Kapitolu 5 Bidliet fl-attività tal-enzimi waqt il-fermentazzjoni tal-enzimi

Kapitolu 5 Bidliet fl-attività tal-enzimi waqt il-fermentazzjoni tal-enzimi

 

Protease, lipase uSuperoxide dismutase (SOD)huma l-enzimi funzjonali ewlenin ta 'Ikel tas-Saħħa tal-Enżima Mikrobjali- Fost dawn,proteasegħandu rwol fihIl-promozzjoni tal-idroliżi tal-proteina fl-ikelfil-ġisem tal-bniedem. Barra minn hekk, jista 'wkoll jiddekomponi xi ċelloli li jmutu, ineħħi l-ħmieġ fuq il-wiċċ tal-ġilda u l-pori, u jkollu rwol fl-tqaxxir, u għalhekk jintuża ħafna fil-prodotti tal-banju. Lipase taġixxi fuq ir-rabta ester bejn l-aċidi grassi u l-gliċerol, u s-sottostrat tal-idroliżi huwa ġeneralment żjut naturali. Għalhekk, jidher f'ħafna ikel ta 'telf ta' piż u prodotti tas-saħħa. Ħafna nisa huma estremament imħassba dwar is-suġġett ta 'telf ta' piż, u huwa għalhekk li l-enzimi malajr saru popolari madwar id-dinja.L-enżimi huma sinjuri fil-lipase, li jfisser li għandhom valur għoli ta 'riċerka u prospetti ta' applikazzjoni.Sodhija enzima speċjali tal-metall li tikkatalizza r-reazzjoni ta 'diskussjoni ta'Radikali ta 'l-anjoni tas-superossidu, b'hekktneħħija ta 'radikali ta' l-anjoni tas-superossidufil-ġisem. Huwa ostaklu protettiv għall-organiżmi, u għalhekk jintuża ħafna fil-qasam mediku.
Dan il-kapitolu jieħu l-enzima tat-tuffieħ bħala eżempju. Tibda mill - istadju inizjali tal-fermentazzjoni,attivitajiet ta 'superoxide dismutase, amylase, lipase, protease u cellulase fil-grupp sperimentali u l-grupp ta 'kontroll ġew imkejla kull 15-il jum biex jirriflettu b'mod komprensiv u sistematiku t-tendenza li qed tinbidel ta' attività ta 'enzimi matul il-proċess kollu ta' fermentazzjoni.

Ħwawar ġodda Cistanche

Ikklikkja biex tikseb aktar dettalji

 

Servizz ta 'appoġġ ta' Wecistanche-L-akbar esportatur ta 'Cistanche fiċ-Ċina:
Email: wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp / Tel: +86 15292862950

 

 

 

 

 

 

5.1 Materjali u Metodi

5.1.1 Materjali

(1) Materjali sperimentali

Aħsel tuffieħ frisk b'ilma sterili f'kundizzjonijiet sterili, nixxefhom b'mod naturali fuq mejda operattiva sterili, qaxxarhom, u aqta'hom għal użu aktar tard. Żid iz-zokkor abjad u t-tuffieħ ma 'vażett tal-ħġieġ sterilizzat fi proporzjon tal-massa ta' 1: 1. Attiva l-batterja meħtieġa għall-esperiment u tlaqqamhom fl-enzima skont l-iskema ottima (din il-pass ta 'operazzjoni titħalla barra għall-grupp ta' kontroll), tissiġillaha u poġġih f'post frisk u niexef. Wara 3 xhur ta 'fermentazzjoni tat-temperatura tal-kamra, ħu kampjun biex tikseb il-likwidu tal-enzima kollu li jkun fih il-polpa u ffiltrah. Ħu s-supernatant bħala l-kampjun sperimentali. Wara li l-kampjun jiġi ċċentrifikat f'10, 000 RPM għal 15-il minuta f'ċentrifuga b'veloċità għolja, huwa użat biex jitkejjel id-dejta rilevanti. Ta 'min jinnota li fil-proċess li jsiru enzimi, sabiex tiġi evitata kontaminazzjoni bla bżonn, l-operazzjonijiet kollha tagħna saru f'kundizzjonijiet sterili.

