Espressjoni speċifika tat-tessut tar-riċettur SARS-CoV-2, Enżima 2 li tikkonverti l-anġjotensina, f'Mudelli tal-Ġurdien ta' Mard Kronika tal-Kliewi
Mar 22, 2022
Minn Jannar 2020, il-marda tal-koronavirus 2019 (COVID-19), ikkawżata mis-sindromu respiratorju akut sever koronavirus 2 (SARS-CoV-2), kienet problema tas-saħħa pubblika globali. L-infezzjoni SARS-CoV-2 tiġi stabbilita meta l-proteina S virali tingħaqad mal-enzima 2 li tikkonverti l-anġjotensin ospitanti (ACE2) u tidħol fiċ-ċellula1,2. Għalhekk, espressjoni elevata ta' ACE2 f'organi li huma miri potenzjali ta' SARS-CoV-2 tista' żżid ir-riskju ta' infezzjoni COVID- 19. ACE2 hija enzima li għandha rwol importanti fis-sistema renin-angiotensin (RAS), fejn tikkonverti angiotensin (Ang) II għal Ang1-7 u tifforma komponent tal-ACE2-Ang{{21 }}Assi tar-riċettur MAS3. Jeżerċita wkoll effett protettiv tal-organi billi jikkontrobatta l-attività tal-assi tar-riċettur ACE-Ang II-angiotensin tip 1 (AT1)4–7. Rapporti preċedenti wrew li ACE2 jibdel ix-xejriet ta’ espressjoni speċifiċi għat-tessuti tiegħu taħt diversi kundizzjonijiet, inkluż mard kardjovaskulari, dijabete mellitus (DM), umard tal-kliewi 8–11. L-espressjoni pulmonari ACE2, li hija partikolarment importanti għall-infezzjoni tas-SARS-CoV-2, titnaqqas fis-sindromu ta' distress respiratorju akut indott minn lipopolysaccharide12. Rapport ieħor juri li l-espressjoni ACE2 hija ogħla fl-irġiel anzjani13. Fid-Dipartiment tax-Xjenza Medika u l-Mediċina Kardjorenali, Yokohama City University Graduate School of Medicine, 3-9 Fukuura, Kanazawa-ku, Yokohama 236-0004, Ġappun. 2Programm ta' Disturbi Kardjovaskulari u Metaboliċi, Skola Medika Duke-NUS, Singapor, Singapor. 3Dipartiment tal-Mediċina, Mount Sinai Beth Israel, New York, NY, l-Istati Uniti. 4Dipartiment tal-Bijoloġija Molekulari, l-Iskola tal-Gradwati tal-Mediċina tal-Università ta 'Yokohama City, Yokohama, il-Ġappun. 5Dipartiment tal-Otorinolaringoloġija, Kirurġija tar-Ras u l-Għonq, Skola tal-Mediċina, Università tal-Belt ta’ Yokohama, Yokohama, il-Ġappun. 6Mediċina Interna, Kanagawa Dental University.
Kliem ewlieni;mard tal-kliewi; kliewi; renali ACE2; tessuti tal-kliewi; insuffiċjenza renali
CISTANCHE SE TTEJJEB IL-MARD TAL-KLIEWA/KLIEWA
Barra minn hekk, l-espressjoni ACE2 nażali u branċjali hija ogħla fl-adulti milli fit-tfal14. Madankollu, sa fejn nafu tagħna, ftit studji eżaminaw kif l-espressjoni pulmonari ACE2 tinbidel f'mard ieħor. Pazjenti bi kronikamard tal-kliewi(CKD) għandhom riskju ta' mard sever tal-COVID-19, iżda m'hemm l-ebda evidenza taż-żieda fil-prevalenza tal-COVID-19 f'pazjenti b'CKD15–21. Meta wieħed iqis il-fatt li ACE2 huwa meħtieġ għall-infezzjoni COVID-19, dawn is-sejbiet jistgħu jissuġġerixxu li l-espressjoni pulmonari ta' ACE2 ma tissaħħaħx f'pazjenti b'CKD. Notevolment, l-espressjoni ċellulari ACE2 hija preżumibbilment assoċjata ma' suxxettibilità għar-riskju ta' infezzjoni minn SARS-CoV, li hija relatata ma' SARS-CoV-222. Il-fatt li t-tfal b'espressjoni baxxa ta' ACE2 huma inqas suxxettibbli għal COVID-19 mill-adulti23 jappoġġja wkoll dawn l-ipoteżi. Għalhekk, għamilna esperimenti biex neżaminaw bidliet fl-espressjoni pulmonari ACE2 f'żewġ tipi ta 'ġrieden mudell CKD: indotti minn adenine (jiġifieri, ġrieden adenine) u aċidu aristolokiku (AA) indotti (jiġifieri, ġrieden AA) biex jindirizzaw din l-ipoteżi. Ir-relazzjoni tal-espressjoni ta' ACE2 ma' imblokkaturi RAS ġiet investigata wkoll. S'issa, l-użu ta 'imblokkaturi RAS intwera li jirregola l-espressjoni tal-organu ACE2 f'xi każijiet24-27. Investigazzjonijiet epidemjoloġiċi riċenti wrew li l-użu ta' imblokkaturi RAS ma jżidx ir-riskju ta' COVID-1928–30. Barra minn hekk, l-espressjoni ta' ACE2 fil-pulmuni ma ġietx imsaħħa meta imblokkaturi RAS ġew amministrati lill-ġrieden normali31. Madankollu, ma kien hemm l-ebda rapport dwar l-effetti ta' imblokkaturi RAS fuq l-espressjoni pulmonari ta' ACE2 fil-kuntest ta' CKD; dan il-punt huwa essenzjali għall-ġestjoni futura tal-COVID-19 u s-sequelae tiegħu. Hawnhekk, investigajna bidliet fl-espressjoni pulmonari ACE2 minħabba trattament imblokkatur RAS fil-ġrieden mudell CKD.
