Karatterizzazzjoni Ta 'Aċidi Caffeoylquinic Minn Lepisorus Thunbergianus U l-Attività Inibitorja Tagħhom Melanogenesis

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Hak Hyun Kim, Jae Kwon Kim, Jaehyun Kim, Se-Hui Jung,* u Kooyeon Lee*

ASTRATT:L-iperpigmentazzjoni li tirriżulta mill-attivazzjoni żejda ta' tyrosinase twassal għal tikek jew irqajja aktar skuri fuq il-ġilda tal-bniedem. Għalkemm dawn il-fenomeni ma jagħmlux ħsara, għad hemm domanda kbira għal inibituri tal-melanoġenesi biex jipprevjenu l-iperpigmentazzjoni billi jinibixxu tyrosinase, enzima li tillimita r-rata fil-melanoġenesi. Għalkemm Lepisorus thunbergianus intuża fil-folkremedies bħala aġent dijuretiku u emostatiku, l-effett tiegħu fuq il-melanoġenesi għadu ma ġiex irrappurtat. F'dan l-istudju, ħejjejna estratt ta 'L.thunbergianus u l-frazzjonijiet tas-solvent tiegħu u evalwajna l-attività bijoloġika tagħhom kontra s-sintesi ta' radikali ħielsa u melanin. L-estratt ta 'L. thunbergianus inibixxi l-attività tat-tyrosinase tal-faqqiegħ b'mod aktar effiċjenti minn, u b'attività antiossidant simili għal, arbutin in vitro. Evalwazzjoni komparattiva tal-attività kontra l-melanogenesis u l-anti-tyrosinase tal-frazzjonijiet tas-solvent ta 'L. thunbergianus uriet li, billi tinibixxi l-attività tat-tyrosinase, il-frazzjoni tal-butanol għandha l-ogħla potenzjal għall-inibizzjoni taċ-ċelluli tal-melanoma melanogenesisin. Sibna permezz ta 'analiżi strutturali bl-użu ta' kromatografija likwida ta 'prestazzjoni għolja (HPLC) u spettroskopija NMR li l-komposti ewlenin fil-frazzjoni tal-butanol kienu tliet derivattivi tal-aċidu caffeoylquinic. It-tliet derivattivi kellhom attivitajiet simili ta 'radicalscavenging u anti-tyrosinase in vitro, filwaqt li 5-caffeoylquinic acid biss kellu effett inibitorju fuq -MSH-inducedmelanogenesis. L-effett inibitorju ta '5-caffeoylquinic acid ġie vverifikat bid-determinazzjoni tal-kontenut tal-melanin u l-attività tat-tyrosinase fil-melanoma wara t-trattament taċ-ċelloli b'kompost kummerċjali. Barra minn hekk, aħna żvelaw li l-5-caffeoylquinic acid inibixxa l-melanogenesis billi tikkelat katjoni tar-ram minn kumpless copper-tyrosinase. Għalhekk, l-aċidu 5-caffeoylquinic jew il-frazzjoni butanol iżolati minn L. thunbergianus jistgħu jkunu utli fil-kożmetiċi bħala aġent li jbajdu l-ġilda.

Cistanche tubulosa: l-aġent li jbajdu l-ġilda.

INTRODUZZJONI

Melanin, grupp ta 'pigmenti naturali misjuba fil-biċċa l-kbira ta' l-organiżmi, għandu rwol importanti fil-kannella ta 'frott, fungi, andvegetables u l-pigmentazzjoni fil-ġilda tal-bniedem. 2 Inumani, il-pigment tal-melanin huwa sintetizzat minn melanoċiti taċ-ċelluli dendritiċi speċjalizzati li jinsabu fil-ġonta bejn l-epidermide u d-dermis li fihom tinbeda s-sintesi b'espożizzjoni għal raġġi ultravjola (UV). għalhekk, il-kulur tal-ġilda huwa determinat mill-mudell ta 'distribuzzjoni tal-pigment melanin.2 Disregolazzjoni inmelanin sintesi twassal għal ħafna forom ta' iperpigmentazzjoni, bħal melasma, freckles, spots ta 'età, lentigo solari, iperpigmentazzjoni postinfjammatorja, u sindromi oħra ta' iperpigmentazzjoni.4 Aktar minn a mijiet ta' proteini huma relatati mas-sintesi ta' tomelanin, u fosthom, tyrosinase hija l-enzima li tillimita r-rata li hija rikonoxxuta bħala s-sintesi ta' formelanin responsabbli. inibituri tyrosinase għall-prevenzjoni tal-melanogenesis.1,6 Numru oftyrosinase inibituri, bħal kojic acid, arbutin, hydroquinone, azelaic acid, ellagic acid, u tranexamic acid, werepopularly użati fl-industrija kosmetika bħala anti-melanogenesisagents; madankollu, minħabba l-limitazzjonijiet ta 'drogi kimiċi, li jinkludu ċitotossiċità u effetti sekondarji, hemm xorta waħda titlob materjali ġodda b'sigurtà, stabbiltà, andefficacy mtejba.

