Strateġija ta' Sensing ta' Patoġenu Innat li Tinvolvi Ubikwitinazzjoni ta' Proteini tal-wiċċ Batterjali Parti 2

DISKUSSJONI

Metazoans jużaw ubiquitination bħala mekkaniżmu versatili biex iżommu l-omeostasi ċitosolika, jipprevjenu l-akkumulazzjoni ta 'proteini/organelli bil-ħsara u jiddefendu kontra patoġeni li jinvaduh (40, 41). Minħabba l-varjetà ta 'patoġeni u settijiet differenti ta' proteini bil-ħsara li jiltaqgħu magħhom, l-identifikazzjoni ta 'motifi komuni għar-rikonoxximent tas-sottostrat u l-ubiquitination sussegwenti tirrappreżenta strateġija intelliġenti għall-ottimizzazzjoni tar-riżorsi. Proteini fiċ-ċelloli ewkarjotiċi li huma ddestinati għall-proteolysis huma tipikament identifikati minn motif degron tripartitiku (24).

L-immunità hija l-abbiltà tal-ġisem li jiġġieled il-mard, inklużi r-risponsi għall-batterji, viruses, u sustanzi oħra ta 'ħsara. Jekk is-sistema immuni tal-ġisem tkun kompromessa, mhux se tkun b'saħħitha biżżejjed biex tittratta l-attakk tal-mard. Studji wrew li l-malnutrizzjoni għandha impatt fuq il-funzjoni tas-sistema immuni, u tagħmel il-ġisem aktar suxxettibbli għall-infezzjoni u l-mard. Il-proteina hija waħda mis-sustanzi importanti biex tinżamm l-immunità.

Il-proteini huma magħmula minn aċidi amminiċi, li wħud minnhom jissejħu aċidi amminiċi essenzjali minħabba li jridu jiġu pprovduti mill-ikel u ma jistgħux jiġu sintetizzati mill-ġisem. Dawn l-aċidi amminiċi essenzjali jinkludu tryptophan, leucine, phenylalanine, lysine, isoleucine, methionine, valine, u histidine. Jekk il-ġisem ma jiksibx biżżejjed aċidi amminiċi essenzjali, jista 'jwassal għal metaboliżmu tal-proteini indebolit, li jista' jaffettwa l-funzjoni tas-sistema immuni.

Barra minn hekk, konsum ta 'proteini ta' kwalità għolja jgħin biex iżżomm sistema immuni normali u funzjonijiet tal-ġisem. Meta l-ġisem ikun nieqes mill-proteini, jista 'jwassal għal sistema immuni kompromessa u l-ġisem ikun aktar suxxettibbli għall-mard. Jekk il-ġisem tal-bniedem nieqes mill-proteini għal żmien twil, jista 'jikkawża ħsara fit-tul lis-sistema immuni, u jagħmel lin-nies suxxettibbli għal diversi mard.

Għalhekk, dieta bilanċjata u eżerċizzju xieraq huma ċ-ċwievet biex jinżamm il-konsum tal-proteini. In-nies jistgħu jissodisfaw il-ħtiġijiet tal-proteini tal-ġisem tagħhom billi jieklu ikel aktar rikk fil-proteini bħal laħam, tjur, ħut, fażola, bajd, prodotti tal-ħalib, qmuħ, ġewż, u żrieragħ. Barra minn hekk, eżerċizzju moderat jista 'wkoll iżid id-domanda tal-ġisem għall-proteina u l-effiċjenza ta' assorbiment. Dieta bilanċjata u varjata u stil ta’ ħajja b’saħħtu huma ċ-ċwievet biex tinżamm l-immunità, biex il-ġisem jinżamm b’saħħtu u stabbli, u biex tirreżisti l-invażjoni tal-mard. Minn dan il-lat, jeħtieġ li ntejbu l-immunità tagħna. Cistanche jista 'jtejjeb l-immunità b'mod sinifikanti minħabba li l-polisakkaridi fil-laħam jistgħu jirregolaw ir-rispons immuni tas-sistema immuni tal-bniedem, itejbu l-abbiltà tal-istress taċ-ċelloli immuni, u jtejbu l-immunità taċ-ċelloli immuni. Effett batteriċida.

Ikklikkja suppliment cistanche deserticola

Dan wassalna biex nesploraw jekk motivi simili jistgħux jinstabu fuq uċuħ patoġeniċi, fejn jistgħu jiffunzjonaw bħala prokura għar-rikonoxximent tas-sottostrat. Hawnhekk, aħna nuru li ospitanti ubiquitin ligases jużaw firem molekulari simili biex iħossu patoġeni distinti filoġenetikament. Ir-rikonoxximent tal-patoġenu permezz ta' mudelli/mottivi molekulari komuni (PAMPs) huwa karatteristika kkaratterizzata sew tal-immunità innata (42). Ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li sekwenzi bħal degron fi ħdan il-proteini tal-wiċċ batterjali jaġixxu b'mod ekwivalenti għal PAMPs, biex jagħtu sorveljanza tal-patoġenu intraċellulari. Dan il-modus operand jista 'jiġi sfruttat aktar mill-ospitant għall-preżentazzjoni ta' antiġeni tal-proteini mikrobiċi fuq il-kumpless maġġuri ta 'istokompatibilità I biex jinduċi rispons CD8 qawwi dirett kontra patoġeni intraċellulari.

