L-Impatt tan-Nephrotoxin Ochratoxin A Fuq Ċelloli Renali Umani studjati minn Mudell Ġdid ta' Ko-Kultura Huwa Influwenzat Mill-Preżenza Ta' Fibroblasti

edmund.chen@wecistanche.com

Astratt:Il-kliewihija mhedda minn ħafna sustanzi potenzjalment tossiċi. Biex nistudjaw l-influwenza tan-nephrotoxin ochratoxin A (OTA) waqqafna mudell ta’ ko-kultura taċ-ċelluli li jikkonsisti minn bniedem.renali ċelluli tat-tubuli prossimali u fibroblasti. Studjajna l-effett tal-OTA fuq is-sopravivenza taċ-ċelluli, l-espressjoni ta 'ġeni u/jew proteini relatati mal-mewt taċ-ċelluli, matriċi extraċellulari u omeostażi tal-enerġija. In-nekrożi indotta mill-OTA ġiet imsaħħa fiż-żewġ tipi ta 'ċelluli fil-preżenza tat-tip ta' ċellula l-ieħor rispettiv, filwaqt li l-apoptosi indotta mill-OTA kienet indipendenti minnha. Fil-fibroblasti, iżda mhux fiċ-ċelloli tat-tubuli, kien viżibbli effett ta 'ko-kultura dwar l-espressjoni tal-proteina p21 relatata maċ-ċiklu taċ-ċelluli. L-espressjoni tal-vimentin tal-proteina li tindika t-transizzjoni epiteljali għal mesenkimali kienet indipendenti mill-kundizzjoni tal-kultura. L-espressjoni tal-lncRNA WISP1-AS1 indotta mill-OTA ġiet imsaħħa fil-kokultura. L-espożizzjoni għall-OTA wasslet għal alterazzjonijiet fl-espressjoni tal-ġeni relatati mal-metaboliżmu tal-enerġija b'effett li jimmobilizza l-glukożju u espressjoni mnaqqsa ta 'proteini mitokondrijali. Flimkien nuru li r-reazzjoni taċ-ċelluli tista' tkun differenti fil-preżenza ta' ċelluli li naturalment huma fil-qrib, u b'hekk nippermettu cross-talk ċellulari. Għalhekk, biex tiġi evalwata t-tossiċità ta' sustanza, ikun ta' vantaġġ li jiġi kkunsidrat l-użu ta' kokulturi minflok monokulturi.

Kliem ewlieni:okratossina A; kultura taċ-ċelluli; metaboliżmu tal-enerġija; bilanċ apoptożi-nekrożi; mitokondrija; kliewi; renali

