Aċidu Propioniku Prodott mill-fermentazzjoni ta' Cutibacterium Acnes ittejjeb is-Sinteżi tal-Melanina

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Hsin‑Jou Kao1, Yan‑HanWang2, Sunita Keshari3, John JacksonYang3, Shinta Simbolon1, Chun‑Chuan Chen1 & Chun‑Ming Huang1*

L-irradjazzjoni ultravjola tinduċi akkumulazzjoni ta 'melanin, li tista' titnaqqas bl-użu ta 'prodotti kimiċi li jbajdu. Madankollu, it-tħassib assoċjat dwar is-sikurezza ta' prodotti bħal dawn wassal għat-tfittxija għal alternattivi naturali u li ma jagħmlux ħsara. Dan l-istudju kellu l-għan li jidentifika formulazzjoni aċiduża naturali biex titnaqqas il-pigmentazzjoni tal-ġilda. L-aċidu propjoniku metabolit (CH3CH2COOH, PA) kien l-aktar aċidu xaħmi abbundanti fil-filtrat mill-fermentazzjoni Pluronic F68 (PF68) ta 'Cutibacterium acnes (C. acnes) u naqqas il-melanoċiti pożittivi għal DOPA billi inibixxi b'mod sinifikanti l-attività tat-tyrosinase ċellulari permezz ta' rbit mal- riċettur 2 tal-aċidu xaħmi ħieles (FFAR2). Barra minn hekk, it-trattament ta '4 mM PA ma biddilx il-proliferazzjoni tal-melanocyte, li jindika li hija soluzzjoni effettiva għall-iperpigmentazzjoni, li ma tikkawża l-ebda ħsara ċellulari. Il-melanoċiti DOPA-pożittivi mnaqqsa u l-attività tyrosinase ġew osservati wkoll f'tessut tal-ġilda tal-widna tal-ġrieden injettat b'taħlita ta 'C. acnes u PF68, li jappoġġjaw li l-inibizzjoni tal-melanoġenesi x'aktarx tkun medjata permezz ta' metaboliti ta 'fermentazzjoni minn C. acnesfermentation bl-użu ta' PF68 bħala a. sors tal-karbonju. Barra minn hekk, PA ma affettwax it-tkabbir tal-batterja ġenitur tagħha C. acnes, għalhekk huwa metabolit ta 'fermentazzjoni qawwi li ma jfixkilx il-bilanċ tal-mikrobijoma tal-ġilda.

Il-ġilda taġixxi bħala interface bejn il-ġisem tal-bniedem u l-ambjent estern li tipprovdi difiża kontra patoġeni, ħsara fiżika u ultravjola1. Jekk il-ġilda tal-bniedem tkun esposta żżejjed għar-radjazzjoni ultravjola (UVR) li tinfluwenza l-funzjoni u s-sopravivenza ta 'ħafna tipi ta' ċelluli, tinduċi infjammazzjoni tal-ġilda, li tista 'twassal għal kanċer2,3. Il-ħsara tad-DNA indotta mill-UV jattiva s-sinjali tat-tiswija ċellulari biex tipproduċi melanin fil-melanoċiti, li tirriżulta f'pigmentazzjoni tal-ġilda4,5. Il-wiċċ tal-ġilda tal-bniedem b'saħħtu huwa kkolonizzat minn ambjent divers ta 'mikro-organiżmi, li ħafna minnhom ma jagħmlux ħsara bħala commensals jew patoġeni opportunistiċi6,7. Il-probijotiċi huma eżempji komuni ta' batterjoterapija bil-potenzjal għal fotoprotezzjoni billi jnaqqsu s-sinjali tal-ġilda li qed tixjieħ u jtaffu l-effetti tal-infammazzjoni tal-ġilda kkaġunata mill-UV3,8,9. Pereżempju, batterji tal-aċidu lattiku probijotiku notevolment jipprevjenu reazzjonijiet infjammatorji, allerġiċi u immunosoppressjoni fil-ġilda kkaġunati mill-UV10. Barra minn hekk, il-kapaċità ta' Cutibacterium acnes (C. acnes), batterju predominanti fil-mikrobijoma tal-ġilda, li jipproduċi porfirina b'rispons għall-UVR jagħmilha bijomarkatur ewlieni minħabba r-rwol tiegħu fil-protezzjoni u l-prevenzjoni tad-diżbilanċ2,11,12, għalhekk huwa ta’ interess prattiku13. Studji wrew li l-filtrat tal-ferment (GFF) naqqas il-melanin fiċ-ċelloli tal-melanoma tal-bniedem, u b'hekk inaqqas il-pigmentazzjoni tal-ġilda14. L-aċidi grassi ħielsa (FFA) għandhom effetti regolatorji notevoli fuq il-melanoġenesi u l-attività tyrosinase mrażżna f'ċelluli kkultivati ​​tal-melanoma murina B16F1015. Ħafna għażliet ta 'trattament għall-iperpigmentazzjoni jimblukkaw il-konverżjoni ta' tyrosine għal melanin, li jaġixxi bħala inibitur ta 'tyrosinase, enzima regolatorja ewlenija meħtieġa għall-bijosintesi tal-melanin16. Riċentement, l-użu estensiv ta 'aġenti li jbajdu l-ġilda, bħal komposti fenoliċi u merkurju, f'formulazzjonijiet kożmetiċi qajjem tħassib serju dwar is-sikurezza17. Barra minn hekk, FFAR2 (magħruf ukoll bħala GPR43) huwa preżenti f'varjetà ta 'tessuti bħall-mudullun, il-milsa u l-ġilda normali18 u huwa mira promettenti tad-droga għall-obeżità, il-kolite, u xi reazzjonijiet infjammatorji19. FFAR2 huwa riċettur għal aċidi grassi ta 'katina qasira (SCFAs) b'tulijiet ta' katina ta 'inqas minn sitt karbonju bħall-aċetat, butyrate, u propionate, l-aktar agonist qawwi għal FFAR220,21. Preċedentement, aħna wrejna li l-knockdown in vivo ta 'FFAR2 fil-ġilda tal-ġurdien imblukkat il-medjazzjoni tal-aċidu butiriku tal-irritazzjoni tal-UV3.