L-importanza potenzjali ta 'sejbien medjat mill-ubiquitin ta' patoġeni għad-difiżi ospitanti hija enfasizzata aktar mill-ubiquitination residwu sostanzjali misjuba f'SPN mutanti li m'għandhomx kemm BgaA kif ukoll PspA. Dan jindika li hemm aktar substrati mhux identifikati tal-makkinarju tal-ubiquitin, bir-redundancy li tirriżulta li tiżgura interċettazzjoni robusta tal-patoġenu. Notevolment, xi mistoqsijiet immedjati dwar il-motif degron u l-importanza tiegħu għall-batterja (minbarra li tkun unità rikonoxxibbli) jipprovdu angolu evoluzzjonarju interessanti.

Il-motif degron huwa dispensabbli in vivo, u jekk xejn, il-mutazzjoni jew it-tħassir tal-motif tejbet il-persistenza intraċellulari li tirriżulta f'żieda fil-virulenza. Dan huwa sostanzjat mir-riżultati tagħna li mutazzjoni fil-motif degron tista 'tintuża minn patoġeni biex jaħarbu r-rikonoxximent medjat mill-ubiquitin kif jidher għas-serotip 19F ta' SPN. Madankollu, in-natura kkonservata tal-motif degron fil-BgaA fil-maġġoranza tas-serotipi SPN tista 'tkun suġġestiva ta' kontrostrateġija adottata mill-batterja biex tkun inqas letali għall-ospitant.

Dan jista' jipprovdi opportunità għall-patoġenu biex iżid il-ħabitats okkupabbli tiegħu. Fl-istess ħin, l-ubiquitination tal-wiċċ batterjali jew il-proteini mnixxija fil-motif degron jistgħu jimmodulawhom b'mod funzjonali biex itaffu jew jaqilbu mill-ġdid ir-rispons ospitanti għal benefiċċju eventwali (43). Għalhekk, il-preżenza jew in-nuqqas ta 'dominji jew motifi funzjonali simili ewkarjotiċi (bħal degrons) jistgħu jkunu dipendenti fuq niċċa patoġenika u adattati biex jevadu jew jimmodulaw ir-risponsi immuni tal-ospitanti.

Mekkaniżmu simili ta 'sensing ta' patoġenu li jinvolvi proteini li jorbtu l-guanylate ġie implikat ukoll fit-tneħħija tal-batterji; madankollu, b'differenza mill-ubiquitination, ir-rwol tagħhom huwa rrappurtat li huwa ristrett għal patoġeni Gram-negattivi (44-47). L-ubikwitinazzjoni timmira lejn il-patoġenu irrispettivament mill-oriġini Gram, pereżempju, RNF213 ġie dokumentat li jimmira lil Listeria spp. irrispettivament min-nuqqas ta' LPS (48). Aħna, għalhekk, ma neliminawx il-possibbiltà tal-azzjoni antimikrobika tagħha kontra SPN ukoll.

Wiċċ patoġeniku jista 'jiġi ubikwitinat b'tipi ta' katina multipli b'ligases E3 differenti b'interazzjonijiet interkatina (41). B'mod partikolari, fil-każ ta 'Mtb, Smurf1, u Parkin ġew ippruvati li jiffurmaw tipi ta' katina K48 u K63 li jiffunzjonaw b'mod sinerġiku biex jiddegradaw il-patoġenu (12). Il-fehim tar-rwol mekkanistiku ta 'ubiquitination K48 u l-ligases E3 involuti matul xenarji ta' infezzjoni għadu mhux studjat. Fil-każ ta 'STm, E3 ligase ARIH1 wieħed ġie muri biex jimmira STm cytosolic bi ktajjen ubiquitin K48 li jwasslu għall-eliminazzjoni tagħhom mis-sistema (15). Fuq il-bażi tas-sejbiet tagħna u ta' oħrajn, il-patoġeni bit-tikketta K48-Ub huma fl-aħħar degradati filwaqt li jkunu assoċjati ma' makkinarju proteasomali.

Madankollu, dan l-istudju juri dekorazzjoni K48-Ub ta' proteini tal-wiċċ batterjali speċifiċi. Xi patoġeni huma magħrufa li jimmodifikaw b'mod attiv il-proteini tal-wiċċ tagħhom, jipproteġuhom mill-ubiquitination u l-qtil sussegwenti, u b'hekk jenfasizzaw is-sinifikat tal-lokalizzazzjoni tal-wiċċ tas-sottostrat tal-ubiquitin (10). Barra minn hekk, patoġeni intraċellulari obbligatorji multipli evolvew strateġiji biex de-ubiquitinate infushom, jew jospitaw komponenti regolatorji, biex jevadu t-tneħħija medjata mill-ubiquitin (5). Flimkien, dawn is-sejbiet jenfasizzaw l-importanza ta 'tqanqil ta' allarm medjat mill-ubiquitin bħala mekkaniżmu fundamentali ta 'sensing ta' patoġenu intraċellulari ċentrali għad-difiżi ospitanti.