RiżultatiĠrieden mudell CKD indotti mill-adenina wrew telf sinifikanti fil-piż, tnaqqis fil-funzjoni renali, u pressjoni tad-demm elevata (BP), meta mqabbla mal-kontrolli. Il-piż tal-ġisem tal-linja bażi (BW) u BP sistolika kienu identiċi bejn il-gruppi ta 'kontroll u adenine. BW żdied maż-żmien fil-grupp ta 'kontroll, filwaqt li naqas fil-grupp ta' adenine; dan il-qligħ BW kien differenti b'mod sinifikanti bejn il-gruppi (Fig. 1A). BP sistolika kienet elevata b'mod sinifikanti fil-grupp ta 'adenine, meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll, maż-żmien (Fig. 1B). Wara ġimagħtejn, l-eskrezzjoni tal-albumina fl-awrina kienet elevata b'mod sinifikanti fil-grupp ta' adenina, meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll (ġrieden adenine 41.0±8.3 ug/jum vs. kontroll 13.6±1.7 ug/jum, P<0.001; fig. 1e).="" there="" were="" also="" signifcant="" enhancements="" of="" plasma="" creatinine="" and="" blood="" urea="" nitrogen="" (bun)="" levels="" in="" the="" adenine="" group,="" compared="" with="" the="" control="" group="" at="" 2="" or="" 4 weeks="" (creatinine:="" 2 weeks:="" adenine="" mice="" 0.22±0.01 mg/dl="" vs.="" control="" 0.10±0.01 mg/="" dl,=""><0.05; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 0.31±0.06 mg/dl="" vs.="" control="" 0.11±0.01 mg/dl,=""><0.01; bun:="" 2 weeks:="" adenine="" mice="" 65.0±7.0 mg/dl="" vs.="" control="" 25.7±0.5 mg/dl,=""><0.01; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 61.7±12.5 mg/dl="" vs.="" control="" 25.6±1.6 mg/dl,=""><0.01; fig. 1c,="" d).="" moreover,="" creatinine="" clearance="" also="" showed="" a="" signifcant="" reduction="" in="" the="" adenine="" group="" (2 weeks:="" adenine="" mice="" 170±15 μl/min="" vs.="" control="" 397±25 μl/min,=""><0.001; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 136±29 μl/min="" vs.="" control="" 357±31 μl/min,=""><0.001;>
L-espressjoni ACE2 fil-kliewi tnaqqset b'mod sinifikanti fil-ġrieden mudell CKD indotti mill-adenina, meta mqabbla mal-kontrolli, filwaqt li l-espressjoni ACE2 fil-pulmuni ma kinitx differenti bejn il-gruppi.L-istoloġija renali wriet tkabbir eteroġenju u atrofija tat-tubuli, kif ukoll infiltrazzjoni ċellulari fil-renaliinterstizju, fil-ġrieden adenine. Tbajja ACE2 kienet osservata prinċipalment fil-tubuli prossimali fiż-żewġ gruppi, iżda l-grad ta 'tbajja tnaqqas fil-grupp adenine (Fig. 2A). Livelli tal-proteina ACE2 fil-kliewi(stmat mill-analiżi tal-western blotting) wera tnaqqis sinifikanti fil-grupp ta' adenine, meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll, kemm f'ġimgħatejn kif ukoll f'4 ġimgħat (ġimgħatejn: ġrieden adenine 0.55±0.{{ 9}}4 vs kontroll 1.00±0.10, P<0.001; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 0.32±0.07="" vs.="" control="" 0.90±0.07,=""><0.001; fig. 2c).="" in="">renali ACE2L-espressjoni tal-mRNA wriet tnaqqis sinifikanti fil-grupp tal-adenina wara ġimgħatejn (ġrieden tal-adenine 0.61±0.04 vs. kontroll 1.00±0.03, P<0.001; fig. 2e);="" a="" similar="" tendency="" for="" reduction="" was="" observed="" at="" 4 weeks,="" although="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" signifcant="" (fig. 2e).="" lung="" histology="" findings="" did="" not="" differ="" between="" groups;="" ace2="" staining="" was="" observed="" in="" type="" 2="" alveolar="" epithelial="" cells="" (fig. 2b).="" there="" were="" no="" differences="" in="" ace2="" protein="" or="" mrna="" expression="" levels="" in="" the="" lungs="" at="" 2="" or="" 4 weeks="" (fig. 2d,="" f).="" the="" difference="" in="" plasma="" ace2="" activity="" was="" not="" statistically="" signifcant="">