C. acnes is abundant on the human skin surface accounting for>60 fil-mija tal-batterja2. Barra minn hekk, l-aċidu propjoniku (PA), metabolit tal-fermentazzjoni minn C. acnes, u d-derivattivi esterifikati tiegħu jaġixxu bħala aġent antimikrobiku potenzjali kontra l-kisi ta 'Staphylococcus aureu11,22 u poly(ethylene oxide) huma metodu promettenti biex jiġu evitati infezzjonijiet23. Il-batterji probijotiċi kommensali tal-ġilda jistgħu jinibixxu t-tkabbir ta 'USA300 permezz tal-fermentazzjoni ta' poly(ethylene glycol) dime-methacrylate bħala inizjatur tal-fermentazzjoni selettiv24. PF68, polimeru bbażat fuq PEG huwa trasportatur tal-ġell stabbli għal aġenti antimikrobiċi, li jżid is-solubilità tal-wiċċ tal-mediċina, u ġeneralment jintuża fit-trattament ta 'feriti infettati mingħajr effetti sekondarji dixxernibbli25. F'dan l-istudju, iddeterminajna li PF68 bħala kompost derivat mill-polimeru huwa aġent potenzjalment sigur u effettiv u l-applikazzjoni ta 'metaboliti mill-fermentazzjoni ta' PF68 mill-ġilda commensal C. acnes tista 'tinibixxi l-iperpigmentazzjoni jew il-melanoġenesi tal-ġilda kkaġunata mill-UV.

Benefiċċji cistanche tubolosa: jinibixxi l-melanoġenesi tal-ġilda.

Metodi

Dikjarazzjoni etika.

Dan l-istudju sar b'mod strett bi protokoll approvat tal-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali (IACUC) fl-Università Ċentrali Nazzjonali (NCU), it-Tajwan (NCU-106-016) u f'konformità mal-linji gwida Arrive (https://arriveguidelines) .org/). Ġrieden tal-Istitut tar-Riċerka tal-Kanċer (ICR) (nisa ta '8-9 ġimgħat; Ċentru Nazzjonali tal-Annimali tal-Laboratorju, Taipei, Tajwan) ġew sagrifikati bl-użu ta' CO2 f'kaxxa magħluqa. Il-metodi kollha twettqu skont il-linji gwida u r-regolamenti rilevanti

Kultura batterjali.

C. acnes (ATCC 6919) ġie kkultivat fuq Reinforced Clostridium Medium (RCM, Oxford, Hampshire, England) taħt kundizzjonijiet anerobiċi bl-użu ta 'Gas-Pak (BD, Sparks, MD, USA). Il-batterji kienu kkultivati ​​f'37 grad sal-fażi tat-tkabbir logaritmiku. Il-gerbub tal-batterji nħasdu biċ-ċentrifugazzjoni f'5, 000 × g għal 10 min, maħsula f'salina buffered bil-fosfat (PBS), u mbagħad sospiżi f'PBS jew RCM għal aktar esperimenti.

Fermentazzjoni tal-batterji.

C. acnes (105 unità li tifforma kolonji (CFU)/mL) ġiet inkubata f'10 mL TSB fil-preżenza jew in-nuqqas ta' 2 fil-mija PF68 (BASF, NY, USA) taħt kundizzjonijiet anerobiċi bl-użu ta' Gas-Pak f'37 grad. PF68 waħdu f'TSB ġie inkluż bħala kontroll. Te 0.002 fil-mija (w/v) fenol aħmar (Sigma) f'TSB serva bħala indikatur tal-fermentazzjoni. Bidla tal-kulur minn aħmar-oranġjo għal isfar indikat l-okkorrenza ta 'fermentazzjoni batterjali, li ġiet skoperta minn densità ottika f'560 nm (OD560).

Analiżi tal-kromatografija tal-gass-spettrometrija tal-massa (GC–MS).

