Iċ-Ċelloli tat-Tumur Falli milli Jippreżentaw Epitopi MHC-II ristretti Derivati ​​minn Onkoġeni Għal Ċelloli CD4+ T

Iċ-ċelluli CD4+ T għandhom rwol kritiku fl-immunità kontra t-tumur permezz ta' rikonoxximent ta' antiġeni peptidi ppreżentati fuq MHC klassi II (MHC-II). Għalkemm xi kanċer solidi jistgħu jiġu indotti jesprimu MHC-II, il-punt sa fejn dan jippermetti rikonoxximent dirett minn ċelluli CD4+ T speċifiċi għat-tumur mhuwiex ċar. Aħna iżolajna u kkaratterizzajna riċetturi tal-antiġeni taċ-ċelluli T (TCRs) minn ċelluli T CD4+ ipprajmati b'mod naturali speċifiċi għal 2 onkoproteini, HPV-16 E6, u l-mutazzjoni attivanti KRASG12V, minn pazjenti b'karċinoma taċ-ċelluli squamous tar-ras u tal-għonq u adenokarċinoma tal-kanal tal-frixa, rispettivament, u ddeterminaw il-kapaċità tagħhom li jirrikonoxxu ċelluli tat-tumur li jesprimu l-antiġenu li jesprimu l-antiġen imqabbla mal-antiġen tal-lewkoċiti awtologi jew umani. Sibna fiż-żewġ każijiet li t-TCRs kienu kapaċi jagħrfu ċelluli mmirati mgħobbija bil-peptide li jesprimu ċ-ċelluli li jippreżentaw l-antiġeni taċ-ċelluli MHC-II jew B (APCs) rilevanti meta l-antiġeni kienu espressi b’mod endoġenu u diretti lejn il-mogħdija endosomali iżda naqsu milli jirrikonoxxu t-tumur. ċelluli li jesprimu l-proteina tas-sors anke wara l-induzzjoni tal-espressjoni tal-MHC-II tal-wiċċ minn IFN- jew transduction b'CIITA. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-priming u r-rikonoxximent funzjonali kemm ta 'onkoproteina nukleari (E6) kif ukoll ta' onkoproteina assoċjata mal-membrana (KRAS) huma prinċipalment limitati għal APCs li jippreżentaw inkroċjat aktar milli permezz ta 'rikonoxximent dirett ta' ċelluli tat-tumur indotti biex jesprimu MHC-II.

Benefiċċji ta 'cistanche tubulosa-Antitumor

Introduzzjoni

It-trasformazzjoni malinna taċ-ċelluli somatiċi tinbeda mill-azzjoni ta 'onkoġeni attivati ​​li jirregolaw il-mogħdijiet tat-tkabbir taċ-ċelluli u jwasslu għal proliferazzjoni mhux ikkontrollata (1). Fil-każ ta' kanċers assoċjati mal-HPV, l-espressjoni tal-ġeni bikrija tal-HPV E6 u E7 tikkontribwixxi għall-onkoġenesi billi tinibixxi l-ġeni li jrażżnu t-tumur p53 u Rb, rispettivament (2). Alternattivament, l-attivazzjoni kostituttiva tal-onkoġeni tista 'sseħħ permezz ta' mutazzjoni somatika fil-ġeni li jirregolaw it-tkabbir taċ-ċelluli u l-mogħdijiet ta 'proliferazzjoni, bħall-familja RAS. Tabilħaqq, mutazzjonijiet tal-KRAS li jattivaw bħal KRASG12V jinstabu b'mod komuni f'pazjenti b'kanċer tal-frixa, tal-kolon u tal-pulmun (3). Għalkemm l-onkoġeni jippromwovu l-mard, jistgħu wkoll jipprovdu miri għas-sistema immuni ospitanti. F'dawn l-aħħar snin, ir-rwol tas-sistema immunitarja fil-kontroll tal-kanċer assoċjati mal-HPV sar rikonoxxut b'mod wiesa '. Ċelluli CD8+ u CD{4+ T li jirrikonoxxu HPV E6 u E7, kif ukoll proteini HPV oħra, ġew identifikati kemm fid-demm periferali kif ukoll fil-limfoċiti li jinfiltraw it-tumur (TILs) minn pazjenti b'HPV assoċjati mal-HPV. kanċers (4–6). Immunoterapiji li jimmiraw dawn l-antiġeni, inklużi vaċċini terapewtiċi tal-kanċer u terapija ċellulari adottiva (ACT) b'TILs jew ċelluli T maħduma minn TCR, huma qasam attiv ta 'investigazzjoni preklinika u klinika (2). Ir-risponsi taċ-ċelluli T kontra mutazzjonijiet onkoġeniċi ġew deskritti b'mod wiesa' wkoll (7-9). Barra minn hekk, hemm evidenza klinika diretta li ACT ma' TILs li jimmiraw għal KRAS mutant jista' jippromwovi reazzjonijiet oġġettivi (10). Għalkemm iċ-ċelluli CD8+ T li jagħrfu epitopi derivati ​​minn onkoġeni jimmedjaw ċitotossiċità diretta kontra ċelluli tat-tumur (11-13), ir-rwol taċ-ċelluli CD{4+ T fl-immunità kontra t-tumur huwa inqas mifhum tajjeb. Studji reċenti enfasizzaw subsett ta' ċelluli CD4+ T li jesprimu markaturi ċitotossiċi, bħal granzyme B (GrzmB), f'kanċer tal-bniedem (14, 15). L-ispeċifiċitajiet tal-antiġeni ta' dawn iċ-ċelloli, madankollu, u b'hekk il-potenzjal terapewtiku tagħhom, jibqgħu fil-biċċa l-kbira mhux magħrufa. Barra minn hekk, biex dawn iċ-ċelluli CD4+ T ċitotossiċi jagħrfu u joqtlu ċ-ċelluli tat-tumur, mhux biss iċ-ċellula tat-tumur għandha tesprimi MHC-II, iżda wkoll l-antiġeni rilevanti għandhom ikunu diretti lejn il-mogħdija ta 'preżentazzjoni xierqa. F'dan l-istudju, investigajna l-kapaċità taċ-ċelluli CD4+ T speċifiċi għall-onkoproteini HPV-16 E6 u KRASG12V biex jirrikonoxxu ċelluli tat-tumur li jesprimu l-antiġen. Għalkemm iż-żewġ TCRs setgħu jirrikonoxxu direttament antiġeni pproċessati u ppreżentati b'mod endoġenu diretti lejn il-kompartiment endosomali ta 'ċelluli B imqabbla ma' HLA, l-ebda wieħed ma kien kapaċi jagħraf ċelluli tat-tumur li jesprimu l-antiġenu b'espressjoni indotta ta 'MHC-II. B'mod ġenerali, ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li ċerti antiġeni biss huma ppreżentati direttament fuq ċelluli tat-tumur MHC-II+, li jistgħu jillimitaw il-ġabra ta' ċelluli CD4+ T li kapaċi jagħrfu u jeliminaw direttament iċ-ċelluli tat-tumur.

benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Riżultati

Identifikazzjoni ta' risponsi ta' HPV-16 E6-CD4+ u CD8+ T speċifiċi minn TILs ta' karċinoma taċ-ċelluli squamous tar-ras u l-għonq. Aħna eżaminajna serje ta' kulturi TIL individwali iżolati minn frammenti ta' tumur ta' 2 sa 4 mm minn pazjent (Hu-56) b'HPV-16+ karċinoma taċ-ċelluli skwamużi tar-ras u tal-għonq (HNSCC) (Tabella Supplimentari 1; materjal supplimentari disponibbli onlajn ma' dan l-artikolu; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) minn analiżi IFN-ELISPOT biex jiġu identifikati risponsi taċ-ċelluli T diretti kontra l-onkoproteini virali HPV-16 E6 u E7, bl-użu ta' pools ta' peptidi li jinkludu 15-mers li jikkoinċidu li jkopru t-tul tal-proteini E6 u E7. Notevolment, il-frammenti TIL 12 u 29 iġġeneraw numru sostanzjali ta 'spots fuq l-isfond meta stimolati mill-ġdid bil-grupp ta' peptidi E6 u kien fihom kemm ċelluli CD4+ kif ukoll CD8+ T (Figura 1A u Figura Supplimentari 1A). Biex nidentifikaw is-sottosettijiet ta 'ċelluli T rilevanti, aħna analizzajna dawn il-kulturi TIL bl-użu ta' analiżi ta 'sekrezzjoni ta' ċitokini. Dan żvela l-framment TIL 29 (F29) kien fih ċelluli T CD6-reattivi E8+, filwaqt li l-framment 12 (F12) kien fih kemm ċelluli CD{4+ kif ukoll CD8+ T kapaċi jirrikonoxxi l-grupp ta 'peptidi E6 (Figura 1B). L-ebda waħda miċ-ċelluli CD4+ T ma pproduċiet IL-5 b'reazzjoni għall-istimulazzjoni mill-ġdid E6, li vvalida fenotip bħal Th1-. Biex niddeterminaw il-klonalità tat-TCR ta' E6-TILs speċifiċi, għamilna ċelluli CD4+ T singolu ta' IFN- -secreting minn F12 u CD8+ ċelluli T minn F12 u F29. Is-sekwenzjar tat-TCR żvela TCR wieħed espress minn ċelluli CD4+ T li jħeġġu IFN- – (n=31 ta’ 31 ċellula sekwenzati), kif ukoll klonu TCR wieħed kondiviż minn CD{{53} li jnixxi IFN- }} Ċelloli T kemm minn F12 kif ukoll minn F29 (n=40 ta '41 u 37 ta' 38 ċellula sekwenzati, rispettivament) (Tabella Supplimentari 2). Dawn ir-riżultati jindikaw li ċ-ċelluli CD4+ u CD8+ monoklonali T reattivi għal E6 huma preżenti fi ħdan TILs minn dan il-pazjent. HLA-A*02:01–ċelluli CD8+ T ristretti minn TILs jirrikonoxxu E6 ippreżentat minn linja taċ-ċelluli tat-tumur derivata mill-pazjent. TILs minn F29 ipproduċew IFN- meta stimolati mill-ġdid bil-peptide E629-38, li jissuġġerixxi li l-F29 TCR irrikonoxxa dan l-epitope ristrett HLA-A*02:01 deskritt qabel (Figura Supplimentari 1B) (11). Dan ġie kkonfermat minn studji li jgħaqqdu tetramer bl-użu ta' E629-38/HLA-A*02:01 biex jiġu ttikkettjati ċelluli J76 defiċjenti ta' TCR li jesprimu CD8 uman u bl-użu ta' TCR speċifiku għall-E628-38 deskritt qabel bħala pożittiv kontroll (Figura 2A) (11). Iż-żewġ TCRs urew livelli simili ta 'avidità funzjonali, kif muri minn upregulation tal-markatur ta' attivazzjoni akuta CD69 fuq J76 wara stimulazzjoni b'linji taċ-ċelluli limfoblastojdi B awtologi (B-LCLs) pulsati b'konċentrazzjonijiet titrati ta 'E629-38 peptide (Figura 2, B u Ċ). Din id-dejta tivvalida l-preżenza ta’ klonu taċ-ċelluli CD8+ T speċifiku għal epitope magħruf ta’ E6 b’karatteristiċi funzjonali simili għal TCR li ġie ttestjat f’ambjent kliniku (16). Sussegwentement fittxejna niddeterminaw jekk it-TCR E6-CD speċifiku8+ jistax jirrikonoxxi antiġeni espressi b'mod endoġenu u b'hekk jimmedja ċ-ċitotossiċità kontra t-tumur. Biex nagħmlu dan, użajna HLA-A*02 karatterizzat tajjeb:01+ HPV{-16+ linja tat-tumur, CaSki, kif ukoll linja taċ-ċelluli tat-tumur awtologu, HNSCC-56, iġġenerat permezz riprogrammazzjoni ċellulari tat-tessut tat-tumur primarju kif deskritt qabel (17) għal analiżi taċ-ċitotossiċità in vitro. L-analiżi RNA-Seq ivvalidat l-espressjoni tal-ġeni bikrija tal-HPV-16, inkluż E6, kemm mill-kampjun tat-tumur primarju kif ukoll mil-linja taċ-ċelluli awtologi (Figura Supplimentari 1C). Ċelloli T CD8+ primarji umani li jesprimu l-F29 TCR jistgħu jimmedjaw il-qtil taċ-ċelluli kemm ta' CaSki kif ukoll ta' HNSCC-56 f'firxa ta' proporzjonijiet effettur għal-mira in vitro (Figura 2, D, u E). Flimkien, din id-dejta tivvalida li l-F29 TCR jirrikonoxxi l-antiġen E6 espress b'mod endoġenu. Identifikazzjoni ta' ċellula T CD4+ ristretta għall-HLA-DQ, E6-speċifika minn TILs. Biex tespandi E6-TILs speċifiċi għal aktar analiżi funzjonali, użajna l-protokoll tal-kultura ta' espansjoni rapida deskritt qabel b'OKT-3 u PBMCs alloġeniċi irradjati biex jespandu TILs minn F12. Għalkemm il-kultura primarja F12 oriġinarjament kien fiha kemm ċelluli CD{8+ u CD{4+ T b'reattività E6, il-prodott taċ-ċelluli finali wara espansjoni rapida kien fih 99% ċelluli CD{4+ T, li minnhom madwar 38.33 % wera reattività kontra E6, kif muri minn tbajja taċ-ċitokini intraċellulari għal IFN- (Figura 3A).

Ċiniż herb cistanche plant-Antitumor

Minbarra l-IFN-, it-TILs stimulati E6-speċifiċi għal E4+ jistgħu joħorġu TNF- iżda mhux IL-2 (Figura 2A Supplimentari). Għalkemm il-frekwenza totali taċ-ċelluli GrzmB+ ma żdiedetx bl-istimulazzjoni tal-antiġen, il-gating fuq ċelluli li jxerrdu TNF żvela li E6-CD4+ speċifiċi TILs kien fihom aktar GrzmB intraċellulari maħżuna milli kienu TILs mhux speċifiċi (Figura 2B Supplimentari ). CD4+ li jxerrdu IFN--TILs esprimew ukoll il-mewt taċ-ċelluli programmata tal-markatur koinibitorju 1 (PD{-1), konsistenti mal-firem ippubblikati ta' CD4+ TILs reattivi għat-tumur (Figura 2C Supplimentari) ( 18, 19). E6-CD speċifiċi4+ TILs wrew ħeġġa funzjonali għolja minħabba li dawn iċ-ċelluli setgħu inixxu ċitokini f'konċentrazzjonijiet ta' peptidi inqas minn 1 ug/mL (Figura 3B). Biex tiddetermina l-ispeċifiċità tal-kultura F12 TIL, aħna impulsaw B-LCLs awtologi b'peptidi individwali li jikkorrispondu għal kull wieħed mis-37 peptidi li jinsabu fil-pool E6 oriġinali (Tabella Supplimentari 3). CD4+ TILs minn F12 ħarġu IFN- meta stimulati b'peptidi E61-15 u E{65-19, li jaqsmu sekwenza tal-qalba ta' 11-amino acid (Figura 2D Supplimentari). Esperimenti ta 'kokultura fil-preżenza ta' Abs li jimblukkaw l-HLA wrew sekrezzjoni ta 'IFN imnaqqsa b'mod sinifikanti minn TILs meta B-LCLs ġew imblukkati b'Abs anti-HLA-DQ iżda mhux anti-HLA-DR jew Abs ta' kontroll tal-isotip (Figura 3C). Biex niddeterminaw liema alleli HLA-DQ huma responsabbli għall-preżentazzjoni ta’ dan l-epitope, għamilna pulsazzjoni B-LCLs li jesprimu alleli HLA-DQ magħrufa (Tabella Supplimentari 4) b’E61-15 u sibna li ċ-ċelloli KAS011 li jesprimu HLA-DQA1*01 :02 u DQB1*05:02, iżda mhux Hu-195 B-LCLs li jesprimu DQA1*05:05 u DQB1*03:01, jistgħu jippreżentaw antiġen għat-TILs b'mod komparabbli ma' Hu awtologu{{63} } B-LCLs (Figura 3D). Fl-aħħarnett, fittxejna li nivverifikaw li s-sekwenza TCR identifikata qabel kienet tabilħaqq responsabbli għar-rikonoxximent E6. L-espressjoni tat-TCR F12 fiċ-ċelluli CD4+ T tad-donaturi b'saħħithom tal-bniedem primarji kienet biżżejjed biex tippromwovi r-rikonoxximent tal-peptide E{61-15, kif muri mir-regolazzjoni 'l fuq ta' CD69 u PD-1 (Figura 3E ). Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati juru l-identifikazzjoni ta' epitope ristrett ta' HLA-DQ ta' E6 rikonoxxut minn CD4+ TILs monoklonali. E6-Ċelloli CD4+ speċifiċi T ma jagħrfux jew joqtlu ċelluli awtologi tat-tumur li jesprimu MHC-II. Studji reċenti identifikaw firem ġenetiċi ta' CD4+ TILs ċitotossiċi f'xi kanċers umani (14, 15). Madankollu, mhux magħruf jekk iċ-ċelluli CD4+ T ċitotossiċi għandhomx rwol f'kanċer immexxi mill-HPV. Biex niddeterminaw jekk E6-ċelluli T CD4+ speċifiċi minn TILs jistgħux jirrikonoxxu direttament l-HNSCC-56, l-ewwel investigajna l-istatus tal-espressjoni MHC-II tiegħu. Għalkemm iċ-ċelloli tat-tumur ma esprimew l-ebda wiċċ li jista 'jinqabad MHC-II fil-kultura, it-trattament b'IFN- għal 72 siegħa kien biżżejjed biex jinduċi upregulation ta' MHC-II (Figura 4A). Sussegwentement, ikkultivajna HNSCC-56 b'CD4+ F12 TILs. Importanti, ċelluli tat-tumur MHC-II+ prekundizzjonati b'IFN- ma setgħux jistimulaw CD4+ TILs kif imkejla permezz ta' sekrezzjoni ta' IFN- (Figura 4B).

Figura 1. Identifikazzjoni ta' E6-CD4+ u CD8+ TILs mill-HPV-16+ HNSCC. (A)

Figura 2. Karatteristiċi funzjonali ta' HLA-A*02:01–ristrett, E6-TCR speċifiku minn Hu-56 TILs. (A)

Madankollu, linji taċ-ċelluli tat-tumur ittrattati b'IFN pulsati b'E61-15 qabel iż-żieda ta' TILs setgħu jistimulaw rispons taċ-ċelluli T, li jindikaw li l-espressjoni tal-wiċċ tal-alleli HLA-DQ restrittivi f'linja taċ-ċelluli li tesprimi b'mod endoġenu. E6 ma kienx biżżejjed għar-rikonoxximent tat-tumur iżda kien jeħtieġ tagħbija eżoġena tal-peptide fil-mira. L-istess rekwiżit ta 'tagħbija ta' peptide eżoġenu fil-mira kien osservat b'ċelluli tat-tumur transduced CIITA (HNSCC-56 CIITA), li b'mod kostituttiv jesprimu livelli għoljin ta 'MHC-II tal-wiċċ (Figura 4B). Biex nittestjaw jekk is-CD4+ TILs setgħux jirrikonoxxu verżjoni pproċessata u ppreżentata b'mod endoġenu tal-epitope E6 fuq APC, aħna ttrasduċejna b'mod retroviral B-LCLs awtologi b'kostrutt tal-espressjoni li jikkodifika l-ewwel 50 aċidu amminiku ta' E6 imdewweb mal-MHC- I transmembrane domain (E6-MITD), li jinduċi lokalizzazzjoni tas-sekwenza ta 'amino acid imdewweb mal-membrana tal-plażma u jappoġġja l-preżentazzjoni fuq MHC-II permezz ta' traffikar endosomali (20). B-LCLs li jesprimu l-kostruzzjoni E6-MITD jistgħu jistimulaw E6-CD4+ TILs speċifiċi, li jindikaw li l-epitopi tal-peptidi rikonoxxut minn dawn it-TILs jista' jiġi pproċessat b'mod naturali u ppreżentat fuq MHC-II meta diretta lejn il-mogħdija xierqa (Figura 4C).

