L-Inibitur tal-Prolyl Hydroxylase Fattur li jinduċibbli mill-Ipoksja Orali Enarodustat Ikkontro l-Alterazzjonijiet fil-Metaboliżmu tal-Enerġija Renali fl-Istadji Bikrija tal-Mard Dijabetiku tal-Kliewi

Kuntatt: emily.li@wecistanche.com

Introduzzjoni

Diviżjoni tan-Nefroloġija u Endokrinoloġija, L-Iskola tal-Mediċina tal-Gradwati tal-Università ta 'Tokjo, Tokyo, Ġappun; Fellowship ta' Riċerka għal Xjentisti Żgħażagħ, Soċjetà tal-Ġappun għall-Promozzjoni tax-Xjenza, Tokyo, Ġappun; Laboratorji tar-Riċerka Bijoloġika u Farmakoloġika,

Istitut Ċentrali tar-Riċerka Farmaċewtika, Japan Tobacco Inc., Takatsuki, Ġappun; Dipartiment tas-Sistemi Farmakoloġija, L-Iskola tal-Mediċina tal-Gradwati tal-Università ta 'Tokjo, Tokyo, Ġappun; Laboratorju għall-Bijoloġija Sintetika, Ċentru RIKEN għar-Riċerka dwar id-Dinamika tal-Bijosistemi, Suita, il-Ġappun; u WPI International Research Center for Neurointelligence, L-Università ta 'Tokjo Istituti għall-Istudju Avvanzat (UTIAS), L-Università ta' Tokyo, Tokyo, Ġappun.

Inibituri tal-prolyl hydroxylase tal-fattur induċibbli mill-ipoksja (HIF), magħrufa wkoll bħala stabilizzaturi HIF, iżidu l-produzzjoni endoġenika tal-eritropojetin u jservu bħala aġenti terapewtiċi ġodda kontra l-anemija fl-kronikakliewimard. HIFinduċi l-espressjoni ta 'diversi ġeni relatati mal-metaboliżmu tal-enerġija bħala rispons adattiv għall-ipoksja. Madankollu, għadu skur kif it-tessut intern ta 'riprogrammar metaboliku bl-istabbilizzazzjoni HIF jaffettwa l-patofiżjoloġija ta'kliewi mard. Studji preċedenti jissuġġerixxu li disturbi metaboliċi sistemiċi bħal ipergliċemija u dislipidemija jikkawżaw alterazzjonijiet fil-metaboliżmu renali, li jwasslu għal disfunzjoni renali inkluż mard tal-kliewi dijabetiku. Hawnhekk, aħna nanalizzaw l-effetti ta 'enarodustat (JTZ-951), stabilizzatur HIF orali, fuq il-metaboliżmu tal-enerġija renali fl-istadji bikrija ta' mard tal-kliewi dijabetiċi, bl-użu ta 'firien dijabetiċi indotti minn streptozotocin u ġrieden dijabetiċi indotti minn alloxan. L-analiżi tat-traskriptome wriet li enarodustat jolqot l-alterazzjonijiet fil-metaboliżmu renali dijabetiku. L-analiżi tat-traskriptome wriet li l-metaboliżmu tal-aċidu xaħmi u tal-aċidu amminiku kienu regolati 'l fuq fit-tessut renali dijabetiku u regolati 'l isfel minn enarodustat, filwaqt li l-metaboliżmu tal-glukożju kien regolat 'il fuq. Dawn il-bidliet simmetriċi ġew ikkonfermati mill-analiżi tal-metaboloma. Billi l-glikolisi u l-metaboliti taċ-ċiklu tal-aċidu tricarboxylic ġew akkumulati u l-aċidi amminiċi tnaqqsu fit-tessut renali tal-annimali dijabetiċi, dawn id-disturbi metaboliċi ġew mitigati bl-enarodustat. Barra minn hekk, enarodustatin żied il-proporzjon ta 'glutathione għal glutathione disulfide u ħeles l-istress ossidattiv fit-tessut renali ta' annimali dijabetiċi. Għalhekk, l-istabbilizzazzjoni tal-HIF tikkontrobatta l-alterazzjonijiet fil-metaboliżmu tal-enerġija renali li jseħħu fil-bidudijabetikukliewimard.

Cistanche huwa tajjeb ħafna għall-funzjoni tal-kliewi

Dikjarazzjoni Translazzjonali

L-inibituri tal-prolyl hydroxylase tal-fattur induċibbli mill-ipoksja (HIF) (magħrufa wkoll bħala stabilizzaturi HIF) iżidu l-produzzjoni endoġenika tal-eritropojetin u jservu bħala aġenti terapewtiċi ġodda kontra l-anemija fl-kronikakliewimard. L-analiżi tat-transcriptome u l-metaboloma tagħna tat-tessut renali f'mudelli dijabetiċi tal-firien u tal-ġrieden urew li enarodustat (JTZ-951), stabilizzatur orali HIF, jikkontrobatti l-alterazzjonijiet tal-metaboliżmu tal-enerġija renali fl-istadji bikrija tal-mard tal-kliewi dijabetiku. Ir-riżultati jipprovdu dejta importanti għall-estrapolazzjoni tal-effetti tal-istabbilizzaturi HIF fuq il-metaboliżmu tal-enerġija renali f'ambjenti kliniċi, għalkemm huma meħtieġa aktar studji biex jiċċaraw kif din ir-riprogrammazzjoni tal-metaboliżmu tal-kliewi minn stabilizzaturi HIF taffettwa l-progressjoni ta 'dijabetikukliewimard.

