Riċettur ta' l-Idrokarburi ta' Aryl

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

2.2.6. Kultivazzjoni tal-KE tal-Bniedem Primarju

EC primarja umana (Lonza, Cologne, il-Ġermanja) ġiet ikkultivata f'medja bażali endoteljali kompluta (EBM) (Lonza, Cologne, il-Ġermanja) supplimentata b'1 ug/mL hydrocortisone, 12ug/mL estratt tal-moħħ bovin, 50ug/ ml gentamicin, fattur ta 'tkabbir epidermali tal-bniedem 10ng/mL, u 10 fil-mija (o/v)serum tal-għoġol tal-fetu f'37 grad u 5 fil-mija CO, sat-tielet passaġġ. Wara distakkament b'0.05 fil-mija (o/o)Trypsin/EDTA (Thermo Xjentifiku, Schwerte, il-Ġermanja), iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'platti ta 'kultura ta' 6 ċm jew pjanċi ta 'kultura ta' 6 tajjeb għal mill-inqas 18-il siegħa qabel it-trasfezzjoni jew it-trattament.

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

2.2.7. Trasfezzjoni Transitorja tal-KE

Iċ-ċelloli ġew trasfettati kif deskritt qabel [65]. Fil-qosor, EC ġiet trasfettata bl-użu ta 'SuperFectTransfection Reagent(Qiagen, Hilden, Germany) skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. L-espressjoni żejda jew il-knockdown ta 'AhR inkiseb wara 24 jew 48 siegħa, rispettivament. L-effiċjenza tat-trasfezzjoni mal-espressjoni żejda kienet madwar 40 fil-mija.

2.2.8. Scratch Wound Assay tal-KE

Għall-investigazzjoni tal-kapaċità migratorja tal-KE, saru analiżi tal-feriti tal-grif kif deskritt qabel [66]. Fid-dettall, il-feriti ġew stabbiliti f'monosaff taċ-ċelluli bi barraxa taċ-ċelluli tul linja ta 'traċċa. Wara l-korriment, ċelluli mhux imwaħħla tneħħew permezz ta 'ħasil ġentili.estratt tas-salsa cistancheIt-trattament tal-curcumin sar direttament wara li l-ferita ġiet issettjata. Cur-cumin ġie maħlul f'DMSO u użat fil-konċentrazzjoni finali ta '7.5 uM. Il-migrazzjoni tal-KE ġiet ikkwantifikata billi tbajja ċ-ċelloli b'5 ug/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Carl Roth, Karlsruhe, il-Ġermanja) f'PBS għal 5 minuti wara li ċ-ċelloli kienu ġew iffissati b'4 fil-mija (v/v)paraformaldehyde għal 15-il minuta f'temperatura tal-kamra. L-immaġini ttieħdu bl-użu ta' mikroskopju fluworexxenti Zeiss AxioVision Observer D1(Carl Zeiss, Oberkochen, il-Ġermanja))bl-użu ta' 200-ingrandiment. Iċ-ċelloli emigrati fil-ferita mil-linja tat-traċċa ġew magħduda awtomatikament bl-użu tal-funzjoni ta 'analiżi tal-partiċelli ta' Image] 1.52a ] 67I wara li n-nuklei li jikkoinċidu ġew separati.

Cistanche jista 'anti-aging

2.2.9. Immunotesting tal-KE

EC ġie ffissat b'4 fil-mija (o/v) paraformaldehyde għal 15-il minuta f'temperatura tal-kamra. Wara l-permeabilizzazzjoni u l-imblukkar fi 0.3 fil-mija (o/o)Triton-X 100 u 3 fil-mija (o/u)serum tal-mogħoż normali fil-PBS, iċ-ċelloli ġew inkubati b'antikorp tal-fenek kontra AhR (1:100, Abcam, Cambridge, ir-Renju Unit) jew Nrf2 (klonu D1Z9C, 1:100, Cell Signaling Technology, Frankfurt, Ġermanja) dilwit f'1 fil-mija (o/v)serum normali tal-mogħoż f'PBS matul il-lejl f'4 C. Imbagħad, iċ-ċelloli ġew maħsula b' PBS u inkubat ma' Alexa 594-akkoppjat mogħoż anti-fenek IgG (1:500, Invitrogen, Darmstadt, il-Ġermanja) għal siegħa f'temperatura ambjentali.cistanche zokkGħat-tbajja 'l-actin, iċ-ċelloli ġew inkubati b'Alexa FluorTM 488 Phalloidin (1:70, Invitrogen, Darmstadt, il-Ġermanja) għal 20 min f'temperatura tal-kamra. In-nuklei kienu counterstained b'0.5 ug/mL DAPI f'PBS għal 5 min f'temperatura tal-kamra u ċ-ċelloli ġew immuntati b'ProLong'MDiamond Antifade Mountant (Invitrogen, Darmstadt, il-Ġermanja). Immaġini fluworexxenti ttieħdu bl-użu ta 'mikroskopju fluworexxenti Zeiss AxioVision Observer D1, b'ingrandiment ta' 400 × jew 200 ×.

2.2.10. qPCR fiċ-Ċelloli

L-RNA ċellulari totali ġie iżolat billi tgħaqqad il-liżi fi TRIzolTM ma 'proċessar downstream bl-użu tal-RNeasy Mini Kit(Qiagen(Hilden, Germany)) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Is-sinteżi ta 'cDNA saret bl-użu tal-Kit ta' Traskrizzjoni Reverse QuantiTect9 (Qiagen （Hilden, il-Ġermanja)) b'1 ug RNA skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Livelli ta' traskrizzjoni relattivi ġew determinati permezz ta' PCR bl-użu ta' 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix u Rotor-Gene Q thermal cycler (Qiagen (Hilden, Ġermanja)). It-traskrizzjoni għall-proteina ribosomali L32 (rpl32) intużat bħala referenza, u l-espressjoni relattiva ġiet ikkalkulata bil-metodu AC [68]. Intużaw il-pari ta' primers li jkopru l-Intron li ġejjin:kapital (numru ta' adeżjoni tal-ġene NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3';ahr(ġene numru ta' adeżjoni NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3';sod2(numru ta' adeżjoni tal-ġene NM_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTGGGTTC-3';rpl32(numru ta' adeżjoni tal-ġeni NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCACATCAGCACAC{{ 41}}'.

2.3.Ġrieden

2.3.1.Linji tal-ġurdien u tnissil

Mara 8-12-ta' ġimgħa ("żagħżugħa") u 18-ta' xahar ("qodma") B6 defiċjenti fl-AHR.129-AHRtmlBra/J (Schmidt et al.,1996; riferit sa hawn bħala AHR-KO) ġrieden kienu mrobbija bħala eterozigoti fil-faċilità tal-annimali tal-IUF. Littermates tat-tip selvaġġ intużaw għall-kontroll. Il-ġrieden ġew imrobbija u miżmuma taħt kundizzjonijiet speċifiċi ħielsa minn patoġeni fuq ċiklu ta’ dawl-dlam ta’ 12/12-il siegħa u rċevew chow standard (sniff"MZ, SNIFF, Soest, Germany) ad libitum. 2.3.2.qPCR fil-Ġrieden

L-RNA totali kien iżolat minn tessuti ta 'organi ta' tliet ġrieden defiċjenti WT u AHR bi TriZol[. Imbagħad 400 ng ta 'RNA ġew traskritti b'lura bl-użu tar-reverse transcriptase M-MLV (Promega, Madison, WI, USA) u primers hexamer każwali. Il-livelli ta' espressjoni tal-ġeni tkejlu f'duplikat għal kull tessut tal-ġrieden fuq Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, il-Ġermanja), f'volum finali ta' 15 μL, li fih 7.5 μL Rotor Gene SybrGreenTM (Biorad, Feldkirchen, il-Ġermanja), 1 uM ta' kull primer ,1.5 μL ilma ħieles minn cDNA u RNase. L-effiċjenzi tal-primer kienu bejn 90 fil-mija u 146 fil-mija. Ara t-Tabella S2 għas-sekwenzi tal-primer u l-effiċjenzi. Il-livelli tal-espressjoni ġew kkalibrati għall-espressjoni ta 'RPS6 bħala ġene tad-dar fl-istess kampjun bl-użu ta' {{13 }}Metodu CT [69].