C. acnes (105 CFU/mL) ġie inkubat f'TSB (10 mL) fil-preżenza ta '2 fil-mija PF68. Wara 1-jum il-midja iffermentata ġiet ċentrifugata f'5000 g għal 10 min u s-supernatant intuża għall-iskoperta ta 'SCFAs bl-użu ta' protokoll ippubblikat qabel26. Il-livelli ta' aċidu aċetiku (AA), PA, aċidu butiriku (BA), u aċidu iso-butiriku (I-BA) fil-midja tal-fermentazzjoni ġew ikkwantifikati permezz ta' kurva ta' kalibrazzjoni magħmula minn sitt livelli mhux żero bl-użu tal-FFA Test Standard ( Restek Corporation, Bellefonte, PA, USA) li hija dilwita għal 500-, 1,000-, 2,000-, 5,000- u 10,000- darbiet.

Kultura taċ-ċelluli tal-melanoma B16F10.

Il-linja taċ-ċelluli tal-melanoma B16F10 ġiet ġentilment ipprovduta minn Dr Richard Gallo, Università ta 'California San Diego, USA, u Dr Cheng Ching-Yi, Chang Gung University of Science and Technology, Tajwan. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) supplimentat b'10 fil-mija serum bovin tal-fetu (FBS, Life Technologies) u 1 fil-mija Peniċillina-streptomycin (Life Technologies) f'37 grad u 5 fil-mija. CO2. Iċ-ċelloli tkabbru sa 70-80 fil-mija konfluwenza u mbagħad subkultivati ​​bl-aċidu Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic (EDTA, Life Technologies).

Reazzjoni tal-katina tal-polimerażi kwantitattiva ta' traskrizzjoni inversa (RT-qPCR).

RT-qPCR kien impjegat biex jistudja l-espressjoni tal-ġene tyrosinase fiċ-ċelloli tal-melanoma B16F10 ittrattati b'4 mM PA għal 48 siegħa. L-RNA ċellulari totali ġie estratt permezz ta’ Quick-RNA MiniPrep Kit (Zymo Research, CA, USA), segwit minn traskrizzjoni inversa għal cDNA bl-użu ta’ kit ta’ sinteżi ta’ cDNA iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) u amplifikat b’RT-qPCR f’ sistema ABI 7300 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Il-limitu taċ-ċiklu komparattiv (ΔΔCT) intuża biex jiddetermina l-kwantifikazzjoni tal-espressjoni tal-ġeni. Il-livell tal-ġene tal-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) intuża għan-normalizzazzjoni tal-ġene tyrosine kinase. Primer għal tyrosinase u GAPDH huma 5′-TGACAAAGCCAAAACCCCCA-3′ (quddiem); 5′-TTGTTCAAAAATACTTCCAGTGTGT-3′ (wara) u 5′-TGTGTCCGTCGRGGATCTGA-3′ (quddiem); 5′-GATGCCTGCTTCACCACCTT3′(reverse).

Attività tat-tyrosinase ċellulari wara t-twaqqigħ tal-ġene FFAR2.

Iċ-ċelloli tal-melanoma B16F10 ġew miżrugħa b'densità ta' 5 × 104 ċelluli/bir fi pjanċi ta' 24-bir. Barra minn hekk, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'antagonist selettiv FFAR2 GLPG0974 (0.1 µM, GLPG) u PA (4 mM) u inkubati f'37 grad f'5 fil-mija CO2 għal 24 siegħa. Iċ-ċelloli ġew trypsinized u lysed bil-buffer RIPA (Thermo Fisher Scientific, NJ, USA). Iċ-ċelloli lysed ġew iffriżati fi grad -80 u jinħallu darbtejn segwit minn ċentrifugazzjoni fi 12,000 rpm għal 10 min. Is-supernatant tħallat ma' 1 ug/mL ta' Levodopa (L-DOPA, Sigma) fi proporzjon ta' 2:1 fi pjanċa ta' 96-bir, inkubat f'temperatura tal-kamra (RT) għal siegħa u OD f'475 nm kien misjuba27.

għal xiex jintuża cistanche: inaqqas l-attività ta' tyrosinase

Tikkettar BrdU.

Ċelloli tal-melanoma B16F10 tkabbru fuq 8-slajds tal-kamra tal-bir (Thermo Fisher Scientific) f'DMEM b'10 fil-mija FBS, peniċillina, u streptomycin sakemm inkisbet konfluwenza ta' 70 fil-mija. Bromodeoxyuridine (10 μM, BrdU, ACROS, New Jersey, USA) ġie miżjud mal-midja tal-kultura flimkien ma '4 mM PA. BrdU miżjud ma 'PBS fil-midja tal-kultura kien inkluż bħala kontroll. Wara 24 siegħa, iċ-ċelloli ġew iffissati b'4 fil-mija perfluoro Roxy (PFA, Sigma) u mbagħad permeabilizzati b'0.2 fil-mija Triton X-100 (Sigma) għal 10 min. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'2 N HCl f'37 grad għal 25 min, newtralizzati b'HCl b'0.1 M buffer Borate (pH 8.5) għal 10 min, u mblukkati b'buffer imblukkar qabel inkubazzjoni anti-BrdU antikorp (Abcam, MA, USA) matul il-lejl u ħmar kontra l-mogħoż Alexa Fluor 568 IgG (H plus L) (teknoloġiji tal-ħajja) bħala t-tieni antikorpi għal siegħa f'4 gradi. In-nuklei ġew counterstained b'4,6-diamidino2-phenylindole (DAPI, Sigma). L-immaġini ġew akkwistati b'softwer cellSens imqabbad ma 'mikroskopju Olympus BX63.

