal 24 siegħa, l-attivazzjoni ta 'caspase-3, 7, 8, 9, u PARP ġiet skoperta mill-analiżi tal-western blot. Meta mqabbla mal-kontroll, il-livelli ta' cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-7, cleaved-caspase-3 u cleaved-PARP, iżda mhux il-livelli ta' cleaved-caspase{{20 }}, ġew regolati 'l fuq minn trattament CTPG b'mod dipendenti fuq id-doża (Fig. 7). Dawn ir-riżultati indikaw li CTPG-W naqqas Δψm u ppromwova r-rilaxx ta 'cytochrome c biex jattiva caspases li jinduċu l-apoptosi taċ-ċelloli Eca-109.

Diskussjoni

CHM tradizzjonali jista 'jikkaġuna apoptożi ta' ċelluli tal-kanċer esophageal permezz ta 'mogħdijiet differenti, inkluż ir-riċettur tal-mewt estrinsiku, u mogħdijiet intrinsiċi tal-istress tar-retikulu mitokondrijali u endoplasmiku (29). L-istudju preċedenti tagħna wera li CTPG, bħala l-komponent ewlieni ta 'C. tubulosa, inibixxi t-tkabbir taċ-ċelluli B16-F1{0 tal-melanoma permezz tal-induzzjoni tal-apoptożi permezz ta' mogħdija dipendenti fuq il-mitokondrija (24). Fl-istudju preżenti, l-effett antitumorali ta' CTPG-W fuq iċ-ċelluli Eca-109 ġie investigat u ġie ddeterminat li CTPG-W irażżan it-tkabbir taċ-ċelluli Eca{-109, indotta apoptożi, u arrest taċ-ċiklu taċ-ċelluli, naqqas Δψm, żied ir-rilaxx ta 'cytochrome c u attivat caspases. CTPG u CTPG-W jistgħu jinduċu apoptożi u arrest taċ-ċiklu taċ-ċelluli fiċ-ċelloli tal-kanċer. Madankollu, il-mekkaniżmi preċiżi huma differenti minħabba l-komponenti differenti ta 'CTPG (26.64% echinacoside, 10.19% acteoside, u 1.71% isoacteoside) u CTPG-W (39.16% echinacoside u 2.44% acteoside). CTPG arresta ċelloli B16-F10 fil-fażijiet G0/G1, iżda CTPG-W arresta ċelloli Eca-109 fil-fażi S (24). Il-produzzjoni ta' ROS żdiedet b'mod dipendenti fuq id-doża b'CTPG, iżda indikat bidla b'mod dipendenti fuq iż-żmien b'doża għolja ta' CTPG-W, li żdiedet b'mod sinifikanti fil-bidu tat-trattament CTPG-W (2-6 h) u naqas b'mod sinifikanti wara 12-il siegħa, meta mqabbel mal-kontroll. Raġuni possibbli hija li l-komponent ewlieni ta 'CTPG-W huwa echinacoside. Diversi studji rrappurtaw li l-echinacoside jista 'jinibixxi l-produzzjoni ta' ROS u l-apoptożi indotta minn ROS biex jeżerċita l-effetti newroprotettivi u kontra t-tixjiħ tiegħu (38-40). Bl-istess mod, l-attività ta ' scavenging radikali ħielsa kienet osservata fl-istudju preżenti. Għalhekk, ġie spekulat li xi komponenti, inklużi verbascoside, iso-verbascoside, u salidroside f'doża għolja ta 'CTPG-W jistgħu immedjatament jinduċu ġenerazzjoni ta' ROS biex jikkawżaw apoptosi taċ-ċelloli Eca-109 (41,42), u mbagħad ROS kien scavenged minn echinacoside. Raġuni oħra possibbli għad-differenzi fil-produzzjoni ROS minn CTPG u CTPG-W hija li ntużaw linji ta 'ċelluli differenti f'dan l-istudju u fl-istudju preċedenti (24). Dong et al (43) irrappurtaw li echinacoside jista 'jikkaġuna l-apoptożi taċ-ċelluli tal-kanċer tal-kolorektum tal-bniedem SW480 permezz tal-ġenerazzjoni ta' ħsara ossidattiva tad-DNA mingħajr żieda fil-livelli ta 'ROS.

It-trattament CTPG-W naqqas Δψm u kkawża r-rilaxx ta 'cytochrome c, li jippromwovi l-qsim ta' caspase -9 (28). B'mod konsistenti, il-livelli ta' cleaved-caspase-9 ġew regolati 'l fuq permezz ta' trattament CTPG-W. Sussegwentement, il-caspase attiva-9 tista' tattiva l-caspase-3 biex tinduċi apoptożi (44). Il-livelli ta' cleaved-caspase-3 ġew ukoll regolati 'l fuq bit-trattament CTPG-W. Madankollu, caspase-8 ma kienx attivat minn CTPG-W, li jindika li l-passaġġ estrinsiku tar-riċettur tal-mewt ma kienx involut fl-apoptosi indotta minn CTPG-W. Dawn l-osservazzjonijiet jindikaw li CTPG-W jinduċi apoptosi taċ-ċelloli Eca-109 permezz tal-attivazzjoni ta' mogħdija dipendenti mill-mitokondrijali.

PARP jaqdi rwoli importanti fl-istabbiltà ġenomika u jista 'jinqasam mill-caspases attivi, partikolarment caspase-3 u -7 (45). Ġie determinat li t-trattament CTPG-W attivat il-caspase-3 u -7, li jistgħu jaqsmu l-PARP biex jinibixxu t-tiswija tad-DNA u jikkawżaw apoptożi.

CTPG-W irażżan ukoll it-tkabbir taċ-ċelluli BEL-7404 tal-karċinoma epatoċellulari tal-bniedem b'mod dipendenti mid-doża u l-ħin (dejta mhux ippubblikata). Għalkemm CTPG-W jinibixxi t-tkabbir taċ-ċelluli Eca-109 u BEL{-7404, jippromwovi l-proliferazzjoni ta 'splenocytes, li jista' jkun dovut għall-kontenut ta 'polisakkaridi (~50%) f'CTPG-W (46 ). Bl-istess mod, diversi studji rrappurtaw li l-polisakkaridi jistgħu jippromwovu l-proliferazzjoni tal-isplenoċiti (46-49). Fil-mudell tal-ġurdien, ġie determinat li CTPG-W żied b'mod sinifikanti l-indiċi tal-milsa, meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll, iżda ma affettwax il-piż tal-ġisem u l-indiċi tal-organi l-oħra inklużi l-qalb, il-fwied, il-kliewi u l-pulmun (dejta mhux ippubblikata), li jindika li CTPG-W m'għandu l-ebda effett ċitotossiku fuq ċelluli normali.

Kollettivament, id-dejta indikat li CTPG-W jinibixxi t-tkabbir taċ-ċelluli Eca-109 permezz ta' induzzjoni ta' apoptożi permezz ta' mogħdija dipendenti mill-mitokondrija

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%