CISTANCHE SE TTEJJEB INSUFFIRIMENT TAL-KLIEI/RENALI

Introduzzjoni

Minħabba l-funzjoni escretorja tiegħu, il-kliewihija mhedda minn varjetà ta’ sustanzi ta’ ħsara bħal drogi jew kontaminanti ta’ l-ikel, bħal mikotossini li jwasslu għal akuta jew—saħansitra agħar—kronika;mard tal-kliewibi prevalenza ta' madwar 10 fil-mija [1,2]. Biex tifhem il-mekkaniżmi ta 'l-azzjoni nefrotossiċi huwa ta' għajnuna li jinstabu strateġiji biex itaffu dawn ix-xenarji detrimentali u saru ħafna studji biex isolvu l-mistoqsija dwar għaliex u kif.kliewihuma fil-periklu [3–5]. Biex tistudja l-influwenzi ta’ sustanza fuq organiżmu, ħafna drabi jkun diffiċli li tuża annimali sħaħ minħabba tħassib etiku u prerekwiżiti organizzattivi, għaljin u elaborati. Barra minn hekk, trasferiment ta 'għarfien għas-sitwazzjoni tal-bniedem huwa assoċjat ma' inċertezzi. Għalhekk, mudelli ta 'kultura taċ-ċelluli ġew stabbiliti u jintużaw b'mod wiesa', u għandhom il-vantaġġ li tip ta 'ċellula speċifiku u r-rispons tiegħu għal sustanza jew għal trattament jistgħu jiġu studjati taħt kundizzjonijiet ikkontrollati. Għalkemm saru bosta sejbiet importanti bl-użu ta 'dan l-approċċ, xi żvantaġġi huma inerenti: ċelloli ta' linja taċ-ċelluli ħafna drabi ġew immortalizzati permezz ta 'mutaġenesi jew metodi oħra—xi kultant drastiċi—[6]. Dan jippermetti tqandil faċli u użu fit-tul iżda bil-periklu li r-riżultati misjuba f'sistema mudell speċifika jistgħu ma jkunux trasferibbli għas-sitwazzjoni fl-organu jew organiżmu kollu. Biex jingħelbu dan l-iżvantaġġ, minflok linji taċ-ċelluli immortalizzati, jistgħu jintużaw ċelloli primarji, iżda l-ġenerazzjoni ta 'ċelloli primarji ħafna drabi hija diffiċli ħafna u teħtieġ ħiliet tekniċi avvanzati. Barra minn hekk, iċ-ċelloli primarji ħafna drabi ma jgħixux għal perjodu twil ta 'żmien u jeħtieġu kundizzjonijiet speċjali ta' kultura individwali. Iżda ċ-ċelloli primarji huma pass eqreb lejn il-kundizzjonijiet naturali u għall-inqas kultant irriżulta li huma aktar sensittivi għal, eż., stimuli tossiċi bħalma huma l-linji taċ-ċelluli [7], li jfisser li l-linji taċ-ċelluli jistgħu jkunu aktar robusti. Żvantaġġ ieħor huwa l-fatt li ċ-ċelloli ħafna drabi jinżammu f'monokultura, jiġifieri, mingħajr l-influwenzi ta 'tipi oħra ta' ċelluli, li fl-organu tad-dar tagħhom normalment ikunu qrib. Għalhekk, jista 'jkun pass lejn sitwazzjoni aktar realistika li tistudja r-rispons ta' tip ta 'ċellula għal sustanza jew trattament fil-preżenza ta' dawk iċ-ċelloli, li huma fl-organu nattiv fil-viċin.

Ġolkliewi, Iċ-ċelloli tat-tubuli prossimali huma mdawra b'fifibroblasts u tista' tiġi preżunta influwenza—probabbilment reċiproka. Dan huwa wkoll il-każ fiħsara lill-kliewixenarji li fil-biċċa l-kbira tal-każijiet iwasslu għal infjammazzjoni tubulo-interstizjali u fibrożi [8,9], u huma deċiżivi għat-tnaqqis ta’kliewifunzjoni. Minħabba l-kapaċitajiet tat-trasport u enżimatiċi tagħhom,renaliċelluli tat-tubuli prossimali huma fil-periklu minn varjetà ta' sustanzi tossiċi potenzjali bħal, eż., drogi jew il-fdalijiet tagħhom jew mikotossini. Rwol wieħed tal-fibroblasts tal-madwar huwa li jforni l-matriċi extraċellulari permezz ta 'rilaxx ta' kollaġeni u komponenti oħra tal-matriċi u għalhekk li jipparteċipaw fl-integrità tat-tessut [10]. Iżda huma wkoll—flimkien maċ-ċelluli epiteljali—involuti fi proċessi infjammatorji jew fi fibrotiċi.mard tal-kliewi[11] bir-riskju li tiżviluppainsuffiċjenza renali. 