Il-mudelli tal-ġurdien ġew maħluqa mill-espożizzjoni tad-dawl UV.

Mudelli tal-ġurdien kienu strumentali fl-avvanz tal-fehim tal-ħafna rwoli tal-UVR28. L-UVR iżid il-melanoċiti pożittivi għal DOPA fil-ġilda, speċifikament fis-sit tal-espożizzjoni29. Il-protokoll għat-trattament tal-injezzjoni ta 'C. acnes għall-widnejn tal-ġrieden ġie deskritt fl-istudju preċedenti tagħna3 (Din ir-referenza ma titkellimx dwar l-injezzjoni ta' C. acnes). Il-widnejn tal-ġrieden ICR ġew injettati intradermalment b'C. acnes (107 CFU) bi u mingħajr 2 fil-mija PF68 segwit minn espożizzjoni ultravjola B (UVB) ta' wavelength ta' 312 nm f'doża ta' 200 mg/cm2 bl-użu ta' lampa UV (Mudell EB{ {10}}C, Spectronics Corp., Westbury, NY, USA) għal 2 min kuljum għal 3 ijiem. Widnejn tal-ġrieden injettati b'PBS jew PF68 segwiti minn espożizzjoni UVB ġew inklużi bħala kontroll. Fi grupp ieħor ta 'ġrieden ta' esperiment, il-widnejn ġew applikati b'4 mM PA segwiti minn espożizzjoni għall-UV, b'PBS bħala kontroll.

Sajlenser tal-ġeni medjat minn siRNA ta' FFAR2.

Sabiex isikket il-ġene FFAR2, użajna s-siRNA modifikat kimikament li jimmira r-riċettur FFAR2 (FFAR2 siRNA), il-kontroll negattiv siRNA (NC siRNA), u l-kontroll mingħajr injezzjoni (C), li nkisbu minn GenePharma Co. (Shanghai, iċ-Ċina). Is-sekwenzi oligonukleotidi tagħhom huma siFFAR2: sens strand, 5′-CCGGUGCAGUACAAGUUAUTT-3′; fergħa kontra s-sens, 5′-AUAACUUGUACUGCACCGGTT-3′. kontroll: sens strand, 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′; fergħa kontra s-sens, 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′. Dawn is-siRNAs modifikati kimikament ġew mogħtija kuljum għal 3 ijiem permezz ta 'injezzjoni intradermali fil-widnejn tal-ġrieden bl-użu ta' microneedle (2 mg/kg ta 'piż tal-ġrieden). Mit-tieni jum, applika b'2 fil-mija PA u espożizzjoni UV għal 3 ijiem. It-trattament minn qabel għall-injezzjoni ta' siRNA lill-ġurdien kif deskritt f'referenza30. Għaxar, il-widnejn tal-ġrieden ġew imneħħija u mtebbgħin fir-raba 'jum.

Western blotting.

Il-widnejn tal-ġrieden ġew injettati b'FFAR2 modifikat kimikament u siRNAs ta 'kontroll segwiti b'applikazzjoni b'espożizzjoni ta' 2 fil-mija PA u UVB għal 3 ijiem. Fit-tielet jum il-widnejn tal-ġrieden ġew maqtugħa, omoġenizzati, u mbagħad lysed b'RIPA buffer (Thermo Fisher Scientific). Lisati taċ-ċelluli (30 µg) ġew soġġetti għal ġel SDS-PAGE ta’ 10 fil-mija, li mbagħad ġie trasferit għal membrana ta’ poly(vinylidene fluoride) (PVDF) (Sigma) u mblukkata b’5 fil-mija (w/v) ħalib bla xaħam qabel l-inkubazzjoni matul il-lejl b’ antikorpi primarji għal FFAR2 Rabbit PolyAb (Proteintech, Rosemont, IL, USA) f'4 grad jew -actin (1:1,000; Cusabio Technology, Houston, TX, USA). Dan kien segwit minn trattament b'antikorp sekondarju tal-mogħoż kontra l-fenek konjugat ma' horseradish peroxidase (1:5000) (Thermo Fisher Scientific) għal siegħa. Il-meded tal-proteini ġew skoperti b'reaġent ta 'skoperta kimiluminixxenti (Thermo Fisher Scientific) u Omega Lum C Imaging System (Gel Co., San Francisco, CA, USA). Il-meded tal-proteini saru bl-użu ta 'softwer ImageJ.