L-istudju tagħna wera aktar ir-rwol ċentrali ta 'SCF E3 ligase, partikolarment ma' FBXW7, fl-ubiquitination batterjali li żżid id-degradazzjoni tal-patoġenu. Mutazzjonijiet eterozigoti f'FBXW7, partikolarment R505C (residwu kritiku fil-but tar-rikonoxximent tas-sottostrat) varjant, jikkawżaw karċinomi multipli u lewkimja limfoċitika fil-bnedmin (49, 50). Studju reċenti bbażat fuq koorti indika li kważi 43 fil-mija tal-pazjenti b'lewkimja limfoċitika kronika (CLL) jċedu għal pnewmonja batterjali u sepsis, segwiti minn infezzjonijiet fungali (51).

Dan jikkorrobora l-osservazzjoni tagħna tal-ħila abrogata taċ-ċelloli ospitanti li jkollhom mutazzjoni FBXW7 biex iħossu u jeliminaw il-patoġeni. Is-sejbiet tagħna, għalhekk, jipprovdu spjegazzjoni molekulari mhux mistennija tar-riskju msaħħaħ ta 'infezzjonijiet f'pazjenti b'CLL. Ir-rabta bejn il-polimorfiżmu ġenetiku fil-ġeni E3 ligase u s-suxxettibilità għal infezzjonijiet batteriċi hija wkoll issostanzjata minn pazjenti bil-marda ta 'Parkinson, li huma vulnerabbli għad-deni tifojde jew il-lebbra (14), li jissuġġerixxi l-kontribut notevoli ta' E3 ligase fl-immunità tal-ospiti kontra infezzjonijiet batteriċi u manutenzjoni. ta' stat stabbli ċellulari.

Bħala konklużjoni, aħna ddeċifraw lingwa universali ta 'sensing ta' patoġeni li jgħixu fiċ-ċitosol li jistgħu jiġu applikati b'mod effiċjenti mill-ospitanti biex jirrikonoxxu mikro-organiżmi għall-eliminazzjoni sussegwenti. B'mod kollettiv, dawn is-sejbiet jitfgħu dawl fuq il-fehim tal-proċessi immuni ċellulari rudimentali, li jistgħu jiġu sfruttati biex jintensifikaw l-immunità antibatterika.

MATERJALI U METODI

Kultura taċ-ċelluli

Kemm il-linja taċ-ċelluli tal-karċinoma alveolari tal-pulmun tal-bniedem (pnewmoċiti tat-tip II) A549 [American Type Culture Collection (ATCC) Nru. CCL185)] u l-linja taċ-ċelluli ta' adenokarċinoma ċervikali HeLa (ATCC nru. CRM-CCL-2) ġew ikkultivati ​​fil-mezz ta' Eagle modifikat ta' Dulbecco (DMEM; HiMedia) supplimentat b'10 fil-mija serum tal-fetu bovin (Gibco) f'37 grad u 5. fil-mija CO2.

Razez batterjali u kundizzjonijiet tat-tkabbir

SPN (R6, serotip 2, rigal minn Tim J. Mitchell, Università ta 'Birmingham, ir-Renju Unit) tkabbar f'brodu Todd-Hewitt supplimentat b'1.5 fil-mija estratt tal-ħmira f'37 grad f'5 fil-mija CO2. L-antibijotiċi li ġejjin intużaw biex jikbru kulturi SPN meta meħtieġ: kanamycin (200 ug/ml), spectinomicin (100 ug/ml), u chloramphenicol (4.5 ug/ml). Disa 'mitt mikrolitru ta' 0.4 OD600 (densità ottika f'600 nm) kultura SPN imkabbra tħalltu ma '600 ul ta' 80 fil-mija gliċerol sterili (32 fil-mija konċentrazzjoni finali ta 'gliċerol) u maħżuna f'friża ta' -80 grad. Dawn il-ħażniet tal-gliċerol intużaw bħala inoculum tal-bidu għall-esperimenti kollha.

Il-kulturi ta' Escherichia coli DH5 u STm (ATCC 14028) tkabbru f'brodu Luria-Bertani (LB) f'37 grad taħt kundizzjonijiet ta' tħawwad (200 rpm), u meta meħtieġ, intużaw l-antibijotiċi li ġejjin: kanamycin (50 ug/ml), spectinomiċina (100 ug/ml), chloramphenicol (20 ug/ml), u ampicillin (100 ug/ml). Għall-analiżi kollha ta 'infezzjoni, il-batterji tkabbru sa OD600 ~ 0.4, segwiti minn sospensjoni mill-ġdid f'salina buffered bil-fosfat (PBS) għal densità simili qabel infettat iċ-ċelloli ospitanti.