CISTANCHE SE TTEJJEB INSUFFIRIMENT TAL-KLIEI/RENALI
Ġrieden mudell CKD indotti mill-AA wrew telf sinifikanti fil-piż u tnaqqis funzjonali renali, meta mqabbla mal-grupp tal-vettura, filwaqt li BP ma kienx differenti bejn il-gruppi.Il-linja bażi tal-BW u l-BP sistolika kienu identiċi bejn il-gruppi tal-vettura u AA. BW żdied maż-żmien fil-grupp tal-vetturi, filwaqt li naqas fil-grupp AA; dan il-gwadann tal-BW kien differenti b'mod sinifikanti bejn il-gruppi (Fig. 3A). Madankollu, ma kien hemm l-ebda differenza fil-BP sistolika bejn il-gruppi (Fig. 3B). Meta mqabbel mal-grupp tal-vetturi, kien hemm titjib sinifikanti fil-livelli tal-krejatinina u tal-BUN fil-plażma, kif ukoll eskrezzjoni tal-albumina fl-awrina, fil-grupp AA (kreatinina: ġrieden AA 0.40±{{6} }.03 mg/dL vs vettura 0.14±0.01 mg/dL, P<0.001; bun:="" aa="" mice="" 62.8±4.6 mg/="" dl="" vs.="" vehicle="" 29.0±1.4 ="" mg/dl,=""><0.001; urinary="" albumin="" excretion:="" aa="" mice="" 61.3±7.3 ="" μg/day="" vs.="" vehicle="" 9.5±0.9 μg/day,=""><0.001; fig. 3c–e).="" creatinine="" clearance="" also="" showed="" a="" signifcant="" reduction="" in="" the="" aa="" group="" (aa="" mice="" 72±12="" μl/min="" vs.="" vehicle="" 159±13="" μl/min,=""><0.001;>
L-espressjoni ta’ ACE2 fil-kliewi tnaqqset b’mod sinifikanti fil-ġrieden mudell CKD indotti mill-AA, meta mqabbla mal-kontrolli, filwaqt li l-livelli tal-proteina ACE2 pulmonari ma kinux differenti bejn il-gruppi. L-analiżi tal-istoloġija renali wriet atrofija tubulari u infiltrazzjoni ċellulari fil-renaliinterstizju fil-grupp AA. Tbajja ACE2 kienet osservata prinċipalment fil-tubuli prossimali fiż-żewġ gruppi, iżda l-grad ta 'tbajja tnaqqas fil-grupp AA (Fig. 4A). Livelli tal-proteina ACE2 fil-kliewiwera tnaqqis sinifikanti fil-grupp AA, meta mqabbel mal-grupp tal-vetturi (ġrieden AA {{0}}.22±0.03 vs. vettura 1.00±0.08, P<0.001; fig. 4c).="" in="" addition,="">renali ACE2L-espressjoni tal-mRNA tnaqqset b'mod sinifikanti fil-grupp AA (ġrieden AA {{0}}.30±0.02 vs. vettura 1.00±0.06, P<0.001; fig. 4e).="" lung="" histology="" findings="" did="" not="" differ="" between="">
Tbajja ACE2 kienet osservata fiċ-ċelloli epiteljali alveolari tat-tip 2 (Fig. 4B) u ma kien hemm l-ebda differenza fil-livell tal-proteina ACE2 pulmonari bejn il-gruppi (Fig. 4D). L-espressjoni tal-mRNA ACE2 fil-pulmuni kienet aktar baxxa b'mod sinifikanti fil-grupp AA milli fil-grupp tal-vetturi (ġrieden AA 0.76±0.04 vs. vettura 1.{{11} }±0.04, P<0.01; fig. 4f).="" moreover,="" there="" was="" a="" signifcant="" reduction="" in="" plasma="" ace2="" activity="" in="" the="" aa="" group="" (aa="" mice="" 84.8±2.6="" rfu/min="" vs.="" vehicle="" 98.3±3.0="" rfu/min,=""><0.01;>
Olmesartan attenwa t-titjib tal-BP u l-eskrezzjoni tal-albumina fl-awrina u t-tnaqqis ta 'telf ta' piż fi ġrieden mudell CKD indotti minn adenine.It-trattament b'olmesartan attenwat it-telf ta 'piż fil-ġrieden adenine (Fig. 5A). It-trattament b'olmesartan naqqas ukoll b'mod sinifikanti l-BP sistolika kemm fil-gruppi ta' kontroll kif ukoll f'gruppi ta' adenina (ġrieden adenine 131.5±0.4 mmHg vs. kontroll 121.2±0.7 mmHg, P<0.001; olmesartan="" mice="" 111.7±1.1 ="" mmhg="" vs.="" control="" 121.2±0.7 ="" mmhg,=""><0.001; adenine+olmesartan="" mice="" 117.2±0.9 ="" mmhg="" vs.="" adenine="" mice="" 131.5±0.4 mmhg,=""><0.001; fig. 5b).="" in="" adenine="" mice,="" olmesartan="" treatment="" improved="" plasma="" creatinine="" level="" (adenine="" mice="" 0.19±0.02="" vs.="" control="" 0.13±0.01,="" p="" <="" 0.01;="" adenine+olmesartan="" mice="" 0.14±0.01="" vs.="" adenine="" mice="" 0.19±0.02,="" p="" <="" 0.01;="" fig. 5c)="" and="" suppressed="" urinary="" albumin="" excretion="" (adenine="" mice="" 67.9="" ±6.7 μg/day="" vs.="" control="" 18.0±3.6 μg/day,="" p=""><0.001; adenine+olmesartan="" mice="" 52.5±2.3="" vs.="" olmesartan="" mice="" 17.4±3.7 μg/day,=""><0.001; adenine-olmesartan="" mice="" 52.5±2.3 μg/day="" vs.="" adenine="" mice="" 67.9±6.7 μg/day,=""><0.05;>
Olmesartan ma affettwax l-espressjoni ta' ACE2.Fil-gruppi ta 'kontroll u adenine, la l-mRNA u lanqas il-livelli ta' espressjoni tal-proteini ta 'ACE2 fil-kliewi ma nbidlu bit-trattament b'olmesartan (Fig. 6A, C). Ma kien hemm l-ebda tibdil fil-livelli tal-mRNA pulmonari ACE2 jew espressjoni tal-proteini bejn il-gruppi ta 'kontroll u adenine (Fig. 6B, D). Ma kien hemm ukoll l-ebda differenza sinifikanti fl-attività ACE2 fil-plażma (Fig. 6E). L-espressjoni tal-mRNA ACE2 fil-passaġġ respiratorju ta 'fuq (farinġi) ġiet eżaminata wkoll, iżda ma ġiet osservata l-ebda differenza sinifikanti bejn il-gruppi (Figura Supplimentari S1).
DiskussjoniIl-pandemija tal-COVID-19 kellha impatt profond mad-dinja kollha. Għal individwi anzjani u nies b'komorbiditajiet, l-informazzjoni dwar ir-riskju ta' infezzjoni u s-severità tal-COVID-19 hija konsiderazzjoni kritika. Kien hemm bosta studji epidemjoloġiċi ta' COVID-19 madwar id-dinja, li wrew li pazjenti b'CKD huma aktar probabbli li jiżviluppaw COVID sever-1917 iżda l-morbidità ta' COVID-19 tista' ma tkunx elevata f'pazjenti b'CKD15–21. Notevolment, ir-riżultati ta 'diversi meta-analiżi wrew li l-prevalenza ta' CKD kienet 1.7-5.2 fil-mija f'pazjenti b'COVID-1915-17,21. Barra minn hekk, analiżi ta’ 5,700 pazjent bil-COVID-19 fi New
York-żona wriet li 8.5 fil-mija kellhom sottostantimard tal-kliewi19. Minħabba li l-prevalenza stmata ta' CKD hija 9.1 fil-mija madwar id-dinja18 u madwar 15 fil-mija fl-Istati Uniti20, ir-riskju ta' infezzjoni SARS-CoV-2 jista' ma jiżdiedx meta mqabbel mal-preżenza ta' CKD. ACE2 għandu rwol importanti fit-trażmissjoni tal-COVID-191,2. Barra minn hekk, il-livell ta' espressjoni ACE2 fiċ-ċelloli tal-passaġġ tal-arja huwa assoċjat mar-riskju ta' infezzjoni minn SARS-CoV, koronavirus simili għall-aġent kawżattiv tal-COVID-1922. Minħabba li COVID-19 huwa marda respiratorja, l-espressjoni ACE2 fil-pulmuni hija komponent importanti tat-trażmissjoni tal-mard. Fl-istudju preżenti, aħna ipoteżijna li n-nuqqas ta 'żieda fl-espressjoni pulmonari ACE2 f'CKD hija marbuta man-nuqqas ta' morbożità COVID-19 elevata. Din l-ipoteżi hija sostnuta mill-fatt li t-tfal b'espressjoni baxxa ta' ACE2 huma inqas suxxettibbli għal COVID-19 mill-adulti. Aħna użajna żewġ tipi ta 'ġrieden mudell CKD fl-esperimenti tagħna biex neżaminaw bidliet fl-espressjoni pulmonari ACE2 b'konnessjoni mal-patoġenesi CKD. CKD indotta mill-adenina hija mudell rappreżentattiv tal-annimali tal-marda32. Amministrazzjoni eċċessiva ta 'adenine tista' tinduċi CKD billi tikkawżarenaliostruzzjoni tubulari u deġenerazzjoni, kif ukollrenalifibrożi interstizjali, minħabba d-depożizzjoni ta '2-8 dihydroxyadenine32,33. B'kuntrast, CKD indotta mill-AA hija kkawżata mill-induzzjoni tal-fibrożi minn ħsara tubulari indotta minn AA34. Dawn iż-żewġ mudelli ġew magħżula minħabba li BP intwera li jiżdied fil-mudell CKD indott mill-adenine35, filwaqt li ma jiżdiedx fil-mudell CKD indott mill-AA36. Notevolment, pressjoni għolja hija kumplikazzjoni komuni osservata f'pazjenti b'CKD; aħna preżunt li jkun utli li ninvestigaw jekk il-preżenza jew in-nuqqas ta 'pressjoni għolja tinfluwenzax l-espressjoni pulmonari ACE2 fil-patoġenesi CKD. Ir-riżultati wrew li l-renali ACE2livelli ta' proteini tnaqqsu fiż-żewġ mudelli CKD. Fil-ġrieden adenine, ma kien hemm l-ebda differenza sinifikanti fil-livelli ta 'mRNA f'4 ġimgħat, iżda kien hemm tnaqqis fil-livelli ta' proteina. Waħda mir-raġunijiet għal din id-diskrepanza tista' tkun l-involviment tar-repressjoni translazzjonali. Lambert DW, et al. wera li miR-421 irażżan it-traduzzjoni tal-proteina ACE2 mingħajr ma affettwa l-livelli tat-traskrizzjoni ACE237. Studju ieħor wera wkoll li miR-421 fis-serum żdied f'pazjenti b'CKD jew ipertensjoni38,39. Għalhekk, fil-grupp ta 'ġrieden adenine b'perjodu itwal ta' CKD u pressjoni għolja (4 ġimgħat), miR-421
tista 'tiġi miżjuda u mrażżna t-traduzzjoni tal-proteini, li tirriżulta f'diskrepanza bejn l-mRNA u l-espressjoni tal-proteini. Il-livelli tal-proteina ACE2 pulmonari ma kinux differenti fiż-żewġ mudelli CKD meta mqabbla mal-kontrolli u l-vetturi. Għalkemm huwa intriganti li l-espressjoni tal-mRNA ACE2 pulmonari tnaqqset fil-mudell CKD indott mill-AA, is-sejbiet tagħna kienu aktar notevoli minħabba li ma sibna l-ebda differenza fil-livelli tal-proteina pulmonari ACE2, li jinfluwenzaw direttament l-infezzjoni SARS-CoV-2. Barra minn hekk, l-attività ACE2 fil-plażma ma kinitx differenti fiż-żewġ mudelli CKD meta mqabbla mal-kontrolli u l-vetturi. ACE2 li jinħall fil-plażma huwa meqjus li jkun imqasam u rilaxxat miċ-ċelloli tat-tessuti. Żieda fl-attività ACE2 fil-plażma ġiet irrappurtata li hija assoċjata ma' żieda fir-rilaxx tal-proteina ACE2 mit-tessuti, li tissuġġerixxi tnaqqis fil-proteina ACE2 fit-tessuti40. Għalhekk, ir-riżultati tal-istudju preżenti li l-attività tal-plażma ACE2 ma nbidlitx fl-istat CKD jindika li r-rilaxx tal-proteina ACE2 espressa fit-tessuti ma jinbidelx fl-istat CKD, li jappoġġja s-sejbiet li l-espressjoni tal-proteina ACE2 fit-tessuti ma nbidlitx f' il-kuntest tas-CKD. Ir-relazzjoni bejn il-COVID-19 u l-imblokkaturi RAS hija fokus kontinwu tad-diskussjonijiet tar-riċerka. Studji preċedenti fuq l-annimali wrew li l-imblokkaturi RAS jirregolaw l-espressjoni ACE2 tat-tessuti, li wassal għal biżgħat li l-użu ta 'imblokkaturi RAS jista' jżid ir-riskju ta 'infezzjoni SARS-CoV-2. Madankollu, l-użu ta' imblokkaturi RAS f'dawk l-istudji preċedenti wassal biss għal regolazzjoni 'l fuq tat-tessut ACE2 taħt kundizzjonijiet patoloġiċi speċifiċi24,27; dan ir-regolamentazzjoni ma qabiżx il-medda normali. Studju ieħor li jeżamina pulmonari urenali ACE2l-espressjoni fil-ġrieden normali kkurati b'imblokkaturi RAS ma wriet l-ebda żieda, meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll31. Min-naħa l-oħra, kien hemm rapport li l-imblokkaturi RAS bħal candesartan u captopril żiedu l-espressjoni pulmonari ACE2 fil-firien normali41. Fil-prattika klinika tad-dinja reali, xi studji epidemjoloġiċi dwar l-użu ta' imblokkaturi RAS f'pazjenti b'COVID-19 urew li l-użu ta' dawk il-mediċini ma jżidx ir-riskju ta' COVID-1928–30. Madankollu, l-effett ta' imblokkaturi RAS fuq l-espressjoni pulmonari ta' ACE2 għadu kontroversjali. L-ebda studju preċedenti ma eżamina l-effetti ta' imblokkaturi RAS fuq l-espressjoni pulmonari ta' ACE2 fil-kuntest ta' CKD, għalkemm imblokkaturi RAS huma essenzjali għat-trattament ta' pazjenti b'CKD. L-istudju preżenti sar biex jindirizza dan il-vojt fil-letteratura. Biex timmudella aktar mill-qrib il-prattika klinika tad-dinja reali, użajna l-mudell CKD indott mill-adenine, li juri pressjoni għolja fl-istess ħin. Ir-riżultati wrew li l-għoti ta' olmesartan, imblokkatur ta' RAS, ma saħħaħx l-espressjoni pulmonari ta' ACE2, meta mqabbel mal-kontrolli. Barra minn hekk, l-espressjoni tal-mRNA ACE2 fil-passaġġ respiratorju ta 'fuq, il-mira inizjali tal-infezzjoni SARS-CoV-2, ma ġietx imsaħħa b'reazzjoni għat-trattament b'olmesartan.Renali ACE2il-livelli tal-proteini tnaqqsu fil-mudell CKD; l-għoti ta' olmesartan ma żiedx il-livelli tal-proteina ACE2 renali fil-ġrieden ta' kontroll u adenine. In-nuqqas ta' restawr fl-ACE2 tal-kliewi fi ġrieden adenine kkurati b'olmesartan seta' kien dovut għall-użu ta' mudell CKD differenti, meta mqabbel ma' studju preċedenti27, kif ukoll it-tul relattivament qasir ta' kura b'imblokkatur tar-riċetturi tal-angiotensin25,27. Madankollu, il-kura b'olmesartan tejbet diversi parametri ta' insuffiċjenza renali, inkluża t-tneħħija ta' albumina fl-awrina. Dawn ir-riżultati jappoġġjaw l-użu kontinwu ta' imblokkaturi RAS f'pazjenti b'COVID-19 li għandhom CKD.
CISTANCHE SE TTEJB L-INFEZZJONI TAL-KLIEI/KLIEWA
Dan l-istudju kellu xi limitazzjonijiet. L-ewwel, eżamina biss bidliet fl-espressjoni pulmonari ACE2 fil-ġrieden mudell CKD, filwaqt li ma investigatx direttament l-infezzjoni SARS-CoV-2. It-tieni, osservajna l-ġrieden adenine għal 4 ġimgħat u l-ġrieden AA għal 8 ġimgħat f'dan l-istudju, iżda r-riżultati jistgħu jkunu differenti f'perjodu itwal ta 'osservazzjoni. It-tielet, l-espressjoni ACE2 fil-pulmuni tista 'tvarja bejn ġrieden u bnedmin. Ir-raba’, f’pazjenti b’CKD, is-severità tal-COVID-19 x’aktarx li tkun akbar, iżda ma nistgħux nirreferu għall-mekkaniżmu sottostanti tas-severità. Il-ħames, mhuwiex biss il-livell ta 'espressjoni ta' ACE2 pulmonari li jiddetermina s-suxxettibilità għal COVID-19 iżda jista 'jkun affettwat ukoll minn ħafna fatturi oħra. Bħala konklużjoni, ma sibna l-ebda bidla fl-espressjoni tal-proteina pulmonari ACE2 fil-ġrieden mudell CKD, irrispettivament mill-istatus ta 'pressjoni għolja. Barra minn hekk, l-użu ta 'kura ta' imblokkatur tar-riċetturi ta 'angiotensin fil-ġrieden mudell CKD ma żiedx l-espressjoni pulmonari ACE2. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu l-ipoteżi li r-riskju tal-morbidità tal-COVID-19 jista 'ma jkunx elevat f'pazjenti b'CKD minħabba l-espressjoni pulmonari stabbli tagħhom ACE2. Is-sejbiet jipprovdu wkoll evidenza xjentifika bażika importanti li l-imblokkaturi RAS jistgħu jintużaw b'mod sikur fit-trattament ta' pazjenti b'COVID-19 li għandhom CKD.
Materjal u Metodi Annimali.Dan l-istudju sar skont il-linji gwida tal-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa għall-użu ta 'annimali esperimentali. L-esperimenti kollha fuq l-annimali ġew riveduti u approvati mill-Kumitat tal-Istudji tal-Annimali tal-Università tal-Belt ta 'Yokohama (Numru ta' Approvazzjoni: FA{{{{10}}}}), li kienu konformi mal-linji gwida ARRIVE. Saru sforzi biex jitnaqqas kemm jista’ jkun in-numru ta’ annimali użati u tiġi żgurata tbatija minima. Il-ġrieden kienu miżmuma f'ambjent ikkontrollat b'ċiklu ta '12-siegħa dawl-dlam f'temperatura ta' 25 grad. Il-ġrieden tħallew aċċess liberu għall-ikel u l-ilma. Ġrieden mudell CKD. L-esperimenti twettqu bl-użu ta' ġrieden maskili C57BL/6 J ta' 8–9-ġimgħat, wara akklimatizzazzjoni ta' 1-ġimgħa fil-gruppi kollha. Fl-esperiment ta' adenine, il-ġrieden ġew mitmugħa dieta mħallta ma' 0.2 fil-mija adenine (0.2 fil-mija adenine flimkien ma 0.3 fil-mija NaCl, 3.6 kcal/g, CE{{ 18}}; CLEA, Tokyo, Ġappun; grupp ta' adenina) jew dieta standard (0.3 fil-mija NaCl, 3.6 kcal/g, CE-2; CLEA; grupp ta' kontroll) għal ġimgħatejn jew 4 ġimgħat. Fl-esperiment AA, ġrieden ġew injettati intraperitonealment b'AA (3 mg/kg) darbtejn fil-ġimgħa għal 4 ġimgħat, segwiti minn perjodu ta' rkupru ta' 4-ġimgħa; il-grupp tal-vettura ġie injettat b'vettura (75 fil-mija dimethyl sulfoxide). Fl-esperiment ta 'trattament ta' olmesartan, il-ġrieden ġew maqsuma b'mod każwali f'erba 'gruppi sperimentali: (1) grupp ta' kontroll; (2) grupp ta 'adenine, mitmugħa dieta mħallta ma' 0.2 fil-mija adenine; (3) grupp ta 'kontroll-olmesartan, ittrattat bl-antagonist tar-riċettur AT1 olmesartan fl-ilma tax-xorb (4 mg/kg/jum; Daiichi Sankyo Chemical Pharma Co., Ltd, Tokyo, Ġappun); u (4) grupp adenine-olmesartan, li jieħu dożi identiċi għal dawk fil-gruppi 2 u 3.
Kejl tal-BP.BP sistolika tkejjel bil-metodu tail-cuf (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokyo, Ġappun), kif deskritt qabel42,43. Il-kejl kollu twettaq bejn 9:00 u 14:00 h. Saru mill-inqas 10 kejl f'kull ġurdien u l-valur medju intuża għall-analiżi.Analiżi kwantitattiva ta' reazzjoni tal-katina tal-polimerażi tat-traskrizzjoni inversa f'ħin reali.L-RNA totali ġie estratt mill-pulmun,renali, u tessut farinġi li juża ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Japan); cDNA ġie sintetizzat bl-użu tas-Sistema SuperScript III First-Strand (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Twettqet analiżi kwantitattiva ta 'reazzjoni tal-katina ta' traskrizzjoni inversa-polimerażi kwantitattiva f'ħin reali bl-użu ta 'Sistema ta' Sekwenza ta' Sekwenza ABI PRISM 7000; Prodotti ta 'traskrizzjoni inversa ġew inkubati b'TaqMan PCR Master Mix u sonda TaqMan personalizzata (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), kif deskritt qabel44,45. Intużat is-sonda TaqMan li ġejja: ACE2 (Mn01159003_m1). Il-livelli ta' mRNA ġew normalizzati għal dawk ta' 18S rRNA.
Analiżi tal-Blott tal-Punent.L-espressjoni tal-proteina ġiet analizzata permezz ta 'western blotting bl-użu ta' omoġenati tat-tessuti, kif deskritt qabel45,46. Fil-qosor, l-estratt totali tal-proteina ġie ppreparat minn tessuti b'buffer tal-kampjun li kien fih sodium dodecyl sulfate. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ta 'kull kampjun kienet imkejla b'NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific), bl-użu ta' albumina tas-serum bovin bħala l-istandard. Ammonti ugwali ta 'estratt ta' proteina minn kull kampjun tat-tessut (tessut tal-pulmun: 24 ug, tessut tal-kliewi: 10 ug) ġew frazzjonati fuq ġel tal-polyacrylamide 5-20 fil-mija (Atto, Tokyo, Ġappun). Il-proteini separati mbagħad ġew trasferiti għal membrana polyvinylidene difluoride bl-użu tas-Sistema iBlot Dry Blotting (Invitrogen). Il-membrani ġew imblukkati għal siegħa f'temperatura tal-kamra b'salina buffered bil-fosfat li fiha 5 fil-mija trab tal-ħalib xkumat. Il-membrani ġew inkubati b'antikorpi primarji għal ACE2 (Ab108252 1:500 [pulmun] jew 1:1000 [kliewi], Abcam, Cambridge, MA, USA) u -actin (A{{16} }:10,000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Il-membrani ġew maħsula u mbagħad inkubati b'antikorpi sekondarji għal 60 min f'temperatura tal-kamra. Is-siti tar-reazzjonijiet tal-antikorp-antiġen ġew viżwalizzati permezz ta' substrat ta' kimiluminixxenza msaħħaħ (Merck, Kenilworth, NJ, USA). L-immaġini ġew analizzati kwantitattivament bl-użu ta 'ChemiDoc Touch (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Biex tqabbel il-livelli ta 'espressjoni tal-proteina ACE2 fil-pulmun utessuti tal-kliewifil-ġrieden normali, twettqet western blotting addizzjonali fuq l-istess membrana (Figura Supplimentari S2). L-ammont ta' proteina deskritt kien frazzjonat fi ġellijiet ((A) pulmun: 24/10/1 ug, kliewi: 24/10/1 ug, (B) pulmun: 24/12 ug , kliewi: 0.2/0.15/0.1 ug); intuża l-istess antikorp primarju għal ACE2 (Ab108252 1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA). Biex tiġi eżaminata l-ispeċifiċità tal-antikorp, intuża ACE2-peptide imblukkar selettiv (ab198988). Western blotting wera faxxa waħda ta 'proteina, li ġiet abolita minn ACE2-peptide imblukkar selettiv (Figura Supplimentari S3).