Għadd tal-melanoċiti.

Il-qarquċa mill-ġurdien tneħħew manwalment u t-tessuti tal-ġilda kienu mxarrba f'soluzzjoni ta 'ammonju thiocyanate (Sigma) f'37 grad għal 20 min. Is-saffi epidermali u bażali ġew imqaxxra mill-bqija tat-tessut tal-ġilda, u l-melanoċiti ġew imtebba billi tgħaddas f'0.1 M PBS (pH 7.2) li kien fih 0.14 fil-mija L-DOPA f'RT għal 3 sigħat u l-għadd tal-melanoċiti fit-tessuti tal-ġilda ġie determinat mikroskopikament skont protokoll ippubblikat qabel29.

Analiżi statistiċi.

L-analiżi tad-dejta saret permezz tat-test t mhux imqabbad bl-użu tas-software Prism Il-livelli Te ta’ sinifikat statistiku ġew indikati kif ġej: *P<0.05,><0.01,><0.001, and="" ns="non-significant." the="" mean±standard="" deviation="" (sd)="" for="" at="" least="" three="" independent="" experiments="" except="" for="" two="" independent="" western="" blotting="" analyses="" for="" fig.="" 4c="" was="" displayed.="" animal="" experiments="" were="" performed="" with="" at="" least="" three="" animals="" per="" treatment="">

cistanche tubolosa

Riżultati

C. acnes jinduċi fermentazzjoni ta 'PF68.

Studji preċedenti wrew il-fermentazzjoni tal-probijotiċi tal-ġilda għall-induzzjoni tal-produzzjoni ta 'SCFA fil-preżenza ta' komposti bħala sors tal-karbonju26. Biex tinvestiga jekk C. acnes setax jiffermenta PF68, C. acnes ġie inkubat b'PF68 f'TSB media għal ġurnata b'fenol aħmar bħala indikatur biex tissorvelja l-fermentazzjoni batterjali. Fil-midja TSB inkubata b'batterji biss, l-aħmar fenol inbidel minn aħmar għal oranġjo minħabba replikazzjoni batterjali, filwaqt li fil-midja TSB li fihom batterji u PF68, il-kulur aħmar fenol inbidel għal isfar ċar bi tnaqqis fil-pH li jindika l-użu ta 'PF68 bħala sors tal-karbonju għall-fermentazzjoni (Fig. 1A). Barra minn hekk, l-OD560 tal-fenol aħmar wera tnaqqis sinifikanti fil-valur tal-pH fil-midja TSB li fihom batterji u PF68 (Fig. 1B) meta mqabbla ma 'batterji jew PF68 waħdu. Te SCFAs li jinsabu fil-ferment ta 'C. acnes kkultivati ​​b'PF68 ġew identifikati permezz ta' analiżi GC-MS (Fig. 1C) u nstabu li kienu AA, PA, BA, u aċidu I-BA, b'PA11 li għandu l-ogħla konċentrazzjoni (Fig. 1D). ).

Figura 1. Il-fermentazzjoni batterjali bil-polimer kienet akkumpanjata minn tnaqqis fil-pH intraċellulari.

Effett in vitro tal-PA fuq il-produzzjoni tal-melanin permezz tal-PA-FFAR2.

Fatty acids modulate the degradation of tyrosinase, a crucial enzyme involved in melanin biosynthesis in melanocytes and melanoma cells31. Therefore, to detect the in vitro effect of PA on melanin synthesis, B16F10 melanoma cells were treated with 4 mM PA for 48 h, with the decreased expression of the tyrosinase in PA treated melanoma cells compared to the control (Fig. 2A). The immunostaining of PA-treated melanoma cells after BrdU labeling showed that PA did not alter the proliferation of melanoma cells (Fig. 2B). Furthermore, the effect of PA and AA, two highly expressed SCFAs in the fermentation filtrate (Fig. 1D)32, on melanin production was assessed in melanoma cells, with PA causing a>tnaqqis doppju fil-produzzjoni tal-melanin meta mqabbel ma 'AA (Fig. 2C). L-SCFAs, bħall-PA u l-AA, jirregolaw il-funzjonijiet tagħhom permezz ta 'interazzjoni ma' FFAR2 u FFAR3, bil-PA tkun fost l-aktar SCFA qawwija għal dawn iż-żewġ riċetturi33. Meta wieħed iqis ir-regolamentazzjoni tal-PA permezz tal-interazzjoni tagħha ma 'FFAR2, l-imblukkar tas-sinjalar ta' dan ir-riċettur bl-użu ta 'inibitur selettiv jista' jkun approċċ utli biex jiġi evalwat ir-rwol tal-PA fir-regolamentazzjoni tal-melanoġenesi. L-attività tat-tyrosinase ċellulari ma nbidlitx billi timblokka FFAR2 bl-użu tal-antagonist selettiv FFAR2 GLPG qabel it-trattament b'PA u naqset mingħajr GLPG b'kuntrast mal-grupp ta' kontroll (Fig. 2D). Dawn ir-riżultati wrew ir-rwol effettiv ta 'PA-FFAR2 fl-attenwazzjoni tal-kontenut ta' melanin billi jinibixxi l-attività ta 'tyrosinase kinase fiċ-ċelloli tal-melanoma bi proliferazzjoni taċ-ċelluli mhux mibdula.