L-introduzzjoni

L-inibituri tal-prolyl hydroxylase tal-fattur li jinduċibbli mill-ipoksja (HIF) iżidu l-produzzjoni endoġenika tal-eritropojetin u jservu bħala aġenti terapewtiċi ġodda kontra l-anemija fil-każ kronika.kliewimard. Iċ-ċelloli huma mogħnija b'mekkaniżmu difensiv kontra l-ipoksja, u HIF huwa regolatur ewlieni ta 'din id-difiża. Il-kliewi huma fiżjoloġikament esposti għall-ipoksja, u l-ipoksja kronika hija rikonoxxuta bħala mogħdija komuni finali li twassal għal mard tal-kliewi fl-aħħar stadju. Meta wieħed iqis li l-HIF jinduċi l-espressjoni ta’ diversi ġeni relatati mar-risponsi tal-ipoksja, l-istabbilizzaturi HIF jista’ jkollhom effetti plejotropiċi fuq il-progressjoni ta’kliewimardkif ukoll titjib fl-anemija fil kronikakliewimard. Interessanti, HIF jinduċi l-espressjoni ta 'ġeni glycolytic u pyruvate dehydrogenase kinase, li jinibixxi pyruvate dehydrogenase milli juża pyruvate biex iħaddem iċ-ċiklu tal-aċidu trikarbossiliku mitokondrijali (TCA). għall-adattament taċ-ċelloli esposti għal ambjenti iposiċi. Madankollu, jibqa' skur kif ir-riprogrammazzjoni metabolika tat-tessut renali permezz ta' stabbilizzazzjoni HIF taffettwa l-patofiżjoloġija ta'kliewi mard. Il-mard tal-kliewi dijabetiku (DKD) huwa l-kawża ewlenija tal-mard tal-kliewi fl-aħħar stadju. Disturbi metaboliċi sistemiċi bħal ipergliċemija u dislipidemija jikkawżaw alterazzjonijiet fil-metaboliżmu tal-kliewi, li jwasslu għal disfunzjoni renali inkluż DKD. Studji preċedenti wrew żieda fil-fluss metaboliku u akkumulazzjoni ta 'glukożju u metaboliti taċ-ċiklu TCA fit-tessut kortikali renali dijabetiku, li jistgħu jkunu relatati ma' disfunzjoni mitokondrijali u progressjoni DKD. Aħna ipoteżijna li stabilizzaturi HIF jistgħu jreġġgħu lura l-alterazzjonijiet tal-metaboliżmu fit-tessut kortikali tal-kliewi dijabetiċi, meta wieħed iqis li HIF, bħala rispons adattiv għall-ipoksja, inaqqas il-fluss metaboliku fiċ-ċelloli biex jirreprimi l-konsum tal-ossiġnu. Għalhekk, bl-użu ta 'analiżi tat-traskriptome u tal-metaboloma, wettaqna studju ta' prova tal-kunċett biex nifhmu b'mod komprensiv kif enarodustat (JTZ-951), stabilizzatur orali HIF, jaffettwa alterazzjonijiet tal-metaboliżmu renali li jseħħu fl-istadji bikrija ta 'DKD.

RIŻULTATI: Enarodustat jinduċi riprogrammazzjoni metabolika miċ-ċiklu TCA għal glikolisi fiċ-ċelloli tat-tubuli prossimali tal-kliewi

Peress li l-kortiċi renali huwa magħmul prinċipalment minn tubuli prossimali, l-ewwel eżaminajna l-effetti ta 'enarodustat fuq il-fluss metaboliku taċ-ċelluli tat-tubuli prossimali renali in vitro. L-ewwel, Mito Stress Test (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) u Glycolytic Rate Assay (Agilent) saru f'ċelluli kkultivati ​​HK -2, linja taċ-ċelluli epiteljali tat-tubuli prossimali tal-bniedem (Figura 1a). Enarodustat naqqas b'mod sinifikanti r-respirazzjoni mitokondrijali (ċiklu TCA) u żied il-glikolisi bażali, li jindika riprogrammazzjoni metabolika miċ-ċiklu TCA għal glikolisi (Figura 1; Figura Supplimentari S1). Aħna wettaqna wkoll esperiment bl-użu ta 'RNA ta' interferenza żgħir (siRNA) għal HIF -1 (Figura 2; Figura Supplimentari S2). HIF-1 knockdown permezz ta' siRNA biddel alterazzjonijiet metaboliċi (respirazzjoni bażika, respirazzjoni massima, kapaċità respiratorja żejda, u produzzjoni ta' adenosine triphosphate [ATP]) indotti minn enarodustat, li wera li r-riprogrammar metaboliku kien prinċipalment permezz ta' HIF-1 stabbilizzazzjoni (Figura 2; Figura Supplimentari S2). L-attività tal-pyruvate dehydrogenase, fattur importanti għaċ-ċelloli biex jużaw il-pyruvate biex ialimentaw iċ-ċiklu tat-TCA, tnaqqset ukoll b'enarodustat (Figura 2f), li kienet kompatibbli mal-osservazzjonijiet ippubblikati qabel.