2.4.In Silico Analiżi

Omoloġija Immudellar tal-LBD CeAhR

Il-mudell strutturali ta 'C. elegans AhR LBD (residwi 267-372) ġie ġġenerat minn immudellar ta' omoloġija. L-istrutturi tar-raġġi X tad-dominji PASB tal-membri tal-familja bHLH-PAS omologi li jaqsmu l-ogħla identità tas-sekwenza (madwar 20 fil-mija) mal-CeAhR PASB intużaw bħala mudelli: iċ-ċikli tal-produzzjoni tal-lokomotriċi ċirkadjani kaput (CLOCK, PDB: 4F3L), il- proteina 3(NPAS3, PDB:5SY7) li fiha d-dominju PAS newronali, il-fatturi li jinduċu l-Ipoksja 20(HIF2o, PDB:3H82,4ZP4,3F1N)u lo(HIFlo, PDB:4H6J). Il-mudell inkiseb ma' MODELLER[70-72].cistanche tubulosa benefiċċji u effetti sekondarjiL-aħjar mudell intgħażel minn fost l-10 iġġenerati, ibbażat fuq l-aħjar PUNTEĠĠ DOPE [73]. Il-kwalità tal-mudelli ġiet evalwata bl-użu ta' PROCHECK [74]. L-istrutturi sekondarji ġew attribwiti minn DSSPcont [75]. Il-kavità tal-irbit fi ħdan l-LBDs immudellati ġiet ikkaratterizzata bl-użu tas-server CASTp[76]. Il-viżwalizzazzjoni tal-mudelli twettqet bl-użu ta' PYMOL[77].

2.5.Analiżi Statistika

Sakemm ma jkunx iddikjarat mod ieħor, analiżi statistiċi saru fi GraphPad Prism (Verżjoni 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA). Għall-analiżi tal-ħajja/saħħa, saret analiżi statistika bl-użu ta' OASIS[53]. Analiżi statistika tad-dejta tal-mikroarray saret f'R (R Foundation (Vjenna, Awstrija)). Boxplots inħolqu fi GraphPad Prism (Verżjoni 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA) u juru l-medjan (linja),25-75th percentile (kaxxa), u 10-90th percentile (whiskers).

3. Riżultati

3.1. Il-kurkumina Tippromwovi l-Ispan tas-Saħħa b'Manjiera Dipendenti u Indipendenti mill-AhR

It-telf ta' ahr-1 jippromwovi s-saħħa u l-ħajja ta' C.elegans f'kundizzjonijiet bażali[14] u għandu impatt negattiv fuq il-karatteristiċi relatati mal-età b'reazzjoni għal modulaturi AhR tal-mammiferi, bħal benzo[a]pyrene (BaP), UVB dawl, u mikrobijota [25]. Polifenoli tad-dieta, bħal cur-cumin, jiffurmaw grupp importanti ta 'modulaturi AhR tal-mammiferi b'effetti pro-lonġevità f'C. elegans [78,79]. Għalhekk investigajna l-effett li jestendi l-ħajja tal-kurkumina għad-dipendenza ahr-1 tagħha. Il-kurkumina estendiet b'mod riproduċibbli u sinifikanti l-ħajja u s-saħħa ta 'C. elegans b'mod dipendenti fuq ahr-1-(Figura 1A, B). Preċedentement, urejna li t-telf ta' ahr-1 jestendi wkoll il-ħajja fil-mudelli tal-marda ta' Huntington u l-marda ta' Parkinson, b'espressjoni żejda tal-muskoli ta' poliglutamina suxxettibbli għall-aggregazzjoni (polyQ40) u -synuclein (-syn), rispettivament, filwaqt li f' fl-istess ħin iżidu l-kontenut tagħhom ta 'aggregati ta' proteini [25]. Interessanti, it-trattament tal-curcumin żied in-numru ta 'aggregati polyQ40 u -syn sal-istess punt bħat-telf tal-funzjoni ahr-7 (Figura 1C). Il-kurkumina ppromwoviet ukoll il-ħajja u l-kapaċità lokomotorja f'dawn il-mudelli tal-mard (Figura 1DE), iżda l-effetti tat-telf ta' ahr-1 u s-supplimentazzjoni tal-kurkumina kienu addittivi fil-PolyQbackground (Figura 1D), u żvelaw funzjonijiet protettivi indipendenti tal-AHR-1- tal-kurkumina mill-inqas f'dan l-isfond kompromess.

Figura 1. Il-kurkumina tippromwovi s-saħħa b'mod AHR-1-dipendenti u indipendenti. Kurvi tat-tul tal-ħajja (A) u span(B) tas-saħħa tan-nematodi wt u ahr-1 ittrattati b'DMSO jew kurkumina. Il-kurvi tas-sopravivenza juru data miġbura ta' 290-300 dud/kundizzjoni f'5 esperimenti. Test statistiku:test log-rank, # sinifikat vs. DMSO,*sinifikat vs.wt, Bonferronip-valur<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.2.ugt-45 Jimedja l-Effetti Kontra t-Tixjiħ tal-Kurkumina u t-Tnaqqis tal-ahr-1