Prodotti naturali, inklużi pjanti, batterji, u fungi, saru sorsi alternattivi għall-iskoperta ta’ ingredjenti effiċjenti li jbajdu l-ġilda minħabba t-tossiċità inqas u l-bijokompatibilità u l-bijodisponibilità aħjar tagħhom. jew il-qoxra tas-siġar u hija mqassma fir-reġjuni moderati tal-Asja tal-Lvant, bħall-Korea, il-Ġappun, iċ-Ċina, il-Filippini, u l-Indokina. L. thunbergianus intuża bħala aġent adiuretiku, emostatiku u huwa antitussiv fil-folkremedies Koreani. Studji preċedenti rrappurtaw li estratt ta 'L. thunbergianus għandu attività topika ta' perossidazzjoni kontra l-lipidi f'attività lokali u antiossidanti.9 Barra minn hekk, l-estratt ta 'L. thunbergianus wera inibizzjoni sinifikanti ta' tkabbir dipendenti fuq il-konċentrazzjoni f'kanċer orali u ċelluli tal-kanċer tal-kolon.10 L-estratt ta 'L. thunbergianus jista' jkollu applikazzjonijiet potenzjali fl-industrija tal-kosmetiċi minħabba li dan l-impjant fih diversi komposti flavonoid u molekuli bijoattivi numerużi, li jinkludu quercetin 3-methyl ether-glucoside, vitexin, orjentali, perjodiku-glucoside, isovitexin, orientin, Corentin, u caffeoylquinicacid.9a Madankollu, l-effetti tal- L. thunbergianus estratt onmelanin sinteżi fil-melanocytes għad iridu jiġu eluċidati.

Figura 1. Analiżi ta 'l-estratt ta' L. thunbergianus għal (A) ABTS scavenging radikali, (B) anti-tyrosinase, u (C) intraċellulari ROS scavengingactivities

F'dan l-istudju, ħejjejna l-estratt ta 'L. thunbergianus u l-frazzjonijiet tas-solvent tiegħu permezz ta' frazzjonament serjali u investigajna l-effetti inibitorji tal-frazzjonijiet tas-solvent fuq il-melaninbiosynthesis fiċ-ċelloli tal-melanoma B16F10. Aħna identifikajna l-frazzjoni tal-butanol (n-BuOH) bħala porzjon ewlieni li fih l-inibitur naturali u kkaratterizzajna aktar l-effetti tad-derivattivi tal-aċidu caffeoylquinic iżolati mill-estratti ta 'L. thunbergianus fuq l-inibizzjoni tal-bijosintesi tal-melanin.

reviżjoni cistanche: anti-ossidazzjoni

RIŻULTATI U DISKUSSJONI

L-Estratt ta' l-Ethanol ta' L. thunbergianus Jneħħi 2,2′-Azinobis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)Radikali u Inibixxi l-Attività Tyrosinase.

L-estrazzjoni ta'L. thunbergianus b'70 fil-mija etanol (EtOH) sar biex tiġi vvalutata l-attività inibitorja potenzjali ta 'komposti naturali fil-pjanta. L-attività ta 'scavenging radikali ta' l-estratt ta 'L.thunbergianus ġiet iddeterminata fil-firxa ta' konċentrazzjoni ta '2-200 ug/mL. L-estratt ta 'l-etanol showedconcentration-dependent radical scavenging attività b'effett massimu f'50 ug/mL fejn ir-riżultat kien konsistenti ma' dak ta 'arbutin użat bħala kontroll pożittiv (Figura 1A).

Aħna evalwajna wkoll l-effett inibitorju tal-estratt fuq l-attività tat-tyrosinase tal-faqqiegħ billi tkejjel ir-rata ta 'sintesi ta' dopachrome katalizzata minn tyrosinase. L-etanolestratt inibixxa 87 fil-mija tal-attività tyrosinase f'500 ug/mL, filwaqt li l-arbutin inibixxi biss 38 fil-mija tal-attività tyrosinase fl-istess konċentrazzjoni (Figura 1B). Imbagħad, aħna evalwajna l-attività ta 'scavenging tal-estratt fuq ROS intraċellulari żdiedet b'100 μM perossidu tal-idroġenu. It-trattament bil-perossidu ta' l-idroġenu wassal għal żieda ta' madwar 2.1-darbiet fil-livell ta' ROS intraċellulari taċ-ċelloli B16F10 (Figura 1C). Sibna li ż-żieda medjata mill-perossidu ta 'l-idroġenu ta' ROS intraċellulari ġiet scavenged mill-estratt b'mod dipendenti fuq id-doża: l-attività massima ta 'scanning f'100 ug/mL kienet 78 fil-mija (Figura 1C). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-estratt ta 'l-etanol ta' L. thunbergianus fih ingredjenti bijoattivi li jinibixxu l-attività ta 'tyrosinase kif ukoll ROS scavengingABTS radikali u intraċellulari.

estratt ta 'cistanche deserticola: jinibixxi l-attività ta' tyrosinase.

Potenzjal Inibitorju ta 'L. thunbergianus Fractionsagainst Melanogenesis.

