Xanthine Oxidoreductase Attività fil-plażma fqira u rikka tal-plejtlets bħala indikatur tal-istress ossidattiv f'terapija ta' sostituzzjoni tal-kliewi meħtieġa f'pazjenti

Sfond Astratt: Xanthine oxidoreductase(XOR) hija enzima hydroxylase involuta fil-metaboliżmu tal-purini. L-attività XOR tista 'tvarja: il-proteina homodimer tista' tiġi kkonvertita f'żewġ isoformi differenti XD (antiossidant) u XO (proossidant). Stress ossidattiv u infammazzjoni li jakkumpanjawmard kroniku tal-kliewi(CKD), dijalisi, u trapjant tal-kliewi, irriżultaw f'attivazzjoni tal-plejtlits. L-istudju preżenti kellu l-għan li jiddetermina l-influwenza tat-terapija ta 'sostituzzjoni tal-kliewi applikata fuq xanthine oxidoreductase u l-attività isoform tagħha.

Materjali u Metodi: Il-grupp ta' studju kien jikkonsisti minn 117-il pazjent, maqsuma f'4 gruppi: pazjenti b'emodijalisi - 30, pazjenti b'dijalisi peritoneali - 30, pazjenti bi trapjant tal-kliewi - 27, u trattament konservattiv {{5} } pazjenti. Il-grupp ta' kontroll kien jikkonsisti minn 30 voluntier b'saħħithom. Riżultati: Instabu differenzi sinifikanti fl-attività XOR fil-plażma fqira tal-plejtlits (PPP) fi ħdan il-gruppi studjati (p=0.001). Kien hemm relazzjoni bejn it-tip ta’ terapija ta’ sostituzzjoni tal-kliewi tal-isoformi kollha ta’ oxidoreductase fil-PPP (p<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Thekawża ta’ mard kroniku tal-kliewikienet riflessa wkoll f'differenzi fl-attività XD u XO fil-PPP.

Konklużjonijiet: It-tip ta 'terapija ta' sostituzzjoni renali użata f'pazjenti CKD, l-età tal-pazjenti, it-tul tad-dijalisi, il-kawżi ta 'CKD, u l-istadju ta' progressjoni jaffettwaw b'mod sinifikanti l-attività ta 'XOR u l-isoformi tiegħu.

Kliem ewlieni: Xanthine oxidoreductase, Platelets, Terapija ta’ sostituzzjoni tal-kliewi,Mard kroniku tal-kliewi, Enżimi antiossidanti

KEMM JIEĦU BIEX TAĦDEM ĊISTANCHE?

Sfond

Xanthine oxidoreductase (XOR) hija enzima hydroxylase involuta fil-metaboliżmu tal-purini. Jikkatalizza l-ossidazzjoni ta 'ipoxanthine għal xanthine u xanthine għal aċidu uriku (UA). L-attività XOR tista 'tvarja: il-proteina homodimer tista' tiġi kkonvertita f'żewġ iżoformi differenti. Xanthine dehydrogenase (XD) huwa espress b'mod predominanti f'tessut b'saħħtu, u xanthine oxidase (XO) huwa ġġenerat minn modifika XD wara t-traduzzjoni, residwi ta' ossidazzjoni cysteine ​​kif ukoll proteoliżi limitata, li għandhom rwol dominanti fiċ-ċelloli u fit-tessuti waqt il-korrimenti [1-3] ]. L-attivitajiet tal-isoformi msemmija jopponu lil xulxin [4]. XOR jaġixxi fil-preżenza ta 'NAD+ bħala dehydrogenase, u b'ossiġnu molekulari bħala oxidase. Il-kapaċità ta 'XOR li tikkonverti malajr minn antiossidant għal ossidant, f'diversi tipi ta' ħsara fit-tessuti, hija element essenzjali għal rispons immuni innat rapidu, ta 'benefiċċju, pereżempju, infezzjoni batterjali jew fungali [5].