Fit-tfittxija ta 'effettituri possibbli downstream ahr-1-dipendenti tal-curcumin, ħadna approċċi mmirati u imparzjali. Aħna eżaminajna l-espressjoni tal-ġeni fil-mira AhR tal-mammiferi klassiċi u ffukajna fuq il-ġeni Cyp peress li l-curcumin tbiddel l-espressjoni ta 'CyplA1 u CyplB1 fiċ-ċelloli tal-mammiferi [80,81]. Madankollu, il-kwantifikazzjoni ta' 47 cyps differenti f'C.elegans permezz ta' PCR semi-kwantitattiv f'ħin reali (qPCR) wriet li cyp-13B1 biss kien regolat b'mod sinifikanti 'l fuq jew bit-tnaqqis ta' ahr-1 jew bil-kurkumina b'mod dipendenti ahr-1-(Figura S1A-B), filwaqt li t-tliet cyps l-oħra (jiġifieri, cyp-13A5, cyp-13A8 u cyp-42A1) kienu miżjuda bil-kurkumina biss fin-nuqqas ta' ahr-1(Figura S1). Din id-dejta, flimkien ma 'xogħlijiet oħra [25,82], tissuġġerixxi li cyps x'aktarx mhumiex il-miri ewlenin ta' CeAhR. Dan huwa appoġġjat ukoll mill-analiżi traskrittomika tagħna f'mutanti tat-tip selvaġġ u ahr-1. Tabilħaqq, konsistenti mar-rwol tal-AHR-1 fid-determinazzjoni newronali [37,38,40,41], il-bidliet fl-espressjoni tal-ġeni bejn mutanti tat-tip selvaġġ u ahr-1 wrew arrikkiment fi proċessi marbuta mal-iżvilupp newronali u differenzjazzjoni u l-ebda tibdil kbir fil-ġeni ta' ditossifikazzjoni klassika (Figura 2A).qPCR analiżi ta' wħud mill-aktar ġeni regolati 'l fuq u 'l isfel bejn ahr-1(jul45) u wild-type (atf-2 , K04H4.2, egl-46, T20F5.4, ptr-4, dyf-7,clec{-209, C01B4.6, C01B4.7, F56A4.3)l-aktar ikkonfermaw id-dipendenza ahr-1-tagħhom f'kundizzjonijiet bażali (Figura 2B) iżda la UVB [25] u lanqas curcumin (Figura 2C) affettwaw b'mod sinifikanti l-espressjoni ta 'dawn il-ġeni. Staqsejna jekk il-bidliet fl-espressjoni f'dawn il-ġeni humiex konservati b'mod evoluttiv u evalwajnax l-espressjoni tagħhom f'tessuti differenti (jiġifieri, moħħ, fwied, imsaren, u demm) ta' 8- u 18-xhur ta' tip selvaġġ u AhR KO ġrieden. Xi ġeni wrew tendenza għal espressjoni akbar fil-ġrieden żgħar (atf-2 omologu) jew qodma (lpr-4/5 omologi) b'mod speċifiku għat-tessuti, iżda la mudell ovvju u lanqas bidliet konservati ma kienu osservati (Figura S2). Dawn ir-riżultati jirriflettu differenzi possibbli speċifiċi għall-ispeċi jew attività ta 'traskrizzjoni AhR dipendenti mit-tessuti f'mammiferi injorati mill-analiżi transcriptomic ta' l-annimali sħaħ f'C. elegans. Eżami bir-reqqa tal-ġeni l-aktar espressi b'mod differenzjat bejn C. elegans wild-type u ahr-1(jul45) wera li l-espressjoni ta 'ħafna minn dawn il-ġeni hija affettwata f'C.elegans matul ix-xjuħija u minn modulaturi AhR tal-mammiferi tad-dieta ( eż., quercetin u resveratrol)[25], u b'hekk jissuġġerixxi rwol għall-AHR-1 fl-espressjoni tal-ġeni modulata bil-polifenol. F'konformità ma' dan ix-xenarju, id-dejta tal-mikroarray wriet li l-biċċa l-kbira tal-ġeni espressi b'mod differenzjat fuq it-trattament tal-curcumin kienu tabilħaqq regolati b'mod dipendenti fuq l-ahr-1-(Figura 2D; Tabella 1).estratt ta' cistanche tubulosaMinn 47 ġeni mibdula mill-curcumin fit-tip selvaġġ (43 'l fuq u 4 'l isfel regolati), 5 biss ġew indotti wkoll mill-curcumin f'ahr-1(ju145). Fost il-ġeni regolati mill-curcumin b'mod dipendenti fuq l-AHR-1-kienu l-enzimi tal-fażi Il u interessanti, xi wħud minnhom (ugt-9 u ugt{-29), kienu regolati fl-istess direzzjoni mill-curcumin jew permezz ta' telf ta' ahr-1 (Tabella 1). Għalhekk, aħna vverifikajna l-espressjoni tagħhom u dik ta' ugts addizzjonali(ugt-45 u ugt{-57) li ġew espressi b'mod differenzjat meta applikajna analiżi statistika inqas restrittiva mhux ikkoreġuta għal paraguni multipli. Mill-ġeni eżaminati, ugt-45 żdied f'ahr{-1(ijul45)u bit-trattament tal-kurkumina (Figura 3A, B). Osservajna wkoll bidliet fl-espressjoni ta' xi ġeni ta' ditossifikazzjoni bejn wild-type u Ġrieden AhR KO b'mod dipendenti mit-tessut. L-espressjoni differenzjali ta' dawk il-ġeni kienet l-ogħla fil-moħħ, fejn Ugt2a3 (ugt-9 u ugt{-29 f'C.elegans) kien down- u Hpgds (gst-4 f'C. elegans) kienet regolata 'l fuq (Figura S3A). Ma kien hemm l-ebda bidla fl-espressjoni ta' xi wieħed mill-ġeni ttestjati fil-kampjuni tal-fwied ta' ġrieden (Figura S3B). F'konformità mad-dejta ta' C,elegans, l-omologu murini ugt-45 Ugt3a2 wera tendenza lejn espressjoni żejda fil- intestini tal-ġrieden Ahr KO (Figura S3C). Notevolment, ugt-45 RNAi impedixxa l-effetti ta' benefiċċju fuq il-ħajja u s-saħħa promossi minn kurkumina (Figura 3C,D) jew tnaqqis ta' ahr-1 (Figura 3E,F) li jindika li ż-żewġ interventi jistgħu jiddependu fuq sinjalar downstream modulat b'mod konġunt biex iqajjem l-attività tagħhom kontra t-tixjiħ.

Figura 2. Ġeni rregolati b'mod differenzjat mill-curcumin huma primarjament regolati b'mod dipendenti fuq ahr-1-.(A)Arrikkiment tal-ontoloġija(GO) tal-ġeni għal proċessi bijoloġiċi wara fużjoni tat-terminu GO f'ahr-1 vs. (B, C) L-espressjoni tal-ġeni regolati 'l isfel u 'l fuq l-aktar b'saħħithom bejn wt u ahr-1 [25]kienet ivvalutata bil-qPCR f'wt vs.ahr-1(B) u DMSO-vs . nematodi trattati bil-kurkumina (C). Boxplots juru data minn 3 esperimenti. L-espressjoni hija murija relattiva għal wt ittrattat b'DMSO (linja mqabbda). Test statistiku:1-mod ANOVA bit-test tal-paraguni multipli ta' Tukey,*p-value<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">

Figura 3.ugt-45 hija meħtieġa għall-estensjoni tal-ħajja tal-mutanti tal-curcumin u ahr-1. (A, B) L-espressjoni tal-ġeni ġiet ivvalutata bil-qPCR f'wt vs.ahr-1(A) u DMSO- vs. nematodi wt ittrattati bil-kurkumina (B). Boxplots juru data minn 3 esperimenti. L-espressjoni hija murija relattiva għall-wt ittrattat b'DMSO (indikat bħala linja b'sing). Test statistiku: 2-Way ANOVA bit-test ta' paraguni multipli ta' Sidak, *p-value<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>