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex, li huwa konsistenti mar-rapport preċedenti.10bIktar minn hekk, l-effetti inibitorji ta 'frazzjonijiet ta' solventi differenti attività ontyrosinase żdiedu b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni: l-attivitajiet inibitorji massimi ta 'n-Hex u CH2Cl2frations kienu taħt 65 fil-mija, iżda dawk ta' EtOAc u Il-frazzjonijiet n-BuOH kienu ogħla minn 70 fil-mija (Figura 2B). L-attività inibitorja kienet fl-ordni ta 'n-BuOH> EtOAc> CH2Cl2> n-Hex. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li frazzjonijiet aktar idrofiliċi, inklużi frazzjonijiet n-BuOH u EtOAc, wrew attività ogħla ta' tneħħija tar-radikali u attività inibitorja aħjar minn frazzjonijiet thelipophilic n-Hex u CH2Cl2. .

Sussegwentement, l-effetti tal-frazzjonijiet tas-solvent ta’ L. thunbergianus fuq il-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-melanoma ġew investigati billi ġew ittrattati ċelluli B16F10 b’200 ug/mL kull waħda minn frazzjonijiet differenti jew 2mg/mL arbutin fil- preżenza ta '-melanocyte-stimulatinghormone (-MSH), li huwa magħruf sew li jippromwovi l-melanogenesis permezz ta' induzzjoni ta 'fattur ta' traskrizzjoni assoċjat mal-mikroftalmija (MITF). Imbagħad investigajna l-effett inibitorju tal-frazzjonijiet tas-solvent fuq il-melanoġenesi stimulata minn -MSH fiċ-ċelloli tal-melanoma. Trattament b'-MSH indotta żieda ta' madwar 2.0-darbiet fil-kontenut intraċellulari tal-melanin taċ-ċelloli B16F10 (Figura 2D). Sibna li l-melanoġenesi medjata minn -MSH kienet kompletament inibita mill-frazzjoni n-BuOH (p < 0.01)="" u="" parzjalment="" inibita="" mill-etoacfraction="" (40="" fil-mija,="" p="">< 0.01),="" filwaqt="" li="" l-melanoġenesi="" medjata="" minn="" -msh="" ma="" nbidlitx="" b'mod="" sinifikanti="" minn="" n-hex="" u="" frazzjonijiet="" ch2cl2="" (figura="" 2d).="" barra="" minn="" hekk,="" l-effetti="" inibitorji="" tal-frazzjonijiet="" tas-solvent="" fuq="" l-attivazzjoni="" tat-tyrosinase="" medjata="" minn="" -msh="" ġew="" iddeterminati="" peress="" li="" tyrosinase="" għandu="" rwol="" ewlieni="" fil-melanoġenesi.="" minn="" -msh,="" filwaqt="" li="" l-frazzjonijiet="" n-hex="" u="" ch2cl2="" ma="" għamlux,="" kif="" muri="" fil-figura="" 2e.="" barra="" minn="" hekk,="" l-effett="" scavenging="" ta="" 'frazzjonijiet="" solventi="" differenti="" fuq="" iż-żieda="" ta'="" ros="" intraċellulari="" kien="" stimulat="" mill-perossidu="" ta="" 'l-idroġenu.="" il-frazzjonijiet="" kollha="" tas-solvent="" qalbu="" ż-żieda="" intraċellulari="" ta="" 'ros="" medjata="" mill-perossidu="" ta'="" l-idroġenu,="" kif="" muri="" fil-figura="" 2f.="" dawn="" ir-riżultati="" jindikaw="" li="" l-buohfraction="" ta="" 'l.="" thunbergianus="" inibit="" il-melaninsynthesis="" indotta="" minn="" -msh="" billi="" jinibixxi="" l-attività="" ta'="" tyrosinase="" intraċellulari="" fiċ-ċelloli="" b16f10.="" barra="" minn="" hekk,="" dawn="" ir-riżultati="" jissuġġerixxu="" li="" l-ingredjenti="" bijoattivi="" li="" jinibixxu="" s-sintesi="" tal-melanin="" kienu="" idrofiliċi="" u="" nstabu="" prinċipalment="" fil-frazzjoni="">

Figura 2. Effetti ta 'frazzjonijiet tas-solvent fuq attivitajiet ta' tneħħija radikali ABTS, anti-tyrosinase, u anti-melanogenesis.

Identifikazzjoni u Karatterizzazzjoni ta 'Komposti Bijoattivi ta' L. thunbergianus Estratt.

Biex tidentifika u tikkaratterizza l-ingredjenti li jinibixxu l-melanoġenesi, saret analiżi tal-kromatografija likwida ta 'prestazzjoni għolja (HPLC) għall-frazzjonijiet kollha tas-solvent. L-analiżi HPLC tal-frazzjonijiet tas-solvent wriet li l-frazzjonijiet kollha fihom tliet komposti maġġuri f'ħinijiet ta 'żamma ta' 21, 28, u 29 min għall-komposti 1, 2, u 3, rispettivament (Figura 3A-D). Dawn it-tliet komposti ewlenin ġew iżolati aktar permezz ta 'purifikazzjoni preparativeHPLC. L-ammonti tat-tliet komposti ewlenin fil-frazzjoni n-BuOH ġew determinati bl-użu ta' derivattivi kummerċjali tal-aċidu caffeoylquinic bħala molekuli standard interni, skont ir-rapport preċedenti.12