Figura 2. L-effetti ta 'l-espressjoni tal-ġeni tat-tyrosinase u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli fiċ-ċelloli tal-melanoma wara t-trattament ta' PA.

It-taħlita ta 'C. acnes u PF68 inibbet melanoċiti li jiffunzjonaw indotti mill-UVB fil-widnejn tal-ġrieden.

L-applikazzjoni topika ta 'estratti ta' fermentazzjoni jew aċidi grassi intweriet li tnaqqas l-iperpigmentazzjoni tal-ġilda indotta mill-UV billi tirregola d-degradazzjoni ta 'tyrosinase34,35. Studji preċedenti wrew li l-melanoġenesi wara l-espożizzjoni UV hija dovuta għall-attivazzjoni ta 'melanoċiti li jaħdmu fl-epidermide jew id-dermis36. Wara li stabbilixxa li PA bħala SCFA maġġuri mill-fermentazzjoni ta 'C. acnes ta' PF68 jista 'effettivament inaqqas il-produzzjoni ta' melanin in vitro, aħna mbagħad eżaminajna l-effett ta 'C. acnes flimkien ma' PF68 fuqha in vivo. Il-widnejn tal-ġrieden ICR ġew esposti għall-UVB kull jum ieħor għal 3 ijiem fl-istess ħin mal-injezzjoni ta 'C. acnes u PF68. Injezzjoni b'PBS jew C. acnes jew PF68 waħdu kienu inklużi bħala kontrolli. Is-saffi epidermali u bażali ġew imqaxxra mit-tessut tal-ġilda fil-widna tal-ġurdien u l-melanoċiti kienu mtebbgħin b'L-DOPA. Kien hemm żieda sinifikanti fin-numru tal-melanoċiti wara l-espożizzjoni UVB, bl-ebda bidla wara injezzjoni b'C. acnes jew PF68 waħdu. Madankollu, ġie skopert tnaqqis sinifikanti fin-numru ta 'melanoċiti pożittivi għal DOPA fil-gruppi ta' espożizzjoni UVB wara trattament b'taħlita ta 'C. acnes u PF68 (Fig. 3A).

Figura 3. Induzzjoni ta 'melanoċiti mill-UVB u inibizzjoni minn trattamenti differenti.

Titjib tal-melanocyte li jaħdem indott mill-UVB fil-widna tal-ġurdien minn PA, metabolit tal-fermentazzjoni ta 'C. acnes.

L-effett tal-applikazzjoni diretta tal-PA fuq il-melanoġenesi indotta mill-UV ġie vvalutat. L-iperpigmentazzjoni indotta mill-UV u l-espressjoni tat-tyrosinase fil-ġilda tal-widna tal-ġurdien fil-grupp ta 'kontroll tbaxxew b'mod sinifikanti wara l-applikazzjoni topika ta' PA għal 3 ijiem (Fig. 3B). Tus, PA, metabolit mill-fermentazzjoni PF68 ta 'C. acnes jinibixxi l-produzzjoni ta' melanocytes li jiffunzjonaw b'sintesi ta 'melanin permezz ta' UVB indotta. L-espressjoni tat-tyrosinase naqset b'mod notevoli fiċ-ċelloli ttrattati b'PA meta mqabbla mal-kontroll (Fig. 3C).

PA jinibixxi melanoċiti li jiffunzjonaw indotti mill-UVB permezz ta' FFAR2 in vivo.

Biex jiġi ddeterminat jekk it-tnaqqis fil-melanoġenesi eżoġena seħħx permezz ta 'interazzjoni PA mar-riċettur kognat tiegħu, FFAR2 ġie knocked down fil-melanoċiti tal-ġilda tal-widna tal-ġurdien, segwit minn espożizzjoni UVB u trattament PA. UVB indotta żieda fil-proliferazzjoni ta 'melanocytes u l-attività tyrosinase tnaqqset b'mod sinifikanti fl-epidermide tal-widna tal-ġurdien injettat b'NC siRNA wara l-applikazzjoni ta' PA (Fig. 4A, B). Madankollu, in-numru ta 'melanoċiti u attività tyrosinase jibqa' mhux mibdul anke wara l-applikazzjoni PA fl-epidermide tal-widna tal-ġurdien irradjata UVB imwaqqfa b'FFAR2. Aħna kkonfermajna l-knockdown tal-ġene FFAR2 billi tkejjel il-livell ta 'espressjoni tal-proteina ta' FFAR2 permezz ta 'analiżi Western blot (Fig. 4C). Għalhekk, PA jinterferixxi mal-melanoġenesi billi jrażżan l-attività ta 'tyrosinase, li fiha PA-FFAR2 għandu rwol potenzjali fil-produzzjoni tal-melanin.

