Żewġ Triterpenojdi Mill-Weraq ta' Rubus Fraxinifolius U l-Attivitajiet Inibitorji Tagħhom Tyrosinase U Elastase

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

Bosta komposti terapewtiċi ġew iżolati minn riżorsi organiċi abbundanti b'mod naturali, li jistgħu joffru sorsi ekonomiċi u sostenibbli ta 'komposti b'attivitajiet bijoloġiċi sikuri u effikaċi. Fl-industrija tal-kosmetiċi, komposti naturali b'attivitajiet kontra t-tixjiħ huma mfittxija bil-ħerqa. Għalhekk, ħejjejna diversi estratti mill-weraq ta 'Rubusfraxinifolius u użajna testijiet ta' inibizzjoni ta 'enżimi biex iżolaw komposti b'effetti protettivi kontra t-tixjiħ tal-ġilda. Żewġ triterpenojdi ġew iżolati minn Rubus fraxinifolius Poir. weraq. L-istrutturi kienu kkaratterizzati minn analiżi spettroskopiċi (LC-ESI-MS, 1D/2D NMR) u paragun mad-dejta rrappurtata. Il-Komposti 1 u 2 ġew determinati bħala 2,3-O-ethylene glycol,19-hydroxyurs-12-en-23,28-aċidu dijojku u 2,{{15} }O-propandiol,19-hydroxyurs-12-en-28-aċidu oic. L-estratt u l-iżolati tal-metanol ġew ivvalutati għall-effetti inibitorji tagħhom fuq elastase u tyrosinase. Il-komposti 1 u 2 inibixxew elastase b'ICso 122.199 ug/mL u 98.22 ug/mL, u inibixxu wkoll tyrosinase b'ICso 207.79 ug/mL u 221.51 ug/mL, rispettivament. Id-docking molekulari wera li ż-żewġ komposti għandhom affinitajiet lejn l-enzimi.

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

Għalkemm diffiċli biex jinkisbu, sustanzi naturali kontra t-tixjiħ li huma sikuri għall-bnedmin jistgħu jinħasdu b'mod ekonomiku u sostenibbli minn riżorsi naturali abbundanti. Madwar 700 speċi ta 'Rubus (Rosaceae) huma mqassma globalment, għalkemm ftit speċi jinstabu fit-tropiċi. Dan il-ġeneru fih nutrijenti (zokkor, vitamini, eċċ.), metaboliti sekondarji (triterpenoids, flavonoids, polyphenols, eċċ.), u għandu ħafna attivitajiet kontra t-tixjiħ (antiossidant, ant elastase, ant tyrosinase, anti-collagenase, anti-UV, anti-infjammatorji, fejqan tal-feriti, eċċ.)1. Barra minn hekk, l-ispeċi Rubus irrapporta wkoll li fihom diversi triterpeni b'diversi attivitajiet bijoloġiċi -'.

Fl-Indoneżja, R. fraxinifolius Poir. (Rosaceae) hija mqassma f'Java, Borneo, eċċ., u popolarment magħrufa bħala 'urban.x'inhu cistancheBarra minn hekk, xi bdiewa lokali jaħsdu dawn il-pjanti, u l-frott tal-berry ġeneralment jiġi kkunsmat jew frisk jew iffriżat. L-istudju ta 'qabel tagħna wera li l-estratt ta' zokk ta 'R. frascinifolius għandu l-attività li jinibixxi elastase, tyrosinase, u bħala antiossidant8. Xi investigazzjonijiet oħra wrew ukoll li l-weraq u l-frott ta 'R. fraxinifolius għandhom attività antiossidant qawwija?10.Madankollu, l-istudju ta' R. fraxinifolius ftit ġie riċerkat, u l-ebda studji ta 'komponenti kimiċi ma ġew irrappurtati.