Il-komposti iżolati mbagħad ġew identifikati b'paragun tad-dejta tagħhom 1H u 13C NMR mal-letteratura u nstabu li jaqblu mal-istrutturi proposti (Figura 4).13 Figura 3E turi l-istruttura molekulari tat-tliet komposti. Kompost 1 (rendiment, 3.2 ± 0.1 mg/100 mg n BuOH frazzjoni) inkiseb bħala trab isfar ċar. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.66 (1H, brs), 9.20 (1H, brs), 7.49 (1H, d, J=15.9 Hz), 7.04 (1H, s), 6.99 ( 1H, d, J=8.2Hz), 6.78 (1H, d, J=8.1 Hz), 6.23 (1H, d, J=15.9 Hz), 5.20( 1H, m), 5.08 (1H, brs), 4.89 (1H, brs) 4.13 (1H, m), 3.84 (1H, m), 3.56 (1H, s), 3.35 (1H, s), 1.99 (1H, s), m), 1.92 (1H, m), 1.89 (1H, m), 1.79 (1H, m). 13C{1H} NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (176.42, 168.10, 148.14, 145.53, 144.75, 125.65,121.07, 115.75, 114.71, 114.71, 114.71, 168.10, 148.14, 145.53, 144.75, 125.65,121.07, 115.75, 114.71, 114.71, 114.71, 114.71, 168.10, 148.14, 145.53, 144.75) Il-kompost 1 ġie identifikat bħala 3-caffeoylquinicacid permezz ta' analiżi NMR u b'paragun mal-letteratura preċedenti.13b

Kompost 2 (rendiment, 14.1 ± 0.1 mg/100 mg n-BuOHfraction) inkiseb bħala trab isfar ċar. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.64 (1H, brs), 9.20 (1H, brs), 7.52 (1H,d, J=15.9 Hz), 7.06 (1H, s), 7.02 ( 1H, d, J=8.1 Hz) 6.79(1H, d, J=7.9 Hz), 6.30 (1H, d, J=15.9 Hz), 4.85 ( 1H, brs),4.70 (1H, d, J=4.9 Hz), 4.12 (1H, brs), 3.95 (1H, m), 1.97 (2H, m), 1.88 (1H, m), 1.83 (1H, m). 13C{1H} NMR (100MHz, DMSO-d6) δ (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77,125.54, 121.19, 115.76, 114.6.683, 114.683, 114.683, 114.683, 114.77, 125. 54, 121. 19, 115. 76, 114. 68. Il-kompost 2 ġie identifikat bħala 5-caffeoylquinic acid permezz ta' analiżi NMR u b'paragun mal-letteratura preċedenti.13c

Kompost 3 (rendiment, 3.9 ± 0.2 mg/100 mg n-BuOHfraction) inkiseb bħala trab isfar ċar. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.64 (1H, brs), 9.20 (1H, brs), 7.52 (1H,d, J=15.9 Hz), 7.06 (1H, s), 7.02 ( 1H, d, J=8.1 Hz) 6.79(1H, d, J=7.9 Hz), 6.30 (1H, d, J=15.9 Hz), 4.85 ( 1H, brs),4.70 (1H, d, J=4.9 Hz), 4.12 (1H, brs), 3.95 (1H, m), 1.97 (2H, m), 1.88 (1H, m), 1.83 (1H, m). 13C{1H} NMR (100MHz, DMSO-d6) δ (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77,125.54, 121.19, 115.76, 114.6.683, 114.683, 114.683, 114.683, 114.77, 125. 54, 121. 19, 115. 76, 114. 68. Il-kompost 3 ġie identifikat bħala 4-caffeoylquinic acid permezz ta' analiżi NMR u b'paragun mal-letteratura preċedenti.13a

Figura 3. Kromatogrammi HPLC ta '(A) n-Hex, (B) CH2Cl2, (C) EtOAc, u (D) frazzjonijiet n-BuOH ta' L. thunbergianus u (E) struttura tat-tliet komposti ewlenin.

Potenzjal Inibitorju ta 'Derivattivi ta' Aċidu Caffeoylquinic Iżolati minn L. thunbergianus kontra Melanogenesis.

Sussegwentement, biex tidentifika l-ingredjent bijoloġikament attiv li jinsab taħt l-anti-melanogenesis potenti, iddeterminajna l-attività inibitorja tat-tliet derivattivi ta 'l-aċidu caffeoylquinic iżolati minn L. thunbergianus kontra ċelluli ta' inmelanoma ta 'sintesi ta' melanin. L-ewwel, ġew investigati l-effetti tat-tliet derivattivi fuq it-tneħħija radikali ABTS. Ir-riżultati showedthat-tliet derivattivi kellhom simili ABTS scavengingactivities radikali (Figura 5A). Imbagħad investigajna l-effett inibitorju tat-tliet derivattivi iżolati mill-attività ta 'L. thunbergianus ontyrosinase. It-tliet derivattivi wrew inibizzjoni dipendenti fuq il-konċentrazzjoni ta 'attività tyrosinase, withmaximal inibizzjoni f'konċentrazzjoni ta' 200 μM (Figura 5B).Further, investigajna l-effett inibitorju tat-tliet derivattivi fuq is-sintesi tal-melanin indotta minn -MSH f'ċelluli B16F10. Trattament b'-MSH indotta żieda ta' madwar 2.0-darbiet fil-kontenut ta' melanin intraċellulari taċ-ċelluli B16F10 (Figura 5C). Interessanti, il-komposti 1 (3-caffeoylquinicacid) u 3 (4-caffeoylquinic acid) żiedu b'mod sinifikanti s-sintesi tal-melanin b'25 u 23 fil-mija, rispettivament (Figura 5C, p< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