Mikotossina studjata b'mod intensiv b'rilevanza għas-saħħa tal-bniedem hija ochratoxin A (OTA) [12,13]. Jista 'jinstab f'varjetà ta' oġġetti tal-ikel [12,14] u li jiġi evitat l-espożizzjoni u l-assorbiment tiegħu huwa kważi impossibbli [9,15]. Dan iwassal għall-osservazzjoni li l-OTA tiġi skoperta ta 'spiss fid-demm tal-bniedem f'konċentrazzjonijiet nanomolari baxxi [16]. F'annimali esposti, l-OTA twassal għalinsuffiċjenza tal-kliewiu bidliet fifibrotic [17,18]. L-espożizzjoni għall-OTA hija preżunta li hija involuta fil-bniedemmard tal-kliewi[19]. Fiċ-ċelluli tat-tubuli prossimali primarji umani, intwera effett tossiku ta 'OTA, li huwa wkoll osservabbli f'fifibroblasts primarji umani, għalkemm mhuwiex prominenti daqs fiċ-ċelloli tat-tubuli prossimali [7]. Il-mekkaniżmi wara l-azzjoni tossika tal-OTA għadhom mhux mifhuma kompletament u huma suġġetti għal ħafna studji li għadhom għaddejjin. Kemm iċ-ċelluli ġirien b'funzjonijiet differenti jinterferixxu u b'hekk jimmodulaw il-funzjoni taċ-ċelluli kważi mhux magħruf iżda huwa mistenni. Fi studju preċedenti bl-użu ta 'mudell ta' ko-kultura li jikkonsisti f'farkliewitubuli prossimali u ċelloli tal-fifibroblast, irriżulta li sseħħ tip ta 'crosstalk bejn iż-żewġ tipi ta' ċelluli, li wassal għall-osservazzjoni li l-effetti ta 'OTA bħala transizzjoni epiteljali għal mesenkimali (EMT) seħħew biss taħt kundizzjonijiet ta' ko-kultura [20]. Konklużjoni oħra li tista’ tinġibed minn dak l-istudju u oħrajn kienet li ċ-ċelloli tal-firien huma aktar robusti rigward it-tolleranza għall-OTA meta mqabbla maċ-ċelluli tat-tubuli prossimali tal-bniedem [7,20] u għalhekk hija meħtieġa sistema mudell ibbażata fuq ċelloli umani biex tevalwa aktar mill-qrib is-sitwazzjoni umana u ir-riskju ta' espożizzjoni għall-OTA.

Għalhekk, fl-istudju preżenti, nistabbilixxu mudell avvanzat ta’ ko-kultura taċ-ċelluli li jikkonsisti f’ċelluli tat-tubuli prossimali tal-bniedem (ċelluli HK2) u fifibroblasts umani (ċelluli CCD-1092SK) biex nistudjaw l-effetti tal-OTA fuq is-sopravivenza taċ-ċelluli (apoptożi). , nekrożi) u espressjoni ta 'xi ġeni magħżula b'mod eżemplari relatati maċ-ċiklu taċ-ċelluli, mewt taċ-ċelluli, matriċi extraċellulari, u metaboliżmu. Simili għal studji preċedenti li jużaw ċelluli tal-firien [20], iċ-ċelluli tat-tubuli prossimali umani tqiegħdu fuq apparati tal-filtri u l-filtri tpoġġew fuq saff ta’ fibroblasti miżrugħa fuq il-qiegħ ta’ dixx Petri sabiex in-naħa bażolaterali taċ-ċelloli epiteljali tħares lejn. il-fibroblasts, li jippermettu tip ta 'konversazzjoni bejn iż-żewġ tipi ta' ċelluli.