estratt ta' cistanche tubolosa

Diskussjoni

Il-melanin, fattur kritiku tad-difiża tal-ġilda kontra l-irradjazzjoni UV, huwa sintetizzat fil-melanosomi tal-melanoċiti, trasferit għal keratinoċiti ġirien permezz tat-truf dendritiċi, u eventwalment imqassam madwar l-epidermide tal-ġilda37. Il-metaboliti tal-fermentazzjoni tal-batterji jintużaw dejjem aktar fit-terapija tal-ġilda minħabba l-effett ta 'benefiċċju tagħhom fuq infjammazzjoni tal-ġilda kkaġunata mill-UV u disturbi infettivi3. F'dan l-istudju, aħna wrejna li PA, il-metabolit ewlieni mill-fermentazzjoni PF68 ta 'C. acnes, naqqas il-livelli ta' melanocyte li jiffunzjonaw indotti mill-UVB billi jinibixxi l-attività ta 'tyrosinase in vitro u in vivo permezz ta' FFAR2.

Studji preċedenti wrew l-inibizzjoni tal-melanoġenesi permezz tal-inibizzjoni tat-tyrosinase minn metaboliti tal-fermentazzjoni minn batterji LA probijotiċi u Lactobacillus24,38,39. Ukoll, il-polimeru bbażat fuq PEG ta 'piż molekulari għoli (~20,000) ġie kompletament degradat permezz tal-fermentazzjoni minn batterji gram-negattivi li jipproduċu aċetat u propionate40. F'dan l-istudju, PA (~ 4 mM) kien l-aktar SCFA abbundanti fil-filtrat mill-fermentazzjoni PF68 ta 'C. acnes u naqqas il-kontenut ta' melanin fil-melanoċiti b'mod aktar effettiv minn AA. Barra minn hekk, it-trattament b'4 mM PA inibixxi b'mod sinifikanti l-attività tat-tyrosinase ċellulari f'melanoċiti li jipprova li l-inibizzjoni tal-melanoġenesi minn PA seħħet permezz tat-tnaqqis tal-espressjoni tal-ġeni tat-tyrosinase. In-nies għandhom l-istess numru ta 'melanoċiti li mhix ir-raġuni li taffettwa l-pigmentazzjoni tal-ġilda iżda l-attivazzjoni ta' melanoċiti li jaħdmu bl-irradjazzjoni UV36,41. Hawnhekk, trattament ta '4 mM PA ma biddilx il-proliferazzjoni tal-melanoċiti, li jindika li hija għażla ta' trattament effettiva, li ma tikkawża l-ebda ħsara ċellulari. In-numru mnaqqas ta' melanoċiti u l-attività ta' tyrosinase kienu osservati wkoll f'tessut tal-ġilda tal-widna tal-ġrieden injettat b'taħlita ta' C. acnes u PF68, li juri li l-inibizzjoni tal-melanoġenesi x'aktarx tkun medjata permezz ta' metaboliti tal-fermentazzjoni mill-fermentazzjoni ta' C. acnes bl-użu ta' PF68 bħala karbonju. sors. Barra minn hekk, l-istudju tagħna ivvalida l-PA bħala aġent antimikrobiku eċċellenti, mingħajr ebda tibdil fit-tkabbir tal-batterja ġenitur tiegħu C. acnes, li juri PA bħala metabolit qawwi li ma jfixkilx il-bilanċ tal-mikrobijoma tal-ġilda11.

Il-produzzjoni ta 'melanin hija mibdija u regolata minn diversi sistemi ta' sinjalar, fejn tyrosinase jikkatalizza l-konverżjoni ta 'tyrosine għal DOPA, u f'dopaquinone, li jwassal għall-formazzjoni ta' pigmenti melanoċitiċi42,43. Fil-biċċa l-kbira tal-każijiet, ir-reaġenti għat-tħaffif tal-ġilda jaġixxu f'diversi livelli ta 'produzzjoni ta' melanin permezz ta 'FFAR2 biex jaffettwaw l-attività ta' tyrosinase jew jimmiraw direttament lejn tyrosinase biex jinibixxu l-melanoġenesi fil-ġilda44-46. SCFAs bħal PA u AA jeżerċitaw l-effetti tagħhom billi jorbtu mar-riċetturi simili selettivi tagħhom bħal FFAR2 jew FFAR3, bil-PA tkun fost l-aktar SCFA qawwija għaż-żewġ riċetturi47. GLPG, antagonist selettiv ta 'FFAR2, u sajlenser tal-ġeni medjat minn siRNA ta' FFAR2 biex jappoġġja l-imblukkar ta 'FFAR23,48. Fl-istudju attwali, in-numru miżjud tal-melanocytes u l-espressjoni tal-ġeni tyrosinase fit-tessut tal-ġilda tal-widnejn tal-ġrieden ma nbidlitx b'reazzjoni għar-radjazzjoni UVB anke wara applikazzjoni PA għal knockdown FFAR2 fil-ġrieden (Fig. 4A). Barra minn hekk, l-espressjoni tal-ġeni tyrosinase naqset wara trattament PA in vitro, madankollu, l-imblukkar tal-ġene FFAR2 b'GLPG, antagonist selettiv ta 'FFAR2, tjiebet l-effett ta' PA biex ittaffi l-espressjoni tal-ġene tyrosinase. Wara li jimblokka FFAR2, it-telf ta 'FFAR2 jirriżulta f'espressjoni mtejba ta' attività ta 'tyrosinase wara trattament PA. Għalkemm kemm PA kif ukoll AA, il-metaboliti tal-fermentazzjoni minn C. acnes, għandhom affinità simili għall-irbit ta 'FFAR220, l-effikaċja relattivament aktar baxxa ta' AA fl-attenwazzjoni tal-attività ta 'tyrosinase fil-melanoċiti tivvalida l-potenzjal terapewtiku ta' PA bħala postbijotiku kontra melanoġenesi.