Screening ta 'proteini fil-mira putattivi ta' ubiquitin

Il-proteini kollha tal-wiċċ preżenti fil-proteome STm u SPN ġew identifikati għall-ewwel darba mil-letteratura ppubblikata. Sekwenzi kompluti ta 'proteini tal-proteini tal-wiċċ inkisbu minn UniProt, li mbagħad intużaw biex jidentifikaw il-preżenza ta' motivi degron. Ġew ikkurati sett ta’ 29 motiv degron putattiv minn letteratura ppubblikata (24, 52, 53) u mid-database tal-Ewkarjotiċi Linear Motif. Il-modulu regex ta 'Python intuża biex jidentifika l-post ta' tali motifi kkurati kollha fis-sekwenzi tal-proteini tal-wiċċ. Twettqet aktar tfittxija lineari biex tidentifika l-preżenza ta 'residwu ta' lisina fil-qrib (8 sa 14-il residwi ta 'aċidu amminiku) għal kull motif degron identifikat. Dan ir-residwu ta' lisina huwa preżunt li jaġixxi bħala s-sit ta' twaħħil għall-parti ta' ubiquitin. Fl-aħħar, is-sekwenzi tal-proteini magħżula ġew mitmugħa f'IUPred (54), għodda ta 'tbassir tal-istruttura tal-proteini, biex tiġi lokalizzata l-preżenza ta' reġjun diżordinat bejn il-motif degron u l-lysine prossimali. Il-proteini li jirriżultaw (BgaA u PspA għal SPN u RlpA għal STm) intgħażlu għall-evalwazzjoni bħala miri ta 'ubiquitination u dekodifikazzjoni tar-rwol tagħhom fit-tneħħija tal-patoġenu.

Kostruzzjoni tar-razza batterjali

L-iskambju alleliku permezz ta 'rikombinazzjoni omologa twettaq bl-użu ta' reġjuni li jġorru l-ġeni li jġorru kasett antibijotiku mdaħħal għall-ġenerazzjoni ta 'razez mutanti kemm f'SPN kif ukoll f'STm (tabella S2).

Għal SPN, 500-bp reġjuni upstream u downstream ta 'bgaA, pspA, u l-ġeni tiegħu ġew amplifikati mill-ġenoma b'primers xierqa (tabella S3) u assemblati fil-vettur pBKS. Wara l-klonazzjoni ta 'dawn il-frammenti, kasett ta' reżistenza għall-antibijotiċi (spectinomiċin għal borża kif ukoll pspA u chloramphenicol għal hysA) ġie mdaħħal f'dan il-kostrutt. Il-plasmidi rikombinanti linearizzati mbagħad ġew trasformati f'WT SPN bl-użu ta 'peptide 1 li jistimula l-kompetenza (GenPro Biotech), rikombinanti ġew magħżula bl-użu ta' antibijotiċi rispettivi, u s-sostituzzjoni tal-ġeni ġiet ikkonfermata permezz ta 'reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR) u sekwenzar tal-loċi tal-ġeni rispettivi. Għal STm, il-metodu λ-red recombinase intuża għall-ġenerazzjoni ta 'mutanti ta' tħassir tal-ġeni (55).

Fil-qosor, sekwenzi omologi għat-truf tal-ġene tal-ħabel ġew mehmuża fis-sekwenzi primer li jintużaw għall-amplifikazzjoni tal-cassette tar-reżistenza għall-kanamycin. Il-cassette mbagħad ġie elettroporat fir-razza WT STm, u knockouts iġġenerati minn rikombinazzjoni omologa ġew magħżula abbażi tar-reżistenza tal-kanamycin. It-tħassir tal-ġeni ġie kkonfermat bl-użu tal-PCR u s-sekwenzjar tal-locus tal-ġeni. Fulllength pspA, hysA, u bgaA-T maqtugħ (1 sa 3168 bp) ġew ikklonati taħt il-promotur P23 fil-vector shuttle pIB166 (56) u użati għall-kumplimentazzjoni.

Dawn il-plażmidi rikombinanti ntużaw ukoll għal mutaġenesi diretta lejn is-sit biex jiġġeneraw varjanti differenti ta' bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R, u bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAKs, pspAKs, pAK315R, pspAK315R, pAK315R, pAK315R, pspAK315R, pspAK315R n ), u tiegħu (hysADegron-BgaA u hysADegron-PspA) bl-użu ta' settijiet ta' primers xierqa (tabella S3) u trasformati f'mutanti ΔbgaA u ΔpspA. Il-kloni kollha ġew ivverifikati permezz tas-sekwenzjar tad-DNA. L-espressjoni ta 'varjanti differenti ta' BgaA, PspA, u HysA ġiet ikkonfermata minn Western blot bl-użu ta 'antikorpi xierqa.