Figura 4. Spettri 1H NMR ta' (A) 3-caffeoylquinic acid, (B) 4-caffeoylquinic acid, u (C) 5-caffeoylquinic acid u spettri 13C NMR ta' (D) {{ 6}}aċidu caffeoylquinic, (E) 4-aċidu caffeoylquinic, u (F) 5-aċidu caffeoylquinic

Verifika ta' l-Effikaċja ta' Kontra l-Melanġenesi ta' 5-Caffeoylquinic Acid.

Biex nivverifikaw l-effett inibitorju ta' {{0}}caffeoylquinic acid kontra l-melanoġenesi, iddeterminajna l-effett inibitorju tas-sintesi kummerċjali ta' {{{0}caffeoylquinic acid onmelanin medjata minn -MSH. Trattament b'konċentrazzjonijiet aktar baxxi ta' 0.1 u 0.2 mM 5-caffeoylquinicacid żiedet bi ftit is-sinteżi tal-melanin u l-attività intracellulartyrosinase, filwaqt li konċentrazzjonijiet ogħla ta' 0.5 u 1mm tal-kompost reġġgħu lura l-melanoġenesi medjata minn -MSH u attività tyrosinase intraċellulari (Figura 6A, B) li fiha r-riżultati huma konsistenti mar-rapport preċedenti.14

L-aċidu caffeoylquinic huwa kompost fenoliku ffurmat minn rabta teester bejn l-aċidu caffeic u l-aċidu L-quiniku. Id-derivattivi ta 'l-aċidu caffeoylquinic ġew magħrufa li għandhom attivitajiet ta' kontra l-melanogenesis u anti-tyrosinase kif ukoll attività ta 'scavenging ta' ROS. Tyrosinase huwa metalloenzyme multifunzjonali li fih ir-ram b'katjoni tar-ram divalenti.1 Derivattivi ta 'l-aċidu caffeoylquinic jistgħu jinibixxu l-attività ta' tyrosinase billi jikelataw katjoni tar-ram responsabbli għas-sostenn ta 'l-istat attiv ta' tyrosinase. Biex tbassar l-interazzjoni bejn 5-caffeoylquinic acid u tyrosinase, sar studju ta' docking komputazzjonali molekulari bl-użu tal-programm Maestro. L-aħjar pożizzjoni għall-kompost, totyrosinase docked, hija murija fil-Figura 6C, D. L-istudju ta 'docking molekulari wera li 5-caffeoylquinic acid jinteraġixxi ma' copperion f'distanza ta '2.43 Å u jistabbilixxi serje ta' π−πstacking ma' His 259, Asn 260, His 85, u His 263 residuesand H-bond b'Arg 268. Barra minn hekk, l-enerġija li torbot bejn tyrosinase u 5-caffeoylquinic acid kienet -4.425 kJ/mol. Dawn ir-riżultati jindikaw li 5-caffeoylquinic acid jista' jinibixxi l-attività ta' tyrosinase permezz ta' kelazzjoni tar-ram. Biex nivverifikaw il-mekkaniżmu inibitorju tal-melanoġenesi permezz ta' 5-caffeoylquinicacid, iddeterminajna l-kapaċità ta' kelazzjoni tar-ram ta' 5-caffeoylquinic acid. L-abbiltà ta 'chelating tar-ram ta' 5-caffeoylquinic acid żdiedet b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni (Figura 6E). Dan ir-riżultat jissuġġerixxi li 5-caffeoylquinicacid jinibixxi s-sintesi tal-melanin permezz tal-kelazzjoni ta' katjoni tar-ram li jinteraġixxi mat-tyrosinase.

Figura 5. Effetti tat-tliet derivattivi tal-aċidu caffeoylquinic fuq it-tneħħija radikali, in vitro anti-tyrosinase, u attività kontra l-melanogenesis fiċ-ċelloli B16F10.

MATERJALI U METODI

Materjali

L. thunbergianus inxtara mill-onlinemarket www.jirisangol.com (Korea) u mnixxef taħt kundizzjonijiet ambjentali qabel l-użu f'dan l-istudju. Reaġenti, bħal 2,2′-żingu bis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) u 3-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), ormon li jistimula l-melanocyte (-MSH), u enżimi, bħal tyrosinase tal-faqqiegħ, inkisbu minn Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Potassiumpersulfate (K2S2O8), pyrocatechol violet, u 3,4-dihydroxy-L phenylalanine (L-DOPA) inxtraw minn Alfa Aesar (Haverhill, MA, USA).