(2) Strumenti ewlenin
L-istrumenti meħtieġa għall-esperiment huma l-istess bħal 3.1.1 (2).

 

5.1.2 Metodi

(1) Determinazzjoni ta 'attività ta' superoxide dismutase (SOD) [66]
Is-soluzzjoni tal-pyrogallol ġiet imsaħħna minn qabel f'banju tal-ilma tat-temperatura kostanti ta '25 grad għal perjodu ta 'żmien. Skond it-Tabella 5.1, ammont xieraq ta 'buffer, ilma distillat u l-istess volum ta' aċidu idrokloriku jew soluzzjoni ta 'pyrogallol ġew miżjuda mat-tubu tat-test. Il-banju tal-ilma tat-temperatura kostanti ġie ssettjat għal 25 grad għal 2 0 min. Wara li l-likwidu mħallat malajr jitħawwad, ġie injettat immedjatament fil-cuvette. Il-valur ta 'assorbenza A0 tal-kampjun ġie mkejjel kull 30 sekonda f'tul ta' mewġa ta '325nm bl-użu ta' spettrofotometru.

Tab.5.1 Żid l-ammont tar-reaġent tal-benżin bi tliet fenol li jmissu

 

Il-metodu għad-determinazzjoni tal-attività SOD huwa bażikament l-istess bħall-operazzjoni ta 'hawn fuq. L-unika differenza hija li qabel ma żżid pyrogallol, {{0}}. 5 ml ta 'soluzzjoni ta' kampjun ta 'enzima ta' konċentrazzjonijiet differenti jeħtieġ li jiżdiedu l-ewwel. Fl-istess ħin, huwa miżjud l-istess volum ta 'ilma distillat. L-assorbenza mkejla hija ASOD. Ir-rata ta 'inibizzjoni u l-attività ta' l-enzima SOD huma kkalkulati skond il-Formula 5.1 u l-Formula 5.2: Rata ta 'Inibizzjoni (%)=(△ a 0-} △ Asod) / △ A {0} × 100 (5.1 (5.1) attività ta' l-enzimi (u / ml)=rata ta 'inibizzjoni V1 / V2 × N (5.2) Fejn: V1 huwa l-volum totali tas-soluzzjoni, ML; V2 huwa l-volum tas-soluzzjoni tal-kampjun tal-enzima, ML; △ A0 hija r-rata ta 'ossidazzjoni awtomatika ta' pyrogallol; △ ASOD hija r-rata tal-bidla tal-valur tal-assorbenza tal-kampjun; n hija d-dilwizzjoni multipla (2) Determinazzjoni tal-attività tal-amylase Dan l-istudju uża l-metodu kolorimetriku tal-lamtu tal-jodju biex tiddetermina l-attività tal-amilasi. Il-passi ta 'operazzjoni speċifiċi jirreferu għall- "Proċedura Nazzjonali ta' Operazzjoni tal-Laboratorju Kliniku" [67]. Huwa prinċipalment maqsum fiż-żewġ punti li ġejjin:

 