Antikorpi u reaġenti

Anti-Enolase u serum anti-PspA (S. Hammerschmidt, Università ta' Greifswald, il-Ġermanja); serum anti-BgaA (S. King, The Ohio State University, USA); u antikorpi speċifiċi għal His6 (Invitrogen, MA1-21315), rabta K48-Ub (Millipore, 05-1307), rabta K63-Ub (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (Millipore, MAB374), GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z], phosphothreonine (CST, 9381S), IgA, Kappa minn majeloma murina, klonu TEPC-15 (Sigma-Aldrich, M1421), u PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404) ġew akkwistati. Intużaw l-antikorpi sekondarji li ġejjin: horseradish peroxidase (HRP)-tagged anti-fenek (BioLegend, 406401), HRP-tagged anti-mouse (BioLegend 405306), anti-fenek Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), anti-fenek Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), immunoglobulina A kontra l-ġurdien konjugat bil-bijotina (Life Technologies, M31115), Alexa Fluor kontra l-ġurdien (Invitrogen, A31570), Alexa Fluor 488 kontra l-ġurdien (Invitrogen, A21202), anti-goat Fluor 633 (Invitrogen, A21082), u FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Espressjoni u purifikazzjoni tal-proteini

BgaA-T u l-varjanti tiegħu ġew ikklonati f'pET28 bl-użu ta 'siti ta' restrizzjoni Xba I/Not I. Plasmidi rikombinanti li jikkodifikaw BgaA-T b'tag His-terminal N ġew trasformati f'ċelloli E. coli BL21 (DE3) għall-espressjoni tal-proteini. Kolonji trasformati friski tkabbru f'LB li kien fih kanamycin (50 ug/ml) f'37 grad fuq inkubatur ta' shaker għal 12-il siegħa. Wieħed fil-mija tal-kultura primarja ġie miżjud ma' litru ta' brodu LB u inkubat f'37 grad fuq inkubatur ta' shaker sakemm l-OD600nm laħaq bejn 0.6 u 0.8. L-espressjoni tal-proteina ġiet indotta biż-żieda ta '100 μM isopropyl- -D-thiogalactopyranoside (IPTG) u tkabbar il-kultura aktar f'37 grad għal 5 sa 6 sigħat b'aġitazzjoni f'150 rpm.

Iċ-ċelloli nħasdu permezz ta' ċentrifugazzjoni f'6000 rpm għal 10 min f'4 gradi. Il-pellet taċ-ċelluli ġie sospiż mill-ġdid f'buffer A [25 mM tris (pH 8.0) u 300 mM NaCl] u lysed permezz ta 'sonication. Id-debris taċ-ċelluli ġie separat permezz ta' ċentrifugazzjoni (14,000 rpm, 50 min, 4 gradi), u s-supernatant ġie applikat fuq kolonna Ni-NTA, ekwilibrata b'buffer A. Il-kolonna ġiet maħsula b'10 volumi ta' kolonna ta' buffer A, u l-proteini His-tagged ġew elużi b'imidazole (250 mM) fil-buffer A. Il-varjanti kollha ta 'BgaA-T ġew espressi u purifikati bl-użu tal-istess proċedura. FBXW7 ġie subklonat fil-vettur pGEX-4 T{-1 li kellu tag N-terminal glutathione S-transferase (GST) mill-vettur pCMV6-Entry-FBXW7 bl-użu tal-enzima ta' restrizzjoni Eco RI.

FBXW7 b'tikketta GST kien espress f'ċelluli E. coli BL21 (DE3) wara induzzjoni ta' espressjoni ta' proteina b'0.1 mM IPTG u tkabbir fi 30 gradi għal 4 sigħat. GST-FBXW7 mill-estratt mhux raffinat ta 'E. coli ġie ppurifikat bl-użu ta' kromatografija fuq kolonna Glutathione-Sepharose (GE HealthCare). Frazzjonijiet li kien fihom proteini purifikati ġew miġbura u kkonċentrati sa 0.5 mg/ml bl-użu ta '10-kDa filtru ta' qtugħ ta' piż molekulari (Amicon) permezz ta' ċentrifugazzjoni f'4700 rpm f'4 gradi. Il-purità tal-proteini ġiet iċċekkjata fuq l-elettroforeżi tal-ġel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) segwit minn tbajja 'b'Coomassie blu.