3.3. AHR-1 u Curcumin Ipproteġi b'mod Indipendenti kontra Stress Ossidattiv

Il-proprjetajiet ta 'benefiċċju tal-polifenoli ħafna drabi huma attribwiti għall-kapaċità tagħhom li jipproteġu kontra speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS)|83,84]. Peress li AhR huwa involut fi proċessi medjati mill-istress ossidattiv [85-87], staqsejna jekk il-curcumin jistax ikollu impatt fuq il-fiżjoloġija tal-annimali permezz tar-risponsi antiossidanti regolati mill-AhR. Aħna osservajna li ahr-1 mutanti jipproduċu aktar mitokondrijali (mt) ROS u għandhom potenzjal imnaqqas tal-membrana mitokondrijali (Figura 4A, B), żewġ parametri li jikkorrelataw mal-lonġevità [88,89]. Filwaqt li konsistenti mal-paradigma tal-mitohormesis ahr-1(jul45) jipproduċu ftit aktar mtROS u jgħixu aktar, dawn l-annimali kienu aktar sensittivi għall-istress ossidattiv mit-tip selvaġġ. Speċifikament, l-effetti detrimentali indotti minn juglone u H2O2 fuq l-annimali li jaqbżu, il-motilità u s-sopravivenza kienu b'mod sinifikanti aktar b'saħħithom f'ahr-1(jul45) meta mqabbla mat-tip selvaġġ (Figura 4C-F). Din id-dejta tissuġġerixxi li t-tnaqqis tal-AHR-1 għandu effetti motor metic ta' benefiċċju f'kundizzjonijiet bażali, filwaqt li l-preżenza tiegħu hija meħtieġa għall-protezzjoni tal-istress ossidattiv, u b'hekk jissepara żewġ parametri li spiss jikkorrelataw mal-età, jiġifieri l-ħajja u r-reżistenza għall-istress. Minflok, il-kurkumina tejbet b'mod sinifikanti r-reżistenza għall-H, O, u l-juglone kemm f'mutanti tat-tip selvaġġ kif ukoll f'ahr-1 (Figura 4E,F), li tissuġġerixxi li l-curcumin iqajjem rispons antiossidant indipendenti ahr-1-. B'mod konsistenti mar-regolazzjoni mhux akkoppjata tal-ħajja u r-reżistenza għall-istress ossidattiv, is-sajlenser ugt-45 ma affettwax is-sensittività għall-istress ossidattiv la għal mutanti ahr-1 jew annimali ttrattati bil-kurkumina (Figura 4G).reviżjonijiet cistanche tubulosaGħalhekk, il-kurkumina għandha effetti favur il-lonġevità permezz ta' ahr-1 u ugt-45, iżda tipproteġi kontra l-istress ossidattiv permezz ta' ahr-1-mekkaniżmi indipendenti.

3.4. Nrf2/SKN-1 Medja l-Effetti Indipendenti mill-AhR tal-Kurkumina

Biex nevalwaw aktar il-crosstalk AhR-curcumin f'karatteristiċi addizzjonali relatati mal-età, kejlna l-kapaċità migratorja fl-EC primarja tal-bniedem — karatteristika għall-funzjonalità tal-bastiment, li tonqos bl-età [90] u titnaqqas bl-attivazzjoni tal-AhR [14]. F'konformità mal-attività kontra t-tixjiħ tas-soppressjoni ahr-1 u tal-kurkumina, l-espressjoni żejda ta 'AhR ġiet inibita b'mod sinifikanti, filwaqt li l-kurkumina żdiedet, il-kapaċità migratorja tal-KE primarju tal-bniedem (Figura 5A). Ta 'min jinnota, l-induzzjoni ta' kapaċità migratorja mill-curcumin kienet komparabbli f'ċelluli vojta trasfettati b'vettur jew espressjoni AhR (Figura 5A). Madankollu, il-migrazzjoni ta 'ċelluli ttrattati bil-kurkumina tnaqqset b'mod sinifikanti minn espressjoni żejda AhR: il-kurkumina jinduċi f'ċelluli vojta trasfettati b'vettur sa 60 ċellula migrata għal kull qasam ta' qawwa għolja, filwaqt li f'ċelluli li jesprimu żejjed AhR biss sa 25 ċellula għal kull qasam ta 'qawwa għolja (Figura 5A). Din id-dejta tissuġġerixxi li l-effett pro-migratorju tal-kurkumina huwa modulat minn mekkaniżmi indipendenti mill-AhR iżda possibbilment ukoll minn tnaqqis fl-attività AhR. Wara ddeterminajna d-distribuzzjoni intraċellulari ta 'AhR u l-espressjoni ta' cVplal f'EC uman ittrattat bil-kurkumina, Curcumin ma affettwax it-traslokazzjoni AhR-nukleari (Figura 5B) jew espressjoni cyplal (Figura 5C). Fit-tfittxija ta' mogħdijiet modulati mill-curcumin b'mod indipendenti mill-AhR, erġajna erġajna għal profili ta' traskrizzjoni tan-nematodi biex insibu fatturi ta' traskrizzjoni li jirregolaw ġeni modulati b'mod sinifikanti b'telf ta' ahr-1 jew bi trattament ta' kurkumina f'annimali selvaġġi (Tabella 1) ). Din it-tfittxija in silico identifikat il-fattur ta' traskrizzjoni redox SKN-1, l-ortologu ta' Nrf2 uman (fattur nukleari erythroid 2-relatat fattur 2), li l-attivazzjoni tiegħu mill-kurkumina [91] spiss tiġi rrappurtata bħala medjatur possibbli ta' l-attività anti-ossidant tagħha [92,93]. Għaldaqstant, il-prototip C.elegans Nrf2/SKN-1-ġene dipendenti, gst-4, huwa espress żżejjed fil-mutant alhr{-1 [25] u indott mill-curcumin fit-tip selvaġġ u saħansitra aktar f'ahr-1 mutanti (Figura 5D). Barra minn hekk, il-kurkumina żiedet l-istabbilizzazzjoni u t-traslokazzjoni nukleari ta’ Nrf2 fl-EC primarja tal-bniedem (Figura 5E) u induċiet l-espressjoni ta’ manganese superoxide dismutase (Sod2)—ġene fil-mira Nrf2 klassiku—fiċ-ċelloli trasfettati b’vettur vojt jew f’ċelloli li fihom AhR huwa imsikkta minn shRNA (Figura 5F). In-nuqqas ta 'induzzjoni ta' Sod2 minn AhR shRNA fl-EC jista 'jkun dovut għal tnaqqis parzjali (50 fil-mija) fl-espressjoni (Figura S3D), li jista' ma jkunx biżżejjed biex tixpruna l-attivazzjoni ta 'Nrf2 jew ta' fattur ta 'traskrizzjoni addizzjonali (TF), li , f'C.elegans, jista' jaqbel mal-induzzjoni tal-gst-4 [94]mat-tnaqqis sħiħ ta' AhR. Interessanti, Hpgds, omologu ta 'C.elegans gst-4, żdied b'mod sinifikanti fil-moħħ tal-ġrieden AhR KO (Figura S3A) iżda mhuwiex mira ta' Nrf2. Evidenza ulterjuri għal sinjalar indipendenti possibbli ta' Nrf2/SKN-1 attivat minn tnaqqis ta' ahr-1 hija li l-attivazzjoni tal-gst-4 bil-kurkumina hija mrażżna kompletament mill--7 RNAi tal-ġilda fil- C.elegans tip selvaġġ, filwaqt li l-mutanti ahr-1 għadhom jinduċu gst-4 minkejja t-tnaqqis tal-ġilda-1 (Figura 5G, H). Madankollu, il-ġilda-1 RNAi naqqas ir-reżistenza għall-istress ossidattiv kemm fit-tip selvaġġ kif ukoll f'ahr-1(ju145) (Figura 5I). B'mod mhux mistenni, is-sajlenser tal-ġilda-1 ma affettwax ir-reżistenza tal-juglone ta 'annimali ttrattati bil-kurkumina (Figura 5I). Id-dejta tagħna tiżvela xenarju kumpless fejn il-curcumin jippromwovi karatteristiċi differenti ta' kontra t-tixjiħ billi jiddependu jew fuq sinjalazzjoni dipendenti fuq AhR jew indipendenti minn AhR iżda Nrf2/SKN-1-dipendenti (u addizzjonali).