① Preparazzjoni tas-soluzzjoni
Soluzzjoni tal-lamtu buffered ({{0}}. 4g / l): iżen preċiż 9g ta 'sodju chloride, 22.6g ta' fosfat ta 'idroġenu anidruż tad-diżodju, u 12.5g ta' potassju anidruż dihydrogen fosfat, jinħalluhom f'5 0}} ta 'ilma distillat, u saħħan sakemm is-soluzzjoni tagħli; Iżen b'mod preċiż 0.4g ta 'lamtu li jinħall, ħollha f'10ml ta' ilma distillat, ħawwad b'mod uniformi, u aġġusta għal pejst; Injetta s-soluzzjoni tal-lamtu aġġustata għal pejst fis-soluzzjoni tat-togħlija ta 'hawn fuq, u aħsel il-bekk ripetutament sakemm il-lamtu jiġi trasferit kompletament għas-soluzzjoni tal-ilma jagħli. Wara li tħawwad indaqs ma 'virga tal-ħġieġ, kessaħ it-temperatura tal-kamra, żid 5ml ta' 37% soluzzjoni ta 'formaldehyde tax-xagħar, u dilwit għal 1L b'ilma distillat. Il-valur tal-pH tas-soluzzjoni huwa 7.0 ± 0.1, u jitqiegħed fil-friġġ għall-użu.
Soluzzjoni tal-istokk tal-jodju (0. 1 mol / l): iżen b'mod preċiż 1.7835g jodat tal-potassju u 22.5g jodur tal-potassju f'500ml nadif
Beaker, żid bil-mod u indaqs 4.5ml aċidu idrokloriku kkonċentrat, ħawwad kontinwament matul il-proċess ta 'żieda, iddilwixxi mal-iskala b'ilma distillat, u ħawwad indaqs. Poġġiha fil-friġġ għall-użu u aħżinha fi flixkun tar-reaġent kannella.
Soluzzjoni tal-Applikazzjoni tal-Jodin ({{0}}. 01mol / l): Ħu ċertu ammont ta 'soluzzjoni tal-istokk tal-jodju (0.1 mol / l), iddilwixxiha 10 darbiet b'ilma distillat, poġġiha fil-friġġ għall-użu, u aħżenha sa xahar.

② Passi ta 'Operazzjoni Esperimentali
Ħu s-soluzzjoni tal-enzima u ħallatha 10 darbiet bil-melħ fiżjoloġiku, u topera skont it-Tabella 5.2. Ħallat sew, it-tul ta 'mewġa ta' l-ispettrofotometru huwa 660nm, u l-passaġġ ħafif tat-tazza kolorimetrika huwa ta '10mm. Żero b'ilma distillat u aqra l-assorbenza ta 'kull tubu. Ikkalkula l-attività tal-amilasi bbażata fuq il-formula tal-kalkolu bażiku 5.3.

 

Tab.5.2 Passi ta 'Operazzjoni ta' Determinazzjoni ta 'Amilase

 

(3) Determinazzjoni tal-attività tal-lipase

Il-metodu ta 'determinazzjoni sar skond QB / T {{{0}} [68]. Soluzzjoni tat-test ta '2% ta' enzima ġiet ippreparata b '0. {0 25 mol / L buffer tal-fosfat (pH 7.5), il-fenolphtalein intuża bħala indikatur, u l-aċidi grassi ġew titrati b'soluzzjoni standard ta' idrossidu tas-sodju. L-attività tal-lipase ġiet ikkalkulata abbażi tal-volum ta 'idrossidu tas-sodju kkunsmat fl-esperiment. Ir-regola hija: f'pH ta '7.5 u temperatura ambjentali ta' 40 grad, 1 ml ta 'soluzzjoni ta' enzima likwida idrolizza lipase għal 1 min biex tipproduċi 1 μmol ta 'aċidu xaħmi, li hija unità ta' attività lipase waħda, espressa bħala U / ml. Imbagħad, l-attività tal-lipase ġiet ikkalkulata skont il-Formula 5.4: attività tal-enzima (u / ml)=(BA) × C / 0.05 × 50 × 1/15 × N {{= 200 / 3 × (BA) × C × N (5.4) fejn: b huwa l-volum ta 'sodju ta' soluzzjoni ta 'sodju ta' l-idrossidi. A huwa l-volum ta 'soluzzjoni standard ta' idrossidu tas-sodju kkunsmat fil-grupp ta 'kontroll vojt, ML; C hija l-konċentrazzjoni ta 'soluzzjoni standard ta' idrossidu tas-sodju, mol / L; 0.05 huwa l-fattur ta 'konverżjoni tal-konċentrazzjoni ta' soluzzjoni standard ta 'idrossidu tas-sodju; 50 huwa l-kontenut ta 'aċidu xaħmi ta' soluzzjoni ta 'idrossidu tas-sodju; 15 min huwa l-ħin tar-reazzjoni; n hija d-dilwizzjoni multipla.