Cistanche jista 'anti-aging

Elastase hija enzima serine protease, li għandha rwol kruċjali fit-tikmix jew sagging tal-ġilda permezz tad-degradazzjoni tal-fibra elastika dermali (elastin) u tikkawża telf ta 'elastiċità tal-ġilda. Waħda minn dawn hija elastase derivata mill-fibroblast tal-ġilda. Għalhekk, bħala moderaturi tad-degradazzjoni tal-fibra tal-elastin li tikkawża t-tixjiħ tal-ġilda, l-inibituri tal-elastasi ġibdu l-attenzjoni bħala aġenti għall-preparazzjonijiet kożmetiċi,12. Il-melanogenesis hija medjata minn tyrosinase u tirregola l-bijosintesi tal-melanin permezz ta 'reazzjoni f'żewġ stadji. Fil-pass inizjali, L-tyrosine huwa idrossilat għal L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA). Fit-tieni pass, L-DOPA jiġi ossidizzat għall-O-quinone korrispondenti. Għalhekk, komposti naturali b'attività inibitorja ta 'tyrosinase huma komunement użati fil-kożmetiċi li jinibixxu l-iperpigmentazzjoni bil-melanin u għalhekk jiffavorixxu t-tibjid tal-ġilda.Cistanche kontra t-tixjiħL-inibituri tal-enżimi elastase u tyrosinase jistgħu jiġu żviluppati bħala aġenti li jbajdu l-ġilda, kontra t-tixjiħ jew kontra t-tikmix biex jittrattaw disturbi dermatoloġiċi44.

Dan l-istudju iżolat ursane triterpenoids minn weraq ta 'R.fraxinifolius u spjega l-istrutturi tagħhom f'analiżi spettroskopiċi bl-użu ta' spettroskopija tal-massa ta 'jonizzazzjoni elettrospray (ESI-MS) u 'H NMR, |3CNMR, u 2D NMR (DEPT, HSQC, HMQC, u HMBC). Sussegwentement, wettaqna analiżi ta 'attivitajiet inibitorji ta' elastase u tyrosinase ta 'estratti mhux raffinati, frazzjonijiet u komposti iżolati.

L-attività ta 'żewġ komposti magħżula ġiet osservata wkoll permezz tal-metodu in silico f'din ir-riċerka. Sar approċċ ta' docking molekulari b'DockThorl516. Il-makromolekuli użati f'din ir-riċerka nkisbu minn bank tad-dejta tal-proteini (RCSB PDB, 2000) b'identitajiet 2y9x u 3hgp għal tyrosinase u elastase, rispettivament l718. Il-makromolekuli ġew ottimizzati f'UCSF Chimera u r-riżultati tal-docking molekulari. ġew osservati b'PyMOL1920.

riżultati u diskussjoni

The ethyl acetate and methanolic extracts of R. fraxinifolius leaves showed potential as elastase inhibitors with percent inhibitory>40 fil-mija f'100 ug/mL, filwaqt li l-estratt ta 'n-hexane ma kellu l-ebda attività (Fig. 1). Xi Rubus wera wkoll attività inibitorja ta 'elastasi bħal R. Sanctus（ inibizzjoni fil-mija 14.68-49.20 f'100 ug/mL), R.compactus,R. robustus, eċċ.221. Għalhekk, aħna frazzjonajna l-estratti attivi bl-użu ta 'kromatografija likwida vakwu/VLC u ġbarna ll frazzjonijiet minn kull wieħed. Frazzjonijiet mill-estratt tal-aċetat tal-etil urew attivitajiet inibitorji ta' elastase dgħajfa (<20% in="" 100="" ug/ml),but="" some="" methanol="" fractions="" showed="" potential="" activity="" in="" these="" assays.="" we="" choose="" metha-nol="" fraction="" 8(m8)for="" further="" isolation="" because="" it="" hadthe="" largest="" yield(57%)="" and="" also="" have="" elastase="" inhibitory="" activity(44.82%).m8="" was="" further="" partitioned="" and="" purified="" over="" silica="" gel="" and="" through="" a="" sephadex="" column,="" and="" two="" amorphous="" powders="" were="">

L-iżolati ġew identifikati u kkaratterizzati bl-użu ta' liquidl chromatography-mass spectroscopy (LCMS), 'H u 13CNMR, DEPT, koerenza kwantistika waħda eteronukleari (HSQC), korrelazzjoni quantum multipla eteronukleari (HMQC), u korrelazzjoni ta' bond multiplu eteronukleari (HMBC). Tabella 1, wriet id-dejta spettrali NMR tal-komposti.