Figura 4. AHR-1 u curcumin jipproteġu b'mod indipendenti kontra l-istress ossidattiv. (A) Immaġini rappreżentattivi (xellug) u kwantifikazzjoni tal-intensità DSRed (lemin) fin-nematodi wt jew ahr-1 imtebbgħin b'MitoSOX. Boxplots juru data miġbura minn 129-135 dud/kundizzjonijiet fi 3 esperimenti. (B) Il-potenzjal tal-membrana tal-mitokondrija ġie vvalutat permezz ta 'tbajja' TRME f'nematodi ta' etajiet indikati. Immaġini rappreżentattivi (xellug) u l-kwantifikazzjoni tal-fluworexxenza TMRE (lemin) huma ppreżentati. Boxplots juru data miġbura minn 3 esperimenti.(C,D) Attività tal-ippumpjar tal-farinġi(C) u motilità(D) ta' mutanti wt u ahr-1 wara trattament H2O2. Boxplots juru data miġbura minn 39-54(C)jew 35-36 dud/kundizzjoni (D)f'3-4esperimenti.*p-value<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">

Figura 5. Il-kurkumina jattiva Nrf2/SKN-1 indipendenti mill-Assaġġ tal-ferita ta' Scratch AhR.(A) f'EC primarju uman trattat b'kurkumina (cur)-jew DMSO trasfettat b'vettur vojt (EV) jew vettur ta' espressjoni għal bniedem AhR. Bord ta 'fuq: stampi rappreżentattivi; il-linja dashed tirrappreżenta l-bidu tal-migrazzjoni. Skala bar: 100 um. Panel t'isfel: kwantifikazzjoni; boxplots juru data ta' 4-6esperimenti.Test statistiku:1-mod ANOVA,*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.5. Il-kurkumina u l-Pro-Ossidanti juru Effetti Opposti fuq l-Attività AHR-1

B'mod konsistenti mal-effett kontra t-tixjiħ ta 'AHR-espressjoni/attività mnaqqsa, id-dejta tagħna tissuġġerixxi li l-curcumin jista' jestendi l-ħajja ta' C.elegans billi jrażżan il-mogħdijiet regolati AHR-1-permezz ta' tnaqqis tal-espressjoni/attività AHR-1 jew taġixxi fuq mogħdijiet ta' sinjalar downstream komuni. Għalhekk, ippruvajna nikkwantifikaw l-attività tal-AHR-1 f'C.elegans, iżda bosta tentattivi biex nevalwaw l-espressjoni tal-AHR-1 u l-lokalizzazzjoni subċellulari bl-użu ta' anti-korpi (kontra AhR tal-mammiferi jew antikorpi personalizzati kontra CeAhR) jew immarkati b'mod fluworexxenti. reporters(OP562, UL1709, ZG93) ma tawx evidenza sinifikanti. Meta wieħed iqis li AHR-1 jeħel ma' XREs in vitro [35], ħsibna li nużaw l-espressjoni tal-ġeni mmexxija mill-XRE bħala qari għall-attività AHR-1. Għalhekk, rrikorrejna għal ċelluli Cos7 derivati ​​mix-xadini, li ma jesprimux AhR endoġenu u b'hekk ma juru l-ebda attività AhR endoġena [95,96] u jistgħu jiġu sfruttati biex jimmonitorjaw l-induzzjoni ta' Luciferase mmexxija minn XRE bħala qari għal AHR-1 attività (Larigot et al.; sottomessi flimkien ma’ dan l-istudju). Meta ċ-ċelluli Cos7 ġew ko-trasfettati ma' vettori li jesprimu C.elegans AhR/alr-1, ARNT/aha-1, u promotur li fih XRE akkoppjat ma' luciferase tal-ġene CYPIA1 uman [64] AHR{ {27}} wera attività baxxa f'kundizzjonijiet bażali (trattati bil-vettura). Ta 'min jinnota, it-trattament bil-curcumin jew nutraceuticals oħra li jippromwovu tixjiħ b'saħħtu f'C.elegans, bħal lutein [97] u resveratrol [98,99], soppressa b'mod sinifikanti l-attività AHR-1 (Figura 6A-C). Minflok, BaP u leflunomide, attivaturi AhR magħrufa fil-mammiferi, ma affettwawx l-attività AHR-1 (Figura 6A, B) fil-konċentrazzjonijiet li użajna. Notevolment, l-attività AHR-1 ġiet abolita fiċ-ċelloli Cos7 trasfettati b'vettur li jesprimi l-ahr-1(jul45) allele minflok l-allel tat-tip selvaġġ (Figura 6A-C), li jissuġġerixxi li jul45 huwa veru. alleli ta' telf ta' funzjoni u li l-intensità tal-luċiferażi mkejla hija dovuta għal AHR funzjonali-1.