Analiżi immunoistokimika.Pulmun urenalitessuti mill-ġrieden ġew iffissati b'4 fil-mija paraformaldehyde u sussegwentement inkorporati fil-paraffin. Sezzjonijiet ħoxnin ta 'erba' mikrometri ġew dewaxed u reidratati; L-irkupru tal-antiġeni sar permezz ta' tisħin microwave. It-taqsimiet ġew imblukkati biex titnaqqas l-attività tal-bijotina endoġena bl-użu ta 'reaġent li jimblokka l-perossidasi (Dako, Carpinteria, CA, USA) u ttrattati għal 60 min b'10 fil-mija serum normali tal-mogħoż f'salina buffered bil-fosfat. Is-sezzjonijiet imbagħad ġew inkubati b'antikorp anti-ACE2 dilwit għal 1:500 (Ab15348, Abcam). Biex tiġi eżaminata l-ispeċifiċità tal-antikorp, l-immunotebgħa ġiet eżaminata wkoll bl-ommissjoni tal-Ab primarju u bl-użu ta' peptide imblukkar selettiv ACE2-(ab15352). Tbajja ACE2 fil-pulmun utessut renalis kien osservat, li ma kienx osservat meta l-antikorp kien preassorbit b'ACE2-peptide imblukkar selettiv (ab15352) jew ommissjoni ta 'antikorp ACE2. (Figura Supplimentari S4).
CISTANCHE SE TTEJB L-UĠIGĦ TAL-KLIEI/KLIEWA
Analiżi bijokimika.Wara li nifs 5 fil-mija anestesija isoflurane, Inġabru kampjuni tad-demm permezz ta 'titqib kardijaku fl-istat mitmugħ permezz ta' titqib tal-qalb. Annimali esperimentali nqatlu b'mod uman wara anestesija. Kampjuni tad-demm sħiħ ġew ċentrifugati fi 3000 rpm (MR-150, Tomy Seiko Co., Ltd., Tokyo, Ġappun) f'4 gradi għal 10 minuti biex tissepara l-plażma. Il-kampjuni tal-plażma li rriżultaw inħażnu f'-80 grad sakemm jintużaw. Il-livelli tal-krejatinina fil-plażma, il-BUN, il-kreatinina fl-awrina, u l-albumina fl-awrina tkejlu bl-użu ta 'awtoanalizzatur Hitachi 7180 (Hitachi, Tokyo, Ġappun).
Attività ACE2 fil-plażma.L-attività ACE2 tkejlet minn TechnoPro R&D Company (Tokyo, Ġappun) bl-użu tal-Kit tal-Analiżi tal-Attività ACE2 (SensoLyte 390) f'temperatura ta '27 grad. Il-kampjuni ġew dilwiti 1:10 bl-użu tal-assay buffer ipprovdut mal-ACE2 Activity Assay Kit. L-assaġġ sar fi 384-pjanċi tal-bir. Kampjuni tal-plażma, buffer tal-assaġġ biss (sfond), jew 4-methyl-coumarin-7-amide (0.16–5 μM) bħala standard ta' referenza ġew miżjuda ma' pjanċa ta' reazzjoni OptiPlate{-384 F f'10 μL/bir. Għaxar, soluzzjoni tas-sottostrat ACE2 (0.05 mM 4-methylcoumaryl-7-amide/Dnp f'assay buffer) ġiet miżjuda f'10 μL/bir. Wara r-reazzjoni, l-intensità tal-fluworexxenza (Ex/ Em=330 nm/390 nm) ġiet imkejla f'intervalli ta '5-min għal 3 sigħat bl-użu ta' qarrej tal-pjanċa EnSpire (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). L-intensità tal-fluworexxenza tal-kampjuni f'kull punt tal-ħin ġiet ikkalkulata mill-intensità tal-fluworexxenza tal-kampjuni. L-inklinazzjoni ta 'kull kampjun (RFU/min) ġiet iddeterminata minn approssimazzjoni lineari tal-plott matul il-perjodu minn 30 sa 90 min wara l-bidu tal-kejl.
Analiżi statistika.Id-dejta hija espressa bħala medja± żball standard tal-medja. Id-differenzi ġew analizzati kif ġej. Analiżi f’żewġ direzzjonijiet tal-varjanza, segwita minn analiżi post hoc Bonferroni, saret biex jiġu ddeterminati differenzi matul iż-żmien bejn adenine u gruppi ta’ kontroll (Figuri 1, 2), gruppi AA u vetturi (Fig. 3A, B), jew adenine u olmesartan gruppi (Figuri 5, 6 u S1). T-testijiet mhux imqabbla ntużaw biex jiddeterminaw differenzi bejn AA u ġrieden tal-vetturi (Figuri 3C-F, 4). valuri P<0.05 were="" considered="" statistically="">