L-effetti ta 'ħsara tar-ritratti kkawżati mill-UVR fuq il-ġilda ġibdu attenzjoni estensiva. Prodotti għall-iskrinjar tax-xemx u kontra l-iperpigmentazzjoni huma użati ħafna iżda s-sigurtà, il-penetrazzjoni tal-ġilda u l-effikaċja terapewtika tagħhom għadhom fid-dubju49. Għalkemm avobenzone huwa komponent komuni fil-ħarsien mix-xemx minħabba l-effikaċja għolja tiegħu kontra l-UV, huwa foto instabbli u għalhekk mhux sikur, u ġie skopert fid-demm wara applikazzjonijiet kroniċi50,51. L-iżvilupp ta 'tibjid effettiv tal-ġilda permezz tal-imblukkar tal-espressjoni tat-tyrosinase minn metaboliti tal-fermentazzjoni minn batterji jew polimeri probijotiċi bħala sors tal-karbonju huwa mod effettiv u naturali biex trażżan il-melanoġenesi38,39. Peress li l-użu ta 'probijotiċi ħajjin għall-kożmetiċi huwa regolat b'mod strett, il-promozzjoni tal-effetti ta' benefiċċju tagħhom permezz ta 'metaboliti ta' fermentazzjoni minn batterji probijotiċi ħajjin saret applikazzjoni fattibbli. Barra minn hekk, PF68 bħala prebijotiku jista 'jsaħħaħ il-produzzjoni ta' SCFAs mill-fermentazzjoni ta 'C. acnes u ntuża biex itejjeb l-istabbiltà bijoloġika u jassisti diversi aġenti terapewtiċi bħal mikrosferi mgħobbija 6-mercaptopurine fl-interazzjoni tagħhom mal-ġisem tal-bniedem52. Barra minn hekk, PF68 jista 'jiġi inkorporat fil-membrani taċ-ċelluli u jittrasloka f'ċelloli u ġie użat bħala trasportatur tal-ġel stabbli għal aġenti antimikrobiċi, u jżid is-solubilità tal-wiċċ tal-mediċina fit-trattament tal-ġilda12,23. Għalhekk, PF68 ġie kkunsidrat bħala għażla sigura u effettiva għall-iżvilupp ta 'farmaċewtiċi u kożmetiċi. Minbarra l-funzjoni ta 'PF68 bħala inizjatur tal-fermentazzjoni biex iżid l-attività ta' fermentazzjoni ta 'C. acnes, għandu wkoll il-potenzjal li jkun aġġuvant biex inaqqas id-dożi effettivi ta' reaġenti tal-mediċina u jtejjeb is-solubilità ta 'drogi li jinħall f'ilma fqir.

B'mod ġenerali, dawn ir-riżultati juru li l-interazzjoni PA-FFAR2 tista 'tkun mekkaniżmu ċentrali fl-effett ta' probijotiċi jew postbijotiċi fuq iperpigmentazzjoni kkawżata minn UVR. It-trattament tal-PA ma affettwax il-proliferazzjoni tal-melanoċiti. Meta mqabbla mat-terapiji kimiċi, il-metaboliti tal-probijotiċi huma aktar ħfief u naturali53. Għalkemm il-mekkaniżmu eżatt li bih il-metaboliti tal-fermentazzjoni PF68 ta 'C. acnes jinibixxu l-melanoġenesi mhuwiex ċar, l-evidenza mill-istudju preżenti tissuġġerixxi l-involviment tal-mogħdija SCFAs-FFAR2-tyrosinase. Dawn ir-riżultati huma ta 'benefiċċju għat-trattament kliniku futur ta' disturbi tal-pigmentazzjoni u għall-iżvilupp ta 'kożmetiċi li jżidu l-firxa ta' applikazzjonijiet ta 'prodotti li jbajdu. Fl-aħħar nett, id-diversità tal-probijotiċi toffri trattamenti personalizzati għall-iperpigmentazzjoni u l-iżvilupp ta 'prodotti ddedikati b'rendiment ogħla.

Benefiċċji ta 'estratt ta' cistanche: jbajdu l-ġilda