Imbagħad fittxejna li ninvestigaw jekk il-kurkumina tnaqqasx l-attività ta 'AHR-1 permezz ta' rbit dirett jew modulazzjoni indiretta. Sal-lum, l-ebda ligands ta 'C.elegans AHR-1 ma ġew identifikati, u peress li m'hemm l-ebda informazzjoni disponibbli dwar l-LBD tiegħu, għamilna analiżi in silico biex nikkaratterizzawh. Iż-żewġ isoformi AHR-1, la u 1b, kienu allinjati u għalkemm differenti fit-tul, is-sekwenza tad-dominju PASB tagħhom hija identika. Din is-sekwenza mbagħad ġiet allinjata mad-dominju PASB ta’ Drosophila melanogaster, u ma’ dawk ta’ żewġ AhRs minn vertebrati li għalihom kienu ġġenerati mudelli strutturali qabel, jiġifieri ġrieden (Mus musculus)[100], u zebrafish (Danio rerio)[101](Figura 6D). L-allinjament wera differenzi ċari bejn l-ispeċi bil-partikolarità ewlenija ta 'l-invertebrati baring tħassir ta' sekwenza fl-aktar reġjun varjabbli fid-dominju PAS, li jikkorrispondu għar-reġjun flessibbli, inkluż il-gozz helical (C , D , E helices) u l-linji qosra li jgħaqqdu dawn l-elementi (Figura 6D,E). Dawn it-tħassir jistgħu jnaqqsu l-ispazju disponibbli fil-kavità tal-irbit ta 'dawn l-AhRs. Imbagħad iġġenerajna mudell 3D tal-AHR-1 PASB permezz ta' mmudellar ta' omoloġija. Dan il-mudell jippreżenta t-tinja PAS tipika, iżda b'helix Do iqsar meta mqabbel ma 'AhRs oħra. Madankollu, il-kavità interna għandha xi partikolaritajiet; fih aktar residwi idrofobiċi u huwa maqtugħ bin-nofs minn xi ktajjen interni tal-ġenb. B'mod partikolari, H365 u H274 huma ffaċċjati u jistgħu jiffurmaw bond idroġenu fin-nofs tal-kavità; barra minn hekk, il-ktajjen tal-ġenb Y332, L363, u L302 jistgħu jostakolaw il-kavità, u jnaqqas l-ispazju intern disponibbli għal ligandi (Figura 6E). Din il-kavità żgħira u maqtugħa x'aktarx ma tippermettix l-irbit ta 'ligandi kbar (eż., TCDDor curcumin). Simili għall-mudell strutturali AHR-1, mudell taż-żebrafish zfAhRla wera li l-kavità LBD hija maqtugħa meta mqabbla mal-paralogi li jorbtu TCDD zfAhR1b u zfAhR2 [101]. Ligands żgħar u flessibbli, bħal leflunomide, jorbtu u jattivaw iż-zfAhRla, iżda l-konċentrazzjoni ta 'leflunomide li ttestjajna ma attivatx AHR-1 fis-sistema taċ-ċelluli Cos7 tagħna (Figura 6B). Imbagħad staqsejt jekk mutazzjonijiet fl-aċidi amminiċi responsabbli għall-kavità żgħira tal-LBD jistgħux jippermettu li ligandi klassiċi jattivaw CeAhR. Ir-residwu CeAhR L363 (Figura 6D) jikkorrispondi għal A375 f'mAhRb-Iand V375 f'Madrid, u dan ir-residwu għandu impatt kbir fuq l-irbit tal-ligand [102]. Bl-istess mod, T386 ta' zfAhRla (Figura 6D), li jaqbel ma' A375 f'mAhRb-1 u A386 f'zfAhR1b u zfAhR2, jikkontribwixxi għan-nuqqas ta' rbit ta' TCDD ta' zfAhRla u, meta mutat għal alanine, jerġa' jġib ukoll is-sensittività Y296DDH. introdotti [101]. L-aċidu amminiku Y296 huwa diġà histidine f'C.elegans (H274). Għalhekk, aħna mutat biss il-leucine fil-pożizzjoni L363 fil-vettur CeAhR għal alanine (L363A) (Figura 6D, E indikata minn vleġġa). Barra minn hekk, biddel l-istidina fil-viċin fil-pożizzjoni H365 għal glutamina (H365Q), li hija Q377 fil-ġrieden (Figura 6D, E indikata permezz ta 'vleġġa) peress li x'aktarx tifforma rabta idroġenu ma' H274 u tista 'tikkontribwixxi għall-kavità żgħira ta' AHR { {49}} (Figura 6E). Imbagħad ittestjajna jekk il-ligandi AhR tal-mammiferi jaffettwawx l-attività AHR-1 meta L363 u H365 jiġu mutati. Madankollu, dawn l-alterazzjonijiet, minflok ma jirrestawraw ir-rispons għal ligandi ksenobijotiċi bħal f'zebrafish [101], neħħew anke l-attività bażali AHR-1, simili għall-allel ju145 (Figura 6F). Dawn ir-riżultati juru differenzi ċari bejn l-LBDs ta' C.elegans u zebrafish iżda juru li l-LBD huwa fundamentali għall-attività bażali AHR-1. Flimkien ma' studji preċedenti [35,38,82], ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li l-AHR-1 x'aktarx li ma jkunx involut fir-rispons ta' transattivazzjoni klassiku indott minn ksenobijotiċi, li għalhekk jista' ma jkunx rilevanti għal ahr-1-regolat. tixjiħ fiżjoloġiku. Minflok, il-komposti derivati ​​mill-pjanti jistgħu jeżerċitaw effetti konservati tal-inqas parzjalment permezz tat-trażżin tal-mogħdijiet modulati AHR-1-. Il-mudell 3D tagħna jissuġġerixxi li l-kurkumina ma timmodulax l-attività AHR-1 billi torbot l-LBD tagħha. Għalhekk, is-soppressjoni tal-attività AHR-1 mill-curcumin tista 'tkun dovuta għall-effett antiossidant tagħha. B'mod konsistenti ma' din il-possibbiltà, u s-sensittività miżjuda tal-mutanti ta' C.elegans ahr-1 għall-istress ossidattiv, sibna li l-attività AHR-1 hija tabilħaqq miżjuda b'aġenti li jinduċu ROS. Jiġifieri, iċ-ċelluli Cos7 ittrattati bir-rotenone pro-ossidant urew żieda fl-attività AhR meta trasfettati jew ma 'C.elegans jew AhR murina iżda mhux meta trasfettati bl-allel jul45 jew l-allele b'mutazzjonijiet LBD (Figura 6G, H).

B'mod ġenerali, filwaqt li l-attivazzjoni ta 'CeAhR tipproteġi kontra l-istress ossidattiv kmieni fil-ħajja, l-espressjoni mnaqqsa tagħha tikkontrobatti t-tixjiħ u timmedja l-effett ta' benefiċċju kontra t-tixjiħ tal-curcumin (Figura 7). Il-kurkumina għalhekk tista' tgħin biex tibbilanċja l-attivazzjoni ta' TF redox b'mod dipendenti fuq il-kuntest u l-ħin u tiffavorixxi s-soppressjoni ta' AhR direttament permezz tal-effett antiossidant tagħha u/jew permezz tal-attivazzjoni ta' Nrf2/SKN-1 (jew TF ieħor), li jistgħu fl-istess ħin jimmedja l-attività kontra t-tixjiħ tal-curcumin.

Figura 6. Il-kurkumina u l-pro-ossidanti għandhom effetti opposti fuq l-attività AHR-1. (AC) Evalwazzjoni tal-attività AHR-1 wara trattament bil-komposti indikati fiċ-ċelloli Cos7 trasfettati jew b'wt AHR-1(wt) jew AHR-1 li jġorru l-mutazzjoni punt ju145 (ju145) u AHA-1 kif ukoll luciferase li jinduċibbli mill-XRE. Boxplots juru dejta ta' 3-5esperimenti.* valur p<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">

Figura 7. Mudell propost tal-mogħdija tas-sinjalar AHR-1 fir-rispons ta 'C.elegan għal pro-u antiossidanti. F'kundizzjonijiet "normali" (pannell tan-nofs), AHR-1 hija attivata minn ROS intraċellulari. Dan iwassal għat-twaqqigħ tal-chaperones minn AHR ċitosolika-1 u t-traslokazzjoni nukleari sussegwenti ta 'AHR-1. Fin-nukleu, AHR-1 jifforma eterodimer bit-traslokatur nukleari AHR (AHA{{ {7}}) u jeħel ma' XREs ta' ġeni fil-mira, li mbagħad iwassal għat-tnaqqis fil-livelli ta' ROS intraċellulari. F'dawn il-kundizzjonijiet, it-telf tal-funzjoni ahr-1 iwassal għal żieda fil-ħajja. Fil-preżenza ta 'antiossidanti (pannell tax-xellug), il-konċentrazzjonijiet ta' ROS intraċellulari huma baxxi li jwasslu għal AHR-1 li jirrisjedi fiċ-ċitoplasma, marbut mill-kofatturi tiegħu. L-inibizzjoni tal-attività bażali AHR-1 twassal għal tul ta' ħajja akbar. Fil-preżenza ta' pro-ossidanti (pannell tal-lemin) AHR-1 huwa attivat minn ROS eċċessiv, li jirriżulta fit-traslokazzjoni nukleari tiegħu, il-formazzjoni ta' eterodimer AHR{-1-AHA{-1, u l-bidu ta' traskrizzjoni tal-ġeni fil-mira. Fl-ahr-1 KO, id-ditossifikazzjoni mnaqqsa ta' ROS permezz ta' ġeni fil-mira indotti mill-AHR-1- twassal għal akkumulazzjoni ta' ROS u tagħmel l-ahr-1 KO suxxettibbli.