Trasfezzjonijiet taċ-ċelluli ospitanti

BgaA-T ġie kklonat f'vettur pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene nru. 130261) li jinduċi doxycycline (Addgene nru. 130261) bl-użu ta' kit ta' klonazzjoni ta' infużjoni (Takara). Klon pożittiv ġie kkonfermat bis-sekwenzjar ta' Sanger. Il-mutazzjoni FBXW7R505C twettqet b'mutaġenesi diretta lejn is-sit bl-użu ta' pMRX-GFP-FBXW7 bħala mudell u kkonfermata bis-sekwenzjar Sanger. It-trasfezzjonijiet kollha saru bl-użu ta 'reaġent Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific), u l-għażliet saru fil-preżenza ta' blasticidin hydrochloride (2 ug / ml; HiMedia).

knockdown tal-ġene dirett minn siRNA

Għal knockdown medjat mill-interferenza tal-RNA ta' ġeni speċifiċi, intużaw is-siRNAs li ġejjin: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819), u siGSK3 (Dharmacon ON-TARGET) SMARTpool L-003010-00-0005). Fil-qosor, ċelluli A549 mkabbra fi 24-platt tajjeb ġew trasfettati b'mod temporanju b'siRNAs jew scramble (siControl) speċifiċi għall-ġeni (siControl) (150 pmol) bl-użu ta' Lipofectamine 3000 skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Sitta u tletin siegħa wara t-trasfezzjoni, iċ-ċelloli ġew ipproċessati għal Western blotting u immunofluworexxenza jew analiżi tal-protezzjoni tal-peniċillina-gentamycin.

Tbassir tal-istruttura u mmudellar

L-istrutturi kollha kienu mbassra minn AlphaFold (Protein Omology/analogy Recognition Engine V 2.0) (57) u viżwalizzati bl-użu ta 'PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, verżjoni 2.0 Schrödinger, LLC). L-istrutturi kienu kkodifikati bil-kulur f'PyMol ibbażati fuq punteġġi IUPred (54) li jvarjaw minn ordnat (blu) għal diżordinat (aħmar) permezz ta' abjad.

Western blotting

Kulturi SPN mkabbra għal {{0}}.4 OD600nm ġew lysed permezz ta 'sonikazzjoni, u estratti mhux raffinati nġabru wara ċentrifugazzjoni (15,000 rpm, 30 min, 4 gradi). Għal A549s, monosaffi ġew maħsula diversi drabi bil-PBS u lisati f'assaġġ ta' radjoimmunopreċipitazzjoni (RIPA) kiesaħ fis-silġ [50 mM tris-Cl (pH 7.89), 150 mM NaCl, 1 fil-mija Triton X-100, 0.5 fil-mija sodju deoxycholate, u 1 fil-mija SDS] li fihom cocktail inibitur tal-protease (Promega), fluworidu tas-sodju (10 mM), u EDTA (5 mM). Is-sospensjoni taċ-ċelluli ġiet ivvibrata fil-qosor u ċentrifugata biex tiġbor lisati taċ-ċelluli. Proteini preżenti f'lisati taċ-ċelluli batterjali jew A549 (10 jew 20 ug) ġew separati fuq ġels SDS-PAGE ta '12 fil-mija u trasferiti għal membrana attivata ta' polyvinylidene difluoride. Wara l-imblukkar f'5 fil-mija ħalib xkumat, il-membrani ġew ittestjati b'antikorpi xierqa primarji u sekondarji mmarkati HRP. Il-blots ġew żviluppati fl-aħħar bl-użu ta 'sottostrat ta' kimiluminixxenza msaħħa (Bio-Rad).
Assaġġ tal-protezzjoni tal-peniċillina-gentamicin

Razez SPN imkabbra sa OD600nm 0.4 f'brodu Todd-Hewitt supplimentat b'0.2 fil-mija estratt tal-ħmira (THY) ġew imqassma, sospiżi mill-ġdid f'PBS ( pH 7.4), u dilwit f'mezz ta' analiżi għall-infezzjoni ta' monosaffi A549 b'multipliċità ta' infezzjoni (MOI) ta' 10. Wara siegħa ta' infezzjoni, il-monosaffi ġew maħsula b'DMEM u inkubati b'mezz ta' analiżi li kien fih peniċillina (10 ug/ml). ) u gentamicin (400 ug/ml) għal sagħtejn biex joqtol SPN extraċellulari. Iċ-ċelloli mbagħad ġew lysed b'0.025 fil-mija Triton X-100, u l-lysate ġie miksi fuq pjanċi tal-agar Brain Heart Infusion biex jiġu enumerati SPN vijabbli. L-invażjoni perċentwali ġiet ikkalkulata bħala [unitajiet li jiffurmaw kolonji (CFU) fil-lisat/CFU użat għall-infezzjoni] × 100. Biex tiġi vvalutata s-sopravivenza intraċellulari, f'9 sigħat wara l-infezzjoni (mill-bidu tat-trattament tal-peniċillina-gentamycin), ġew ippreparati lisati taċ-ċelluli bħala imsemmija hawn fuq, u mifruxa plated u batterji superstiti ġew enumerati. L-effiċjenza tas-sopravivenza (perċentwali) kienet rappreżentata bħala bidla darbiet fil-perċentwali tas-sopravivenza relattiva għall-kontroll fil-punt taż-żmien indikat (normalizzat għal 0 sigħat).