Dejta ta' sfond ta' firien dijabetiċi kkaġunati minn streptozotocin

Mir-riżultati ta 'esperimenti in vitro, aħna ipoteżijna li stabilizzaturi HIF jistgħu itaffu l-alterazzjonijiet tal-metaboliżmu fit-tessut kortikali renali dijabetiku permezz ta' riprogrammazzjoni metabolika miċ-ċiklu TCA għal glikolisi. L-ewwel għażilna firien dijabetiċi indotti minn streptozotocin (STZ) bħala l-mudell għall-esperiment tal-prova tal-kunċett biex tittestja l-ipoteżi msemmija hawn fuq. F'dan il-mudell, id-dijabete hija indotta malajr, li tippermettilna nosservaw l-effetti netti tad-dijabete u stabilizzaturi HIF fuq il-metaboliżmu tal-enerġija fit-tessut renali f'perjodu qasir ta 'żmien. Il-protokoll ta 'studju u d-dejta bażika minn esperimenti fil-firien dijabetiċi indotti minn STZ huma murija fil-Figura 3a. Qassamna l-firien fi gruppi 3: grupp A (fart), grupp B (DKD), u grupp C (DKD þ enarodustat). Il-glukożju fil-plażma tad-demm, l-emoglobina glikosilata HbA1c, it-trigliċeridi, u l-livelli tal-kolesterol totali f'jum 14 żdiedu b'mod sinifikanti fi gruppi dijabetiċi meta mqabbla mal-grupp A, filwaqt li ma kien hemm l-ebda differenzi sinifikanti bejn il-gruppi B u C (Figura 3d-g). Għalkemm il-livelli tal-krejatinina fil-plażma ma kinux differenti bejn il-gruppi, l-eskrezzjoni tal-albumina fl-awrina żdiedet b'mod sinifikanti u l-glomerulomegalija kienet notevoli fil-grupp B meta mqabbla mal-grupp A, u enarodustat kellu t-tendenza li jreġġa' lura dawn il-bidliet (Figura 4). Il-livelli tan-nitroġenu tal-urea fid-demm kienu ogħla fil-gruppi dijabetiċi, li jirriflettu deidrazzjoni minħabba d-dijabete. Fil-qosor, il-kliewi tal-firien ittrattati bl-STZ fl-istudju tagħna jirrappreżentaw l-istadji bikrija tad-DKD. Analiżi tat-traskriptome u tal-metaboloma saru bl-użu tat-tessut kortikali renali ta' dawn il-firien.

Analiżi tat-traskriptome tat-tessut kortikali tal-kliewi

Ir-riżultati tal-analiżi tat-traskriptome tat-tessut kortikali tal-kliewi huma murija fil-Figuri 5 u 6. L-analiżi tal-komponenti prinċipali u l-analiżi ta 'raggruppament ġerarkiku indikaw li l-gruppi A, B, u C ġew separati fi gruppi differenti, rispettivament (Figura 5a u b). Ġeni espressi b'mod differenzjali ġew magħżula minn │log2 fold-change (FC) │ Akbar minn jew ugwali għal 0.5 u valur Q <0.05. l-ontoloġija="" tal-ġeni="" u="" l-analiżi="" tal-mogħdijiet="" kanoniċi="" wrew="" li="" l-ġeni="" relatati="" mal-metaboliżmu="" tal-aċidu="" xaħmi="" kienu="" regolati="" 'l="" fuq="" fil-grupp="" b="" meta="" mqabbla="" mal-grupp="" a.="" b'kuntrast,="" il-ġeni="" relatati="" mal-metaboliżmu="" tal-glukożju="" u="" r-rispons="" tal-ipoksja="" inkluż="" in-netwerk="" hif-1="" kienu="" regolati="" 'l="" fuq="" fil-grupp="" c="" meta="" mqabbla="" mal-grupp="" b="" (figura="" 5c="" u="" d).="" aħna="" wettaqna="" wkoll="" analiżi="" tal-arrikkiment="" tas-sett="" tal-ġeni="" (gsea)="" bl-użu="" tad-dejta="" traskrittomika="" (figura="" 6,="" tabelli="" 1="" u="" 2).="" settijiet="" ta="" 'ġeni="" ta'="" metaboliżmu="" ta="" 'aċidu="" xaħmi="" u="" amino-aċidi="" kienu="" regolati="" 'l="" fuq="" fil-grupp="" b="" meta="" mqabbla="" mal-grupp="" a="" (figura="" 6).="" b'kuntrast,="" dawn="" is-settijiet="" tal-ġeni="" kienu="" regolati="" 'l="" isfel,="" u="" s-settijiet="" tal-ġeni="" tal-metaboliżmu="" tal-glukożju="" kienu="" regolati="" 'l="" fuq="" fil-grupp="" ċ="" meta="" mqabbla="" mal-grupp="" b,="" li="" juri="" li="" l-enarodustat="" biddel="" alterazzjonijiet="" tal-metaboliżmu="" indotti="" mid-dijabete="" (figura="" 6).="" barra="" minn="" hekk,="" settijiet="" ta="" 'ġeni="" taċ-ċiklu="" tca="" kienu="" regolati="" 'l="" isfel="" fil-grupp="" c="" meta="" mqabbla="" mal-grupp="" b="" (tabella="" 2),="" li="" hija="" kompatibbli="" mal-kunċett="" ta'="" riprogrammazzjoni="" metabolika="" indotta="" minn="" enarodustat="" f'tubuli="" prossimali="" osservati="" fl-istudju="" in="" vitro="" tagħna.="" fil-qosor,="" enarodustat="" ikkontrobatta="" l-alterazzjonijiet="" tal-metaboliżmu="" tal-kliewi="" dijabetiċi="" minn="" perspettivi="">

Analiżi tal-metaboloma tat-tessut kortikali renali

Aħna kejlu l-konċentrazzjonijiet assoluti ta '116 metaboliti relatati mal-enerġija fit-tessut kortikali renali tal-firien (n =4, għal kull grupp) magħżula b'mod każwali minn kull grupp (Tabella Supplimentari S1; Figura Supplimentari S3). Twettqet analiżi parzjali diskriminanti tal-inqas kwadri (PLS-DA) biex tiġi vvalutata s-sinifikat tad-diskriminazzjoni tal-klassi (Figura 7). Aħna wettqu analiżi ta 'arrikkiment tas-sett ta' metaboliti (MSEA) billi użaw il-metaboliti b'punteġġ ta 'importanza varjabbli PLS-DA fil-projezzjoni (VIP) $ 1. Differenzi fil-metaboliżmu ta 'aċidi amminiċi, bħal glycine, serine, methionine, aspartate, glutamate, arginine, proline, u b-alanine bejn il-gruppi A u B ġew innutati. Differenzi fil-metaboliżmu tal-amino-aċidi ġew osservati wkoll bejn il-gruppi B u C. Barra minn hekk, il-proċessi tal-metaboliżmu tal-glukożju, bħal glycolysis u gluconeogenesis, wrew xejriet differenti bejn il-gruppi B u C (Figura 7).

Viżwalizzazzjoni tad-dejta tat-traskriptome u tal-metaboloma fuq il-mappa tal-mogħdija metabolika tal-enerġija....

Aħna viżwalizzajna dejta tat-traskriptome u tal-metaboloma għal fehim komprensiv tal-alterazzjonijiet tal-metaboliżmu tal-enerġija (Figura 8). Il-metaboliti taċ-ċiklu tal-glikolisi u t-TCA nstabu li ġew akkumulati fil-grupp B meta mqabbla mal-grupp A, li jista 'jkun dovut għall-influss eċċessiv tal-glukożju u r-regolazzjoni 'l fuq tal-metaboliżmu tal-aċidu xaħmi f'DKD. Il-konċentrazzjoni ta 'aċidu amminiku tnaqqset fil-grupp B meta mqabbla mal-grupp A, li tirrifletti l-upregulation tal-metaboliżmu ta' l-aċidu amminiku (Figura 8a). B'kuntrast, l-akkumulazzjoni tal-metaboliti tal-glikolisi ġiet meħlusa minn enarodustat, minħabba l-fluss iffaċilitat tal-glikolisi. Enarodustat biddel ukoll il-bidliet indotti mid-dijabete fil-metaboliti taċ-ċiklu tat-TCA u l-aċidi amminiċi (Figura 8b). Barra minn hekk, enarodustat itaffu l-akkumulazzjoni ta 'glutathione disulfide (GSSG) fit-tessut renali dijabetiku u b'hekk wera proporzjon ogħla ta' glutathione/GSSG, li ssuġġerixxa li enarodustat ħeles l-istress ossidattiv fid-DKD (Figura 8a u b). It-tnaqqis fl-istress ossidattiv kien ikkonfermat mil-livelli tal-markatur tal-perossidazzjoni tal-lipidi malondialdehyde fit-tessut kortikali renali: enarodustat biddel l-akkumulazzjoni ta 'malondialdehyde fit-tessut kortikali renali dijabetiku (Figura Supplimentari S4). Fil-qosor, l-integrazzjoni tad-dejta tat-traskriptome u l-metaboloma wriet li enarodustat jikkontrobatta l-alterazzjonijiet tal-metaboliżmu tal-enerġija renali li jseħħu fl-istadji bikrija ta 'DKD.

Alterazzjonijiet simmetriċi tal-metaboliżmu (dijabete vs enarodustat) huma kkonfermati f'mudell alternattiv

Aħna wettaqna analiżi tat-traskriptome fi ġrieden dijabetiċi indotti mill-alloxan, mudell ieħor ta 'annimali tad-dijabete, biex nikkonfermaw is-sejbiet tagħna fil-mudell tal-firien. Protokolli ta 'studju u data ta' sfond għall-mudell tal-ġurdien huma murija fil-Figura 9. L-eskrezzjoni tal-albumina fl-awrina żdiedet b'mod sinifikanti fil-grupp B meta mqabbla mal-grupp A, li ġie mreġġa 'lura minn enarodustat (Figura 9d). Barra minn hekk, applikajna analiżi 3-dimensjonali komprensiva (Cocktails tal-Immaġini tal-Moħħ/Korp mhux Ostakolati, u Analiżi Kompjutazzjonali [CUBIC]–kliewi)16 biex nivviżwalizzaw il-glomeruli fil-kliewi. Il-glomerulomegalija kienet notevoli fil-grupp B meta mqabbla mal-grupp A, li ġiet imreġġa 'lura minn enarodustat (Figura 9e). L-analiżi tat-traskriptome tat-tessut renali fi ġrieden dijabetiċi indotti mill-alloxan uriet alterazzjonijiet tal-metaboliżmu simetriku (dijabete vs enarodustat) bl-istess mod bħal fil-mudell tal-far dijabetiku indott minn STZ (Figura 10): il-metaboliżmu tal-aċidu xaħmi kien regolat 'il fuq mid-dijabete, filwaqt li l-glukożju il-metaboliżmu kien irregolat b'enarodustat. Barra minn hekk, il-metaboliżmu ta 'amino-aċidi kien regolat 'il fuq mid-dijabete u regolat 'l isfel minn enarodustat. Għalhekk, enarodustat ikkontrobatta l-alterazzjonijiet tal-metaboliżmu tal-enerġija renali li seħħew fl-istadji bikrija ta 'DKD fil-mudell tal-ġurdien dijabetiku indott minn alloxan kif ukoll fil-mudell tal-far dijabetiku indott minn STZ.

DISKUSSJONI

F'dan l-istudju, wrejna li l-enarodustat (JTZ-951), stabilizzatur orali HIF, jikkontrobatta l-alterazzjonijiet tal-metaboliżmu tal-enerġija renali li jseħħu fl-istadji bikrija tad-DKD f'mudelli tad-dijabete tal-firien u tal-ġrieden. Analiżi tat-traskriptome u tal-metaboloma wrew alterazzjonijiet tal-metaboliżmu simmetriku fit-tessut renali (dijabete vs enarodustat): il-metaboliżmu tal-aċidu xaħmi u tal-amino-aċidi ġew regolati 'l fuq f'DKD, filwaqt li enarodustat irregola dawn il-mogħdijiet u addizzjonalment irregola l-metaboliżmu tal-glukożju (Figuri 5-10).

Ma ġiex iċċarat bis-sħiħ jekk l-istabbilizzazzjoni tal-HIF għandhiex effetti protettivi fuq il-patofiżjoloġija tad-DKD jew le. Studji preċedenti wrew li t-tessut renali dijabetiku huwa espost għal ipoksja17 u l-espressjoni HIF fit-tessut renali dijabetiku hija insuffiċjenti biex tirrispondi għall-kundizzjonijiet iposiċi tagħhom, li hija parzjalment ikkawżata minn stress ossidattiv. ħsara tubulointerstizjali f'DKD indotta minn STZ.19 Ir-riżultati tal-istudju fuq l-annimali indikaw ukoll li l-istabbilizzazzjoni tal-HIF protetta kontra l-iżvilupp tal-obeżità, 20 tjiebet is-sensittività għall-insulina, 20 u tbaxxi l-livelli tal-kolesterol fis-serum.21 Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu l-effetti protettivi tal-istabbilizzazzjoni tal-HIF fl-iżvilupp ta ' DKD. B'kuntrast, l-istabbilizzazzjoni suprafiżjoloġika tal-HIF permezz tat-tħassir ta 'von Hippel-Lindau kienet irrappurtata li tinduċi fibrożi renali.22 Ir-rwol tal-istabbilizzazzjoni tal-HIF fil-progressjoni ta' DKD jista 'jkun dipendenti mill-kuntest minħabba l-effetti plejotropiċi ta' HIF u l-eżistenza ta 'fenotipi DKD varjati. L-għan ta 'dan l-istudju kien li jiċċara l-effetti netti tal-istabbilizzazzjoni tal-HIF fuq il-metaboliżmu tal-enerġija fil-kliewi dijabetiċi. Rapporti preċedenti indikaw li alterazzjonijiet tal-metaboliżmu tal-enerġija jseħħu f'DKD. Sas et al.10 wrew żieda fil-fluss metaboliku tal-enerġija u akkumulazzjoni ta 'metaboliti tal-glukożju fit-tessut kortikali renali dijabetiku, li jistgħu jkunu relatati ma' disfunzjoni mitokondrijali. You et al.23 irrappurtaw li fumarate, metabolit taċ-ċiklu TCA, kien akkumulat fit-tessut renali dijabetiku u kkontribwixxa direttament għall-progressjoni tad-DKD. Preċedentement urejna li l-metaboliti taċ-ċiklu tat-TCA akkumulaw fit-tessut renali dijabetiku, li kien imreġġa 'lura permezz ta' inibizzjoni tal-kotransporter 2 tas-sodju-glukożju jew restrizzjoni tal-kaloriji. kienu regolati 'l fuq f'pazjenti dijabetiċi tat-tip 1 mingħajr DKD meta mqabbla ma' pazjenti b'DKD. L-attivazzjoni ta’ PKM2 biddel l-akkumulazzjoni tal-metaboliti tal-glikolisi u rrestawrat il-funzjoni mitokondrijali, parzjalment billi żiedet il-fluss glikolitiku.24,25 Dawn ir-rapporti preċedenti jissuġġerixxu li l-akkumulazzjoni tal-glikolisi u l-metaboliti taċ-ċiklu tat-TCA jistgħu jaffettwaw il-progressjoni tad-DKD, li tista’ tittaffa permezz ta’ glikolisi ffaċilitata inkluż PKM2 attivazzjoni. Fl-istudju tagħna, l-istabbilizzazzjoni tal-HIF minn enarodustat reġġa' lura l-alterazzjonijiet tal-metaboliżmu tal-enerġija u ttaffi l-akkumulazzjoni tal-glikolisi u l-metaboliti taċ-ċiklu tat-TCA fit-tessut kortikali renali dijabetiku (Figura 8). L-espressjoni ta 'enzimi glikolitiċi inkluż PKM2 kienet ukoll regolata 'l fuq minn enarodustat (Figura Supplimentari S4B). Barra minn hekk, enarodustat itaffu l-akkumulazzjoni ta 'GSSG u żied il-proporzjon glutathione/GSSG, li jissuġġerixxi li enarodustat ħeles l-istress ossidattiv f'DKD (Figura 8). Dan it-tnaqqis indott minn enarodustat fl-istress ossidattiv kien ikkonfermat ukoll minn bidliet fil-livelli ta 'malondialdehyde fit-tessut kortikali renali (Figura Supplimentari S4A). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-istabbilizzazzjoni tal-HIF għandu jkollha rwoli protettivi fuq il-patofiżjoloġija tad-DKD mill-inqas minn perspettivi metaboliċi. Huwa ċert li ma nistgħux neżaminaw jekk ir-riprogrammar metaboliku mill-istabbilizzazzjoni HIF għandux effetti diretti fuq il-progressjoni tad-DKD, minħabba li jista 'jkun impossibbli li wieħed jagħraf l-effetti netti ta' alterazzjonijiet tal-metaboliżmu fuq ir-riżultat renali minħabba r-rwol plejotropiku ta 'HIF. Madankollu, fl-istudju tagħna, eskrezzjoni ħafifa ta 'l-albumina urinarja u anormalitajiet patoloġiċi renali (glomerulomegalija u tħaxxin tal-membrana tal-kantina glomerulari) indotti mid-dijabete ġew mitigati minn enarodustat, f'assoċjazzjoni man-normalizzazzjoni tal-metaboliżmu tal-enerġija renali. Aħna estrajna l-ġeni li l-bidliet fl-espressjoni tagħhom ikkorrelataw mal-livelli tal-albumina urinarja (257 sondi; 232 ġene) mid-dejta tal-mikroarray fil-mudell tal-ġurdien dijabetiku indott minn alloxan u wettaqna analiżi tal-arrikkiment tal-mogħdija (Figura Supplimentari S5). Bħala riżultat, il-mogħdijiet relatati mal-membrana mitokondrijali u t-trasport tal-elettroni respiratorju huma upregulated assoċjati mal-livelli tal-albumina urinarja, li jindika li l-piż mitokondrijali huwa relatat mill-qrib mal-eskrezzjoni tal-albumina fl-awrina. Għalhekk, hemm possibbiltà li n-normalizzazzjoni metabolika tat-tessut renali dijabetiku minn stabilizzaturi HIF tista 'tnaqqas il-piż mitokondrijali u ttaffi l-progressjoni ta' DKD. Id-dejta tagħna tissuġġerixxi l-patofiżjoloġija tad-DKD minn perspettivi metaboliċi kif ġej: L-ipergliċemija toħloq domanda għall-enerġija għar-riassorbiment tal-glukożju fit-tubuli prossimali renali; għalhekk, iċ-ċiklu TCA fil-mitokondrija huwa attivat bil-forza biex jissodisfa d-domanda għall-enerġija fl-istadji bikrija ta 'DKD (irregolazzjoni 'l fuq tal-metaboliżmu ta' aċidu xaħmi u amino-aċidu). U stabilizzaturi HIF jistgħu jtaffu dan il-piż mitokondrijali mill-programmazzjoni mill-ġdid metabolika miċ-ċiklu TCA għall-glikolisi (regolazzjoni 'l isfel tal-metaboliżmu ta' aċidu xaħmi u amino-aċidu u regolazzjoni 'l fuq tal-glikolisi), li jista' jkollhom rwoli protettivi kontra l-progressjoni tad-DKD. Hemm bżonn ta 'aktar studji li jinkludu omics b'ċellula waħda biex jiċċaraw kif il-piż mitokondrijali fit-tessut renali jaffettwa direttament il-patofiżjoloġija tad-DKD. Mistoqsija oħra interessanti hija jekk l-istabbilizzaturi HIF jaffettwawx direttament l-assorbiment tal-glukosju fit-tubuli prossimali. Id-dejta in vitro tagħna wriet li l-produzzjoni ta 'ATP hija mnaqqsa b'mod sinifikanti minn enarodustat permezz ta' riprogrammazzjoni metabolika miċ-ċiklu TCA għall-glikolisi (Figuri 1 u 2). Meta wieħed iqis li l-ATP huwa meħtieġ għar-riassorbiment tal-glukosju mill-kotrasportatur tas-sodju-glukosju 2, l-ewwel ipotizzajna li r-riassorbiment tal-glukosju jista 'jkun inattivat minn enarodustat. Madankollu, il-livelli tal-glukożju fl-awrina ma kinux differenti b'mod sinifikanti bejn il-grupp B u l-grupp C fiż-żewġ mudelli tal-annimali (Figura Supplimentari S6). Probabbilment, it-tnaqqis fil-produzzjoni ta 'ATP minn enarodustat huwa ħafna aktar ħafif f'sitwazzjoni fiżjoloġika meta mqabbel mal-effett tiegħu in vitro; għalhekk, l-istabbilizzazzjoni tal-HIF ma taffettwax l-assorbiment tal-glukosju permezz tal-kotrasportatur tas-sodju-glukosju 2, għall-inqas fl-esperimenti tagħna fuq l-annimali. L-istudju tagħna kellu 2 limitazzjonijiet. L-ewwel, użajna firien dijabetiċi STZinduced u ġrieden dijabetiċi indotti minn alloxan bħala mudelli DKD fi stadju bikri u osservajna l-effetti għal żmien qasir ta 'kundizzjonijiet dijabetiċi. Madankollu, fl-ambjent kliniku, stabilizzaturi HIF jiġu amministrati lil pazjenti b'anemija fi stadju tard DKD. Jinħtieġu aktar studji biex jifhmu l-effett tal-istabbilizzazzjoni tal-HIF fuq alterazzjonijiet tal-metaboliżmu renali f'DKD fi stadju tard. It-tieni, l-istudju ma kellux biżżejjed qawwa statistika fir-rigward tat-tixrid tal-konċentrazzjonijiet tal-metaboliti fid-dejta tal-metaboloma, filwaqt li d-dejta tat-traskriptome kellha qawwa statistika kbira biżżejjed biex tiċċara l-istampa kollha tal-metaboliżmu tal-enerġija. Minħabba li mhux ħafna metaboliti wrew differenza sinifikanti bejn il-gruppi, għamilna PLS-DA u għażilna l-metaboliti b'punteġġ VIP PLS-DA akbar minn jew ugwali għal 1 għall-MSEA. Għalkemm huwa diffiċli li tiċċekkja bidla metabolika bl-użu tad-dejta tal-metabolomika waħedha, ir-riżultati tal-analiżi tal-metaboloma kienu kompatibbli mad-dejta traskrittomika (Figuri 7 u 8), li pprovdew appoġġ addizzjonali għall-effetti osservati tal-alterazzjonijiet tat-traskriptome fuq il-metaboliżmu tal-enerġija renali. Bħala konklużjoni, enarodustat (JTZ-951), stabilizzatur HIF orali, jikkontrobatta l-alterazzjonijiet tal-metaboliżmu tal-enerġija renali fl-istadji bikrija ta 'DKD. L-istudju tagħna jissuġġerixxi li l-istabbilizzazzjoni tal-HIF tista 'sservi bħala intervent potenzjali li jimmira l-metaboliżmu tal-enerġija renali mhux regolat fid-DKD.

METODI

Mito Stress Test u Assaġġ tar-Rata Glycolytic

Iċ-ċelluli HK-2 ġew miżrugħa fuq 96-mikroplate bir-reqqa f'densità ta' 1 * 10⁴ċelluli/bir. L-għada, il-fluss metaboliku tkejjel f'ħin reali minn Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) bl-użu ta' Mito Stress Test Kit (103015-100; Agilent) jew Glycolytic Rate Assay Kit (103344- 100; Agilent). Konċentrazzjonijiet ta 'glukożju, piruvat, u glutamina fil-midja tal-kultura kienu 10 mmol/l, 1 mmol/l, u 2 mmol/l, rispettivament.

trasfezzjoni siRNA

HIF-1 knockdown tmexxiet minn Stealth RNAi għall-bniedem HIF1A (HSS104774 [#1] u HSS104775 [#2]; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Stealth RNAi siRNA Negative Control Med GC Duplex #2 (12935112; Thermo Fisher Scientific) intuża bħala l-kontroll negattiv.

Western blotting

L-antikorpi primarji użati għat-tbajja’ kienu antikorp HIF-1 kontra l-bniedem (poliklonali tal-fenek, 1:500; Novus Biologicals, Littleton, CO) u antikorp ta’ l-aktina kontra l-bniedem (poliklonali tal-fenek, 1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Antikorp sekondarju kien l-antikorp IgG tal-mogħoż kontra l-fenek konjugat mal-perossidażi taż-żwiemel (170-6515, 1:5000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Esperimenti fuq l-annimali

Crl: firien CD (Sprague Dawley) u ġrieden Crl: CD1 (Istitut tar-Riċerka dwar il-Kanċer) inkisbu minn Charles River Laboratories Japan Inc. (Yokohama, Ġappun). L-esperimenti kollha ġew approvati mill-Bord ta' Reviżjoni Istituzzjonali tal-Università ta' Tokyo (numru ta' approvazzjoni P17-110). Il-proċeduri kollha tal-annimali twettqu skont il-linji gwida tal-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa (Gwida għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Laboratorju). Il-protokolli tal-istudju huma murija fil-Figuri 3 u 9.

Analiżi tat-traskriptome

L-RNA totali mit-tessut kortikali renali ġie iżolat bl-użu ta' GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (RTN7{{10}}; Sigma-Aldrich). L-RNA totali (100 ng) ġie ttikkettjat bl-użu ta' Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent) u mbagħad ibridizzat għal SurePrint G3 Rat GE v2 8x60K Microarray (għall-far; Agilent) u SurePrint G3 Mouse GE v{{7 }}x60K Microarray (għall-maws), rispettivament. L-esperimenti kollha tal-mikroarray saru minn DNA Chip Research Inc. (Tokyo, Ġappun). Id-dejta mhux ipproċessata ġiet ipproċessata bil-pakkett R limma f'Bioconductor (http://www.bioconductor.org/) biex twettaq korrezzjoni tal-isfond u normalizzazzjoni tad-dejta bl-użu tal-metodu ta 'normalizzazzjoni ta' kwantili. L-effetti tal-lott tneħħew minn ComBat (Biokonduttur) fl-esperiment tal-far. Ġeni espressi b'mod differenzjali ġew determinati minn│log2 FC│ Akbar minn jew ugwali għal 0.5 u valur Q < 0.05.="" l-ontoloġija="" tal-ġeni="" u="" l-analiżi="" tal-mogħdijiet="" kanoniċi="" twettqu="" bl-użu="" tal-magna="" ta’="" korrelazzjoni="" basespace="" (illumina,="" san="" diego,="" ca).="" id-dejta="" tal-microarray="" ġiet="" iddepożitata="" fiċ-ċentru="" nazzjonali="" għall-informazzjoni="" dwar="" il-bijoteknoloġija="" gene="" expression="" omnibus="" bħala="" serje="" gse131221="" (far)="" u="" gse139317="">

Analiżi ta' Arrikkiment tas-Sett tal-Ġene

GSEA huwa metodu ta' komputazzjoni li jiddetermina jekk sett ta' ġeni definit a priori jurix differenzi statistikament sinifikanti u konkordanti bejn 2 stati bijoloġiċi. GSEA twettqet bl-użu ta' GSEA v.3.0 (Broad Institute, Cambridge, MA). Il-mogħdijiet b'rata ta' skoperta falza < 0.25="" tqiesu="">

Analiżi tal-metaboloma

Il-kejl tal-metaboloma sar minn Human Metabolome Technologies Inc. (Tsuruoka, il-Ġappun). Il-konċentrazzjonijiet tal-metaboliti ġew ikkalkulati billi nnormalizzaw l-erja tal-quċċata ta' kull metabolit fir-rigward tal-erja tal-istandard intern u bl-użu ta' kurvi standard, li nkisbu minn 3-kalibrazzjonijiet tal-punti. Ara wkoll il-Metodi Supplimentari.

Analiżi ta' arrikkiment tas-sett ta' metaboliti

L-analiżi tad-dejta tal-metabolomika saret bl-użu tal-pjattaforma integrata bbażata fuq il-web MetaboAnalyst 4.0. Twettaq PLS-DA u ġew ikkalkulati punteġġi VIP assoċjati. Il-metaboliti b'punteġġ VIP PLS-DA akbar minn jew ugwali għal 1 intużaw għall-MSEA.

Kwantifikazzjoni ta 'żoni glomerulari f'patoloġiji renali

Aħna ħadna b'mod każwali 3 stampi patoloġiċi mill-immaġni perjodika tat-tbajja 'l-aċidu-Schiff ta' kull kampjun u kejlna kull żona glomerulari rispettivament billi tuża Fiġi (distribuzzjoni ta 'ImageJ; Istituti Nazzjonali tas-Saħħa, Bethesda, MD).

KUBIKA-kliewi

Twettqet immaġini 3-dimensjonali komprensiva tal-glomeruli fit-tessut renali bl-użu ta' CUBIC skont id-dokumenti preċedenti tagħna. Fil-qosor, kliewi tal-ġurdien fissi ġew mgħaddsa f'CUBIC-L għal delipidazzjoni u mbagħad soġġetti għal tbajja immunofluworexxenti. Fl-aħħarnett, l-indiċi refrattiv kien imqabbel bit-tqegħid tal-kampjuni f'CUBIC-R plus . Immaġini komprensivi 3D-dimensjonali minn kliewi trasparenti ġew akkwistati b'mikroskopija tal-fluworexxenza tal-folja tad-dawl mibnija apposta (MVX10-LS; Olympus, Tokyo, Ġappun). L-antikorp primarju użat għat-tbajja kien l-antikorp anti-podocin (poliklonali tal-fenek, 1:100, P0372; Sigma-Aldrich). L-antikorp sekondarju kien Alexa Flour 555- ħmar konjugat kontra l-fenek IgG (1:100, A-31572; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).

Analiżi statistika

Għal paraguni multipli, {{0}}mod analiżi tal-varjanza segwita mit-testijiet ta' paraguni multipli ta' Tukey post hoc, jekk xieraq, ġiet applikata. L-analiżi statistiċi kollha saru bis-softwer GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, San Diego, CA). P < 0.05="" kien="" ikkunsidrat="" statistikament="" sinifikanti.="" id-dejta="" hija="" ppreżentata="" bħala="">

ŻVELAR

MN irċieva onorarja, miżati konsultattivi, jew finanzjament tar-riċerka minn KyowaHakko-Kirin, Akebia, Astellas, Chugai, GlaxoSmithKline, Japan Tobacco Inc. (JT), Torii, Tanabe-Mitsubishi, Daiichi-Sankyo, Takeda, Ono, Bayer, Boehringer Ingelheim , u Alexion. TT irċieva għotja għar-riċerka minn JT. Enarodustat (JTZ-951) ġie pprovdut minn JT, Tokyo, il-Ġappun. L-EAS u l-HRU huma koinventuri ta' privattivi proprjetà ta' RIKEN. Parti minn dan l-istudju saret b'kollaborazzjoni ma' Olympus Corporation u softwer tip appoġġjat minn Bitplane. L-awtur l-ieħor ma ddikjara l-ebda interessi f'kompetizzjoni.

RIKONOXXIMENTI

Aħna grati lejn Dr Shuhei Yao u Dr Shinji Tanaka għal diskussjonijiet siewja. Nirringrazzjaw ukoll lil Dr Tsuyoshi Inoue, Dr Satoru Fukuda, u s-Sinjura Kahoru Amitani għall-appoġġ tekniku tagħhom. Dan ix-xogħol sar parzjalment taħt l-appoġġ taċ-Ċentru tax-Xjenza tal-Isotopi, l-Università ta 'Tokjo. Dan ix-xogħol kien appoġġjat minn Grant-in-Aid for Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellow (JSPS KAKENHI grant 19J11928 to SH), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (JSPS KAKENHI grant 18H02824 to MN) ), Għotja fl-Għajnuna għar-Riċerka Xjentifika (C) (għotja JSPS KAKENHI 17K09688 lil TT), u Għotja fl-Għajnuna għar-Riċerka Xjentifika fuq Oqsma Innovattivi (għotja KAKENHI 26111003 lil MN).