Riżultati

Proteina, Lactate Dehydrogenase Rilaxx u Caspase-3 AttivitàBiex tikseb l-ewwel impressjoni dwar l-effetti possibbli tal-kundizzjonijiet tal-kultura nfisha kif ukoll dwar l-effetti fuq alterazzjonijiet indotti mill-OTA, qabbilna l-attività ta’ caspase-3 bħala miżura għall-apoptosi ta’ ċelloli mkabbra f’monokultura mal-attività ta’ ċelloli mkabbra f’ko -kultura inkubata bi jew mingħajr 100 nM OTA għal żewġ punti ta 'żmien, 24 u 48 siegħa. Barra minn hekk, ġie ddeterminat ir-rilaxx tal-lactate dehydrogenase (LDH) bħala miżura għan-nekrożi kif ukoll il-kontenut tal-proteini biex tagħti impressjoni ġenerali fuq l-istat taċ-ċellula. Għalhekk, ammonti ugwali ta 'ċelluli tqiegħdu jew fil-qiegħ tal-bir (fifibroblasts) jew fuq fifiltru (ċelluli tat-tubuli prossimali). Wara li laħqet il-konflwenza, il-fifiltri tqiegħdu fil-bjar li fihom kienu jinsabu l-fifibroblasts (ara l-astratt grafiku). Kif muri fil-Figura 1A, kważi l-ebda effett dipendenti fuq il-kundizzjoni tal-kultura fuq il-kontenut ta 'proteina ma jista' jiġi osservat fiż-żewġ tipi ta 'ċelluli wara 24 jew 48 siegħa (ara wkoll Fajl Supplimentari S1). Fil-fifibroblasts, l-espożizzjoni għall-OTA wasslet għal żieda żgħira fil-kontenut tal-proteini filwaqt li fiċ-ċelloli tat-tubuli l-OTA wasslet għal tnaqqis żgħir tal-kontenut tal-proteini li turi li l-OTA jista 'jkollha effett negattiv fuq iċ-ċelloli tat-tubuli. Dawn l-effetti kienu kważi indipendenti mill-kundizzjoni tal-kultura fiż-żewġ tipi ta 'ċelluli

Figura 1. Effetti ta' ochratoxin A (OTA) u/jew kundizzjonijiet ta' kultura fuq il-kontenut ta' proteina (A), attività ta' caspase-3 (B), u rilaxx ta' lactate dehydrogensase (LDH) (C). Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​jew f'mono- jew f'ko-kultura u esposti għal 100 nM OTA għal 24 jew 48 siegħa. N=3–6, n=14–18 (proteina, LDH) jew 8–9 (caspase-3). * jindika ap < 0.05="" għal="" ċelloli="" mhux="" esposti="" għall-ota="" (tqabbil="" l-effetti="" tal-ota,="" resp.="" in-naħa="" tax-xellug)="" jew="" għal="" ċelloli="" f'mono-kultura="" (tqabbil="" tal-effetti="" tal-kultura,="" resp.="" in-naħa="" tal-lemin).="" biex="" tispjega="" aktar="" l-effett="" fuq="" il-kontenut="" tal-proteini,="" studjajna="" l-apoptożi="" u="" n-nekrożi.="" meta="" mqabbel="" mal-fifibroblasts,="" l-ota="" kellha="" effett="" ċar="" fuq="" l-apoptosi="" fiċ-ċelloli="" tat-tubuli="" wara="" espożizzjoni="" ta="" '24="" siegħa="" b'żieda="" ta'="" madwar="" 2.5-darbiet="" fl-attività="" (figura="" 1b).="" wara="" espożizzjoni="" ta'="" 48="" siegħa,="" iż-żieda="" kienet="" għadha="" osservata="" iżda="" mhux="" daqshekk="" distintiva="" daqs="" wara="" 24="" siegħa.="" madankollu,="" dawn="" iż-żidiet="" kienu="" kważi="" indipendenti="" mill-kundizzjonijiet="" tal-kultura="" ħlief="" li="" wara="" 48="" siegħa="" fil-preżenza="" ta="" 'fifibroblasts="" l-attività="" ta'="" caspase="" fiċ-ċelloli="" tat-tubuli="" kienet="" kemmxejn="" imnaqqsa,="" li="" jindika="" effett="" protettiv="" modest="" tal-ko-kultura.="" madankollu,="" effett="" protettiv="" tal-kokultura="" kien="" osservabbli="" għall-fifibroblasts,="" speċjalment="" fil-preżenza="" ta="" 'ota.="" fil-ko-kultura,="" ir-rilaxx="" ta="" 'ldh="" kien="" imsaħħaħ="" b'mod="" ċar="" f'fifibroblasts="" u="" ċelloli="" tat-tubuli="" meta="" mqabbel="" ma'="" kundizzjonijiet="" ta="" 'monokultura="" indipendenti="" mill-preżenza="" ta'="" ota="" (figura="" 1c).="" fiċ-ċelloli="" tat-tubuli,="" l-ota="" wasslet="" għal="" żieda="" ta="" 'ldh="" rilaxxata="" fil-midja="" speċjalment="" wara="" espożizzjoni="" ta'="" 48="" siegħa,="" li="" ma="" kinitx="" daqshekk="" pronunzjata="" fil-fibroblasti.="" meħuda="" flimkien,="" il-preżenza="" tat-tip="" ta="" 'ċelluli="" l-oħra="" rispettivi="" wasslet="" għal="" nekrożi="" msaħħa="" iżda="" għal="" inqas="" apoptożi="" sabiex="" il-kontenut="" ġenerali="" ta'="" proteina="" ma="" nbidelx="" b'mod="" notevoli.="" l-effetti="" ta="" 'ota="" fuq="" l-apoptożi="" u="" n-nekrożi="" kienu="" wkoll="" fil-biċċa="" l-kbira="" indipendenti="" mill-preżenza="" jew="" l-assenza="" tat-tip="" ta'="" ċellula="">

Western Blot u Espressjoni mRNA

CDKN1A/p21Iċ-ċiklu taċ-ċelluli intwera li kien influwenzat mill-OTA u seta' jintwera li l-proteina p21 li hija involuta fiċ-ċiklu taċ-ċelluli kienet regolata 'l fuq mill-OTA fiċ-ċelloli tat-tubuli [21]. Biex tinvestiga sa fejn il-proteina, kif ukoll l-espressjoni ta 'kodifikazzjoni mRNA għal p21, hija influwenzata mill-preżenza ta' fibroblasts, wettaqna Western blots u RT-PCR. Kif muri fil-Figuri 2A, B u 3, espożizzjoni ta '48 siegħa għal OTA 100 nM wasslet għal żieda fl-ammont ta' proteina p21 f'mono iżda wkoll f'kundizzjonijiet ta 'ko-kultura fiċ-ċelloli tat-tubuli. F'fibsoblasts taħt kundizzjonijiet ta' ko-kultura, l-OTA ma kellha l-ebda effett fuq l-espressjoni tal-proteina p21-għalkemm l-espressjoni tal-mRNA żdiedet b'OTA indipendenti mill-preżenza tat-tip taċ-ċellula l-oħra. Interessanti, taħt kundizzjonijiet ta 'ko-kultura, l-espożizzjoni OTA ma żiedetx aktar l-espressjoni tal-proteina p21. Fiċ-ċelloli tat-tubuli, l-espressjoni tal-RNA ma ġietx mibdula mill-preżenza ta 'fibroblasti iżda f'fibroblasti f'ko-kultura, l-espressjoni tal-pZlmRNA ġiet imsaħħa mhux biss f'OTA esposti iżda wkoll diġà f'ċelloli mhux esposti għal OTA (ara wkoll Fajl Supplimentari S1). Dan juri li l-p resenee tat-tip taċ-ċellula l-ieħor għandu influwenza fuq l-espressjoni tal-proteina p21, speċjalment fil-fibroblasti.

Cyclooxygenase 2 (COX2)Intwera li l-proteina cyclooxygenase 2 (COX2) kif ukoll il-livelli tal-mRNA jiżdiedu matulinsuffiċjenza tal-kliewi[22]. Kif muri fil-Figuri 2C, D u 3, fil-fifibroblasts biss l-espressjoni tal-proteini żdiedet bl-espożizzjoni OTA. Barra minn hekk, fil-preżenza ta 'ċelluli tat-tubuli, l-espressjoni tal-proteina COX2 ġiet imtejba f'ċelluli mhux ittrattati kif ukoll f'ċelluli esposti għall-OTA, li turi influwenza ċara taċ-ċelluli tat-tubuli. L-espressjoni tal-mRNA, madankollu, ma kinitx influwenzata mill-OTA u seħħ effett żgħir ħafna ta 'ko-kultura mill-espożizzjoni tal-OTA. B'kuntrast, fiċ-ċelloli tat-tubuli, l-mRNA u l-espressjoni tal-proteini ta 'COX2 kienet kompletament indipendenti mill-OTA jew il-preżenza ta' fifibroblasts. Dan juri li dwar iċ-ċelloli tat-tubuli COX2 jistgħu jinfluwenzaw il-fifibroblasts iżda l-fifibroblasts m'għandhom l-ebda influwenza fuq iċ-ċelloli tat-tubuli.

FibronectinInsuffiċjenza tal-kliewispiss ikun akkumpanjat minn fifibrożi. Matul il-fifibrosis, isseħħ akkumulazzjoni ta 'matriċi extraċellulari u osservazzjoni waħda minbarra l-oħra hija żieda fl-ammont ta' proteina fifibronectin [23]. Għalhekk, l-alterazzjoni dipendenti fuq l-OTA ta 'l-mRNA ta' fibronectincoding u l-espressjoni tal-proteina ġiet determinata f'kundizzjonijiet ta 'mono- jew ko-kultura. Kif muri fil-Figuri 3 u 4A, B, espożizzjoni ta '48 siegħa ta' ċelluli tat-tubuli għal 100 nM OTA wassal għal tnaqqis ta 'fifibronectin intraċellulari kemm f'mono-u ko-kultura. L-effett OTA kien aktar baxx fil-kokultura. Barra minn hekk, l-ammont ta 'kodifikazzjoni ta' mRNA għal fifibronectin tnaqqas bl-espożizzjoni OTA indipendentement mill-kundizzjonijiet tal-kultura u l-preżenza ta 'fifibroblasts wasslet għal espressjoni ta' mRNA aktar baxxa f'ċelloli ta 'kontroll u esposti għal OTA. B'kuntrast, fil-fifibroblasts l-espressjoni tal-fifibronectin kważi ma ġietx mibdula la mill-OTA u lanqas mill-kundizzjonijiet tal-kultura minħabba varjabbiltà kbira, speċjalment fil-Western blots. Tendenza lejn espressjoni indotta minn OTA tista' tkun viżibbli fil-monokultura.

VimentinVimentin hija proteina li l-abbundanza tagħha tiżdied meta sseħħ transizzjoni epiteljali għal mesenkimali (EMT) u l-iżvilupp tal-EMT jista’ jwassal għalinsuffiċjenza tal-kliewi[23]. Għalhekk, l-alterazzjoni dipendenti fuq l-OTA ta 'l-mRNA ta' vimentin u l-espressjoni tal-proteina ġiet determinata f'kundizzjonijiet ta 'mono- u ko-kultura. Kif muri fil-Figuri 3 u 4C, D, espożizzjoni ta '48 siegħa ta' ċelluli tat-tubuli għal OTA 100 nM wasslet għal abbundanza aktar baxxa ta 'proteina vimentin kemm taħt kundizzjonijiet ta' mono- u ko-kultura. Madankollu, fil-preżenza ta 'fifibroblasts l-espressjoni tal-proteina vimentin kienet indipendenti mill-kundizzjonijiet tal-kultura. L-espressjoni tal-kodifikazzjoni tal-mRNA għal vimentin kważi ma ġietx mibdula la mill-OTA u lanqas mill-kundizzjonijiet tal-kultura bl-eċċezzjoni li l-espożizzjoni tal-OTA fil-kokultura wriet żieda żgħira. Fil-fifibroblasts, l-espressjoni tal-proteina vimentin kienet kompletament indipendenti mill-espożizzjoni tal-OTA kif ukoll mill-preżenza taċ-ċelloli tat-tubuli. Barra minn hekk, l-espressjoni tal-mRNA li tikkodifika vimentin kważi ma nbidlitx

Espressjoni ta' Xi Ġeni MagħżulaBiex tkompli tittestja b'mod eżemplari sa fejn il-kundizzjonijiet tal-kultura jistgħu jaffettwaw ukoll l-espressjoni ta 'RNAs oħra, għażilna xi ġeni, li għandhom rwol fl-apoptożi-nekrożi, l-iżvilupp tal-kanċer, jew il-metaboliżmu tal-enerġija (ara wkoll Fajl Supplimentari S1).

WISP1-AS1huwa RNA twil mhux kodifikanti (lncRNA) indott mill-OTA li jaffettwa r-regolamentazzjoni tat-traskrizzjoni u għandu rwol fil-bilanċ apoptożi-nekrożi u probabbilment fl-iżvilupp tal-kanċer [24]. Kif jidher fil-Figura 5A, espożizzjoni ta '48 siegħa għal OTA 100 nM wasslet fiż-żewġ tipi ta' ċelluli għal żieda notevoli fl-espressjoni ta 'dak lncRNA. Mingħajr OTA, il-preżenza tat-tip taċ-ċellula l-ieħor rispettiv ma kellha kważi l-ebda influwenza fuq l-espressjoni. Madankollu, fil-preżenza ta 'OTA, l-espressjoni tagħha kienet ogħla fil-kokultura meta mqabbla mal-monokultura.

GDF15Il-fattur tad-divrenzjar tat-tkabbir 15 (GDF15) huwa membru tas-superfamilja tal-fattur tat-tkabbir li qed jittrasforma li tirrispondi għall-istress. Huwa diskuss bħala bijomarkatur ukoll għalmard tal-kliewijew bħala tbassir għas-sopravivenza takliewipazjenti trapjantati [25,26]. L-espressjoni tal-kodifikazzjoni tal-mRNA għal GDF15 ġiet imtejba fiż-żewġ tipi ta 'ċelluli wara espożizzjoni OTA kif muri fil-Figura 5B. Dan l-effett indott mill-OTA kien iffavorit fil-fifibroblasts meta ċ-ċelloli tat-tubuli kienu fil-viċinanza. Fiċ-ċelloli tat-tubuli, madankollu, l-espressjoni kienet indipendenti mill-preżenza ta 'fifibroblasts (Figura 5B).CDK2Kinase 2 dipendenti fuq iċ-ċiklin (CDK2) ġie identifikat permezz ta 'analiżi tan-netwerk ta' korrelazzjoni peżata bħala regolatur ewlieni tad-disregolazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli kkaġunat mill-OTA [21]. Fil-fifibroblasts fil-monokultura l-espressjoni tal-kodifikazzjoni tal-mRNA għal CDK2 ma nbidlitx mill-OTA. Barra minn hekk, il-preżenza ta 'ċelluli tubuli ma affettwatx l-espressjoni mRNA. Madankollu, fiċ-ċelloli tat-tubuli, l-OTA wasslet għal espressjoni kemmxejn imsaħħa biss fil-preżenza ta 'fifibroblasts (Figura 5C).

Glikoġenu u Proteini Relatati mal-Glukożju: PYGM, GYS1 u GLUT1 (SLC2A1)Il-kliewihuwa wkoll involut fl-omeostażi tal-glukożju u jista 'jipprovdi lill-ġisem bil-glukożju jew permezz tal-glukoneġenesi jew billi jimmobilizza l-ħażniet tal-glycogen [27]. Glycogen phosphorylase (PYGM) għandu rwol fid-dekompożizzjoni tal-ħażniet tal-glycogen, u b'hekk jimmobilizza l-glukożju [28]. Kif jidher fil-Figura 6A, espożizzjoni ta '48 siegħa għal OTA 100 nM wasslet għal żieda notevoli fl-espressjoni tal-mRNA li tikkodifika għal glycogen phosphorylase, speċjalment fiċ-ċelloli tat-tubuli. Madankollu, fiċ-ċelloli tat-tubuli din iż-żieda ma kinitx dipendenti fuq il-kundizzjoni tal-kultura filwaqt li fil-fifibroblasts l-espressjoni indotta mill-OTA kienet ogħla fil-preżenza ta 'ċelloli tat-tubuli meta mqabbla mal-kundizzjoni mingħajr ċelloli tat-tubuli, Glycogen synthase 1 (G^YSl) jikkatalizza r-reazzjoni opposta. u billi l-espressjoni tal-fosforilażi kienet regolata 'l fuq, l-espressjoni tas-syntażi kienet irregolata 'l isfel minn OTA fiċ-ċelloli tat-tubuli u f'fibroblasti f'ko-ctilture (Figura 6B). Dan jindika effett li jimmobilizza l-glukożju tal-OTA, Interessanti, l-espressjoni tal-mRNA tat-trasportatur tal-glukożju GLUTl (SLC2A1) kienet ukoll regolata mill-OTA (Figura 6C), li tissottolinja l-idea ta’ domanda mtejba għall-glukożju minħabba l-espożizzjoni tal-OTA forsi minħabba