(4) Determinazzjoni tal-attività tal-protease

Irreferi għal GB / T 23527-2009 [69] b'modifikazzjonijiet ħfief.
① Preparazzjoni ta 'kurva standard
Ħu 1ml ta 'soluzzjoni standard tat-tyrosine b'konċentrazzjonijiet ta' massa differenti, li huma 0, 1 0, 20, 30, 40, u 50mg / l, u żid 5ml ta '0.4mol / L soluzzjoni tal-karbonat tas-sodju u 1ml ta' reagent ta 'folin soluzzjoni għaliha. Irreaġixxi għal 20 minuta f'temperatura ta '40 grad. Wara li r-reazzjoni tkun kompluta, neħħi s-soluzzjoni ta 'reazzjoni u kejjel il-valur ta' assorbenza tas-soluzzjoni f'tul ta 'mewġa ta' 680nm bl-użu ta 'spettrofotometru. Pinġi kurva standard tat-tyrosine b'konċentrazzjoni tat-tyrosine bħala l-assi orizzontali u l-valur ta 'assorbenza bħala l-assi vertikali.

Herbs ġodda cistanche b'qawwa anti-ossidanti qawwija

② Determinazzjoni tal-attività tal-protease
Grupp Esperimentali: Ħu 1ml ta 'soluzzjoni tal-kaseina b'konċentrazzjoni ta' 10 g / L u ħawwadha b'mod uniformi ma '1ml tas-soluzzjoni tal-kampjun li għandha tiġi ttestjata, u tirreaġixxi għal 10min f'temperatura ambjentali ta' 40 grad; Iffiltra u akkwista l-filtrat wara l-wieqfa, ħu 1ml tal-filtrat, 5ml ta 'soluzzjoni tal-karbonat tas-sodju u 1ml ta' reaġent folin, ħawwad indaqs, u tirreaġixxi għal 20min f'temperatura ambjentali ta '40 grad; Uża spettrofotometru biex tkejjel il-valur ta 'assorbenza tas-soluzzjoni f'tul ta' mewġa ta '680nm.
Grupp ta 'kontroll vojt: Ħu 1ml tas-soluzzjoni tal-kampjun biex tiġi ttestjata, żid l-aċidu trikloroaċetiku, tirreaġixxi bis-sħiħ biex tattiva l-protease, u metodi oħra ta' tħaddim huma l-istess bħall-grupp sperimentali.

Ikkalkula l-attività tal-protease skont il-Formula 5.5:
Attività Protease (u / ml)=AK × 4/10 (5.5) fejn: A hija l-assorbenza tas-soluzzjoni tal-enzima fil-grupp sperimentali; K huwa l-ammont ta 'tirosina meta l-assorbenza tkun daqs 1; 4 huwa l-volum totali tas-soluzzjoni ta 'reazzjoni, ML; 10 huwa l-ħin tar-reazzjoni, min.

(5) Determinazzjoni tal-attività taċ-ċellulasi [70]

L-attività taċ-ċellulasi fl-enzimi hija ġeneralment espressa mill-ammont ta 'glukosju rilaxxat minn ċertu ammont ta' soluzzjoni ta 'enzima għal kull unità ta' ħin. Il-prinċipju tal-użu tal-metodu tal-karta tal-filtru biex titkejjel l-attività taċ-ċellulasi huwa li ċ-ċellulasi tista 'tiddekomponi ċ-ċelluloża fil-karta tal-filtru biex tipproduċi metaboliti sekondarji bħal glukosju, u l-glukosju jista' jirreaġixxi ma '3, 5- aċidu dinitrosaliċiliku biex jifforma kumpless isfar. Il-kulur ta 'din ir-reazzjoni huwa relattivament qawwi, li jista' jiddetermina sew l-ammont ta 'glukosju u zokkor ieħor li jnaqqas prodott.