Immunofluworexxenza

Għal analiżi ta 'immunofluworexxenza, ċelluli A549 jew HeLa tkabbru fuq coverslips tal-ħġieġ u infettati b'razez SPN jew STm f'MOI ~ 25 għal siegħa segwiti minn trattament antibijotiku għal sagħtejn. F'punti ta 'żmien mixtieqa wara l-infezzjoni (9 sigħat għal infezzjoni SPN f'A549s u 3 sigħat għal infezzjoni b'STm f'HeLa), iċ-ċelluli ġew maħsula b'DMEM u mwaħħla b'metanol imkessaħ bis-silġ fi -20 grad għal 10 min. Barra minn hekk, il-coverslips ġew imblukkati bi 3 fil-mija albumina tas-serum bovin (BSA) f'PBS għal sagħtejn f'temperatura tal-kamra (RT). Iċ-ċelloli mbagħad ġew ittrattati b'antikorp primarju xieraq f'1 fil-mija BSA f'PBS matul il-lejl f'4 gradi, maħsula b'PBS, u inkubati b'antikorp sekondarju adattat f'1 fil-mija BSA f'PBS għal siegħa f'RT. Fl-aħħar, coverslips ġew maħsula bil-PBS u mmuntati fuq glassslides flimkien ma 'VECTASHIELD bi jew mingħajr 4′,6-diamidino{-2-phenylindole (Vector Laboratories) għall-viżwalizzazzjoni bl-użu ta' mikroskopju konfokali tal-iskannjar bil-laser (LSM 780, Carl Zeiss). ) taħt 40× jew 63× objettivi taż-żejt. L-immaġini ġew akkwistati wara qsim ottiku u mbagħad ipproċessati bl-użu tas-softwer ZEN lite (verżjoni 5.0). Il-mikroskopija ta 'superresolution saret bl-istess mod bl-użu ta' Elyra 7 (Carl Zeiss) fil-modalità SIM. Għall-analiżi tal-kololizzazzjoni, il-batterji ġew skurjati b'għadd viżwali ta 'n > 100 batterja għal kull replika.

Mikroskopija elettronika ta' trażmissjoni

Wara infezzjoni b'SPN u STm, iċ-ċelloli ġew maħsula b'{{0}}.1 M sodium cacodylate buffer, iffissat b'2.5 fil-mija glutaraldehyde (Sigma-Aldrich) f'{{{0}.1 M sodium cacodylate buffer ( Sigma-Aldrich) għal 3 sigħat f'4 gradi. Wara l-iffissar, iċ-ċelluli nġabru permezz ta 'barraxa taċ-ċelluli u ġew imqassma f'2000 rpm għal 10 min. Iċ-ċelloli mbagħad ġew maħsula b'0.1 M sodium cacodylate buffer u postfixed b'1 fil-mija osmium tetroxide f'0.1 M sodium cacodylate buffer għal 20 min f'4 gradi. Wara ħasliet sussegwenti b'cacodylate buffer u ilma distillat, iċ-ċelloli ġew imbagħad deidrati f'konċentrazzjonijiet dejjem jiżdiedu ta 'etanol (50, 70, 95, u 100 fil-mija) u propylene oxide għal 30 minuta u fl-aħħar inkorporati fir-reżina epoxy (Electron Microscopy Sciences, 14300) polimerizzazzjoni f'75 grad għal 45 min. Sussegwentement, il-kapsuli ġew trasferiti għal forn ta '95 grad għal 45 min. Sezzjonijiet ultrarqaq (70 nm) inqatgħu bl-użu ta 'sikkina djamant fuq Leica EM UC7 Ultramicrotome u mtebbgħin b'2 fil-mija uranyl acetate u 1 fil-mija taċ-ċomb ċitrat u meqjusa bl-użu ta' mikroskopju elettroniku ta 'trażmissjoni (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) f'120 KV.

Ubikwitinazzjoni ex vivo

A549-li jesprimi BgaA-T u l-varjanti tiegħu ġew ittrattati b'MG132 (5 μM), u l-espressjonijiet tal-proteini ġew indotti b'doxycycline (100 ug/ml) għal 24 siegħa. Iċ-ċelloli mbagħad ġew lysed fil-buffer RIPA, u l-kampjuni ġew elettroforizzati minn SDS-PAGE (8 fil-mija). Il-konferma tal-espressjoni tal-proteini u l-ubiquitination ta' BgaA-T u l-varjanti tagħha ġew ippruvati permezz ta' Western blot wara probing b'antikorpi anti-BgaA u anti-K48-Ub, rispettivament.

Ubikwitinazzjoni in vitro

Għal testijiet ta 'ubiquitination in vitro, proteini rikombinanti ġew ippurifikati kif deskritt qabel (58). Il-kumpless SCFFBW7 E3 ligase ġie inkubat b'0.1 mM E1 rikombinanti (UBE1; Boston Biochem), 0.25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem), u ubiquitin (2.5 ug/ml; Boston; Biochem) fil-preżenza ta 'BgaA-T purifikat u l-varjanti tiegħu. Ir-reazzjonijiet ta' ubikwitilazzjoni saru f'assay buffer [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM adenosine triphosphate (ATP), 1 mM -mercaptoethanol, u 0.1 fil-mija Tween 20] għal sagħtejn f'25 grad . Ir-reazzjonijiet twaqqfu b'5 × buffer Laemmli, solvuti fuq ġellijiet SDS-PAGE, u analizzati permezz ta 'immunoblotting bl-użu ta' antikorp anti-BgaA.