4. Diskussjoni

AhR oriġinarjament ġie skopert fil-mammiferi għall-attività ta 'rispons ksenobijotiku tiegħu indott fuq l-irbit ta' tossiċi ambjentali jew ligands endoġeni, iżda modulaturi li ma jiddependux fuq l-irbit tal-ligand jeżistu wkoll iżda huma ħafna inqas investigati. C.elegans jirrappreżenta organiżmu mudell uniku biex jinvestiga l-attivitajiet AhR indipendenti mir-rispons ksenobijotiku klassiku tiegħu peress li CeAhR ma jorbotx ligandi AhR prototipi [35,39]. Bl-użu ta' dan il-mudell, identifikajna funzjoni kkonservata b'mod evoluttiv għall-AhR fil-proċess tat-tixjiħ [14] u wrejna li wħud mill-modulaturi tal-AhR tal-mammiferi (jiġifieri, batterji, Bal, u UVB) jaffettwaw il-parametri tat-tixjiħ permezz tal-AHR-1 f' b'mod dipendenti mill-kuntest [25]. Hawnhekk, segwejna s-sejbiet preċedenti tagħna b'investigazzjoni aktar mekkanistika tal-karatteristiċi tat-tixjiħ irregolati mill-AhR madwar l-ispeċi mill-polifenol curcumin tad-dieta. L-analiżi magħquda tagħna in vivo, in vitro, u in silico żvelaw xenarju ġdid u kumpless: filwaqt li l-curcumin jippromwovi karatteristiċi kontra t-tixjiħ fin-nematodi u l-EC primarja umana tal-inqas parzjalment b'mod dipendenti fuq AhR, l-effetti antiossidanti tagħha fiż-żewġ speċi jiddependu. fuq mekkaniżmi indipendenti mill-AhR iżda primarjament dipendenti Nrf2/SKN-1.

Urejna għall-ewwel darba li l-curcumin ittardja t-tixjiħ fiżjoloġiku ta' C.elegans b'mod dipendenti fuq l-AHR-1-. Fit-tfittxija ta 'effettituri possibbli downstream dipendenti ahr-1-tal-curcumin, użajna approċċi mmirati u imparzjali u sibna li l-maġġoranza tal-ġeni regolati b'mod differenzjat mat-trattament tal-curcumin huma regolati b'mod AHR-1-dipendenti. Barra minn hekk, ħafna minn dawn il-ġeni wrew mudell ta' espressjoni simili f'annimali mnaqqsa u ttrattati bil-kurkumina AHR-1-, li jissuġġerixxi li l-kurkumina qed tippromwovi l-estensjoni tal-ħajja permezz tat-trażżin tal-attività tal-AHR-1. B'mod sorprendenti, la l-analiżi mmirata u lanqas it-traskriptomika ma indikaw rwol ewlieni għall-ġens tal-miri AhR klassiċi bħal tazzi, li minflok instabu li fil-biċċa l-kbira kienu sottoespressi fin-newroni (Larigot et al.; sottomessi flimkien ma 'dan l-istudju). Interessanti, dawn is-sejbiet jistgħu jindikaw li t-traskriptomika tal-annimali sħaħ tista 'taħbi l-effetti speċifiċi għan-newroni ta' AhR, f'dan il-każ speċifiku permezz tal-ġeni cps. Sibna li fost il-ġeni espressi b'mod differenzjat, ħafna jappartjenu għal enzimi ta' ditossifikazzjoni tal-fażi II, bħall-imsaren-45, li żdiedet kemm bit-tnaqqis ta' ahr-1 (u fil-moħħ tal-ġrieden AhR KO) u kura tal-kurkumina biex timmedja l-estensjoni tal-ħajja tagħhom. Minflok, it-trattament tal-kurkumina u t-tnaqqis ta' ahr-1 żiedu l-espressjoni ta' enzima oħra ta' ditossifikazzjoni tal-fażi II, GST-4, permezz ta' mekkaniżmi differenti: l-ewwel jiddependu fuq, filwaqt li l-aħħar huwa prinċipalment indipendenti minn, Nrf2/ SKN-1, TF redox klassiku li jinduċi GST-4 fuq stress ossidattiv f'C.elegans [103]. Barra minn hekk, filwaqt li l-curcumin jinduċi risponsi dipendenti Nrf2/SKN-1-f'C.elegans (espressjoni GST-4) u EC primarja umana (espressjoni Sod2 u kapaċità migratorja), tipproteġi wkoll lil C.eleans kontra stress ossidattiv f' b'mod SKN-1-indipendenti. F'C.elegans, il-kurkumina ma tistax testendi l-ħajja fil-mutanti tal-ġilda morda ħafna-1(zu67) [104], filwaqt li GST-4 jista' jiġi indott b'mod SKN-1-indipendenti permezz ta' sinjalazzjoni tal-EGF [94] u crosstalk bejn il-mogħdija tal-EGF u l-AhR kien irrappurtat fil-mammiferi [105].

Interessanti, u bil-maqlub tar-razza tat-tip selvaġġ, osservajna effett indipendenti mill-AHR-1-tal-curcumin fuq is-saħħa f'mudelli ta' nematodi għall-marda ta' Huntington u Parkinson, rispettivament. F'dawn ir-razez, it-trattament tal-kurkumina żied in-numru ta' aggregati tal-proteini bl-istess mod bħad-defiċjenza ta' AHR-1, li jindika jew effett protettiv tal-aggregazzjoni tal-proteini nnifisha u/jew attivazzjoni tal-kurkumina ta' mogħdijiet li jipproteġu kontra l-aggregazzjoni tal-proteini indipendentement minn a/ hr-1 tnaqqis. L-influwenza tal-curcumin fuq l-aggregazzjoni tal-proteini hija kontroversjali: intwera li jinibixxi l-formazzjoni tal-fibri iżda wkoll li torbot speċi pre-fibrillari / oligomeriċi ta 'proteini amilojdoġeniċi, u b'hekk taċċellera l-aggregazzjoni tagħhom u tnaqqas in-newrotossiċità ġenerali [106]. Ta' min jinnota, il-kaffeina, li tipproteġi wkoll kontra l-karatteristiċi tat-tixjiħ kardjovaskulari [66,107], tipprevjeni wkoll il-paraliżi indotta minn A mingħajr ma tnaqqas l-aggregati A iżda permezz tal-attivazzjoni tal-mogħdija protettiva Nrf2/SKN-1-dipendenti [108]. Ikun importanti li jiġi vvalutat jekk l-effett protettiv indott mill-curcumin jew it-tnaqqis kollu-1 fil-mudelli tal-marda C.elegans huwiex medjat minn mekkaniżmi li jippromwovu t-tneħħija ta’ speċi oligomeriċi/pre-fibrillari f’aggregati inqas tossiċi u/jew minn l-attivazzjoni ta' mekkaniżmi oħra, bħal Nrf2/SKN-1, li fl-istess ħin jistgħu jipproteġu kontra l-proteotossiċità. Ta 'min jinnota, l-enzimi ta' ditossifikazzjoni jista 'jkun fihom kemm XRE kif ukoll ARE (elementi li jirrispondu għall-antiossidanti), u ġiet deskritta interazzjoni bejn is-sinjalar regolat Nrf2/ARE u AhR/XRE [109]. Għalhekk se jkun interessanti li jiġi ċċarat kif il-kurkumina tippromwovi l-effetti ta 'benefiċċju differenti kontra t-tixjiħ tagħha permezz tal-bilanċ bejn is-sinjalar regolat minn Nrf2 u AhR.