Figura 3. Karatteristiċi funzjonali ta' CD4+ klonali estiżi, ristretti għall-HLA-DQ, E6-specifici TILs. (A)

Sussegwentement, fittxejna niddeterminaw jekk il-F12 E6-CD4+ speċifiċi TILs kinux kapaċi għal ċitotossiċità diretta tat-tumur. B'mod konsistenti mad-dejta mill-analiżi tar-rikonoxximent tagħna, E6-CD speċifiċi4+ TILs ma setgħux jillimitaw it-tkabbir taċ-ċelluli tat-tumur HNSCC-56, li ma jesprimux MHC-II (Figura 4D) . Barra minn hekk, iċ-ċelloli tat-tumur HNSCC-56 CIITA kibru wkoll mingħajr inibizzjoni fil-preżenza ta' CD4+ TILs. Madankollu, it-tkabbir taċ-ċelluli tat-tumur HNSCC-56 CIITA pulsati b'E61-15 peptide ġie inibit b'mod dipendenti mid-doża taċ-ċelluli effetturi. B'mod ġenerali, din id-dejta tissuġġerixxi li għalkemm l-HNSCC-56 jista' jippreżenta epitopi E6 għal ċelluli CD8+ T, CD{4+ E6-TILs speċifiċi ma jistgħux jirrikonoxxu u lyse direttament l-MHC- II+ ċelluli awtologi tat-tumur. Ġeni involuti fil-preżentazzjoni ta 'antiġeni huma ta' spiss mutati fil-kanċer, li jistgħu jipprevjenu r-rikonoxximent miċ-ċelluli T (21). Biex niddeterminaw jekk iċ-ċelloli tat-tumur HNSCC-56 kienx fihom xi mutazzjonijiet somatiċi li jipprekludu l-preżentazzjoni tal-antiġen fuq MHC-II, għamilna sekwenzar tal-exome sħiħ taċ-ċelloli tat-tumur u PBMCs minn Hu-56 bħala kampjun ta' referenza. Mill-104 mutazzjonijiet somatiċi mhux sinonimi identifikati, ma kien hemm l-ebda mutazzjoni apparenti fil-komponenti tal-mogħdija tal-preżentazzjoni MHC-II, inklużi HLADMA, HLADMB, u CD74 (Tabella Supplimentari 5). Identifikazzjoni ta' TCR HLA-DRB5*01:01-ristrett, speċifiku għal KRASG12V mid-demm ta' pazjent b'adenokarċinoma tal-kanal tal-frixa. Wara dawn ir-riżultati, aħna ddejna niddeterminaw jekk l-inkapaċità taċ-ċelloli tat-tumur li jippreżentaw antiġen fuq MHC-II kinitx vera għal onkoġeni oħra. Minħabba li ċelluli T li jiċċirkolaw speċifiċi għat-tumur ġew identifikati f'pazjenti umani bil-kanċer (8, 22), aħna stimolajna PBMCs minn pazjent (Hu-66) b'adenokarċinoma tal-ductal tal-frixa (Tabella Supplimentari 1) b'ġabra ta' peptidi li jikkorrispondu għal mutazzjonijiet onkoġeniċi komuni (Tabella Supplimentari 6) għal 14-il jum qabel stimulazzjoni mill-ġdid b'peptidi individwali biex jiġu identifikati risponsi taċ-ċelluli T rilevanti minn ELISPOT. Dawn ir-riżultati indikaw il-preżenza ta 'rispons taċ-ċelluli T dirett kontra KRASG12V, kif evidenzjat minn numru akbar ta' spots IFN fuq l-isfond bi tweġiba għall-aċidi amminiċi KRASG12V 1-15 (Figura 5A). Biex tidentifika t-TCRs rilevanti assoċjati ma 'dan ir-rispons, erġajna użajna l-assaġġ ta' sekrezzjoni taċ-ċitokini biex issortja ċelluli li jxerrdu IFN---. L-assaġġ ta 'sekrezzjoni taċ-ċitokini żvela produzzjoni speċifika ta' IFN- permezz ta 'ċelluli CD4+ T bi tweġiba għal stimulazzjoni mill-ġdid b'KRASG12V (Figura 5B). It-tqabbil tal-ktajjen TCR minn ċelluli magħżula li jxerrdu IFN----ma' dawk preżenti f'PBMCs mhux estiżi minn dan il-pazjent wera klonotip wieħed TCR preżenti fl-ogħla frekwenza fost iż-żewġ popolazzjonijiet (Figura 5C u Tabella Supplimentari 2). Dawn ir-riżultati jindikaw li l-frekwenza ta 'dan il-klonu taċ-ċelluli T ġiet estiża fil-linja bażi fil-PBMCs, li tissuġġerixxi rispons in vivo li jirriżulta b'mod naturali aktar milli priming in vitro fil-kultura ta' espansjoni tagħna. Biex nivverifikaw l-ispeċifiċità ta' l-antiġen ta' dan it-TCR, esprimejna f'ċelluli CD4+ T primarji umani permezz ta' trasduzzjoni retrovirali u kkultivajna dawn iċ-ċelloli b'B-LCLs awtologi pulsati jew bil-mutant KRASG12V jew bil-peptide WT korrispondenti. Ċelloli T inġinerija ħarġu IFN- meta stimulati bil-mutant, iżda mhux WT, peptide KRAS, li jivverifikaw li dan it-TCR huwa speċifiku għal KRASG12V (Figura 5D). B'mod konsistenti mar-riżultati tagħna mill-E6 TCR, ċelluli T inġinerija li jesprimu t-TCR speċifiku għal KRASG12V kienu kapaċi wkoll jirrikonoxxu B-LCLs li jesprimu framment ta 'KRASG12V, iżda mhux WT KRAS, diretti lejn l-endosome bl-inklużjoni ta' MITD, li jissuġġerixxi li dan TCR jirrikonoxxi antiġen ipproċessat u ppreżentat b'mod endoġenu (Figura 5D).

Figura 4. Ċelloli awtologi tat-tumur ma jippreżentawx E61-15 endoġenu fuq ċelluli MHC-II għal CD4+ T. (A)

Figura 5. Identifikazzjoni ta 'HLA-DRB5 * 01: 01-ristrett, TCR speċifiku għal KRASG12V mid-demm ta' pazjent b'adenokarċinoma tal-kanal tal-frixa. (A)

Biex tidentifika l-allela HLA li tirrestrinġi, irripejna dawn l-esperimenti ta 'stimulazzjoni tal-peptidi bl-użu ta' B-LCLs li jesprimu kombinazzjonijiet differenti ta 'ġeni HLA. B-LCLs li jesprimu l-aplotip komuni HLA-B7-DR{15-DQ6 jistgħu jistimulaw iċ-ċelluli T maħdumin, filwaqt li B-LCLs mingħajr dawn l-alleli ma setgħux (Figura 5E). Fl-aħħar mill-aħħar, l-istimulazzjoni ta 'dawn iċ-ċelloli minn IHW03304 peptide-pulsed, linja taċ-ċelluli DAP3 tal-ġurdien trasfettata b'HLA-DRB5 * 01:01 tal-bniedem, ivverifikat dan bħala l-molekula HLA restrittiva (Figura 5F). Iċ-ċelloli tat-tumur MHC-II+ NCI-H2444 u DAN-G ma jippreżentawx epitope derivat minn KRASG12V għal ċelluli CD4+ T. Sussegwentement, investigajna l-kapaċità taċ-ċelloli tat-tumur li jippreżentaw direttament epitopi derivati ​​minn KRASG12V fuq MHC-II. Biex niġġenera linji ta 'ċelluli MHC-II+ imqabbla ma' HLA għal dawn l-istudji, aħna ttrasdujna l-linji taċ-ċelluli KRASG12V + NCI-H2444 u DAN-G, derivati ​​minn kanċer tal-pulmun u tal-frixa tal-bniedem, rispettivament, b'CIITA u kowttur li jikkodifika HLA-DRB5 * 01: 01 b'ġene reporter CD34 maqtugħ (Figura 6A). B'mod konsistenti mar-riżultati preċedenti tagħna, iċ-ċelluli tat-tumur MHC-II + li jesprimu l-allel HLA li jirrestrinġu ma setgħux jistimulaw ċelluli T maħduma minn TCR sakemm iċ-ċelluli fil-mira ma kinux l-ewwel pulsati b'peptide eżoġenu (Figura 6B). Importanti, ma kien hemm l-ebda mutazzjonijiet somatiċi elenkati fil-ġeni tal-preżentazzjoni MHC-II (jiġifieri, HLADMA, HLADMB, CD74) jew għal NCI-H2444 jew DAN-G fid-dejta tas-sekwenzjar disponibbli pubblikament (23). Iċ-ċelloli CIITA NCI-H2444 kibru mingħajr inibizzjoni fil-preżenza ta 'ċelluli T inġinerija TCR, filwaqt li ċelloli CIITA NCI-H2444 pulsati b'peptide KRASG12V esperjenzaw it-tkabbir ittardjat tat-tumur (Figura 6C). B'mod konsistenti mar-riżultati miksuba għal HNSCC-56, ċelluli CD{8+ T li jesprimu HLA-A*03:01– ristrett, TCR speċifiku għal KRASG12V (24) kienu kapaċi jagħrfu ċ-ċelloli NCI-H2444 iżda mhux Ċelloli CaSki, li jesprimu HLA-A * 03: 01 iżda mhux KRASG12V (Figura 6D). Dawn ir-riżultati juru li onkoġene distint preżenti fiċ-ċitosol lanqas ma jistax jiġi ppreżentat minn ċelluli tat-tumur MHC-II+ minkejja li jkun ippreżentat b'mod effettiv fuq MHC-I. L-espressjoni ta 'ligands koinibitorji bħal ligand tal-mewt taċ-ċelluli programmati 1 (PD-L1) minn ċelloli tat-tumur jillimita s-sinjalar tat-TCR fiċ-ċelloli T (25). Biex niddeterminaw jekk dan il-mekkaniżmu jistax ikun qed jipprevjeni r-rikonoxximent taċ-ċelloli tat-tumur MHC-II+ minn ċelluli CD4+ T, aħna kkultivajna ċelluli CD4+ T li jesprimu t-TCR tagħna speċifiku għal KRASG12V jew l-E6-speċifiku F12 TCR b'NCI-H2444 CIITA u HNSCC-56 CIITA, rispettivament, bi jew mingħajr Abs imblukkar anti-PD-L1. L-imblukkar tal-interazzjonijiet PD-L1/PD-1 ma kienx biżżejjed biex jippromwovi r-rikonoxximent taċ-ċelluli tat-tumur (Figura 3 Supplimentari). Bl-istess mod, iż-żieda ta 'anti-CD28 agonist Ab ma modulatx ir-rikonoxximent taċ-ċelluli tat-tumur. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li nuqqas ta 'preżentazzjoni ta' antiġenu, aktar milli l-preżenza jew l-assenza ta 'sinjali koinibitorji jew costimulatory, rispettivament, hija responsabbli għal dan il-fenotip. Xi studji jissuġġerixxu li proteini endoġeni internalizzati mill-membrana tal-plażma huma preferenzjali mgħobbija fuq MHC-II għall-preżentazzjoni, meta mqabbla ma 'kompartimenti subċellulari oħra (26). Għalkemm il-proteini KRAS huma spiss assoċjati ma 'membrani permezz ta' modifiki tal-lipidi, ma jesprimux dominju transmembrane, u dawn l-interazzjonijiet mhumiex stabbli (3, 27). Aħna rraġunajna, għalhekk, li l-ankraġġ tal-framment immunoġeniku ta' KRASG12V mal-membrana tal-plażma taċ-ċelluli tat-tumur jista' jippermetti rikonoxximent dirett tal-antiġen miċ-ċelluli CD4+ T. Madankollu, ċelluli tat-tumur li jesprimu l-kostruzzjoni KRASG12V-MITD, kif muri mill-espressjoni ta 'reporter EGFP marbut ma' P2A, bl-istess mod ma setgħux jistimulaw ċelluli CD4+ T inġinerija tat-TCR (Figura 4 Supplimentari). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-lokalizzazzjoni tal-onkoġeni subċellulari mhix l-uniku determinant tal-preżentazzjoni diretta ta 'MHC-II miċ-ċelloli tat-tumur. Barra minn hekk, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-espressjoni żejda tal-antiġen mhix biżżejjed biex tippromwovi l-preżentazzjoni ta 'MHC-II. Ir-riżultati tagħna s'issa jissuġġerixxu li ċ-ċelluli CD4+ T speċifiċi għat-tumur jistgħu jkunu aktar probabbli li jagħrfu l-antiġeni ppreżentati mill-APCs milli miċ-ċelloli tat-tumur infushom. Għalhekk, ivvalutajna l-kapaċità ta' HLADRB5*01:01+ DCs li jippreżentaw antiġeni derivati ​​minn proteini eżoġeni. DCs imqabbla ma' HLA ġġenerati in vitro kienu kapaċi jistimulaw ċelluli CD4+ T inġinerija tat-TCR li jesprimu t-TCR speċifiku għal KRASG12V meta DCs immaturi ġew jew pulsati bil-peptide KRASG12V 20-mer jew mitmugħa proteina sħiħa KRASG12V iżda mhux proteina KRAS WT (Figura 6E). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li għalkemm it-TCR ma jistax jirrikonoxxi antiġeni endoġeni ppreżentati minn ċelluli tat-tumur, jista 'jirrikonoxxi antiġeni eżoġeni ppreżentati inkroċjati fil-kuntest ta' DCs.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Diskussjoni

L-għan ta 'dan l-istudju kien li jiddetermina jekk TCRs iżolati minn ċelluli T ipprajmata b'mod naturali miksuba minn pazjenti bil-kanċer setgħux jirrikonoxxu ċelluli tat-tumur li jesprimu onkoġeni. Fir-rigward tal-klassi I (HLA-A*02:01)–ristrett, HPV-16 E{629-38 TCR miksuba minn HNSCC TILs, ir-rikonoxximent kien, forsi mhux sorpriża, affermat kemm għal linja taċ-ċelluli tat-tumur awtologu. u ċellula tat-tumur ikkaratterizzata sew imqabbla bl-HLA u li tesprimi E6-, CaSki (importanti, ara Figura 2). L-istess TILs (Figura 1) kien fihom ukoll numri sinifikanti ta' ċelluli T CD4+ speċifiċi li jipproduċu IFN- - (Figura 3), li, b'kuntrast, ma għarfux E6- li jesprimu ċelluli tat-tumur, anke meta kienu indotti jesprimu wiċċ abbundanti MHC klassi II ta 'l-allel li jippreżenta korretta (DQA1 * 01: 02 / DQB1 * 05: 02) permezz ta' trattament IFN jew transduction CIITA (Figura 4). L-espressjoni CIITA tinduċi mhux biss l-espressjoni tal-wiċċ tal-proteini MHC-II iżda wkoll HLA-DM u molekuli tal-katina invarjanti, li huma meħtieġa għall-ipproċessar u l-preżentazzjoni tal-antiġeni (28). Iċ-ċelluli B imqabbla ma 'HLA, b'kuntrast, ġew rikonoxxuti minn dan it-TCR meta l-antiġen kien dirett lejn il-mogħdija MHC-II. Sitwazzjoni simili kienet osservata fil-każ ta' TCR ristrett HLA-DRB5 * 01:01 speċifiku għal KRASG12V, li seta' jagħraf ċelluli B imqabbla ma' HLA, iżda mhux ċelluli tat-tumur li jesprimu MHC-II, meta l-antiġen kien dirett lejn il- mogħdija tal-preżentazzjoni tal-MHC-II. Iż-żewġ TCRs kellhom biżżejjed avidità funzjonali biex jimmedjaw ir-rikonoxximent ta 'antiġeni espressi b'mod endoġenu taħt il-kundizzjonijiet deskritti hawn fuq, u t-tnejn setgħu jimmedjaw iċ-ċitotossiċità ta' ċelluli mmirati mgħobbija b'peptidi. Din l-osservazzjoni tal-aħħar tirrifletti ċ-ċirkustanza ppreżentata f'diversi rapporti dwar iċ-ċelluli T CD4+ ċitotossiċi, għalkemm id-dejta tagħna testendi l-kuntest ta' din l-osservazzjoni billi turi li l-espressjoni endoġena tal-antiġen tas-sors u l-induzzjoni ta' MHC-II minn IFN- hija improbabbli. biex jagħti mira fiżjoloġika fuq ċelluli tat-tumur derivati ​​mill-epitelju għal TCRs kontra antiġeni nukleari jew assoċjati mal-membrana. Studji reċenti tal-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina umana u l-melanoma identifikaw firem ġenetiċi li jikkorrispondu maċ-ċelluli T ċitotossiċi CD4+ fost TILs (14, 15). Funzzjonalment, dawn is-CD4+ TILs ċitotossiċi huma kapaċi għar-rikonoxximent dirett tat-tumur dipendenti fuq l-MHC-II, li fl-aħħar mill-aħħar iwasslu għal liżi fil-mira minn granzymes b'mod simili għall-kontropartijiet CD8+ tagħhom. Madankollu, it-traduzzjoni terapewtika ta 'dawn is-sejbiet tista' tkun limitata mill-fatt li ftit tumuri solidi jesprimu MHC-II. Tabilħaqq, riżultati ta '2 studji indipendenti ssuġġerew li madwar terz biss tal-pazjenti b'melanoma għandhom xi ċelluli tat-tumur MHC-II+, u l-frekwenza ta' dawn iċ-ċelloli fit-tumur ħafna drabi hija inqas minn 10% (15, 29). Minflok, is-sors ċellulari predominanti ta 'MHC-II fil-mikroambjent tat-tumur jidher li jinfiltra l-lewkoċiti (26).

Figura 6. Iċ-ċelloli tat-tumur MHC-II+ KRASG12V+ ma jippreżentawx epitopi derivati ​​minn KRASG12V għal ċelluli CD4+ T. (A)

Għalkemm xi ċelluli tat-tumur solidu jesprimu MHC-II kostituttiv jew induċibbli, ir-riżultati tagħna jindikaw li minkejja l-preżenza ta’ ċelluli T CD4+ speċifiċi għall-onkoġeni fost TILs u PBMCs, dawn iċ-ċelloli ma jistgħux jirrikonoxxu u lisizzaw direttament li jesprimu l-antiġeni. Ċelloli tat-tumur MHC-II+, filwaqt li epitopi mill-istess proteina jistgħu jiġu ppreżentati b'mod effettiv liċ-ċelluli CD8+ T fuq MHC-I (13). Dan jissuġġerixxi li l-espressjoni sempliċi ta' antiġen fil-mira tista' ma tkunx biżżejjed biex tagħti rikonoxximent miċ-ċelluli CD4+ T għas-subsett ta' tumuri li jesprimu MHC-II. Barra minn hekk, dawn ir-riżultati jidhru li huma konsistenti f'diversi tipi ta 'tumur, minħabba li l-linji taċ-ċelluli mistoqsijin f'dan l-istudju jinkludu dawk derivati ​​minn HNSCC, adenokarċinoma tal-pulmun u kanċer tal-frixa. Ir-rikonoxximent dirett taċ-ċelluli CD4+ T tal-linji taċ-ċelluli tal-melanoma li jesprimu MHC-II b'mod naturali jew wara t-trasduzzjoni CIITA ġie rrappurtat fi studji 2 (30, 31). Madankollu, f'dawn iż-żewġ studji, frazzjoni sinifikanti tat-TCRs ittestjati ma għarfetx ċelluli tat-tumur direttament. Mhuwiex ċar jekk dawn it-TCRs jirrappreżentawx klonotipi "minn fil-qrib" li ma jirrikonoxxux antiġeni tat-tumur jew TCRs speċifiċi għat-tumur li ma jistgħux jagħrfu l-antiġenu kognat tagħhom minħabba nuqqasijiet fil-preżentazzjoni tal-antiġen bħal dawk enfasizzati f'dan l-istudju. Oliveira et al. (31) wrew li r-rikonoxximent dirett miċ-ċelluli CD4+ T kien ristrett għal 2 melanomi b'piżijiet ta 'mutazzjoni tat-tumur estremament għoljin, li jissuġġerixxi li dan il-fenotip jista' jagħti alterazzjonijiet addizzjonali meħtieġa li jippermettu l-preżentazzjoni MHC-II ta 'antiġeni tat-tumur. Għalkemm it-twaħħil ta' MITD mal-framment immunoġeniku ta' KRASG12V ma rriżultax f'rikonoxximent dirett ta' ċelluli tat-tumur minn ċelluli CD4+ T, studji ddeskrivew preġudizzju għal peptidi endoġeni derivati ​​minn proteini marbuta mal-membrana elużi minn MHC-II, preżumibbilment minħabba riċiklaġġ tal-membrana (26, 32). L-antiġen tal-melanoma Trp1 jeżisti fil-membrana tal-plażma, li jista' jiffaċilita l-preżentazzjoni diretta liċ-ċelluli CD4+ T minn ċelluli tat-tumur B16 (33). Antiġen ieħor assoċjat mal-melanoma, gp100, huwa ppreżentat minn ċelluli tat-tumur liċ-ċelluli CD4+ T b'mod dipendenti fuq id-dominju transmembrane ta' gp100 (34). F'ħidma reċenti li tinvestiga r-rwol taċ-ċelluli CD4+ T speċifiċi għan-neoantiġen f'mudell ta' sarkoma murina, epitopi derivati ​​minn subunità ta' integrina mutata, ukoll proteina marbuta mal-membrana, ġew elużi minn MHC-II fuq tumur trasdott minn CIITA ċelluli (35). Ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li għalkemm proteini marbuta mal-membrana jistgħu jiġu ttraffikati preferenzjali għal endosomi għal preżentazzjoni diretta fuq MHC-II, il-preżenza ta 'proteina tal-membrana immunoġenika waħedha mhix biżżejjed biex tippromwovi din il-preżentazzjoni. Mogħdijiet oħra ta’ preżentazzjoni mhux klassiċi ġew deskritti li jistgħu jippermettu aċċess għall-proteini ċitosoliċi jew nukleari għall-MHC-II, inkluża preżentazzjoni assoċjata mal-awtofaġija ta’ proteini intraċellulari u trasportatur assoċjati mal-ipproċessar tal-antiġeni – preżentazzjoni dipendenti għal ċelluli CD4+ T, fejn antiġeniċi peptidi huma preżumibbilment trasferiti minn MHC-I għal MHC-II waqt ir-riċiklaġġ tal-membrana (36, 37). Ġie rrappurtat rikonoxximent dirett dipendenti fuq MHC-II ta' ċelluli awtologi tat-tumur minn ċelluli CD4+ T speċifiċi għall-epitopi E7 (38, 39); madankollu, dawn l-istudji kienu jikkonċernaw it-tnejn proteini E7 espressi minn sottotipi HPV onkoġeniċi inqas prevalenti (jiġifieri, HPV-33 u HPV{-59) ippreżentati minn ċelluli tal-kanċer ċervikali fuq molekuli HLA-DR. Huwa possibbli, għalhekk, li s-sottotip tal-HPV, l-istoloġija tat-tumur, u alleli HLA li jirrestrinġu jistgħu jkunu wkoll fatturi rilevanti fil-preżentazzjoni differenzjali tal-antiġeni tal-HPV nukleari fuq ċelluli tat-tumur MHC-II+. Għalkemm id-dejta tagħna tissuġġerixxi li ċ-ċitotossiċità diretta tat-tumur mhijiex mekkaniżmu probabbli taċ-ċelluli T CD4+ E6- speċifiċi u KRASG12V, ġew deskritti mekkaniżmi oħra kontra t-tumur taċ-ċelluli T CD{4+, u trasferiment adottiv ta' ċelluli CD4+ T speċifiċi għat-tumur f'pazjenti bil-kanċer wera attività kontra t-tumur (7, 40, 41). Għalhekk, TCRs ristretti MHC-II bħal dawk identifikati f'dan l-istudju jistgħu jkunu utli għall-ACT f'pazjenti umani, minħabba li tali TCRs immiraw lejn epitopi derivati ​​minn onkoproteini tas-sewwieq ristretti għal haplotipi HLA stmati għal 1.27% u 16.10% tal-US White. popolazzjoni, rispettivament, għal HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 u HLA-DRB5*01:01 (42). Notevolment, iċ-ċelluli CD4+ T jgħinu fil-priming taċ-ċelluli CD8+ T speċifiċi għat-tumur billi jagħtu liċenzja lil DCs li jġorru l-antiġenu b'mod dipendenti fuq CD40L (43-45). Aħna nuru li t-TCR speċifiku għal KRASG12V identifikat f'dan l-istudju jirrikonoxxi antiġeni preżentati inkroċjati fil-kuntest ta 'DCs, u jissuġġerixxi li dawn iċ-ċelloli jistgħu jkunu kapaċi jikkontribwixxu għall-immunità antitumorali permezz ta' din il-funzjoni. Iċ-ċelluli CD4+ T jistgħu wkoll jipprovdu għajnuna lokali għaċ-ċelluli CD{8+ T fi ħdan it-tumuri billi joħorġu ċitokini bħal IL{-2 u IFN- , jappoġġaw is-sopravivenza taċ-ċelluli CD{8+ T u reklutaġġ għat-tumur (46). Barra minn hekk, CD4+ TILs jistgħu jirrikonoxxu antiġeni fil-mikroambjent tat-tumur fuq ċelluli majelojdi bħal makrofaġi. Tabilħaqq, studji prekliniċi wrew li fin-nuqqas ta 'MHC-II fuq ċelluli tat-tumur, ċelluli Trp1 CD4+ T trasferiti b'mod adottiv xorta jistgħu jeżerċitaw immunità kontra t-tumur dipendenti fuq IFN- u jikkorrelataw ma' żieda fl-attività ċitotossika tal-makrofaġi (47). Madankollu, dan il-fenomenu jidher li jiddependi fuq is-sekrezzjoni tal-antiġen tat-tumur, li aħna wkoll nispekulaw li huwa minimu fil-każ tal-biċċa l-kbira tal-onkoġeni. B'mod ġenerali, l-istudju tagħna jenfasizza s-selettività tal-preżentazzjoni diretta ta 'antiġeni endoġeni minn ċelluli tat-tumur MHC-II+ u juri li la l-espressjoni CIITA u lanqas il-preżenza ta' antiġenu marbut mal-membrana ma huma biżżejjed waħedhom biex jippromwovu r-rikonoxximent dirett taċ-ċelluli tat-tumur minn CD{{115} } Ċelloli T. Huma meħtieġa aktar studji biex jikkaratterizzaw liema antiġeni jistgħu jiġu ppreżentati direttament miċ-ċelloli tat-tumur MHC-II+ taħt liema kundizzjonijiet biex jifhmu bis-sħiħ ir-rwoli li jiddependu mill-kuntest taċ-ċelluli CD4+ T fil-kanċer.

sistema immunitarja li żżid il-pjanti cistanche

Metodi

Kultura taċ-ċelluli. It-TILs ġew maħsuda u kkultivati ​​kif deskritt qabel (48). Fil-qosor, it-tessut tat-tumur primarju ġie mqassam fi frammenti ta' 2–3 mm, li tqiegħdu fi 24-pjanċa sew u kkultivati ​​f'RPMI-1640 supplimentat b'1{{102}}% serum AB uman, penicillin-streptomycin, HEPES, gentamicin, u 6,000 IU/ mL IL-2. TILs estravażi ġew ikkultivati ​​minn sostituzzjonijiet ta 'nofs midja kull 2-3 ijiem. Ċelloli T umani primarji mid-demm periferali ġew ikkultivati ​​f'medja 50:50 li tikkonsisti f'50% AIM V flimkien ma' 50% RPMI-1640 supplimentati b'10% serum uman AB, penicillin-streptomycin (100 U/ mL kull wieħed; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 IU/mL IL-2, 5 ng/mL IL-7, u 5 ng/mL IL-15. Linji taċ-ċelluli tat-tumur derivati ​​mill-pazjent ġew iġġenerati u kkultivati ​​kif deskritt qabel (17). Fil-qosor, it-tessut tat-tumur primarju ġie maqtugħ fi frammenti iżgħar minn 2 mm u dissoċjat bl-użu ta' GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec). Iċ-ċelloli tat-tumur ġew sospiżi mill-ġdid f'F-Media li kien fihom inibitur ta' Rho kinase 5 μM u miksija fuq sodda ta' fibroblasti 3T3 irradjati (30 Gy). Wara l-kultura inizjali, iċ-ċelluli tat-tumur ġew propagati f'taħlita 3:1 ta 'medja irradjata 3T3-kundizzjonata u F-Media li fiha inibitur ta' Rho kinase 5 μM. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T3-CD40L, u B-LCLs inżammu f'medja RPMI supplimentata b'l-glutamine u HEPES ( 10 mM; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10% FBS, 1 mM sodium pyruvate (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1× MEM aċidi amminiċi mhux essenzjali (Gibco, Thermo Fisher Scientific), u penicillin-streptomycin (100 U/ mL kull wieħed; Gibco). Żammejna 293GP (ATCC) f'suppliment medju DMEM b'10% FBS u penicillin-streptomycin (100 U / mL kull wieħed; Gibco, Thermo Fisher Scientific). IHW03304, GM3107, KAS011, D8, u ċelluli D66 kienu rigali minn Alessandro Sette (La Jolla Institute for Immunology). Assaġġi ELISPOT. TILs jew PBMCs ġew ibbanjati f'100,000 ċellula għal kull bir fi pjanċi ELISPOT miksija b'antiIFN– Abs ({1-D1K, Mabtech). Iċ-ċelloli ġew stimulati mill-ġdid b'pools ta' peptidi HPV-16 E6 u E7 PepMix (JPT), pools ta' peptidi li jirrappreżentaw mutazzjonijiet onkoġeniċi magħżula, jew peptidi individwali indikati f'5 ug/mL għal pools jew 10 ug/mL għal peptidi għal 22 siegħa qabel l-iżvilupp Pjanċi ELISPOT skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur (Mabtech). Għal kontroll pożittiv, intuża 5 ug/mL phytohemagglutinin-L. Kultura ta 'espansjoni ex vivo. Il-PBMCs ġew ibbanjati b'ġabra ta' peptidi li tirrappreżenta mutazzjonijiet onkoġeniċi magħżula f'5 ug/mL. Medju frisk li fih 10 IU/mL IL-2 ġie miżjud fil-jiem 4, 7, u 10. Fl-14-il jum, PBMCs ġew stimulati mill-ġdid għall-użu jew f'analiżi ta 'sekrezzjoni ta' ċitokini jew ELISPOT. Sekwenzar tat-TCR. TILs jew PBMCs ġew stimulati mill-ġdid b'5 ug/mL HPV-16 E6 PepMix (JPT) jew KRASG12V peptide, u ċ-ċelluli li jxerrdu l-IFN ġew immarkati b'mod fluworexxenti bl-użu tal-kit tal-Assaġġ ta' Sekrezzjoni Uman IFN skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur (Miltenyi Biotec) . Ċelloli IFN- + waħdieni ġew magħżula fi pjanċa ta' 96-bir bl-użu ta' FACSAria (BD Biosciences) u RNA-Seq twettqet bl-użu ta' Illumina Miseq biex jiġu identifikati TCR u ktajjen imqabbda. Għall-identifikazzjoni tal-klonu E6-CD speċifiku4+ TCR, iċ-ċelluli li jnixxu l-IFN ġew magħżula kif hawn fuq u s-sekwenzi TCR u TCR ġew amplifikati permezz ta 'PCR nested, multiplexed, kif deskritt qabel (49). Il-prodotti tal-PCR ġew sottomessi għas-sekwenzjar Sanger (ETON Biosciences). Għall-analiżi tal-frekwenza TCR, PBMCs qabel u wara 14-jum espansjoni ex vivo b'peptidi indikati ntbagħtu lil Adaptive Biotechnologies. Analiżi tal-espressjoni tal-HPV. L-RNA ġie iżolat minn Hu-56 ċelluli tat-tumur primarji u l-linja taċ-ċelluli tat-tumur u ġie sottomess għal RNA-Seq tal-massa. Qari tas-sekwenzjar tat-tarf paired ġew immappjati bl-użu ta' BWA (v0.7.12) (50) mal-ġenoma komplut tal-HPV (nru ta' adeżjoni tal-GenBank NC_001526.2) u t-traskriptoma korrispondenti tiegħu. Il-fajl tal-mappa tal-allinjament tas-sekwenza li rriżulta ġie kkonvertit għal mappa tal-allinjament binarju magħżul u indiċjat, segwit mill-għadd tal-qari mapep bl-użu ta 'SAMtools (v1.2) (50). Sekwenzar tal-eżoma kollu. Is-sekwenzjar ta 'l-exome sħiħ u l-RNA-Seq saru fl-Istitut ta' La Jolla għall-Immunoloġija Sequence Core bl-użu ta 'qbid ta' exome sħiħ Agilent u kits Illumina, rispettivament. Il-bijokampjuni FFPE tqassmu miċ-Ċentru tal-Kanċer Moores lil Tempus għal sekwenzar tal-ġenerazzjoni li jmiss flimkien ma 'DNA ta' referenza mqabbla bl-użu ta 'kampjuni tad-demm periferali. Qari tas-sekwenza mis-sekwenzjar tal-exome tat-tumur u l-kampjuni normali ġew allinjati mal-ġenoma ta 'referenza GRCh38 bl-użu ta' SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). Il-varjanti tal-Exome ġew identifikati bl-użu ta 'SpeedSeq Somatic, u l-varjanti ġew annotati bl-użu ta' SNPeff (v4.3i) (52). Id-dejta tas-sekwenzjar tal-RNA-Seq u tal-exome sħiħ għal dan il-manuskritt ttella' fuq NCBI BioProject, numru ta' adeżjoni PRJNA924789. Trasduzzjoni retrovirali taċ-ċelluli T. Is-sekwenzi tan-nukleotidi TCR ġew sintetizzati u kklonati fis-sinsla tar-retrovirus MSGV1 bl-użu ta 'BioXP 3200 (Codex). Is-sekwenza kienet codon ottimizzata għall-espressjoni fiċ-ċelloli umani. Ir-reġjuni kostanti tat-TCR tal-bniedem ġew skambjati għal reġjuni kostanti tat-TCR tal-ġrieden b'sostituzzjonijiet biex itejbu l-espressjoni tal-wiċċ u jippromwovu tqabbil preferenzjali (53, 54). Il-PBMCs tal-bniedem kienu iżolati minn buffy coats. Iċ-ċelluli CD4+ jew CD{8+ T tneħħew b'għażla manjetika, u l-frazzjoni negattiva li fiha l-limfoċiti kollha li kien fadal ġiet ikkultivata f'medja taċ-ċelluli T b'50 ng/mL anti-CD3 Ab (OKT3) għal 2 jiem.