 

①3, 5- aġent colorimetric aċidu dinitrosalicylic
Jiżnu b'mod preċiż 1 0 g ta '3, 5- aċidu dinitrosalicylic b'punt ta' tidwib ta '168-169 grad, jinħallha b'ilma distillat, żid 20g ta' idrossidu tas-sodju u 200g ta 'potassju sodju tartrate, ikompli jsaħħan sakemm is-solidu jinħall kompletament, ikompli jsaħħan sakemm is-solidu jinħallu Phenol mill-ġdid u 0.5g ta 'sulfit tas-sodju anidru, ħawwad kontinwament matul il-proċess ta' żieda sakemm jinħall kompletament, iwaqqaf it-tisħin wara li tħallat b'mod uniformi, kessaħ għat-temperatura tal-kamra, jittrasferixxi kollha għal flask volumetriku ta '1000ml, dilwit lejn il-marka għall-marka b'ilma distillat, poġġi f'temperatura tal-kamra għal ġimgħa, filtru, jiksbu l-flixkun tas-supernanti kannella.Idroliżi ②enzimatika
Pipetta b'mod preċiż {{0}}, 0. 5, 1. {0, 1.5, 2.0ml ta 'soluzzjoni tal-kampjun enzima f'2ml ta' soluzzjoni ta 'buffer aċetiku aċetiku-sodju b'valur ta' pH b'valur ta 'pH ta' 4.5. Wara 5 minuti ta 'banju ta' ilma ta 'temperatura kostanti f'40 grad, żid 6 biċċiet ta' karta tal-filtru tal-kromatografija b'żona ta '1 × 1cm2 rispettivament, u immedjatament ibda l-ħin biex tagħmel il-ħin ta' reazzjoni preċiż għal 60 minuta. Ittrasferixxi immedjatament għal banju tal-ilma jagħli għal reazzjoni għal 10 minuti, u ċ-ċellulasi titlef l-attività tagħha.

 

 

③ Reazzjoni tal-kulur
Ħu s-soluzzjoni tal-kampjun tal-enzima, żid 3ml ta '3, 5- aġent colorimetriku ta' aċidu dinitrosalicilic ippreparat f '①, sħana fil-banju tal-ilma jagħli għal 15-il minuta, ħu, kessaħ it-temperatura tal-kamra, żid 10ml ta' ilma distillat, ħawwad indaqs, uża spettrofotometru f'tul ta 'mewġa ta' 550nm, u kejjel il-grupp ta 'assorbenza tiegħu.
④ Tpinġija ta 'kurva standard tal-glukosju
Ipprepara soluzzjoni standard tal-glukożju b'konċentrazzjoni ta '1mg / ml b'mod preċiż, u uża ilma distillat biex tagħmel is-soluzzjoni standard tal-glukożju b'volum ta' 0, {0. 2, {{0. 4, {{0. 6, 0 8, 1, 1.2, u 1.4ml ta '3, 5- aċidu dinitrosalicilic acuorimetric aġent ippreparat f' ① biex iwettaq reazzjoni ta 'żvilupp tal-kulur. Ipplottja l-kurva standard b'konċentrazzjoni tal-glukosju bħala l-assi orizzontali u l-assorbenza bħala l-assi vertikali.
⑤Kalkulazzjoni
Uża l-valur ta 'assorbenza A wara l-iżvilupp tal-kulur b'soluzzjoni ta' enzima, u mbagħad ikkalkula l-ammont tar-rilaxx tal-glukosju M skond il-kurva standard tal-glukosju, u kkalkula skont il-Formula 5.6:
Attività taċ-ċellulasi (u / ml)=m / (t · m) (5.6) fejn: m huwa l-ammont tar-rilaxx tal-glukosju, ug; T huwa l-ħin tal-idroliżi enżimatika, min; M huwa l-kontenut ta 'enzima fir-reazzjoni, ug / ml.