Assaġġ in vitro kinase

Biex twettaq assay in vitro kinase, is-sistema ta 'enżima kinase GSK3 (Promega) intużat skont il-protokoll tal-manifattur bil-modifiki li ġejjin. Fil-qosor, 3 ug ta' BgaA-T rikombinanti ġew miżjuda ma' 0.5 ug ta' GSK3 attiv b'400 μM ATP f'buffer ta' reazzjoni magħmul minn 40 mM tris, (pH 7.5), 20 mM MgCl2 , BSA (0.1 mg/ml), u 50 μM dithiothreitol. Ir-reazzjoni ġiet inkubata għal sagħtejn fi 30 grad u titwaqqaf billi żżid 1 × Laemmli buffer. Il-kampjuni mbagħad ġew mgħollija u elettroforesizzati għal Western blotting kif imsemmi qabel. BgaA-T fosforilat ġie skopert b'antikorp anti-phosphothreonine.

Mudell in vivo

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 fil-mija piż tal-ġisem tal-bidu, u tnixxija nażali jew okulari ppronunzjata. Kampjuni tad-demm inkisbu permezz ta 'titqib kardijaku taħt anestesija terminali, u l-milsa tneħħiet wara l-mewt għall-enumerazzjoni ta' batterji. Il-kampjuni tat-tessuti ġew ipproċessati b'omoġenizzatur tat-tessuti li jinżamm fl-idejn, u l-omoġenati ġew dilwiti serjali f'PBS qabel ma tqabbdu fuq pjanċi tal-agar tad-demm. Il-pjanċi ġew inkubati matul il-lejl f'temperatura ta '37 grad, 5 fil-mija CO2, u n-numri tal-kolonji batterjali ġew evalwati l-għada.

Analiżi statistika

GraphPad Prism verżjoni 5 intużat għall-analiżi statistika. Testijiet statistiċi li saru għal esperimenti individwali huma msemmija fil-leġġendi rispettivi tal-figura. P < 0.05 tqieset bħala statistikament sinifikanti. Id-dejta ġiet ittestjata għan-normalità u biex tiddefinixxi l-varjanza ta 'kull grupp ittestjat. L-analiżijiet multiparametri kollha inkludew korrezzjonijiet għal paraguni multipli, u d-dejta hija ppreżentata bħala mezz ± SD sakemm ma jkunx iddikjarat mod ieħor.

REFERENZI U NOTI

ME Bianchi, DAMPs, PAMPs, u alarmins: Kulma rridu nkunu nafu dwar il-periklu. J. Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Rikonoxximent tal-Patoġenu u sinjalar infjammatorju fid-difiżi immuni intrinsiċi. Clin. Microbiol. Rev 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Ħajja fuq ġewwa: L-istil ta 'ħajja intraċellulari ta' batterji ċitosoliċi. Nat. Dun Microbiol. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, Ir-rwol ta 'ubiquitylation fid-difiża immuni u l-evażjoni tal-patoġeni. Nat. Dun Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, Is-sistema ta 'ubiquitination fi ħdan interazzjonijiet batterjali host-patoġenu. Mikro-organiżmi 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Analiżi globali ta 'ubiquitinomi ospitanti u batterjali bi tweġiba għall-infezzjoni tas-salmonella typhimurium. Mol. Ċellula 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, Proteina tal-wiċċ ta 'mycobacterium tuberculosis tirrekluta ubiquitin biex tiskatta l-ksenofaġija ospitanti. Nat. Komun. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Ubiquitylation of lipopolysaccharide minn RNF213 waqt infezzjoni batterika. Natura 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, il-kumpless ubiquitin ligase FBXO2/SCF jidderieġi xenofaġija permezz tar-rikonoxximent tal-glycan tal-wiċċ batterjali. EMBO Rep 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, Il-metilazzjoni tal-lisina tipproteġi patoġenu intraċellulari mill-ubiquitylation u l-awtofaġija. Sci. Adv. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, E3 ubiquitin ligase b'sens għal batterji. Cell Host Microbe 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, L-ubiquitin ligase Smurf1 jaħdem f'awtofaġija selettiva ta 'mycobacterium tuberculosis u difiża ta' l-ospiti anti-tuberkulosi. Cell Host Microbe 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, Ktajjen ta 'ubiquitin lineari sintetizzati LUBAC jirrestrinġu l-batterji li jinvadu ċ-ċitosol billi jattivaw l-awtofaġija u NF-κB. Nat. Microbiol. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, L-ubiquitin ligase parkin jimmedja reżistenza għal patoġeni intraċellulari. Natura 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Espansjoni tal-makkinarju ta 'ubiquitylation taċ-ċelluli ospitanti li jimmira s-Salmonella ċitosolika. EMBO Rep 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com