Benefiċċji ta 'cistanche tubulosa-Antitumor

Supernatanti retrovirali TCR ġew iġġenerati permezz ta 'kotrasfezzjoni ta' ċelluli 293GP bil-vettur MSGV1 li fih is-sekwenza TCR rilevanti u l-plasmid RD113. Jumejn wara t-trasfezzjoni, is-supernatanti retrovirali ġew maħsuda u jew użati friski jew iffriżati fi –80 grad. It-trasduzzjonijiet saru fuq pjanċi miksija b'RetroNectin (Takara), kif deskritt qabel (5). L-espressjoni tar-reġjun kostanti tat-TCR murina ġiet ivvalutata permezz ta 'ċitometrija tal-fluss biex tiddetermina l-effiċjenza tat-trasduzzjoni. Iċ-ċelluli T maħduma minn TCR intużaw mhux aktar kmieni minn jum 7 wara l-istimulazzjoni inizjali. Assays funzjonali taċ-ċelluli T. Aħna kkoltivajna 5 × 104 TILs, ċelluli T trasdotti, jew ċelluli J76 Jurkat b'1 × 105 B-LCLs pulsati matul il-lejl b'konċentrazzjonijiet indikati ta 'peptide jew 5 × 103 ċelluli tat-tumur miżrugħa l-ġurnata ta' qabel f'{{16} }tajjeb pjanċi U-qiegħ jew qiegħ ċatt, rispettivament. Fejn indikat, agonist anti-CD28 (klonu CD28.2, BioLegend) jew imblukkar anti-PD-L1 (klonu 29E.2A3, BioLegend) Abs ġew miżjuda ma 'kokulturi taċ-ċelluli T u taċ-ċelluli tat-tumur f'5 u 10 ug/mL, rispettivament. Għal analiżi ta 'ċitokini u markaturi ta' attivazzjoni, 1 × Cell Activation Cocktail (BioLegend) li fih PMA u ionomycin intuża bħala kontroll pożittiv. Għal studji tal-imblukkar tal-HLA, 20 ug/mL tal-Abs li ġejjin ġew miżjuda ma' B-LCLs b'impulsi tal-peptidi mill-inqas sagħtejn qabel iż-żieda taċ-ċelluli T: anti-HLA-DQ (Tü169, BioLegend), anti-HLA-DR (L243, BioLegend), jew kontroll tal-isotip IgG2a tal-ġurdien (MOPC-173, BioLegend). Fejn indikat, iċ-ċelluli tat-tumur ġew ikkultivati ​​għal 72 siegħa b'10 ng/mL rikombinanti IFN- qabel iż-żieda ta 'ċelluli T. Is-supernatanti ġew maħsuda wara 18-24 siegħa, IFN- tkejjel b'ELISA (Thermo Fisher Scientific), u gerbub taċ-ċelluli ġew imtebba 'għaċ-ċitometrija tal-fluss. L-analiżi taċ-ċitotossiċità twettqu b'kokultura ta' ċelluli T b'ċelluli tat-tumur f'proporzjonijiet indikati ta' effettur għal mira. Fil-qosor, 5 × 103 ċelluli tat-tumur ġew miżrugħa u kkultivati ​​matul il-lejl qabel ma żżid ċelluli T fil-proporzjonijiet indikati. Il-liżi taċ-ċelluli fil-mira ġiet iddeterminata bl-użu tal-Analizzatur taċ-Ċelluli xCELLigence Real-Time (ACEA Biosciences), li vvaluta l-impedenza elettrika minħabba l-aderenza taċ-ċelluli kull 30 minuta sat-tmiem tal-esperiment. Id-dejta ġiet analizzata bl-użu tal-pakkett tas-softwer xCELLigence RTCA, u r-riżultati ġew irrappurtati bħala indiċi taċ-ċelluli normalizzat għal 1 fiż-żmien meta ġew miżjuda ċ-ċelloli T. Assaġġ tal-preżentazzjoni MHC-II. Kostruzzjonijiet tad-DNA sintetiċi li jikkodifikaw dan li ġej ġew iġġenerati u kklonati f'MSGV1 bl-użu ta' BioXP 3200 (Codex): il-25 aċidu amminiku N-terminal tal-ġene HLA-B uman, segwiti mill-ewwel 50 aċidu amminiku tal-HPV-16 E6 jew 25 aċidu amminiku ta 'KRASG12V imdewweb mal-55 aċidu amminiku C-terminal ta' HLA-B uman, element li jinqasam minnu nnifsu T2A, u s-sekwenza ta 'kodifikazzjoni ta' EGFP. Supernatanti virali ġew iġġenerati kif deskritt hawn fuq, u B-LCLs awtologi ġew trasdotti fuq pjanċi miksija b'RetroNectin wara stimulazzjoni matul il-lejl fuq sodda ta 'ċelluli 3T3 irradjati (0.5 Gy) li jesprimu CD40L uman (3T3-CD40L). L-effiċjenza tat-trasduzzjoni ġiet evalwata bil-kwantifikazzjoni ċitometrika tal-fluss tal-espressjoni tal-EGFP. B-LCLs trasdotti ġew stimulati bi 3T3-CD40L fil-preżenza ta' 200 IU/mL IL uman rikombinanti-4 (PeproTech) għal 2 rawnds suċċessivi ta' 2-3 ijiem qabel il-kokultura b'TILs awtologi. Ġenerazzjoni ta' DCs għal analiżi ta' preżentazzjoni ta' antiġen. DCs ġew iġġenerati bl-użu tal-metodu ta 'aderenza tal-plastik. PBMCs iffriżati ġew imdewweb u miksija f'medja DC (RPMI-1640 supplimentat b'l-glutamina, 5% serum uman AB inattivat bis-sħana, u 100 U/mL kull penicillin-streptomycin) għal sagħtejn f'37 grad. Ċelloli mhux aderenti tneħħew bil-ħasil b'PBS sħun, u ċelloli aderenti ġew ikkultivati ​​f'medja DC supplimentata b'800 U/mL GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) u 500 U/mL IL-4 (PeproTech) għal 6 ijiem . Żidna 1 ug/mL KRASG12V peptide jew 20 ug/mL KRASG12V jew proteina WT KRAS (Abcam) direttament lil DCs immaturi matul il-lejl. L-għada, id-DCs ġew maħsuda u kkultivati ​​flimkien ma 'ċelluli T maħduma minn TCR bi proporzjon ta' 1:1 matul il-lejl qabel ma vvalutat ir-regolazzjoni 'l fuq ta' CD137 permezz ta 'ċitometrija tal-fluss. Trasduzzjoni retrovirali taċ-ċelluli tat-tumur. Is-sekwenza ta 'kodifikazzjoni tas-CIITA umana ġiet sintetizzata (Teknoloġiji tad-DNA Integrati) u kklonata f'MSGV1 minn Gibson Assembly. Is-sekwenzi ta 'kodifikazzjoni ta' HLADRB5 * 01:01 u ktajjen separati b'sekwenza P2A ġew sintetizzati (Teknoloġiji tad-DNA Integrati) u kklonati f'vettur lentivirali pHAGE modifikat 'l fuq minn sekwenza T2A segwit minn sekwenza reporter CD34 maqtugħa minn Gibson Assembly. Supernatanti retrovirali ġew iġġenerati b'MSGV1, kif deskritt hawn fuq. Supernatanti lentivirali ġew iġġenerati minn kotrasfezzjoni ta 'ċelluli 293T ma' plasmidi pHAGE, tat, rev, gag/pol, u vsv-g. Is-supernatanti virali nġabru 24 siegħa wara u kkonċentrati permezz ta' ċentrifugazzjoni f'tubi Amicon Ultra 5 (MilliporeSigma). Iċ-ċelloli tat-tumur ġew ibbanjati u, ġurnata wara, il-medju ġie sostitwit b'supernatant retrovirali jew lentivirali supplimentat b'10 ug/mL polybrene. Erba' sigħat wara, is-supernatant li kien fih il-virus ġie aspirat u mibdul b'mezz ta' kultura. Iċ-ċelloli tat-tumur MHC-II+ u CD34+ ġew magħżula bl-użu ta' FACS Fusion cell sorter (BD Biosciences). Ċitometrija tal-fluss. Iċ-ċelloli ġew ittikkettati b'Abs monoklonali konjugati bil-fluworokrom mal-antiġeni li ġejjin: CD3-PE anti-uman (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4-PE-Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8-APC (Hit8a, Tonbo). , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend), u TCR kontra l-ġurdien -APC (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). Ċelloli mejta kienu mtebbgħin jew b'DAPI jew LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). E629-38– HLA-A*02:01–PE tetramer ġie mmuntat u ttikkettjat mill-NIH Tetramer Core Facility. Iċ-ċelloli kienu mtebbgħin b'1 ug/mL tetramer għal siegħa fuq is-silġ. Tbajja Ab għall-antiġeni tal-wiċċ saret għal 15-il minuta fuq is-silġ. Għat-tbajja’ taċ-ċitokini intraċellulari (ICS), iċ-ċelluli T ġew kokulturati b’APCs b’impulsi tal-peptidi għal 4-6 sigħat fil-preżenza ta’ Brefeldin A. Iċ-ċelloli ġew permeabilizzati u mtebbgħin għal ċitokini intraċellulari bis-Cytofix/Cytoperm Kit (BD Biosciences) wara t-tbajja’ tal-wiċċ , skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. L-Abs konjugati bil-fluorokromu li ġejjin intużaw għat-tbajja taċ-ċitokini: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2–FITC (MQ{1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11) , BioLegend), u Granzyme B–PE (QA16A02, BioLegend). Id-dejta nkisbet b'ċitometru tal-fluss FACSCelesta (BD Biosciences) u ġiet analizzata bis-softwer FlowJo v10.7. Statistika. Analiżi statistiċi saru bi Prism 8 (GraphPad Software). Għat-tqabbil tal-ICS, intuża t-test 2-denb mhux imqabbad. Għat-tqabbil tas-soppressjoni medjata minn Ab-Ab li jimblokka HLA tas-sinjalar taċ-ċelluli T, intuża 2-mod ANOVA. P <0.05 tqieset statistikament sinifikanti. Approvazzjoni ta' studju. Il-kampjuni umani deidentifikati użati f'dan l-istudju nkisbu taħt kunsens infurmat permezz tal-protokoll UCSD IRB 101391CX, "Tumur Environment Phenotyping and Cell Isolation." Il-kunsens infurmat bil-miktub ġie pprovdut mill-individwi fl-istudju.

Referenzi

1. Hanahan D, Weinberg RA. Il-karatteristiċi tal-kanċer: il-ġenerazzjoni li jmiss. Ċellula. 2011;144(5):646–674.

2. Shamseddine AA, et al. Immunità tat-tumur u immunoterapija għal kanċers relatati mal-HPV. Cancer Discov. 2021;11(8):1896–1912.

3. Simanshu DK, et al. Leading edge review RAS proteini u r-regolaturi tagħhom fil-mard tal-bniedem. Ċellula. 2017;170(1):17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ, et al. Repertorju poliklonali kbir mhux mistenni ta 'ċelluli T speċifiċi għall-HPV huwa lest għal azzjoni f'pazjenti b'kanċer ċervikali. Cancer Res. 2010;70(7):2707–2717.

5. Stevanović S, et al. Pajsaġġ ta 'antiġeni tat-tumur immunoġeniċi f'immunoterapija b'suċċess ta' kanċer epiteljali indott b'mod virali. Xjenza. 2017;356(6334):200–205.

6. Bhatt KH, et al. Il-profiling tar-risponsi speċifiċi taċ-ċelluli T tal-HPV-16-tiżvela reattivitajiet wesgħin tal-antiġen f'pazjenti bil-kanċer orofarinġeali. J Exp Med. 2020;217(10):e20200389.

7. Veatch JR, et al. Ċelluli T CD4 + speċifiċi għal BRAF V600E li jinfiltraw it-tumur ikkorrelati ma' rispons kliniku sħiħ fil-melanoma. J Clin Invest. 2018;128(4):1563–1568.

8. Veatch JR, et al. Ċelloli CD4+ T endoġeni jirrikonoxxu neoantiġeni f'pazjenti bil-kanċer tal-pulmun, inklużi mutazzjonijiet rikurrenti ta' KRAS onkoġeniċi u ERBB2 (Her2). Kanċer Immunol Res. 2019;2(13):910–922.

9. Cafri G, et al. Ċelloli T tal-memorja li jimmiraw mutazzjonijiet onkoġeniċi misjuba fid-demm periferali ta 'pazjenti bil-kanċer epiteljali. Nat Commun. 2019;10(1):449.

10. Tran E, et al. Terapija ta' trasferiment taċ-ċelluli T li timmira KRAS mutant fil-kanċer. N Engl J Med. 2016;375(23):2255–2262.

11. Draper LM, et al. Immirar taċ-ċelluli tal-kanċer epiteljali tal-HPV-16+ minn ċelloli T maħduma mill-ġeni TCR diretti kontra E6. Clin Cancer Res. 2015;21(19):4431–4439.

12. Jin BY, et al. Ċelloli T inġinerija mmirati lejn E7 jimmedjaw ir-rigressjoni tal-kanċer tal-papillomavirus uman f'mudell murini. JCI Insight. 2018;3(8):e99488.

13. Bear AS, et al. Karatterizzazzjoni bijokimika u funzjonali ta 'epitopi KRAS mutanti tivvalida din l-onkoproteina għall-immirar immunoloġiku. Nat Commun. 2021;12(1):4365.

14. Oh DY, et al. Ċelloli intratumorali CD4+ T jimmedjaw iċ-ċitotossiċità kontra t-tumur fil-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina tal-bniedem. Ċellula. 2020;181(7):1612–1625.

15. Cachot A, et al. Ċelloli T CD4 ċitolitiċi speċifiċi għat-tumur jimmedjaw l-immunità protettiva kontra l-kanċer tal-bniedem. Sci Adv. 2021;7(9):eabe3348.

16. Doran SL, et al. Terapija tal-ġeni tar-riċettur taċ-ċelluli T għal kanċers epiteljali assoċjati mal-papillomavirus uman: studju tal-ewwel fil-bniedem, fażi I/II. J Clin Oncol. 2019;37(30):2759–2768.

17. Liu X, et al. Riprogrammazzjoni kondizzjonali u espansjoni fit-tul ta 'ċelluli normali u tat-tumur minn bijokampjuni umani. Nat Protoc. 2017;12(2):439–451.

18. Veatch JR, et al. Iċ-ċelluli CD4+ T speċifiċi għal neoantiġen fil-melanoma umana għandhom stati differenti ta' differenzjazzjoni u jikkorrelataw maċ-ċelluli CD8+ T, makrofaġi, u l-funzjoni taċ-ċelluli B. Ċellula tal-Kanċer. 2022;40(4):393–409.

19. Lowery FJ, et al. Firem molekulari ta 'ċelluli T reattivi għan-neoantiġeni kontra t-tumur minn kanċer metastatiku tal-bniedem. Xjenza. 2022;375(6583):877–884.

20. Kreiter S, et al. Żieda fl-effiċjenza tal-preżentazzjoni tal-antiġeni billi l-antiġeni jiġu gganċjati mas-sinjali tat-traffikar tal-MHC klassi I. J Immunol. 2008;180(1):309–318.

21. Zaretsky JM, et al. Mutazzjonijiet assoċjati ma' reżistenza miksuba għall-imblokk tal-PD-1 fil-melanoma. N Engl J Med. 2016;375(9):819–829.

22. Gros A, et al. Rikonoxximent ta' neoantiġeni tal-kanċer gastrointestinali tal-bniedem billi jiċċirkolaw limfoċiti PD-1+. J Clin Invest. 2019;129(11):4992–5004.

23. Scholtalbers J, et al. TCLP: katalgu tal-linja taċ-ċelluli tal-kanċer onlajn li jintegra tip HLA, neo-epitopi mbassra, virus, u espressjoni tal-ġeni. Ġenoma Med. 2015;7(1):118.

24. Juneja V, Choi J, inventuri; BioNTech US Inc., assenjat. Kostruzzjonijiet tar-riċettur taċ-ċelluli T u użi tagħhom. US Privattiva Nru US202103040215A1. 4 ta’ Novembru, 2021.

25. Sharpe AH, Pauken KE. Il-funzjonijiet varji tal-mogħdija inibitorja PD1. Nat Rev Immunol. 2018;18(3):153–167.

26. Abelin JG, et al. Id-definizzjoni tal-ipproċessar tal-ligand HLA-II u r-regoli tal-irbit bl-ispettrometrija tal-massa ttejjeb il-previżjoni tal-epitopi tal-kanċer. Immunità. 2019;51(4):766–779.

27. Silvius JR, et al. K-ras4B u proteini prenilati li m'għandhomx "it-tieni sinjali" jassoċjaw b'mod dinamiku mal-membrani ċellulari. Mol Biol Cell. 2006;17(1):192–202.

28. Chang CH, Flavell RA. It-transattivatur tal-Klassi II jirregola l-espressjoni ta' ġeni multipli involuti fil-preżentazzjoni tal-antiġeni. J Exp Med. 1995;181(2):765–767.

29. Rodig SJ, et al. Il-proteini MHC jagħtu sensittività differenzjali għall-imblokk ta' CTLA-4 u PD-1 f'melanoma metastatika mhux ittrattata. Sci Transl Med. 2018;10(450):eaar3342.

30. Ahmadzadeh M, et al. Iċ-ċelluli T regolatorji CD4+ umani li jinfiltraw it-tumur juru repertorju TCR distint u juru reattività tat-tumur u tan-neoantiġen. Sci Immunol. 2019;4(31):eaao4310.

31. Oliveira G, et al. Il-pajsaġġ taċ-ċelluli T helper u regolatorji kontra t-tumur CD4+ fil-melanoma. Natura. 2022;605(7910):532–538.

32. Rock KL, et al. Ippreżenta lilek innifsek! Permezz ta' molekuli MHC klassi I u MHC klassi II. Xejriet Immunol. 2016;37(11):724–737.

33. Takechi Y, et al. Proteina tal-membrana melanosomali hija mira tal-wiċċ taċ-ċelluli għat-terapija tal-melanoma. Clin Cancer Res. 1996;2(11):1837–1842.

34. Lepage S, Lapointe R. Is-sekwenzi ta 'mira melanosomali minn gp100 huma essenzjali għall-preżentazzjoni u l-mobilizzazzjoni ta' epitopi endoġeni ristretti tal-MHC klassi II għal kompartimenti endosomali. Cancer Res. 2006;66(4):2423–2432.

35. Alspach E, et al. In-neoantiġeni MHC-II jiffurmaw l-immunità tat-tumur u r-rispons għall-immunoterapija. Natura. 2019;574(7780):696–701.

36. Dengjel J, et al. L-awtofaġija tippromwovi l-preżentazzjoni tal-MHC klassi II ta 'peptidi minn proteini sors intraċellulari. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102(22):7922–7927.

37. Matsuzaki J, et al. Mogħdijiet ta' pproċessar ta' antiġeni mhux klassiċi huma meħtieġa għar-rikonoxximent dirett tat-tumur ristrett għall-MHC klassi II minn ċelloli T CD4+ speċifiċi ta' NY-ESO-1-. Kanċer Immunol Res. 2009;2(4):341–350.

38. Höhn H, et al. CD4+ limfoċiti li jinfiltraw it-tumur fil-kanċer ċervikali jirrikonoxxu peptidi ristretti HLA-DR ipprovduti mill-papillomavirus uman-E7. J Immunol. 1999;163(10):5715–5722.

39. Höhn H, et al. Papillomavirus uman tat-tip 33 E7 peptidi ppreżentati minn HLA-DR * 0402 għal ċelluli T li jinfiltraw it-tumur fil-kanċer ċervikali. J Virol. 2000;74(14):6632–6636.

40. Lu YC, et al. Trattament ta' pazjenti b'kanċer metastatiku bl-użu ta' riċettur taċ-ċelluli T ristrett ta' klassi II ta' kumpless ta' istokompatibilità maġġuri li jimmira l-antiġen tal-linja ġerminali tal-kanċer MAGE-A3. J Clin Oncol. 2017;35(29):3322–3329.

41. Tran E, et al. Immunoterapija tal-kanċer ibbażata fuq ċelluli CD4+ T speċifiċi għal mutazzjoni f'pazjent b'kanċer epiteljali. Xjenza. 2014;344(6184):641–645.

42. Gonzalez-Galarza FF, et al. Aġġornament 2020 tad-database tal-frekwenza tal-alleli (AFND): klassifikazzjoni tad-dejta standard tad-deheb, dejta tal-ġenotip ta' aċċess miftuħ, u għodod ġodda ta' mistoqsija. Aċidi Nukleiċi Res. 2020;48(d1): D783–D788.

43. Schoenberger SP, et al. L-għajnuna taċ-ċelluli T għal-limfoċiti T ċitotossiċi hija medjata minn interazzjonijiet CD40-CD40L. Natura. 1998;393(6684):480–483.

44. Ahrends T, et al. Iċ-ċelluli CD4+ T jgħinu biex jagħtu programm effettur taċ-ċelluli T ċitotossiċi inkluż ir-regolazzjoni baxxa tar-riċetturi koinibitorji u żieda fl-invażività tat-tessuti. Immunità. 2017;47(5):848–861.

45. Ferris ST, et al. cDC1 prime u huma liċenzjati minn ċelluli CD4+ T biex jinduċu immunità kontra t-tumur. Natura. 2020;584(7822):624–629.

46. ​​Bos R, Sherman LA. L-għajnuna taċ-ċelluli CD4+ T fil-ambjent tat-tumur hija meħtieġa għar-reklutaġġ u l-funzjoni ċitolitika ta' limfoċiti CD8+ T. Cancer Res. 2010;70(21):8368–8377.

47. Haabeth OAW, et al. CD4+ Ċellula T—ir-rifjut medjat taċ-ċelluli tat-tumur pożittivi għall-MHC klassi II huwa dipendenti fuq is-sekrezzjoni tal-antiġen u l-preżentazzjoni indiretta fuq l-APCs ospitanti. Cancer Res. 2018;78(16):4573–4585.

48. Dudley ME, et al. Ġenerazzjoni ta 'kulturi ta' limfoċiti li jinfiltraw it-tumur għall-użu f'terapija ta 'trasferiment adottiv għal pazjenti b'melanoma. J Immunother. 2003;26(4):332–342.

49. Dash P, et al. Analiżi ta 'ċellula waħda tar-repertorju tar-riċetturi taċ-ċelluli T. Metodi Mol Biol. 2015;1343:181–197.

50. Li H, et al. L-allinjament tas-sekwenza/format tal-mappa u l-għodod SAM. Bijoinformatika. 2009;25(16):2078–2079.

51. Chiang C, et al. SpeedSeq: analiżi u interpretazzjoni tal-ġenoma personali ultra-veloċi. Metodi Nat. 2015;12(10):966–968.

52. Cingolani P, et al. Programm għall-annotazzjoni u t-tbassir tal-effetti ta 'polimorfiżmi ta' nukleotide wieħed, SnpEff: SNPs fil-ġenoma ta 'Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin). 2012;6(2):80–92.

53. Haga-Friedman A, et al. L-inkorporazzjoni ta 'mutazzjonijiet idrofobiċi transmembrane fit-TCR ittejjeb l-espressjoni tal-wiċċ tagħha u l-avidità funzjonali taċ-ċelluli T. J Immunol. 2012;188(11):5538–5546.

54. Cohen CJ, et al. Attività antitumorali mtejba ta 'ċelluli T inġinerija biex jesprimu riċetturi taċ-ċelluli T bit-tieni bond disulfide. Cancer Res. 2007;67(8):3898–3903.