Estrazzjoni u frazzjonament ta 'L. thunbergianus.

L. thunbergianus imnixxef (80 g) ġie polverizzat bl-użu ta' polverizzatur (HBL-3500S, Samyang Electronics, Korea) u estratt b'70 fil-mija EtOH tliet darbiet (800 mL, kull darba ) f'70 grad għal 3 ijiem. L-estratt li rriżulta kien iffiltrat bil-vakwu bl-użu tal-karta Advantecfilter nru. 1 u 2 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan) u kkonċentrat bl-użu ta 'rotaryevaporator Hei-Vap Advantage (Heidolph, il-Ġermanja) biex tikseb 17.2 g ta' l-estratt EtOHcrude. Dan l-estratt mhux raffinat ġie sospiż f'dH2O (180mL) u suċċessivament frazzjonat b'Hex, CH2Cl2, EtOAc, u n-BuOH biex jagħti Hex (1.51 g, 8.8 fil-mija), CH2Cl2 (0.88 g, 5.1 fil-mija), EtOAc (3.95 g, 23). fil-mija), u n-BuOH (3.02 g, 17.6 fil-mija), kif deskritti qabel.15 L-estratti u l-frazzjonijiet li jirriżultaw ġew imnixxfa bil-friża u maħżuna f'-80 grad qabel l-użu.

Determinazzjoni tal-ABTS Free Radical ScavengingActivity.

Biex tiġi evalwata l-attività antiossidanti ta 'l-estratti ta' L.thunbergianus u l-frazzjonijiet tas-solvent tagħha, ġiet iddeterminata l-attività ta' scavenging ABTSradical, kif deskritta qabel. potassiumperoxy disulfate f'dH2O u inkubat fid-dlam f'temperatura tal-kamra (RT) għal 16-il siegħa qabel l-użu. Is-soluzzjoni radikali ABTS ġiet dilwita b'metanol assolut biex tikseb anassorbance ta' qrib 0.7 f'734 nm. Alikwoti ta '100 μL ta' kull estratt jew frazzjonijiet fil-medda ta 'konċentrazzjoni indikata ta' 2-200 ug / mL ġew miżjuda ma '100 μL ta' soluzzjoni radikali ABTS dilwita u inkubati għal 10 min fid-dlam f'RT. L-assorbiment imbagħad tkejjel f'732 nm bl-użu ta' qarrej tal-mikroplate multimode SpectraMaxM5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). L-attività ta' tneħħija radikali ABTS ġiet ikkalkulata kif ġej

Attività ta' tneħħija radikali tal-ABTS (perċentwali) =1−(Bħala kampjun/Akontroll)×100 (1)

Inibizzjoni ta' Tyrosinase in vitro.

L-effett inibitorju ta 'l-estratti ta' L.thunbergianus u l-frazzjonijiet tas-solvent tiegħu fuq l-attività ta 'tyrosinase ġie vvalutat mill-ammont ta' dopachromesynthesized mir-reazzjoni katalitika ta 'tyrosinase.2a,17Briefly, 50 μL ta' kull estratt jew frazzjoni fil-medda ta 'konċentrazzjoni indikata tħallat ma' 550 μL U/mLmushroom tyrosinase f'50 mM phosphate-buffered saline(PBS; 8.1 mM Na2HPO4, 1.2 mM KH2PO4, pH 6.8, 2.7 mMKCl, u 138 mM NaCl) fi 96-platt tajjeb u inkubat għal RT30. Imbagħad, ġew miżjuda 100 μL ta '1 mM L-DOPA ma' kull bir segwit minn inkubazzjoni għal 10 minuti addizzjonali f'37 grad. L-assorbiment tas-soluzzjoni li tirriżulta tkejjel f'475 nm bl-użu tal-microplatereader multimode SpectraMax M5.

Kultura taċ-Ċelloli.

Iċ-ċelluli tal-melanoma murina B16F10 kienu kkultivati ​​fil-mezz Eagle modifikat ta' Dulbecco (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, USA) supplimentat b'10 fil-mija serum bovin fetali inattivat bis-sħana (Gibco), 100 unità/mL peniċillina, u 100ug/mL streptomycin (3Gibco) taħt umidifikat 5 fil-mija CO2.

Vijabilità taċ-Ċelloli.

Il-vijabbiltà taċ-ċelluli B16F10 kienet determinata permezz ta 'assaġġ MTT, kif deskritt qabel.18 Fil-qosor, iċ-ċelluli B16F10 ġew miżrugħa fi 24-pjanċi bir-bir f'densità ta' 1 × 104 cellsper bir. Wara 24 siegħa, iċ-ċelloli ġew ittrattati bil-konċentrazzjonijiet indikati ta 'estratti jew frazzjonijiet ta' L. thunbergianus għal 48 siegħa. Iċ-ċelloli ġew imbagħad inkubati b'soluzzjoni MTT għal 4 sigħat, u l-kristalli ta 'formazan imnaqqsa ġew maħlula f'DMSO. Is-soluzzjoni li rriżultat ġiet trasferita għal 96-pjanċi tal-bir, u l-assorbiment tkejjel f'540 nm bl-użu tal-qarrej tal-mikroplate SpectraMax M5multimode.