Intermedji ta' reazzjoni ta' xanthine dehydrogenase (XDO) u ossiġnu jistgħu jirreaġixxu kemm ma' NAD+ kif ukoll ma' O2 iżda jippreżentaw affinità ogħla għal NAD+ [6]. Din l-isoforma intermedja ma ġietx iżolata, iżda d-determinazzjoni tal-attività tagħha tiffaċilita t-traċċar tat-trasformazzjoni ta 'XD għal XO [7].

L-attività tas-serum XOR f'diversi mard ġiet investigata b'mod wiesa '. Ir-raġuni għall-interess f'din l-enzima hija d-dualiżmu ta 'l-azzjoni tagħha: il-kapaċità li tipproduċi antiossidanti, u min-naħa l-oħra, il-ħolqien ta' speċi ta 'ossiġnu reattiv. Żieda fl-attività XOR sseħħ f'kundizzjonijiet patoloġiċi bħal epatite virali, mononukleosi infettiva, mard awtoimmuni, pnewmonja, skizofrenija, u dijabete tat-tip II. Iż-żieda fl-attività XOR hija osservata wkoll fis-serum tal-pazjenti wara trapjant tal-kliewi jew tal-fwied [8]. Intwera li l-kodifikazzjoni tal-ġene għal XOR jista 'jkun responsabbli għall-maturazzjoni tal-kliewi, u l-adipoġenesi fil-kliewi, u jista' jipprevjeni t-trasformazzjoni taċ-ċelloli epiteljali f'tessut mesenkimali [9]. Madankollu, minħabba l-aħjar għarfien tagħna, m'hemm l-ebda rapporti ppubblikati li jinvestigaw l-attività XOR fil-plażma fqira fil-plejtlits (PPP) u fil-plażma b'ħafna plejtlits (PRP) f'pazjenti li qed jagħmlu terapija ta 'sostituzzjoni tal-kliewi. L-importanza tal-attività XOR f'dan il-grupp ta 'pazjenti hija relatata ma' żieda fl-attivazzjoni tal-plejtlits, li hija kkawżata minn stress ossidattiv u infammazzjoni li jakkumpanjaw mard kroniku tal-kliewi (CKD), dijalisi u trapjant tal-kliewi. Barra minn hekk, waqt id-dijalisi u t-trapjant tal-organi, it-tessuti u l-vini tad-demm huma mħassra, u l-plejtlits huma l-ewwel ċelluli li jilħqu s-sit tal-ħsara fit-tessuti, li jipparteċipaw b'mod attiv fl-istadji inizjali tal-proċess infjammatorju u l-fejqan [10].

PRP u PPP huma frazzjonijiet tal-plażma tad-demm b'konċentrazzjonijiet ta' plejtlits differenti. Il-kontenut ta' plejtlits ta' PRP u PPP huwa plejtlits/ml u plejtlits/ml, rispettivament. PPP u PRP jinkisbu b'ċentrifugazzjoni ripetuta u ħasil tad-demm sħiħ tal-bnedmin b'veloċitajiet ċentrifugi differenti [11, 12].

PPP, bħala prodott sekondarju taċ-ċentrifugazzjoni tad-demm antikoagulat, għandu konċentrazzjoni ta 'plejtlits aktar baxxa mid-demm normali. Il-komponenti ewlenin tal-PPP huma fibrinoġen, fibronectin, u trombina. L-effetti bijoloġiċi tal-PPP qed jipparteċipaw fl-emostasi u l-koagulazzjoni, li jaġixxu bħala vettur tat-twaħħil taċ-ċelluli, u jippromwovu mitożi ta 'fibroblasti u ċelloli epiteljali [13]. Għalkemm il-PPP mhuwiex ikkonċentrat fil-plejtlits daqs il-PRP, intwera li l-PPP jista 'jsostni wkoll it-tkabbir taċ-ċelluli u s-sopravivenza. PPP jippromwovi l-funzjonijiet taċ-ċelluli assoċjati mal-fejqan tal-feriti u jaċċellera l-migrazzjoni taċ-ċelluli u l-proliferazzjoni tal-fibroblasti [14, 15]. Plażma b'ħafna plejtlits għandha aktar plejtlits ikkonċentrati mill-plażma normali (madwar 150–400 × 103 ċelluli/dL). Hija waħda mid-definizzjonijiet l-aktar komuni ta 'PRP fil-letteratura [16]. Sal-lum, studji limitati kkaratterizzaw XOR u l-attività iżoforma tiegħu fi plażma b'ħafna plejtlits jew fqira f'pazjenti li jbatu minn mard kroniku tal-kliewi. Tan et al. wera ċelluli bil-ħsara minn speċi ta 'ossiġnu reattiv (ROS) (fil-każ ta' terapija kronika ta 'sostituzzjoni tal-kliewi) "tnixxija" iżoformi XOR, li wasslu għal żieda tal-livell ta' enzima fil-plażma [17]. Dan il-mekkaniżmu jispjega l-attività aktar baxxa ta 'XOR u l-isoformi tiegħu fil-plejtlits meta mqabbla ma' PPP. Għalhekk, l-attivinità tal-ossidorduttażi fil-PPP u PRP huma ta 'interess kbir, peress li jistgħu jgħinu biex jinkixfu l-proċessi ċellulari li jseħħu kuljum, sis. Investigazzjonijiet bħal dawn jistgħu wkoll jenfasizzaw indirettament is-severità tal-istress ossidattiv f'dan il-grupp ta 'pazjenti.

Berry et al. Iddeskrivi wkoll li xanthine oxidoreductase huwa mqassam fil-fwied, il-musrana ż-żgħira, il-glandola mammarja, u ċ-ċelloli endoteljali. Metodi ta 'lokalizzazzjoni subċellulari wrew il-preżenza ta' xanthine oxidoreductase kemm fiċ-ċitoplasma kif ukoll fuq il-membrani taċ-ċelluli. Huma jindikaw ukoll li xanthine oxidasereductase fil-plażma jista 'jkun dovut għal sfumatura ta' xanthine oxidoreductase minn membrani taċ-ċelluli jew tnixxija miċ-ċitoplasma. Din hija waħda mir-raġunijiet li nittestjaw l-attività ta 'XOR fil-PPP u PRP biex niddistingwu l-attività tal-enzima fil-plejtlits u ċelluli tad-demm oħra li jinsabu fil-plażma [18]. Ibbażat fuq l-attività ta 'enzimi antiossidanti, nistgħu wkoll niddeterminaw liema tip ta' terapija ta 'sostituzzjoni tal-kliewi hija inqas probabbli li tesponi lill-pazjent għal stress ossidattiv. Minħabba n-natura doppja ta 'XOR, il-fehim tar-relazzjoni bejn it-tip ta' terapiji ta 'sostituzzjoni renali u l-attività ta' isoforms XOR jista 'jkun interessanti ħafna u ta' għajnuna fl-għażla tat-tip ta 'terapija ta' sostituzzjoni renali.

materjali u metodi

Approvazzjoni etika u kunsens

Il-Kummissjoni Bijoetika fl-Università Medika Pomeranian fi Szczecin approvat ir-riċerka mwettqa (nru KB−0012/36/11). Il-parteċipanti kollha, inklużi l-voluntiera b'saħħithom fil-grupp ta 'kontroll, ġew infurmati dwar l-iskop u l-ambitu tal-istudju u taw il-kunsens tagħhom biex jagħtu kampjuni u l-pubblikazzjoni tad-dejta li tirriżulta.

Grupp ta' studju

Kien hemm parteċipanti 147: grupp ta 'kontroll ta' voluntiera b'saħħithom 30 (NK), u pazjenti 117 b'mard kroniku tal-kliewi (CKD) li jattendu l-Klinika tan-Nefroloġija, Transplanetoloġija u Mard Intern tal-Università Medika Pomeranian fi Szczecin. Il-pazjenti kienu maqsuma f'4 gruppi abbażi tat-trattament li rċevew: 30 pazjent qabel u wara l-emodijalisi (HD A u HD B): 30 pazjent irċevew dijaliżi peritoneali (PD); 27 pazjent qabel u wara trapjant tal-kliewi (5-7 ijiem wara l-operazzjoni) (TE, TE A); 30 pazjent irċevew trattament konservattiv (CT) (CKD stadju 2-5). Is-sess, l-età, it-tul tad-dijalisi, il-kawża u l-istadju tal-mard kroniku tal-kliewi, u l-konċentrazzjoni tal-krejatinina fil-gruppi tat-test u tal-kontroll huma mogħtija fit-Tabelli 1 u 2.

Kampjuni

Kampjuni tad-demm (K2EDTA (8 ml), 3.8% trisodium citrate (9: 1; v / v), u serum (8 ml)) inġibdu mill-parteċipanti kollha fl-istudju. Id-demm tal-pazjent emodijalizzat inġibed mill-fistula arteriovenuża tagħhom; it-titqib tal-vini periferali ntużat għall-parteċipanti l-oħra kollha. Ittieħdu kampjuni minn pazjenti bl-emodijalisi qabel (HD A) u madwar 10 min wara li l-pompa twaqqaf (HD B). Id-demm tal-pazjent tat-trapjant inġabar qabel it-trapjant (TE) u 5-7 ijiem wara l-kirurġija (TE A). Pazjenti reklutati għall-grupp TE ma kinux jappartjenu għall-grupp ta 'pazjenti b'emodijalisi jew dijalisi peritoneali f'dan l-istudju. Kienu pazjenti kwalifikati għal trapjant minn madwar il-Polonja kollha. Il-maġġoranza l-kbira tal-pazjenti bi trapjant tal-kliewi kellhom analiżi tal-modalità minn qabel. K2EDTA u kampjuni tad-demm magħqud ġew ċentrifugati f'2600 rpm għal 10 min fi 20 grad biex jiksbu plażma u serum, rispettivament. Biex tikseb plażma b'ħafna plejtlits (PRP) u plażma fqira fil-plejtlits (PPP), id-demm miġbur b'ċitrat ġie ċentrifugat taħt il-kundizzjonijiet f'1100 rpm għal 10 min f'20 grad. Il-PRP li rriżulta ġie trasferit għal tubu ġdid u ċentrifugat f'6000 rpm għal 10 min fi 20 grad: plażma fqira tal-plejtlits (PPP) ġiet trasferita għal tubu separat; il-gerbub tal-plejtlits tlaħlaħ darbtejn u ġie sospiż f'Tyroda buffer (pH7.4). Il-plażma, is-serum, il-PPP u l-PRP ġew iffriżati f'-80 grad sakemm saru l-analiżi. F'pazjenti bl-emodijalisi, id-demm inġabar qabel l-għoti tal-eparina u wara d-dijalisi li damet medja ta' 4–5 sigħat (half-life tal-eparina - 4 h) biex tiġi eliminata kwalunkwe influwenza possibbli tal-eparina fuq l-attività XOR.

Attività ta' Xanthine oxidoreductase fil-plażma fqira tal-plejtlits u l-plejtlits

Id-determinazzjonijiet twettqu bi spettrofotometru Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P. Bidliet ta 'estinzjoni ġew irreġistrati f'340nm (XD) u 302nm (XDO, XO) għal 5min fi 30 grad. L-attività enżimatika ġiet imkejla bħala l-formazzjoni ta 'aċidu uriku u NADH (żidiet f'A340 u A302) u espressa f'mU × mL-1 (milliunits kull millilitru). L-attività enżimatika ġiet ikkalkulata, b'kont meħud tar-rati inizjali ta 'reazzjoni. Il-formazzjoni ta 'aċidu uriku tkejjel f'302nm (isoformi XDO u XO) minħabba li l-assorbenza tagħha għadha għolja hemmhekk, filwaqt li l-bidliet fil-konċentrazzjoni ta' NAD + ma jikkontribwixxux. Il-koeffiċjent ta' estinzjoni għal NADH+ H+ ε340=6.22× 103 [L∙mol−1 cm−1 ] intuża biex tikkalkula l-attività ta' iżoformi ta' xanthine oxidoreductase NADH+ H+: ε302=2.30× 103 [ L∙mol−1 cm−1 ] [7, 19–22].