Kompost 1: kien iżolat bħala trab abjad amorfu. L-ispettri LCMS-ESI għal dan il-kompost wrew quċċata tal-jone molekulari f'm/z 543.32[MH]t, li tissuġġerixxi l-formula molekulari C32H48O- b'disa' ekwivalenti ta' insaturazzjoni. L-ispettri IR żvelaw massimi ta' assorbiment li jikkorrispondu ma 'hydroxyl (3.343.4 cm-l) u olefinic (1.684 cm-1)gruppi funzjonali. Barra minn hekk, 'H NMR spettri tal-kompost I żvelat methine proton (CH) sinjal singlet ta' 2.6, sinjal karatteristiku għall-H-18 tat-tip ursane triterpeni b'19-O-sostituzzjonijiet. It-triterpene tat-tip 19a-hydroxy-ursane għandu wkoll sinjal tipiku tal-proton fiż-żona ta 'madwar 2.6 ppm. Dan is-sinjal deshielded jista' jvarja b'mod notevoli minn sinjali oħra tal-proton tal-metilen ordinalI, b'bidla karatteristika minħabba proton olefinic(H12)f'ou 5.28(t,J=6Hz).cistanche benefíciosAssenjazzjonijiet sħaħ u inekwivokabbli ta' 'H u l3C shift kimiku ġew assistiti minn spettri HMQC(13Cx'H) u HMBC(15Cx'H). Mill-HMBC cross peak, il-proton f'ou 2.60 ġie kkonfermat li huwa H{ {5}}(Fig.2a). Karattri speċifiċi oħra nstabu għall-ħames singlets tal-metil f'1.89,1.02,0.82,1.32,1.20(kull,H{24-27;29),a methyl doublet f'og 0.92(d, J=6 Hz), u s-sinjal tal-proton olefiniku f'5.30(t, J=7 Hz, H-12). L-ispettri preżenti13CNMR juru 32 reżonanza tal-karbonju, u bi spettri DEPT u HMQC, wrew żewġ karboniċi karbonil (δC183.70,C-28 u 8-178.96,C{-23), karbonju olefiniku. f'oc 127.23,C-12,karbonju kwaternarju olefiniku (oc139.49,C-13),karbonju kwaternarju li jġorr l-ossiġnu （o-72.7, C-19 ）, għaxar metilini alifatiċi u sitt karbonju tal-metil. Iż-żewġ karboni olefiniċi f'δ-127.23（C-12）u 139.49(C-13) kienu karatteristiċi tat-tip ursane-triterpenoid. Sinjal ieħor indika l-preżenza ta 'ethylene glycol （-OCH-CH-O-） intwera f'sinjali f'δ4.62（d, J=11.5 Hz）,4.05（d, J=11. 5 Hz）,3.52（d, J=11.5Hz）u 4.06（d, J{=11.5Hz）u appoġġjat b'δ61.27（t） u 63.20（t）. Kien jinsab fi C-2uC-3 ibbażat fuq il-preżenza ta' korrelazzjoni fuq medda twila fl-ispettri HMBC. Għalhekk, il-kompost 1 ġie identifikat bħala 2,3-O-ethylene glycol,19-hydroxyurs-12-en-23,28-aċidu dijojku (Fig. 3a).