Determinazzjoni ta' Speċijiet ta' Ossiġenu Reattiv Intraċellulari (ROS).

Il-livell ta' ROS intraċellulari kien imkejjel bl-użu ta' kit ta' analiżi ROS ċellulari DCF/H2DCFDA (ab113851, Abcam), skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Fil-qosor, iċ-ċelluli B16F10 ġew miżrugħa fi 48-pjanċi bir-bir b'densità ta' 2 × 104 ċelluli għal kull bir. Wara kultura ta '24 siegħa, iċ-ċelluli ġew ittrattati għal 1 siegħa bil-konċentrazzjonijiet indikati ta' frazzjonijiet tas-solvent tal-estratt tal-L. thunbergianus f'0.1 fil-mija tal-albumina tas-serum bovin (BSA) li kien fih midja tal-kultura mingħajr l-ebda aħmar fenol. Iċ-ċelloli mbagħad ġew inkubati b'100 μM perossidu tal-idroġenu għal 30 min.Wara l-ħasil bil-PBS, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'25 μMH2DCFDA f'PBS għal 45 min. Il-livell ROS ġie analizzat b'qarrej tal-mikroplate (Synergy H1, Biotek, Vermont, USA) mgħammar b'filtru ta' fluworexxenza f'485/545 nm (tul ta 'mewġ ta' eċitazzjoni/emissjoni). L-intensità tal-fluworexxenza relattiva medja tal-kontroll kienet ugwali għal 100 fil-mija, bil-kundizzjonijiet tat-trattament ikkalkolati proporzjonalment.

Determinazzjoni tal-Kontenut tal-Melanin.

Il-kontenut tal-melanin kien iddeterminat, kif deskritt qabel, b'xi modifikazzjonijiet.19 Iċ-ċelluli tal-melanoma ġew ikkultivati ​​fi pjanċa ta 'sitt well għal 24 siegħa. Ġew ittrattati bil-konċentrazzjonijiet indikati ta 'l-estratt ta' L. thunbergianus jew frazzjonijiet tas-solvent tiegħu għal 48 siegħa oħra fil-preżenza ta '100 nM -MSH. Gibco), iċ-ċelloli li rriżultaw inqalgħu permezz ta 'inkubazzjoni b'soluzzjoni ta' trypsin-EDTA. Wara ċ-ċentrifugazzjoni f'1000 rpm għal 3 min, il-pellet taċ-ċelluli ġie maħlul f'150 μL ta '1 M NaOH li fih 10 fil-mija DMSO għal siegħa f'60 grad għal siegħa. Il-kontenut tal-melanin kien determinat mill-assorbenza f'405 nm bl-użu tal-qarrej tal-mikroplate.

L-estratt ta 'Cistanche jinibixxi l-melanin.

Determinazzjoni tal-Attività Ċellulari tat-Tyrosinase fiċ-Ċelloli tal-Melanoma.

L-attività tat-tirosinażi fiċ-ċelloli B16F10 ġiet eżaminata abbażi tal-ammont ta’ dopachrome prodott mir-reazzjoni katalitika ta’ tyrosinase intraċellulari. frazzjonijiet għal 48 hin oħra l-preżenza ta '100 nM -MSH. Wara li ħaslu darbtejn bid-D-PBS kiesaħ bis-silġ, iċ-ċelloli ġew lysed f'200 μL ta' buffer ta' analiżi radjoimmunopreċipitazzjoni (RIPA) (Sigma-Aldrich) li kien fih inibituri ta' protease u fosfatażi. Wara ċ-ċentrifugazzjoni tal-lisat taċ-ċelluli miġbur minn kull bir f'15,000g għal 15-il minuta, 100 μL tas-supernatant tħalltu ma' 100 μL ta' 1 mM L-DOPA f'PBS (pH 6.8) segwit b'inkubazzjoni għal 30 min f'37 grad . L-assorbiment ta' dopachrome tkejjel f'475 nm bl-użu tal-microplatereader. Id-dejta ġiet normalizzata bil-konċentrazzjoni tal-proteina ddeterminata mill-assaġġ tal-aċidu bicinchoninic.

Iżolament u Karatterizzazzjoni ta' Komposti Bijoattivi bl-użu ta' HPLC.