Tabella 1 Karatteristiċi ġenerali ta’ pazjenti bl-emodijalisi (HD), dijalisi peritoneali (PD) ittrattati b’mod konservattiv (CKD), trapjant tal-kliewi (TE), u grupp ta’ kontroll (C) li qed jipparteċipaw fl-istudju (medja ± SD)

P * - sinifikat statistiku għad-differenzi bejn il-gruppi HD, PD u CKD, test Fisher eżatt TE u C għal varjabbli kwalitattivi; għal varjabbli kwantitattivi - ANOVA one-way u; P ** - sinifikat statistiku għal differenzi bejn il-gruppi HD, PD u CKD u TE test Fisher eżatt għal varjabbli kwalitattivi għal varjabbli kwantitattivi one-way ANOVA jew; DM - nefropatija dijabetika; HA - pressjoni għolja; GIK - kliewi ta 'infammazzjoni glomerulari; ADPKD - mard tal-kliewi poliċistiku li jintiret awtosomali dominanti; NS - l-ebda differenzi statistikament sinifikanti.

Tabella 2 Karatteristiċi ġenerali ta' pazjenti bl-emodijalisi (B - qabel HD, A - wara), dijalisi peritoneali (PD) ittrattati b'mod konservattiv (CKD) qabel u wara trapjant tal-kliewi (TE B u TE A) u grupp ta' kontroll (NK) li qed jieħdu sehem fil- studju (medja ± SD)

P * - sinifikat statistiku għal differenzi bejn HD A, HD B, PD u gruppi CKD, TE u C għal varjabbli kwantitattivi - Kruskal Wallis ANOVA, one-way ANOVA jew Student's t-test P ** - sinifikat statistiku għal differenzi bejn HD A , HD B, PD u gruppi CKD u TE għall-varjabbli kwantitattivi ANOVA ta' Kruskal Wallis jew analiżi one-way ANOVA Kt / V - indiċi tad-dijalisi (frazzjoni tal-volum V purifikata bit-tneħħija K fil-ħin t) NS ma nstabu l-ebda relazzjoni statistikament sinifikanti

Analiżi statistika Biex tevalwa d-distribuzzjonijiet, intuża t-test KS (Kolmogorov-Smirnov), li fil-każ ta 'xi varjabbli (l-attività ta' isoforms XD u XDO f'PRP) wera distribuzzjoni mhux normali ta 'parametri. Testijiet Exact Fisher u Chi-square intużaw biex janalizzaw dejta kwantitattiva. Bl-użu tat-test t ta' Student u l-analiżi ANOVA għal sistemi univarjati, id-differenzi bejn varjabbli assoċjati (paired) u mhux relatati (mhux paired) ġew evalwati fil-każ ta 'varjabbli b'distribuzzjoni normali. Fil-każ ta 'varjabbli b'distribuzzjonijiet mhux normali, saret analiżi ANOVA ta' Kruskal-Wallis biex tevalwa d-differenzi bejn il-parametri, kif ukoll it-test mhux parametriku Mann-Whitney U għal data mhux imqabbla jew Wilcoxon għal data paired. Intuża mudell ta' rigressjoni multipla lineari biex tiddetermina l-evalwazzjoni multifattura tar-relazzjonijiet bejn il-parametri studjati. Analiżi statistika tar-riżultati saret bl-użu ta' Statistica 12 (StatSoft).