Kompost 2: inkiseb bħala trab amorfu abjad.MS-ESI m/z 527.33 [MH]t (calcd.For 528.3815). Fl-ispettri LCMS-ESI, quċċata ta 'jone molekulari hija preżenti f'm/z 527.33 [MH]t, li tindika l-formula molekulari CH Os, li kienet teħtieġ 8 gradi ta' insaturazzjoni." {15}})u gruppi funzjonali olefiniċi (1,686cm-1). Barra minn hekk, 'l-ispettri HNMR għall-kompost 2 wrew singlet ta' 2.42, li huwa karatteristiku tal-H18 ta' triterpene tat-tip ursane bi {{24 }}O-sostituzzjoni.Cistanche Estratt Kontra r-RadjazzjoniSpettri karatteristiċi speċifiċi oħra kienu jinkludu l-preżenza ta' sitt singlets tal-metil f'og1.22 0.76,0.97,0.69,1.3{0u 1.17(kull,H -24-28,H-30),doublet tal-metil f'0.91 (d,J{=7Hz),u s-sinjal tal-proton olefiniku f'ou 5.37 (d, J{=7 Hz, H-12). L3 korrispondenti (l-ispettri CNMR u DEPT juru 33 reżonanza tal-karbonju, u spettri HSQC u HMQC jindikaw il-preżenza ta 'karbonju karbonil (oc 182.23, C-28), karbonju olefiniku （δ-129.36, C -12）, karbonju kwaternarju olefiniku （δ-140.24, C{-13）, karbonju kwaternarju li jġorr l-ossiġnu (oc73.68, C-19), ħdax alifatiku methylene, u sevenmethyl carbons. Din id-dejta indikat li l-kompost 2 iġorr skeletru ursane-triterpenoid. Is-sinjali l-oħra huma indikati l-preżenza ta 'grupp funzjonali 1,3-propandiol,f'og 3.22(d,J{=11 .5 Hz),3.42(d,J=10.5Hz),1.38(m),1.51(m)u 4.02(d,J{=11.5Hz)u 3.36(t, J{{ {57}}.5Hz).Il-grupp funzjonali tiegħu għandu korrelazzjoni fit-tul ma' C2-C3. Abbażi ta' dawn ir-riżultati, il-kompost 2 għalhekk ġie identifikat bħala 2,3-O-Propanediol,{{ 66}}hydroxyurs-12-en-28-aċidu oic(Figuri 2b u 3b).Kompon simili huwa aċidu 2,3-O-Isopropylidene torments, iżolat minn Rubus xanthocarpus.7

Fit-Tabella 1, l-ispettri kollha 'H u ''C NMR tqabblu ma' aċidu tat-tormenti (TA/2a,3a,19-trihydroxy-12-ursen-28-aċidu oic) ², li huwa ursane triterpenoid li nstab f'diversi speċi ta' Rubus-p L-aċidu tormentiku kellu xebh qawwi mal-komposti 1 u 2, ħlief li ċaqliq kimiċi relatati ma' C-23 u C{31-33 kienu differenti. Din il-parti kienet ikkonfermata wkoll f' DEPT, HMQC, u HMBCexperiments (Fig.2).

L-aċidu tat-tormenti triterpenojdi huwa mqassam b'mod wiesa 'fl-ikel naturali tal-pjanti. Għandu diversi bijoattivitajiet: effetti ipogliċemiċi, proprjetajiet anti-infjammatorji u anti-ateroġeniċi naqqsu l-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-muskoli lixxi vaskulari, u attivitajiet antiproliferattivi fil-linji taċ-ċelluli tal-kanċer tal-kliewi, tal-prostata u tal-melanoma2426. Għalhekk, minħabba li dawn il-komposti għandhom l-istess skeletru, ma għandhomx attivitajiet potenzjali xierqa possibbli.

Figura 4, tirrappreżenta l-attività inibitorja ta 'elastasi u tyrosinase ta' iżolati. Id-dejta miksuba minn analiżi ta' inibizzjoni ta' enżimi in vitro ġiet espressa bħala devjazzjoni standard (SD). Il-komposti 1 u 2 inibixxew elastase b'ICso 122.199 u 98.22 ug/mL, u inibixxew ukoll tyrosinase b'ICso 207.79 u 221.51 ug/mL, rispettivament. Xi triterpenojdi pentaċikliċi (aċidu ursolic u aċidu oleanoliku) irrappurtaw li għandhom attività ta 'inibizzjoni ta' elastase2728. Il-valur ta 'inibizzjoni ta' elastase wkoll tal-kompost 2 huwa inqas minn dak tal-kompost 1. Iż-żewġ komposti kienu inqas attività ta 'inibizzjoni mill-aċidu oleanoliku ta' kontroll pożittiv, li kellu valur ICso ta '90.39 ug/mL. Bi qbil, studji preċedenti wrew ICso għall-aċidu oleanolic ta '76.5 ug/mL u valur ICso ta' 31.0 ug/ml għall-aċidu ursolic28. Analiżi kinetiċi rrappurtati preċedentement ta 'triterpenes pentaċikliċi wrew li dawn il-komposti jinibixxu l-elastasi tan-newtrofili b'mod kompetittiv u riversibbli. Fl-istess studju, esperimenti ta' docking molekulari wrew li l-parti ta' scaffolding molekulari 28-COOH u bonds doppji fi triterpeni pentaċikliċi huma essenzjali għall-attivitajiet inibitorji tagħhom

Waħda mill-problemi li jinqalgħu maż-żieda fl-età hija l-iperpigmentazzjoni.cistanche herbaGħalhekk, hemm tfittxija kontinwa għal aġenti li jtaffu l-ġilda jew depigmentazzjoni ġdida. Is-soppressjoni tat-tyrosinase tista 'taġixxi kontra l-melanoġenesi ". Kif muri f'Fig.4, l-estratt tal-metanol u l-komposti I u 2 wrew attivitajiet moderati bħala inibituri tat-tyrosinase.

F'din ir-riċerka, id-docking molekulari ntuża wkoll biex janalizza l-attivitajiet ta' rbit ta' komposti magħżula ma' tyrosinase u elastase bħala l-miri tagħhom. L-istrutturi tal-kristall użati kienu 2Y9X, struttura tal-kristall ta 'tyrosinase minn Agaricus bisporus b'inibitur tropolone; u BHGP, struttura tal-kristall ta 'elastasi tal-frixa porċina kumplessa b'inibitur qawwi tal-peptidil FR130180. It-tnejn intgħażlu minħabba li nkisbu mill-istess organiżmu użat għall-assaġġ in vitro ta’ din ir-riċerka. Il-makromolekuli huma wkoll marbuta mal-inibituri rispettivi tagħhom sabiex l-istat attiv tal-konformazzjonijiet tal-enzimi jista 'jinkiseb. Il-kokristalli ntużaw bħala ċ-ċentru tal-mira ta 'docking molekulari biex jonqsu l-probabbiltajiet tal-irbit tal-kompost sabiex il-proċess ta' punteġġ isir aktar effiċjenti.

Mill-docking molekulari, inkisbu affinitajiet medji ta 'rbit għaż-żewġ komposti kif muri fil-Figs.5 u 6. Il-previżjoni ta' affinità hija użata biex tikklassifika ligandi differenti meta wieħed iqis l-ogħla pożizzjoni ta 'enerġija ta' kull kompost, tbassir ta 'pożi ta' enerġija aħjar huwa muri minn punteġġi aktar baxxi tal-affinitajiet vinkolanti16. Ir-redocking ta' tropolone inibitur magħżul sar b'affinitajiet medji ta' rbit ta' -7.41 kcal/mol. L-affinitajiet medji ta' rbit tal-komposti 1 u 2 ma' tyrosinase kienu -7.84 kcal/mol u -8.37 kcal/mol, rispettivament (Tabella 2). Iż-żewġ komposti kienu mbassra li jkollhom affinità aħjar mill-inibitur.

Sadanittant, l-affinitajiet medji ta 'rbit ta' elastaseredocking kien -7.84 kcal/mol. L-affinitajiet medji ta' rbit tal-komposti 1 u 2 ma' elastase kienu -7.58kcal/mol u -8.06 kcal/mol, rispettivament. Anki jekk ir-riżultat wera li l-kompost 1 għandu affinitajiet aktar baxxi mill-kokristall, huwa kemmxejn differenti (<0.5 kcal/mol)compared="" to="" the="" inhibitor="" used="" hence="" the="" scores="" may="" ovelrlap31.="" these="" scores="" showed="" that="" both="" compounds="" were="" predicted="" to="" have="" affinities="" toward="" the="" enzymes,="" which="" is="" in="" conjunction="" with="" the="" in="" vitro="" assay="">

Metodi

Proċeduri sperimentali ġenerali. L-ispettri 'H u' NMR ġew irreġistrati f'500 MHz bl-użu ta' strument JEOL JNM-ECZ500R/S1. L-ispettri infra-aħmar (IR) ġew imkejla b'FTIR, IRPrestige-21, Shimadzu. Analiżi oħra twettqu bl-użu ta’ strument Waters UPLC-MIS XEVO G2-XS QTof, VersaMax Microplate Reader u BioTek ELX800 Microplate Reader, folji tal-aluminju miksija bil-lore TLC-Silica gel 60 GF254 (Merck, Darmstadt, il-Ġermanja) , kromatografija tal-kolonna (CC) saru bl-użu ta 'ġel tas-silika 60(Merck, Darmstadt, il-Ġermanja) b'malji 70-230 għall-kromatografija miftuħa u 230-400 malji għall-kromatografija fil-vakwu. Materjali tal-pjanti. Il-weraq ta’ R. fraxinifolius inġabru minn żona ta’ pjantaġġuni fil-muntanja Pangrango, West Java fl-għoli ta’ 4,343 pied, f’Diċembru 2018. Il-kampjun ġie identifikat minn botaniku (Dr. Joni Setijo) fiċ-Ċentru ta’ Riċerka għall-Bijoloġija, Istitut Indoneżjan ta’ Xjenzi, Indoneżja, bin-numru tal-kampjun 033/IPH.1.01/If.07.Il-ġbir ta 'materjal tal-pjanti kien irċieva permess mill-bidwi u kkonformat mar-regolamenti u linji gwida istituzzjonali.

Estrazzjoni u iżolament. Weraq imnixxef bl-arja trab (2300 g) ġew estratti bl-użu ta' apparat Soxhlet b'solvent gradjent (n-hexane, EtOAc, u MeOH) biex jipprovdu l-estratti rispettivi, imbagħad evaporati b'evaporatur rotanti u forn bil-vakwu. L-estratt tal-metanol (291 g) u l-estratt tal-aċetat tal-etil (65 g) ġew adsorbiti fuq il-ġel tas-silika u wettqu kromatografija likwida fil-vakwu/VLC, elużi bi gradjent gradwali ta’ EtOAc: MeOH (minn 1:0 sa 0:1) sa jipproduċi frazzjonijiet għal kull estratt (Eal-Hall u M1-Mill u). Frazzjonijiet simili li kellhom reazzjonijiet pożittivi b'reaġenti sulfuriċi tal-vanillina f'TLC ġew magħquda. Produzzjoni tal-frazzjoni: Eal-3 (2.27 g);Ea4-6(8.47 g);Ea{7-8(12.9 g);Ea9-11 (22.3 g); u M1-3 (4.89 g);M4-5 (5.1 g);M6-7 (6.02g);M8(166.42g);M9(10.53g);M{{38 }}(2.9g).Il-frazzjonijiet kollha ġew sottomessi għall-attività ta 'inibitur elastase, Fr. M8 ta l-akbar rendiment u kellu attività qawwija. Fr. M8 suċċessivament aktar qsim b'CC fuq ġel tas-silika (eluwent CH2Cl2/MeOH bi gradjent gradwali) u purifikat bl-użu ta' kolonna Sephadex LH-20 (eluzzjoni b'CHCl{3-MeOH 100:10, v/v. Żewġ frazzjonijiet wrew natura solida u ġew kristallizzati bil-kloroform u l-metanol biex jiksbu żewġ iżolati: kompost 1 (18 mg) u:2 (31 mg).Il-purità tal-iżolati kollha ġiet evalwata permezz ta 'TLC bidimensjonali u viżwalizzazzjoni tal-post bl-użu ta' 5 fil-mija sulfuriku aċidu fil-metanol, segwit minn tisħin tal-pjanċi f'110 grad għal 5 min.

Il-kristalli ġew identifikati u kkaratterizzati bl-użu ta' kromatografija likwida-spettroskopija tal-massa (LCMS), LH, u t-titjib tad-distorsjonijiet '3C permezz ta' trasferiment tal-polarizzazzjoni (DEPT) NMR, koerenza kwantistika waħda eteronukleari (HSQC), korrelazzjoni kwantika multipla eteronukleari (HMQC) u multiplu eteronukleari. korrelazzjoni tal-bonds (HMBC).

Assaġġ ta' inibizzjoni tal-elastasi. Assaġġ ta 'inibizzjoni ta' elastase sar kif deskritt qabel b'xi modifiki32. Fil-qosor, fi pjanċi tal-mikrotiteru ta' Nunc-96 sew,20-μL alikwoti ta' 0.8-unitajiet/mL PPE f'buffer bażi ta' grad Trizma （pH 8.0 ） tħalltu ma 'kampjuni 20-μL, u t-taħlitiet imbagħad ġew dilwiti għal 180 μL f'buffer bażi ta' grad Trizma. Estratti tat-test ġew inkubati minn qabel b'enżima għal 15min, u alikwoti ta' 20-μL tas-sottostrat N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (A3PVN; 2.9mM) ġew miżjuda u inkubati għal 15-il minuta oħra. Kontroll pożittiv u bjar vojta kien fihom aċidu oleanoliku u ilma, rispettivament. L-esperimenti saru fi tliet kopji, u r-rati ta 'inibizzjoni ġew determinati skond l-assorbiment; ance f'401 nm bl-użu ta' microplate reader VersaMax. L-inibizzjoni perċentwali ġiet ikkalkulata bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja:

fejn E hija l-assorbenza tar-reazzjoni tal-enżima, Eb hija l-assorbenza tal-blank tal-enżima, T hija l-assorbenza tal-kampjun tat-test, u Tb hija l-assorbiment tal-blank tat-test. ukoll il-valuri ġew determinati minn grafika lineari ta 'perċentwali inibizzjoni elastase kontra konċentrazzjoni (50,75,100,125,150 ug/mL). Assaġġ ta' inibizzjoni ta' Tyrosinase. L-inibizzjoni tat-tyrosinase ġiet iddeterminata bl-użu tal-metodu ta 'formazzjoni DOPA-chrome kif deskritt qabel b'modifiki ħfiefl3. Fil-qosor, fi 96-pjanċi tal-bir, 20 μL alikwoti ta' DMSO (kontroll) jew komposti tat-test f'konċentrazzjonijiet differenti tħalltu ma' 40 μL alikwoti ta' 30 U/mL faqqiegħ tyrosinase (Sigma Aldrich) u 100-μL ta' 0.1-M buffer tal-fosfat (pH 6.8). Ġew preinkubati għal 10 min f'temperatura tal-kamra. Ir-reazzjonijiet inbdew minn alikwoti ta 'addirg4μL ta' 10mML-DOPA għal kull bir u inkubazzjoni f'37 grad għal 20 min. L-attività tat-tyrosinase mbagħad ġiet iddeterminata billi tkejjel l-assorbiment f'475 nm. L-aċidu Kojic intuża bħala kontroll pożittiv. L-esperimenti saru fi tliet kopji. Il-perċentwal ta' inibizzjoni ta' tyrosinase ġie kkalkulat bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja:

fejn E hija l-assorbenza tar-reazzjoni tal-enżima, Eb hija l-assorbenza tal-blank tal-enżima, T hija l-assorbenza tal-kampjun tat-test, u Tb hija l-assorbiment tal-blank tat-test. ukoll valuri ġew determinati minn grafika lineari ta 'inibizzjoni elastase perċentwali kontra l-konċentrazzjoni (250,125,62.5,31.25,15.6 ug/mL).

Docking molekulari. F'din ir-riċerka, l-attività farmakoloġika in silico kienet imbassra b'docking molekulari bl-użu ta 'tabib. Docking molekulari mmirat sar bl-użu ta 'ligand kokristalizzat bħala ċ-ċentru tas-sit attiv. L-istruttura 2Y9X intużat għal docking molekulari ta 'tyrosinase ma' tropolone, inibitur ta 'tyrosinase tal-faqqiegħ, bħala l-kokristall tiegħu. Iċ-ċentru tas-sit ta' docking molekulari huwa definit f'-10.032;-28.769 u-43.467 bħala dimensjonijiet X, Y, u Z rispettivament. Il-Katina A ġiet separata għall-użu u l-atomu tal-Holmju tneħħa mill-istruttura bl-użu ta 'UCSF Chimera.

L-istruttura ta '3HGP, elastase porċina ntużat ukoll f'din ir-riċerka.FR130180, peress li l-cocrystal intuża bħala ċ-ċentru tas-sit ta' docking molekulari. Il-koordinati kienu 12.453,9.237, u 1.199 għad-dimensjonijiet X,Y,Z, rispettivament. L-affinità tal-irbit ġiet analizzata mill-aqwa għaxar konformers ta 'kull kalkolu ta' docking molekulari.

Dan l-artikolu huwa estratt minn Rapporti Xjentifiċi|(2021) 11:20452|https://doi.org/10.1038/s41598-021-99970-x