L-approċċi kkombinati tagħna wrew li l-curcumin jinibixxi l-attività AHR-1. Fil-mammiferi, ġie ssuġġerit li l-effett inibitorju AhR tal-curcumin huwa medjat minn rbit dirett LBD [110] jew inibizzjoni tal-proteina kinase C li fosforila AhR[79]. Studju ieħor indika li l-attività tat-traskrizzjoni tal-AhR hija dipendenti fuq l-istatus redox ċellulari u l-istruttura tal-kromatina, li t-tnejn huma influwenzati mill-curcumin[111]. Filwaqt li l-AHR-1 ma torbotx it-TCDD, jorbot lill-XRE in vitro[36] iżda studji sistematiċi, li jindirizzaw il-potenzjal tal-idrokarburi poliaromatiċi, jew ligandi AhR oħra tal-mammiferi biex jimmodulaw l-AHR-1, huma nieqsa primarjament minħabba in-nuqqas ta’ għodod xierqa biex jiġi evalwat dan. L-istudji tagħna jippruvaw jimlew dan il-vojt u jisfruttaw iċ-ċelluli Cos7 li jesprimu AHR-1 akkoppjati ma' testijiet tal-luċiferażi (Larigot et al.; sottomessi flimkien ma' dan l-istudju) u l-immudellar in silico ta' C. elegans LBD, urew li l-curcumin irażżan l-AHR -1 attività, iżda x'aktarx mhux b'rabta diretta LBD. L-assaġġ in vitro użat fl-istudju tagħna kkonferma li CeAhR mhuwiex attivat permezz tas-sinjalar klassiku tal-ksenobijotiċi. Madankollu, ma jiżvelax attivitajiet minħabba l-irbit ta' AhR ma' sekwenzi tad-DNA minbarra l-XRE "klassiku" misjub f'CYP1A1 bħall-XRE li jirrispondu għall-polifenol (quercetin) misjub f'PON1 [112,113]. L-immunostaining fl-EC primarju tal-bniedem jargumenta wkoll kontra l-kurkumina li tinduċi t-traslokazzjoni nukleari AhR, li, flimkien mal-effett promottiv tal-kapaċità migratorja fiċ-ċelloli li jesprimu żżejjed AhR, tista 'tindika wkoll li l-curcumin trażżan l-attività AhR.

Nipproponu li l-effett inibitorju tal-curcumin, aktar milli jiddependi fuq l-irbit ta 'AhR, jinvolvi l-abbiltà antiossidant tiegħu, li tista' tabilħaqq tkun assoċjata ma ', jew saħansitra tiddependi fuq, l-attivazzjoni ta' Nrf2/SKN-1. AhR tal-mammiferi huwa attivat minn ROS permezz ta 'modifika ossidattiva indipendenti mill-LBD [85], iżda d-dejta tagħna turi li l-induzzjoni tal-attività AHR-1 mill-rotenone pro-ossidant teħtieġ l-LBD. Mekkaniżmu indirett ta 'attivazzjoni AhR medjata minn ROS huwa l-formazzjoni tal-ligand AhR qawwi FICZ[114]. Madankollu, FICZ hija molekula planari kbira li, skont il-mudell in silico tagħna, ma tkunx taqbel mal-AHR-1 LBD. Filwaqt li l-mekkaniżmu eżatt li bih l-attività AHR-1 tiġi promossa minn ROS u inibita mill-curcumin (jew permezz tat-tifi diretta ta’ ROS jew indirettament permezz ta’ attivazzjoni ta’ Nrf2 jew ġeni regolatorji ta’ antiossidanti oħra) għad irid jiġi stabbilit, dan huwa appoġġjat b’mod qawwi minn tagħna sejbiet: AHR-1 huwa attivat minn rotenone, u mutanti ahr-1 juru aktar mtROS, potenzjal imnaqqas tal-membrana mitokondrijali u huma aktar sensittivi għal H, O, u juglone kif ukoll għal UVB u BaP [25] , li t-tnejn jipproduċu ROS[115,116]. F'dan il-kuntest, huwa interessanti li wieħed jinnota li mutanti ahr-1 juru alterazzjoni ħafifa tal-funzjonijiet mitokondrijali, li jixbħu lil dawk tal-mitohormesis [117. Dan jissuġġerixxi li t-tnaqqis kollu-1 (u l-curcumin possibbli billi jinibixxi l-AHR-1) jista 'jippromwovi l-medda tas-saħħa permezz ta' stress mitokondrijali ħafif, li huwa magħruf li jestendi l-ħajja ta 'C.elegan permezz ta' ġeni ta 'ditossifikazzjoni modulati b'mod simili fl-ieħor-1 {20}} mutanti [118,119]. Barra minn hekk, jekk Nrf2/SKN-1 u l-mitokondrija għandhomx rwol fil-modulazzjoni tal-attività tal-AHR-1 mat-trattament tal-kurkumina hija possibbiltà interessanti li għad trid tiġi vvalidata.

B'mod ġenerali, billi tieħu vantaġġ mill-karatteristiċi multipli offruti min-nematodu C.elegans għal studji in vivo, nissuġġerixxu li l-funzjoni antenati tal-AhR tista 'tkun fir-regolamentazzjoni ta' enzimi tal-fażi ll relatati ma 'antiossidanti aktar milli risponsi ksenobijotiċi. Oppost għall-effetti detrimentali indotti minn livelli għoljin ta 'ROS, l-effetti ta' benefiċċju promossi minn defiċjenza ta 'AhR jistgħu jkunu medjati minn stress ħafif tal-mitokondrija u/jew produzzjoni ħafifa ta' ROS (mitohormesis), li jiddependu wkoll fuq Nrf2/SKN -1. Aħna nipprovdu wkoll evidenza qawwija għall-interazzjoni bejn il-kurkumina u l-AhR. L-inibizzjoni tal-kurkumina tas-sinjalar tal-AhR hija kkonservata b'mod evoluttiv u x'aktarx mhix medjata billi torbot mal-AhR LBD, iżda pjuttost permezz tal-propjetajiet tal-curcumin li jneħħu r-ROS jew l-attivazzjoni ta 'Nrf2/SKN-1. Il-mogħdija tas-sinjalar Nrf2 tista 'tabilħaqq tiġi attivata mill-curcumin b'modi differenti [91]. Fl-aħħarnett, id-dejta tagħna wriet li l-curcumin jippromwovi effetti kontra t-tixjiħ ukoll b'mod indipendenti kemm f'C.elegans (żieda fl-espressjoni GST-4 u reżistenza għall-istress ossidattiv) u EC primarja umana (żieda fl-espressjoni ta' Sod2 u kapaċità migratorja). ), li jistgħu jispjegaw ukoll l-effetti addittivi tal-kurkumina u t-telf tal-funzjoni AHR-1 fuq il-medda tas-saħħa tal-annimali li jesprimu l-polyQ.

5. Konklużjonijiet

Bħala konklużjoni, permezz ta 'kombinazzjoni oriġinali ta' approċċi in silico, vitro, u in vivo, urejna li filwaqt li l-attivazzjoni ta 'CeAhR tipproteġi kontra l-istress ossidattiv kmieni fil-ħajja, l-espressjoni mnaqqsa tagħha tikkontrobatti t-tixjiħ u timmedja l-effett ta' benefiċċju kontra t-tixjiħ tal-kurkumina (Figura 7) . Il-kurkumina għalhekk tista’ tgħin fl-ibbilanċjar tal-attività ta’ fatturi ta’ traskrizzjoni differenti involuti fir-reazzjonijiet ta’ ditossifikazzjoni/antiossidanti (jrażżnu AhR u jattivaw Nrf2) f’kundizzjonijiet fejn dawn ikunu mibdula (iżdied AhR u jonqos Nrf2/SKN-1), bħax-xjuħija jew disturbi assoċjati mal-età. Ix-xogħol tagħna jżid livell ulterjuri ta 'kumplessità għall-attivitajiet multifunzjonali u speċifiċi għall-kuntest diġà vasti ta' AhR, b'riperkussjonijiet importanti fuq is-saħħa tal-organiżmi u l-ħajja. Barra minn hekk, tiftaħ il-bieb għal studji addizzjonali, bl-użu tas-sistema tan-nematodi biex jiskopru u jinvestigaw funzjonijiet antenati tal-AhR, li huma inqas probabbli li jiġu identifikati fil-mammiferi.

Dan l-artikolu huwa estratt minn Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants