L-Effett Protettiv Ta' Herba Cistanches Fuq Mijotossiċità Indotta minn Statin in Vitro
Mar 24, 2022
Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Elaine Wat a,b,1, Chun Fai Ng a,b,1, Chi Man Koon a,b, Eric Chun Wai Wong a,b, Brian Tomlinson c, Clara Bik San Lau a,b,n
Istitut tal-Mediċina Ċiniża, L-Università Ċiniża ta 'Hong Kong, Shatin, Territorji Ġodda, Ħong Kong
b Laboratorju Ewlenin tal-Istat tal-Fitokimika u r-Riżorsi tal-Pjanti fiċ-Ċina tal-Punent, L-Università Ċiniża ta 'Ħong Kong, Shatin, Territorji Ġodda, Ħong Kong
c Diviżjoni tal-Farmakoloġija Klinika, Dipartiment tal-Mediċina u Terapewtika, L-Università Ċiniża ta 'Ħong Kong, Shatin, Territorji Ġodda, Ħong Kong
Astratt:
Rilevanza etnofarmakoloġika: HerbaĊistanċi(HC,Cistanchedeserticola, jewCistanchetubulosa) hija ħaxixa Ċiniża tradizzjonalment użata għal problemi fil-muskoli. Studji preċedenti wrew li l-estratt HC jista 'jnaqqas il-ħsara fil-muskoli u jtejjeb il-ħażna tal-ATP fil-firien ta' wara l-eżerċizzju. Madankollu, l-effett tiegħu fuq it-tossiċità tal-muskoli indotta minn statin qatt ma ġie investigat.
Għan:L-għan ta' dan l-istudju kien li jiddetermina jekk l-estratt milwiema ta 'HC (HCE) jistax jipprevjeni t-tossiċità indotta minn simvastatin fiċ-ċelloli tal-muskoli skeletriċi tal-firien L6 u jekk verbascoside huwiex il-kostitwent bijoattiv ewlieni li jikkontribwixxi għall-effetti.
Materjali u metodi:MTT sar biex jiddetermina l-effetti ta 'HCE ({{0}}-2000 mg/ml) jew verbascoside (0-160 mM) fuq ċelluli L6 trattati b'simvastatin (10 mM). Assaġġ ta 'apoptosi ta' Annexin V-FITC/PI u analiżi Caspase 3 saru biex jiddeterminaw ir-rwol protettiv ta 'HCE fuq mewt taċ-ċelluli indotta minn simvastatin, u biex jevalwaw jekk HCE eżerċitax l-effett protettiv tiegħu permezz tal-mogħdija ta' caspase. Il-produzzjoni ta 'ATP tkejjel biex tinvestiga jekk HCE jistax jipprevjeni tnaqqis indott minn simvastatin fil-produzzjoni ta' ATP in vitro.
Riżultati:Simvastatin żied b'mod sinifikanti l-mewt taċ-ċelluli apoptotiċi fiċ-ċelloli L6. L-HCE eżerċita b'mod sinifikanti tnaqqis dipendenti fuq id-doża fuq ċelluli apoptotiċi indotti minn simvastatin, possibbilment permezz ta' passaġġ ta' caspase-3. Simvastatin naqqas il-produzzjoni ta 'ATP fiċ-ċelloli L6, li kienet evitata skond id-doża minn HCE. Kien hemm biss tendenza iżda mhux effett sinifikanti (ħlief f'doża għolja) ta' verbascoside fuq il-protezzjoni tat-tossiċità tal-muskoli indotta minn simvastatin.
Konklużjonijiet:Bħala konklużjoni, urejna għall-ewwel darba li l-HCE jista 'jeżerċita effett protettiv dipendenti mid-doża fuq it-tossiċità indotta minn simvastatin in vitro, li ma kienx probabbli minħabba l-preżenza ta' verbascoside. L-istudju tagħna ssuġġerixxa l-użu potenzjali ta 'HC taħt is-sitwazzjoni ta' tossiċità tal-muskoli indotta minn simvastatin.
Kliem ewlieni:HerbaĊistanċi, StatinCholesterol, Iperlipidemija, Tossiċità fil-muskoli, Verbascoside, Caspase-3
1. Introduzzjoni
L-inibituri ta' HMG-CoA reductase (statins), li huma l-iktar klassi ta' mediċini bir-riċetta li nbiegħu fid-dinja fl-istorja, huma dokumentati sew li huma ta' benefiċċju għal pazjenti taż-żewġ sessi f'etajiet differenti b'riskju moderat u għoli ta' mard kardjovaskulari (CVD) (Golomb u Evans, 2008). Imbagħad ġew żviluppati u approvati klinikament statins differenti inklużi pravastatin, atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pitavastatin, rosuvastatin, u simvastatin. B'mod ġenerali, statins kollha jaġixxu billi jinibixxu t-tnaqqis ta 'HMG-CoA għal aċidu mevalonic matul l-istadju bikri tal-mogħdija tal-mevalonat biex inaqqsu l-produzzjoni tal-kolesterol (Kromer u Moosmann, 2009; Thompson et al., 2003). Għalkemm l-istatini huma ġeneralment ittollerati tajjeb, wieħed mill-effetti avversi kliniċi l-aktar importanti u magħrufa huwa t-tossiċità tal-muskoli skeletriċi (rabdomijolisi) (Kobayashi et al., 2008). Anormalitajiet fil-muskoli skeletriċi jistgħu jvarjaw minn mijalġija beninna sa mijopatija severa. Filwaqt li huma proposti medley ta 'mekkaniżmi u jistgħu jkunu responsabbli għall-effetti ħżiena tal-muskoli ta' statin, mekkaniżmi mitokondrijali huma maħsuba li għandhom rwol importanti (Golomb and Evans, 2008). Mevalonat mhuwiex biss prekursur tal-kolesterol, iżda wkoll għal komposti oħra inklużi selenoproteins, dolichol, u ubiquinone (Kaufmann et al., 2006; Vaklavas et al., 2009). L-abbiltà ta 'statins li jinibixxu mevalonate għalhekk tinibixxi wkoll il-produzzjoni ta' selenoproteins bħal glutathione peroxidase (GPx), li huma enzimi importanti fiż-żamma tal-mekkaniżmu ta 'difiża anti-ossidativa (Kromer u Moosmann, 2009). Statins jistgħu jwasslu wkoll għal tnaqqis tal-ubiquinone, li jikkawżaw tnaqqis fil-konsum tal-ossiġnu u sinteżi tal-ATP (Beltowski et al., 2009). Barra minn hekk, iż-żieda ta’ studji in vitro u in vivo wriet li statin jista’ jaġixxi wkoll direttament fuq il-mitokondrija tat-tessuti biex jinduċi transizzjoni tal-permeabilità tal-membrana dipendenti fuq Ca2þ (MPT) b’mod dipendenti mid-doża (Beltowski et al., 2009; Velho et al., 2006). ). Huwa assoċjat ukoll ma 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) miżjuda u stress ossidattiv mitokondrijali, li jwassal għal mewt taċ-ċelluli u għalhekk jikkontribwixxi għal ħsara fil-fwied u fil-muskoli (Beltowski et al., 2009; Velho et al., 2006).
HerbaĊistanċi, il-pjanta mnixxfa kollha ta 'Cistanche deserticola YC Ma, jew Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight (familja Orobanchaceae), huma pjanti parassiti li jikbru b'mod predominanti fiż-żoni tad-deżert tat-tramuntana u l-grigal taċ-Ċina (Siu and Ko, 2010).HerbaĊistanċihija ħaxix toniku Ċiniż li jsaħħaħ Yang li jintuża primarjament biex jikkura defiċjenza tal-kliewi b'sintomi bħal impotenza, infertilità, eġakulazzjoni prematura. In-natura tqila u mċajpra tal-ħaxix xarrab ukoll l-imsaren u tgħin biex ittaffi l-istitikezza. Hija wkoll ħaxixa Ċiniża li hija tradizzjonalment preskritta lill-pazjenti għal uġigħ fil-flettijiet u l-irkopptejn u hija ħaxixa użata komunement f'formulazzjonijiet Ċiniżi għat-trattament ta 'problemi fil-muskoli (Siu and Ko, 2010; Xiong et al., 1998). Interessanti, dan huwa wkoll konsistenti mal-istudji xjentifiċi moderni li wrew l-attivitajiet kontra l-għeja ta 'estratt b'ħafna polysaccharide u phenylethanoid.HerbaĊistanċifil-firien wara l-eżerċizzju billi tnaqqas il-ħsara fil-muskoli u ttejjeb il-ħażna tal-ATP (Cai et al., 2010). Xogħol reċenti wera li estratt tal-metanol ta 'Herba Cistanches jista' jtejjeb il-ġenerazzjoni tal-ATP mitokondrijali (Leung and Ko, 2008). Siu u Ko (2010) wrew danHerbaĊistanċijista 'wkoll itejjeb l-istatus ta' glutathione mitokondrijali billi jimmedja livelli ta 'sintesi ta' glutathione u GPx, u b'hekk jipproteġi t-tessuti minn stress ossidattiv fil-qlub tal-firien. Siu u Ko (2010) wrew dan ukollHerbaĊistanċijista 'jnaqqas il-kontenut ta' Ca2þ mitokondrijali, u b'hekk inaqqas l-MPT dipendenti fuq Ca2þ. Barra minn hekk,HerbaĊistanċiġie wkoll ippruvat li huwa antiossidant qawwi u kennies radikali ħielsa f'diversi organi, li jnaqqas l-istress ossidattiv u l-attivitajiet ROS in vivo studji (Lu et al., 1995; Sui et al., 2011). Aktar interessanti, f'tentattiv biex tiddetermina l-frazzjoni attiva li tikkontribwixxi għall-attività kontra l-għeja ta 'HerbaĊistanċi, instab li verbascoside kien il-kostitwent ewlieni fil-frazzjoni attiva (Cai et al., 2010). Verbascoside kien intwera wkoll li jnaqqas l-għeja tal-muskoli fil-rospi, possibbilment minħabba l-attivitajiet antiossidattivi tiegħu (Liao et al., 1999), li jissuġġerixxi li verbascoside jista 'jkun il-komponent bijoattiv li jikkontribwixxi għall-effetti ta' benefiċċju ta 'Herba Cistanches.
L-għan ta 'dan l-istudju kien li jiddetermina jekk l-użu ta' estratt ta 'l-ilma Cistanches (HCE) tal-ħxejjex jista' jnaqqas it-tossiċità tal-muskoli indotta minn simvastatin in vitro. Ġie ipotetizzat li l-użu ta 'HCE jista' jikkoreġi għall-effetti sekondarji tat-tossiċità tal-muskoli kkawżata minn simvastatin. Sar ukoll tentattiv biex jiġi ddeterminat jekk l-effetti ta’ benefiċċju ta’HerbaĊistanċihuma attribwiti għall-preżenza ta 'verbascoside.
2. Materjali u metodi
2.1. Awtentikazzjoni u preparazzjoni ta' materjali veġetali
Materjal veġetali mhux maħdum ta 'HerbaĊistanċiinxtara mingħand fornitur rinomat f'Guangzhou, iċ-Ċina.HerbaĊistanċiġiet awtentikata kimikament bl-użu ta 'kromatografija ta' saff irqiq (TLC) skont il-Farmakopea Ċiniża (CP), 2010, b'verbascoside u echinacoside bħala l-markaturi kimiċi (dejta mhux murija). Mal-awtentikazzjoni kimika, kampjun vawċer erbarju taHerbaĊistanċiġie depożitat fil-Mużew tal-Istitut tal-Mediċina Ċiniża fl-Università Ċiniża ta 'Hong Kong (CUHK), bin-numru tal-kampjun tal-vawċer 2014–3434.
Fil-qosor, 1 kg tal-ħaxix nej ġie mxarrba għal siegħa, segwit minn estrazzjoni darbtejn billi ssaħħan għal siegħa taħt rifluss f'100 grad bl-użu ta '10 ilma distillat għal kull estrazzjoni. L-estratti milwiema (HCE) ġew magħquda u ffiltrati. Il-filtrat kien ikkonċentrat taħt pressjoni mnaqqsa f'60 grad. L-estratt ikkonċentrat ġie lajofilizzat sa nixfa. Il-persentaġġ tar-rendiment kien 50.1 fil-mija w/w. Ammont żgħir intuża biex tiddetermina l-kwantità ta 'verbascoside u echinacoside bl-użu ta' kromatografija likwida ultra-prestazzjoni (UPLC). It-trab kollu estratt kien ippakkjat bil-vakwu u maħżun sakemm jintuża.
2.2. Analiżi UPLC tal-estratt milwiema
L-analiżi UPLC twettqu bl-użu tas-Sistema Waters Acquity Ultra Performance LC (Waters, USA). Is-solventi kollha meħtieġa għall-analiżi UPLC inxtraw mid-Dipartiment tal-Kimika fl-Università Ċiniża ta 'Hong Kong. Verbascoside u echinacoside inxtraw mill-Istitut Nazzjonali għall-Kontroll tal-Prodotti Farmaċewtiċi u Bijoloġiċi, iċ-Ċina. Is-soluzzjoni tal-kampjun ġiet injettata ġo kolonna Waters Acquity UPLC BEH C18 (10{{20}} 2.1 mm2 id, daqs tal-partiċelli 1.7 mm) bil-Pre-Column Waters ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard ( 5-2.1 mm2 id, daqs tal-partiċelli 1.7 mm). Is-solventi kollha ġew iffiltrati minn qabel b'0.45 mm Millipore filter disk (Millipore) u tneħħiet il-gass. L-elużjoni tal-gradjent twettqet bl-użu tas-sistemi tas-solventi li ġejjin: fażi mobbli A – aċetonitrile; fażi mobbli B – ilma distillat doppju/aċidu formiku (99.9/ 0.1; v/v). L-elużjoni twettqet bi proċedura ta 'gradjent kif ġej: 0-5 min, 88 fil-mija B; 5-10 min, minn 88 fil-mija B għal 83 fil-mija B. Ir-rata tal-fluss użata kienet 0.4 ml/min u s-sejba twettqet f'331 nm skont CP (2010). Kull kampjun (5 ul) ġie injettat fil-kolonna wara filtrazzjoni permezz ta 'diska tal-filtru ta' 0.2 mm. L-identifikazzjoni tal-markaturi kimiċi twettqet billi tqabbel il-ħinijiet ta' żamma u l-assorbiment tal-UV tal-qċaċet mhux magħrufa ma' dawk tal-istandards. Kurva ta 'kalibrazzjoni ġiet impinġa minn serje ta' konċentrazzjonijiet ta 'verbascoside u echinacoside (40, 20, 10, 5, 2.5, u 1.25 mg/ml) għall-kwantifikazzjoni. Il-kwantifikazzjoni ta 'verbascoside u echinacoside fi ħdan l-estratt tal-ħxejjex saret fi tliet kopji. Is-sistema kienet immonitorjata minn kompjuter mgħammar bis-Software Waters MassLynx għall-ġbir, l-integrazzjoni u l-analiżi tad-dejta.
2.3. Kultura taċ-ċelluli
Il-linja taċ-ċelluli tal-muskoli skeletriċi tal-firien L6 inxtrat mill-American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA, USA). Iċ-ċelloli nżammu f'densità subkonfluwenti fil-Medju tal-Ajkla Modifikat ta' Dulbecco (DMEM, ATCC, Manassas, VA, USA) supplimentat b'10 fil-mija v/v serum bovin tal-fetu (FBS) u 1 fil-mija penicillin-streptomycin (P/S), u inkubati f'37 grad f'atmosfera umidifikata li fiha 5 fil-mija CO2 u 95 fil-mija arja.
Biex jiġu ddeterminati l-effetti ta 'HCE fuq it-tossiċità tal-muskoli indotta minn statin, ċelluli L6 ġew ittrattati b'simvastatin f'10 μM għal 48 siegħa biex jinduċu tossiċità. HCE (f'konċentrazzjonijiet 0, 250, 500, 1000, u 2000 ug/ml) jew verbascoside (f'konċentrazzjonijiet 0, 20, 40, 80, u 160 μM) ġew miżjuda bħala ko-trattament ma' statin biex jiġi ddeterminat jekk il- estratt tal-ħxejjex jista 'jipprevjeni t-tossiċità ta' statin indotta fiċ-ċelloli tal-muskoli skeletriċi u li jekk verbascoside jista 'jeżerċita effetti protettivi simili bħall-estratt milwiema tal-ħxejjex.
Effett protettiv ta 'l-estratt ta' Herba Cistanche fuq it-tossiċità indotta minn simvastatin in vitro
2.4. Ċitotossiċità in vitro
Ċelloli L6 (1x105( 0–2000 ug/ml) jew verbascoside (0–160 μM), għal 48 siegħa. Medju sempliċi (DMEM) ġie miżjud mal-bjar ta 'kontroll. L-estratt tal-ħxejjex u l-kompost ġew maħlula f'DMEM.
Wara t-trattament ta' 48 siegħa, il-medium miċ-ċelloli kollha twarrab u 30 ul ta' 5 mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{{ 8}}diphenyl-tetrazolium bromide (MTT; Sigma, USA) fis-salina buffered fosfat (PBS) ġew miżjuda ma 'kull bir u l-pjanċi ġew inkubati aktar għal 3 sigħat f'37 grad. Is-supernatant imbagħad tneħħa u 100 ul ta 'DMSO ġew miżjuda ma' kull bir biex jinħall il-kristalli tal-formazan vjola (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA). L-assorbiment ta 'kull kampjun inqrat f'540 nm bl-użu ta' qarrej tal-mikroplate (Biotek μ-Quant, USA). Ir-riżultati ġew espressi bħala l-perċentwal ta 'assorbiment MTT fir-rigward taċ-ċelloli ta' kontroll.
2.5. Assaġġ tat-tbajja' ta' Annexin-V FITC/PI
Ċelloli L6 (3 x105/tajjeb) ġew ittrattati b’simvastatin, flimkien ma’ diversi dożi jew mingħajrhom ta’ HCE jew verbascoside. Iċ-ċelluli mbagħad inġabru, maħsula, u mtebbgħin b'kit tal-annexin-V FITC skont il-protokoll tal-manifattur (Trevigen, MD, USA). Fil-qosor, iċ-ċelloli ġew maħsula darbtejn b'1 x buffer vinkolanti u kkubati f'soluzzjoni ta 'tikkettar ta' 100 ul li fiha 1 ul annexin-V FITCconjugate u 10 ul PI fid-dlam għal 15-il minuta f'temperatura tal-kamra. Il-fluworexxenza tal-kampjuni ġiet skoperta permezz taċ-ċitometrija tal-fluss (Becton Dickinson FACSCanto II, USA).
2.6. Assaġġ ta' attività ta' Caspase 3
L-attività ta' Caspase 3 ġiet iddeterminata bl-użu ta' analiżi ta' enzimi immunosorbenti fluworometriċi (Sigma) skond l-istruzzjoni tal-manifattur. Fil-qosor, ċelluli L6 (3 105/tajjeb) ittrattati b'simvastatin, flimkien ma' jew mingħajr diversi dożi ta' HCE verbascoside ġew lysed bl-użu tal-lysis buffer. 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) ħieles iġġenerat permezz tal-qsim proteolitiku tas-sottostrat minn Caspase 3 ġew imkejla u kkwantifikati fluworometrikament bil-wavelength ta' eċċitazzjoni f'360 nm, u wavelength ta' emissjoni f'460 nm b'BMG FLUOstarOptimamicroplate qarrej (BMG LABTECH GmbH, il-Ġermanja).
2.7. Assaġġ ATP ċellulari
Ċelloli L6 (3x105/tajjeb) ġew ittrattati b’simvastatin, flimkien ma’ diversi dożi jew mingħajrhom ta’ HCE jew verbascoside. Wara t-trattament, inġabru ċ-ċelloli u l-kontenut ta’ ATP tkejjel bl-użu tal-kit kolorimetriku disponibbli kummerċjalment (Abcam, UK) permezz ta’ kejl tal-kontenut ta’ glycerol phosphate taċ-ċelloli lisati u qari f’570 nm bl-użu ta’ microplate reader (Biotek μ-Quant, USA). ). Il-kejl tal-produzzjoni tal-ATP kien espress bħala perċentwal relattiv għall-grupp ta 'kontroll.
2.8. Analiżi statistika
Id-dejta ġiet ippreżentata bħala mezz7SD, Prism 5 għal Window(verżjoni 5.0c, GraphPad Software, Inc., USA) intużat għall-analiżi statistika. Differenzi sinifikanti fost il-gruppi kollha ġew evalwati b'ANOVA one-way, segwit mit-Test ta' Tqabbil Multiplu ta' Bonferroni. Probabbiltà ta' po0.05 tqieset statistikament sinifikanti.
3. Riżultati
3.1. Analiżi UPLC ta 'estratt milwiema Herba Cistanches
Fig. S1A wriet il-profil UPLC ta 'taħlita standard li fiha echinacoside u verbascoside. Il-punti tal-ħin taż-żamma ta 'kull wieħed minn dawn il-markaturi tqabblu mal-profil UPLC ta'HerbaĊistanċiestratt milwiema (Fig. S1B). L-ammont ta 'echinacoside u verbascoside ġewwaHerbaĊistanċiestratt milwiema nstab li kien {{0}}.45 fil-mija w/w u 0.085 fil-mija w/w, rispettivament.
3.2. Effett ta' HCE u verbascoside fuq iċ-ċitotossiċità in vitro ta' simvastatin fiċ-ċelloli tal-muskoli skeletriċi L6
Kif muri f'Fig. 1A, simvastatin ikkawża ċitotossiċità sinifikanti għaċ-ċelloli L6 kif rifless mit-tnaqqis sinifikanti fil-vijabbiltà taċ-ċelloli L6 f'10 mM simvastatin. It-trattament HCE b'mod dipendenti fuq id-doża u b'mod sinifikanti jipprevjeni ċ-ċitotossiċità indotta minn simvastatin f'500, 1000, u 2000 mg/ml. Verbascoside eżerċita tendenza li jtejjeb il-vijabbiltà taċ-ċelloli L6 kotrattati b'simvastatin. Madankollu, l-ebda waħda mill-konċentrazzjonijiet ma kienet laħqet sinifikat statistiku (Fig. 1B).
Fig. 1. Effett protettiv ta' (a) HCE; u (b) verbascoside fuq ċitotossiċità indotta minn simvastatin fiċ-ċelloli L6. Il-valuri jirrappreżentaw mezzi7SD (n¼3). Differenza sinifikanti bejn it-trattament b'simvastatin waħdu u l-grupp ta' kontroll li juża t-test ta' Student: ### po0.{{10}}01. Differenza sinifikanti fost il-gruppi kollha ttrattati b'simvastatin bi jew mingħajr ko-trattament ta' verbascoside HCE bl-użu ta' ANOVA f'direzzjoni waħda: ** po0.01,*** po0.001.
3.3. Effett ta 'HCE u verbascoside fuq il-mewt taċ-ċelluli indotta minn simvastatin fiċ-ċelloli tal-muskoli skeletriċi L6
Biex teżamina l-mod ta 'mewt taċ-ċelluli indotta minn simvastatin u tiddetermina r-rwol protettiv ta' HCE jew verbascoside fuq il-mewt taċ-ċelluli indotta minn simvastatin, il-proporzjon ta 'ċelluli apoptotiċi ġew skoperti minn tbajja ta' propidium iodide (PI). Ir-riżultati wrew li simvastatin indotta żieda sinifikanti fil-proporzjon ta 'ċelluli apoptotiċi bikrija (Annexin V-FITC pożittiv u PI negattiv, Q4-2), u ċelluli apoptotiċi tard / mejta (Annexin V-FITC pożittiv u PI-pożittiv, Q2-). 2) meta mqabbla mal-grupp ta 'kontroll. Ko-trattament ma 'HCE naqqas il-proporzjon ta' apoptotic kmieni, u apoptotic tard / ċelluli mejta b'mod dipendenti fuq id-doża sa 1000 mg / ml (Fig. 2A). Dan l-effett protettiv kien osservat ukoll fi gruppi ta' trattament konġunt ta' verbascoside. Madankollu, l-ebda waħda mill-konċentrazzjonijiet ittestjati ma kienet laħqet sinifikat statistiku (Fig. 2B).
Fig. 2. Effett ta 'simvastatin bi jew mingħajr HCE jew ko-trattament ta' verbascoside fuq esternalizzazzjoni ta 'phosphatidylserine fiċ-ċelloli L6. Iċ-ċelloli ġew imtebba' b'Annexin-V FITC u I u nstabu permezz ta' ċitometrija tal-fluss
3.4. Effett ta' HCE u verbascoside fuq l-attività ta' caspase 3 fiċ-ċelloli tal-muskoli skeletriċi L6 ittrattati b'simvastatin
Kif muri fil-Fig. 3A, 10 mM simvastatin indott b'mod sinifikanti attività caspase 3 fiċ-ċelloli L6, li jissuġġerixxi simvastatin indotta apoptosis għal ċelloli L6 permezz tal-kaskata caspase. Madankollu, f'ċelluli L6 ikkurati b'simvastatin u HCE, HCE naqqas b'mod sinifikanti u dipendenti fuq id-doża l-attività ta 'caspase 3, li jissuġġerixxi l-abbiltà ta' HCE li jipprevjeni l-apoptosi indotta minn simvastatin permezz tal-kaskata ta 'caspase. Min-naħa l-oħra, għalkemm verbascoside eżerċita wkoll xejra biex tnaqqas iż-żieda indotta minn simvastatin fl-attività tal-enzima caspase 3, il-konċentrazzjoni biss f'160 mM laħqet sinifikat statistiku (Fig. 3B).
Fig. 3. Effett protettiv ta' (a) HCE; u (b) verbascoside fuq attività enżimatika ta' caspase 3 indotta minn simvastatin fiċ-ċelloli L6. Il-valuri jirrappreżentaw mezzi7SD (n¼3–5).Differenza sinifikanti bejn it-trattament b'simvastatin waħdu u gruppi ta' kontroll li jużaw it-test t ta' Student: ###po0.001. Differenza sinifikanti fost il-gruppi kollha ttrattati b'simvastatin bi jew mingħajr ko-trattament ta' HCE jew verbascoside bl-użu ta' ANOVA f'direzzjoni waħda: *po0.05, **p o0.01, ***po0.001.
3.5. Effett ta 'HCE fuq tnaqqis indott minn simvastatin fil-produzzjoni ta' ATP fiċ-ċelloli tal-muskoli skeletriċi L6
Simvastatin (10 mM) naqqas b'mod sinifikanti l-produzzjoni ta 'ATP fiċ-ċelloli L6 b'madwar 60 fil-mija meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll (Fig. 4A). Il-ko-trattament ta 'HCE attenwat b'mod dipendenti fuq id-doża t-tnaqqis fil-produzzjoni ta' ATP f'ċelloli ttrattati b'simvastatin, li minnhom il-konċentrazzjonijiet biss f'500, 1000, u 2000 mg/ml kienu laħqu sinifikat statistiku. Min-naħa l-oħra, għalkemm verbascoside eżerċita xejra biex jerġa 'jġib il-produzzjoni ta' ATP f'50 mg / ml, ma laħaqx sinifikat statistiku (Fig. 4B).
Fig. 4. Effett protettiv ta '(a) HCE u (b) verbascoside fuq tnaqqis indott minn simvastatin fil-produzzjoni ta' ATP fiċ-ċelloli L6. Il-valuri jirrappreżentaw mezzi7SD (n¼3–5).Differenza sinifikanti bejn it-trattament b'simvastatin waħdu u gruppi ta' kontroll li jużaw it-test t ta' Student: ###po0.001. Differenza sinifikanti fost il-gruppi kollha ttrattati b'simvastatin bi jew mingħajr ko-trattament ta' HCE jew verbascoside bl-użu ta' ANOVA f'direzzjoni waħda: *po0.05, **po0.01.
4. Diskussjoni
Bil-prevalenza dejjem tikber ta 'mard kardjovaskulari (CVD) u pazjenti dijanjostikati b'iperkolesterolemija globalment, l-użu ta' statins sar aktar komuni. Għalkemm statins huma ġeneralment tollerati tajjeb ħafna, korriment fil-muskoli huwa effett sekondarju rrappurtat ta 'spiss assoċjat mal-użu statin li jista' jseħħ b'mod akut fil-ġimgħat jew xhur wara li l-mediċina tkun inbdiet (Fine, 2003). Is-sintomi tal-muskoli jistgħu jvarjaw minn problemi ħfief, pereżempju, uġigħ, sensittività, jew dgħjufija bi jew mingħajr elevazzjoni tal-creatine kinase (CK), għall-aktar kundizzjoni severa ta 'rabdomijolisi (Armitage, 2007; Hu et al., 2012). Minħabba l-okkorrenza ta 'dawn l-effetti sekondarji, u l-fatt li ma jeżisti l-ebda trattament effettiv għat-tossiċità tal-muskoli indotta mill-istatina, statins għadhom mhux użati biżżejjed. Fi stħarriġ wiesa 'fuq 10,409 suġġett Franċiż li sar permezz ta' intervista bit-telefon, 10 fil-mija tal-pazjenti li kienu qed jirċievu trattament b'statina rrappurtaw sintomi muskolari, li minnhom 30 fil-mija ta 'dawn il-pazjenti sintomatiċi rriżultaw f'waqfien tal-kura (Rosenbaum et al., 2013).
Aħna għall-ewwel darba wrew li l-estratt ta 'l-ilmaHerbaĊistanċi, ħaxix tradizzjonali Ċiniż użat komunement, jista 'jeżerċita effett protettiv kontra t-tossiċità indotta minn simvastatin in vitro fiċ-ċelloli tal-muskoli skeletriċi L6, li jissuġġerixxi l-potenzjal ta'HerbaĊistanċiestratt milwiema (HCE) għar-rwol protettiv tiegħu tat-tossiċità tal-muskoli indotta mill-istatina, li hija effett sekondarju komuni rikonoxxut f'pazjenti li jieħdu statins. L-abbiltà qawwija ta 'HCE li jipproteġi kontra t-tossiċità tal-muskoli indotta mill-istatina għalhekk tkun ta' potenzjal kbir.
Skont it-teorija tradizzjonali fit-TCM, Yang huwa relatat mal-metaboliżmu tal-enerġija mitokondrijali fil-ġisem, u l-preskrizzjoni ta 'ħxejjex aromatiċi li jqawwu Yang instabet li ttejjeb il-ġenerazzjoni tal-ATP mitokondrijali (Ko and Leung, 2007). Interessanti, osservajna tnaqqis fil-produzzjoni ta 'ATP f'ċelluli tal-muskoli skeletriċi L6 ittrattati b'simvastatin, u dan it-tnaqqis fil-produzzjoni ta' ATP tjieb b'mod sinifikanti b'ko-trattament HCE. Fl-istudju tagħna, bl-użu ta 'ċelluli tal-muskoli skeletriċi tal-firien L6, urejna tnaqqis fil-vijabbiltà taċ-ċelluli kkawżat minn simvastatin. Dan it-tnaqqis fil-vijabbiltà taċ-ċelluli tjieb b'mod sinifikanti bil-ko-trattament ta'HerbaĊistanċib'mod dipendenti mid-doża. Għalkemm il-mekkaniżmu eżatt tat-tossiċità tal-muskoli indotta minn statin ma ġiex spjegat għal kollox, l-apoptosi indotta mill-istatina ta 'mijoċiti skeletriċi b'saħħithom kienet ssuġġerita li tkun fattur li jikkawża mijopatija, l-aktar effett sekondarju komuni esperjenzat minn utenti ta' statin (Dirks and Jones, 2006) . Fl-istudju tagħna, osservajna żieda sinifikanti fiċ-ċelloli apoptotiċi indotti minn simvastatin, li kienet assoċjata ma 'attività ta' caspase 3 elevata b'mod sinifikanti. Din id-dejta hija konsistenti wkoll ma’ studji preċedenti, li wrew li statins varji jistgħu jinduċu apoptożi f’mijoblasti skeletriċi, mijotubi, u f’ċelluli primarji tal-muskoli skeletriċi umani differenzjati permezz tal-attivazzjoni ta’ attivitajiet ta’ caspase-9 u caspase-3 (Dirks). u Jones, 2006). L-HCE tagħna kien kapaċi jipprevjeni din iż-żieda indotta minn simvastatin fl-apoptosi attivata mill-caspase-3 b'mod dipendenti fuq id-doża.
HerbaĊistanċi
Barra minn hekk, il-letteratura preċedenti ssuġġeriet li verbascoside huwa wieħed mill-kostitwenti attivi ewlenin ġewwaHerbaĊistanċi. Verbascoside, magħruf ukoll bħala acteoside, jappartjeni għall-membru tal-phenylethanoid glycosides, grupp naturali ta 'komposti polifenoliċi li jinħall fl-ilma (Liao et al., 1999). Preċedentement, intwera li verbascoside huwa antiossidant qawwi li jista 'jesibixxi attivitajiet qawwija ta' tneħħija ta 'ROS u antiossidattivi (Liao et al., 1999). Fl-istudju tagħna, biex tiddetermina jekk verbascoside huwiex il-komponent ewlieni fi ħdan l-HCE tagħna li jikkontribwixxi għall-effetti ta 'benefiċċju osservati, aħna ttestjajna l-effetti ta' verbascoside fil-konċentrazzjonijiet ta '0–160 mM. Peress li wrejna li l-HCE tagħna huwa attiv fil-medda ta' konċentrazzjoni ta' 250–2000 mg/ml, ibbażat fuq ir-riżultati tal-HPLC tagħna li ssuġġerew li l-HCE tagħna kien fih verbascoside f'konċentrazzjoni ta' 0.085 fil-mija wt /wt, il-konċentrazzjoni attiva ta 'verbascoside għandha tvarja bejn 0.2125-1.7 mg/ml (jiġifieri 0.34-2.72 mM), għandha verbascoside tkun il-kostitwent attiv? Madankollu, naqsu milli nosservaw effett ta 'benefiċċju sinifikanti ta' verbascoside mal-firxa ta 'konċentrazzjoni ttestjata, għalkemm osservajna xejra dipendenti mid-doża għal effett ta' benefiċċju ta 'verbascoside fuq ċelluli tal-muskoli skeletriċi L6. Din id-dejta ssuġġeriet li l-effett ta 'benefiċċju tal-HCE tagħna osservat fiċ-ċelloli skeletriċi L6 x'aktarx ma jiġi attribwit għall-effett ta' verbascoside waħdu, u jissuġġerixxi komponenti oħra għajr verbascoside jistgħu jkunu responsabbli għall-effetti ta 'benefiċċju osservati. Huwa wkoll possibbli li verbascoside jista 'jinteraġixxi ma' komposti bijoattivi oħra fi ħdan l-estratt biex jikkontribwixxi għall-effetti ta 'benefiċċju. Esperimenti addizzjonali li jużaw il-frazzjonament iggwidat mill-bijoassay se jkunu utli biex jipprovdu aktar għarfien dwar l-iskoperta tal-komponenti bijoattivi responsabbli biex jikkontribwixxu għall-effetti protettivi osservati tal-HCE fuq it-tossiċità tal-muskoli indotta minn simvastatin.
Bħala konklużjoni, l-istudju preżenti jindika li l-HCE jista 'jeżerċita effetti protettivi qawwija fuq it-tnaqqis indott minn simvastatin fil-vijabbiltà taċ-ċelluli tal-muskoli in vitro. Dawn ir-riżultati jipprovdu l-evidenza preliminari li tissuġġerixxi li l-estratt akweju HC tagħna jista 'jkun ta' valur terapewtiku bħala ikel funzjonali jew nutraċewtiku għal pazjenti iperlipidemiċi li huma meħtieġa li jirtiraw mit-trattament b'statina minħabba mijotossiċità indotta mill-istatina.
RikonoxximentDan l-istudju kien appoġġjat finanzjarjament mill-Uffiċċju tal-Ikel u s-Saħħa HKSAR, is-Saħħa, u l-Fond għar-Riċerka Medika Nru. 11120831.
Referenzi
Armitage, J., 2007. Is-sigurtà ta 'statins fil-prattika klinika. Lancet 370, 1781–1790.
Beltowski, J., Wojcicka, G., Jamroz-Wisniewska, A., 2009. Effetti avversi ta 'statins - mekkaniżmi u konsegwenzi. Curr. Droga Saf. 4, 209–228.
Cai, RL, Yang, MH, Shi, Y., Chen, J., Li, YC, Qi, Y., 2010. L-attività kontra l-għeja ta 'estratt b'ħafna feniletanojdi minn Cistanche deserticola. Phytother. Riż. 24, 313–315.
Dirks, AJ, Jones, KM, 2006. Apoptożi indotta minn statin u mijopatija skeletrika. Em. J. Physiol. Ċellula Physiol. 291, C1208–C1212.
Fine, DM, 2003. Tossiċità tal-muskoli relatata mal-istatina. Clin. Pharmacol. 3, 554.
Golomb, BA, Evans, MA, 2008. Statin effetti avversi: reviżjoni tal-letteratura u evidenza għal mekkaniżmu mitokondrijali. Em. J. Cardiovasc. Drogi 8, 373–418.
Hu, M., Cheung, BM, Tomlinson, B., 2012. Sigurtà ta 'statins: aġġornament. Ther. Adv. Droga Saf. 3, 133–144.
Kaufmann, P., Torok, M., Zahno, A., Waldhauser, KM, Brecht, K., Krahenbuhl, S., 2006. Tossiċità ta 'statins fuq mitokondrija tal-muskoli skeletriċi tal-firien. Ċellula. Mol. Ħajja Sci. 63, 2415–2425.
Ko, KM, Leung, HY, 2007. Titjib tal-kapaċità ta 'ġenerazzjoni ta' ATP, attività antiossidant, u attivitajiet immunomodulatorji minn ħxejjex aromatiċi tat-tonifikazzjoni Ċiniżi Yang u Yin. Chin. Med. 2, 3.
Kobayashi, M., Kagawa, T., Narumi, K., Itagaki, S., Hirano, T., Iseki, K., 2008. Supplimentazzjoni tal-bikarbonat bħala mod preventiv fil-ħsara tal-muskoli indotta mill-istatini. J. Pharm. Pharm. Sci. 11, -8.
Kromer, A., Moosmann, B., 2009. Il-ħsara fil-fwied indotta mill-istatina tinvolvi cross-talk bejn il-mogħdijiet bijosintetiċi tal-kolesterol u tas-selenoprotein. Mol. Pharm. 75, 1421–1429.
Leung, HY, Ko, KM, 2008. L-estratt ta 'Herba Cistanche itejjeb il-ġenerazzjoni ta' ATP mitokondrijali fil-qlub tal-firien u ċelloli H9C2. Pharm. Biol. 46, 418.
Liao, F., Zheng, RL, Gao, JJ, Jia, ZJ, 1999. Ritardazzjoni ta 'għeja tal-muskoli skeletriċi miż-żewġ glikożidi phenylpropanoid: verbascoside u martensite minn Pedicularis plicata Maxim. Phytother. Riż. 13, 621–623.
Lu, KG, Liu, HB, Gu, QQ, 1995. Studju dwar Kostitwenti Kimiċi ta 'Cistanche deserticola Ma. u Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. Chin. Tradit. Ħxejjex aromatiċi. Drogi 26, 143.
Kummissjoni tal-Farmakopea, 2010. Il-Farmakopea tar-Repubblika Popolari taċ-Ċina. Chemical Industry Press, Beijing.
Rosenbaum, D., Dallongeville, J., Sabouret, P., Bruckert, E., 2013. Twaqqif tat-terapija ta 'statina minħabba effetti sekondarji muskolari: stħarriġ fil-ħajja reali. Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 23, 871-875.
Siu, AH, Ko, KM, 2010. L-estratt ta 'Herba Cistanche itejjeb l-istatus tal-glutathione mitokondrijali u r-respirazzjoni fil-qlub tal-firien, b'induzzjoni possibbli ta' proteini ta 'uncoupling. Pharm. Biol. 48, 512–517.
Sui, ZF, Gua, TM, Liu, B., Peng, SW, Zhao, ZL, Li, L., Shi, DF, Yang, RY, 2011. Kompost tal-karboidrati li jinħall fl-ilma mill-korpi ta 'HerbaĊistanċi: iżolament u l-effett tat-tħaffir tiegħu fuq ir-radikali ħielsa fil-ġilda. Karboidrat. Polim. 85, 75.
Thompson, PD, Clarkson, P., Karas, RH, 2003. Mijopatija assoċjata ma 'statina. JAMA 289, 1681–1690.
Vaklavas, C., Chatzizisis, YS, Ziakas, A., Zamboulis, C., Giannoglou, GD, 2009. Bażi molekulari ta 'mijopatija assoċjata ma' statin. Aterosklerożi 202, 18–28.
Velho, JA, Okanobo, H., Degasperi, GR, Matsumoto, MY, Alberici, LC, Cosso, RG, Oliveira, HC, Vercesi, AE, 2006. Statins jinduċu transizzjoni tal-permeabilità mitokondrijali dipendenti fuq il-kalċju. Tossikoloġija 219, 124-132.
Xiong, Q., Hase, K., Tezuka, Y., Tani, T., Namba, T., Kadota, S., 1998. Attività epatoprotettiva ta 'phenylethanoids minn Cistanche deserticola. Planta Med. 64, 120–125.