HPLC twettqet fuq YL{{0}}(Young Lin Instrument, Korea), mgħammra b'kolonna TC-C18 (4.6 mm, 250 mm, u 5 μm, Agilent, USA), inkonġunzjoni b'sistema gradjent komposta minn solvent A(0.2 fil-mija aċidu formiku) u solvent B (MeOH). Il-proporzjon tas-solvent tal-inklinazzjoni kien issettjat għal 0-5 min, 15 fil-mija B; 5−10 min, 15−20 fil-mija B; 10−15 min, 20−30 fil-mija B; 15−30 min, 30−40 fil-mija B; 30−37 min, 40−60 fil-mija B; 37−40 min, 60−100 fil-mija B; 40−45 min, 100 fil-mija B; 45−50min, 100−15 fil-mija B; u 50-55 min, 15 fil-mija B. Biex jiġu identifikati l-ingredjenti fil-frazzjonijiet tas-solvent, il-fażi mobbli ġiet mogħtija b'rata ta 'fluss ta' 1 mL/min, u l-iskoperta ta 'eluting wascarried out at 330 nm. Biex tiġbor l-ingredjenti bijoattivi frazzjonijiet insolventi, il-fażi mobbli ġiet mogħtija b'rata ta 'fluss ta' 15.0 mL/min, u l-iskoperta ta 'eluting twettqet f'330 nm bl-użu ta' prep-HPLC (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Korea). ), mgħammra b'kolonna prep-C18 (4.6 mm, 212 mm,10 μm, Agilent, USA), flimkien ma 'sistema ta' gradjent komposta minn solvent A (0.2 fil-mija aċidu formiku) u solvent B(MeOH). Il-proporzjon tas-solvent tal-inklinazzjoni kien issettjat għal 0-10 min, 10 fil-mija B;10-20 min, 10-15 fil-mija B; 20−40 min, 15 fil-mija B; 40−60 min, 15−20 fil-mija B; u 60−70 min, 30 fil-mija B.

Immudellar Molekulari.

L-istruttura tal-kristall tal-mushroomtyrosinase għall-immudellar molekulari kienet Agaricustyrosinase (PDB tagħmel: 2Y9X) miksuba mill-Protein DataBank (PDB). L-enzima ġiet ippreparata bl-użu tal-fluss tax-xogħol tal-preparazzjoni proteinwizard inkorporat fil-Maestroprogram (Maestro, verżjoni 11.9.011, Schrödinger, LLC, NewYork, NY, USA, 2019). L-ilma u l-molekuli l-oħra kollha preżenti fil-fajls PDB tneħħew. Docking molekulari sar bl-użu tal-protokoll induced docking fit (IFD) (protokoll tal-Induced Fit Docking Schrödinger Suite 2019), irrappurtat qabel.21

Abbiltà Chelating tar-ram.

Il-kapaċità kelanti tar-ram tal-komposti iżolati minn L. thunbergianus kienet determinata skond ir-rapport preċedenti.22 Kull derivattiv ta' l-aċidu caffeoylquinic (10 μL) fil-konċentrazzjoni indikata tħallat ma' 280 μL ta' buffer ta' aċetat tas-sodju 50 mM (pH 6.0), 6 μL ta' soluzzjoni vjola ta' pyrocatechol 4 mM ippreparata fl-istess buffer, u 10 μL ta' 1 ug/μL CuSO4·5H2O. L-għajbien tal-kulur blu ġie osservat billi tkejjel l-assorbiment f'632nm bl-użu tal-qarrej tal-mikroplate multimode SpectraMax M5. L-ilma intuża bħala kontroll minflok kampjun. L-attività kelanti tal-perċentwal tar-ram ġiet ikkalkulata mill-assorbiment f'632 nm, li hija kif ġej

kapaċità ta' kelazzjoni tar-ram (perċentwali)=1- (Kampjun/Kontroll)×100 (2)

Analiżi Statistika.

Id-dejta kollha f'dan l-istudju kienet espressa bħala l-medja ± devjazzjoni standard (SD) minn tliet esperimenti indipendenti. Analiżi statistiċi saru bl-użu ta' GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Id-differenzi bejn il-valuri medji tal-kontroll u l-gruppi esposti ġew analizzati bl-użu ta' analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda (ANOVA) segwita mill-post hoctest ta' Dunnett. Il-limitu għas-sinifikat statistiku għall-analiżi kollha kien p < 0.05="" (żewġ="">

KONKLUŻJONIJIET

F'dan l-istudju, aħna wrejna li l-estratt ta 'L. thunbergianus jaħrab ir-radikali ABTS u juri effett inibitorju qawwi fuq il-bijosintesi tal-melanin mingħajr ċitotossiċità sinifikanti. Ingredjent abijoattiv eżistenti f'L. thunbergianus u li jinibixxi l-melanogenesis kien iżolat fil-frazzjoni n-BuOH. Barra minn hekk, sibna li t-tliet derivattivi tal-aċidu caffeoylquinic huma komposti ewlenin li jeżistu fil-frazzjoni n-BuOH u li l-aċidu 5-caffeoylquinic huwa ingredjent importanti għal jrażżnu l-melanoġenesi fiċ-ċelloli tal-melanoma billi jinibixxu l-attività tat-tirosinażi ċellulari. Hawnhekk, iżolajna inibitur kompost naturali 5-caffeoylquinic acid mill-estratt ta 'L.thunbergianus biex jipprevjeni l-iperpigmentazzjoni u żvela l-mekkaniżmu ta' inibizzjoni tiegħu li huwa l-bażi tal-melanoġenesi. Għalhekk, is-sejbiet tagħna jissuġġerixxu li 5-caffeoylquinic acid u l-frazzjoni n-BuOH iżolata minn L. thunbergianus jistgħu jkunu utli fil-kożmetiċi bħala aġenti li jbajdu l-ġilda.

slices cistanche