Proteini Relatati mal-Mitokondrija: NDUFB10 u MRPS16

Hemm indikazzjonijiet li l-espożizzjoni OTA tista 'twassal għal tnaqqis tal-potenzjal mitokondrijali fikliewiċelluli [24] li juru li l-funzjoni mitokondrijali tista 'tiġi influwenzata mill-espożizzjoni tal-OTA, li tista' tkun influwenzata wkoll mill-preżenza ta 'fibroblasti. Għalhekk, rappreżentattivi ta' RNA oħra li jikkodifikaw għal proteini mitokondrijali, aħna nuru hawnhekk l-espressjoni tal-mRNAs li jikkodifikaw għal NDUFB10 u MRPS16. NDUFBt0 kodiċi għas-subunità mitokondrijali NADH:ubiquinone oxidoreductase B10, li hija parti mill-kumpless respiratorju mitokondrijali I u espressa ħafna fil-qalb ukliewi(Ġene NCBI. Disponibbli onlajn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4716 (aċċessat fis-17 ta' Marzu 2021)). Il-kodiċi tal-ġene MRPS16 għall-proteina ribosomali mitokondrijali S16, li għandha rwol fis-sintesi tal-proteini mitokondrijali. Kif muri fil-Figura 7, l-espożizzjoni ta '24 siegħa OTA wasslet fiż-żewġ tipi ta' ċelluli għal espressjoni mnaqqsa taż-żewġ mRNAs. Fiċ-ċelloli tat-tubuli, l-espressjoni mnaqqsa tal-ġene NDUFB10 ma kinitx influwenzata mill-preżenza ta 'fibroblasti, filwaqt li fil-fibroblasti it-tnaqqis indott mill-OTA ta' l-espressjoni NDUFB10 ġie salvat kemmxejn fil-preżenza ta 'ċelloli tat-tubuli (Figura 7A). Fiċ-ċelloli tat-tubuli, l-espressjoni diġà mnaqqsa tal-kodifikazzjoni tal-ġene għas-subunità ribosomali mitokondrijali mill-OTA kienet addizzjonalment aktar baxxa fil-preżenza ta 'fibroblasti, filwaqt li fil-fibroblasti l-preżenza ta' ċelloli tat-tubuli wasslet għal espressjoni kemmxejn ogħla ta 'MRPS16 mRNA (Figura 7B). Dan juri li l-funzjoni mitokondrijali tista 'tiġi affettwata mill-OTA iżda li l-effett OTA jista' addizzjonalment jiġi modifikat meta ż-żewġ tipi ta 'ċelluli jkunu qrib xulxin.

Diskussjoni

Il-kliewihija pperikolata minn varjetà ta 'sustanzi nefrotossiċi bir-riskju ta' akut jew chronitinsuffiċjenza tal-kliewi[1]. Għall-istudju tal-impatt ta 'sustanzi nefrotossiċi fuq tipi differenti ta' ċelluli u biex jitnaqqas l-immaniġġjar tal-annimali, il-kulturi taċ-ċelluli ġew applikati b'mod wiesa '. Dawn il-kulturi taċ-ċelluli għandhom il-vantaġġ addizzjonali li l-kundizzjonijiet sperimentali jistgħu jiġu kkontrollati u l-effetti speċifiċi ta’ sustanza investigati bl-użu ta’ tip ta’ ċellula definit. Minbarra dawn il-vantaġġi mhux ikkontestati, jibqgħu xi kunsiderazzjonijiet: pereżempju, fl-"organu tad-dar" tip ta’ ċellula waħda (eż., ċelluli tat-tubuli prossimali fil-kliewi) hija mdawra b'tipi oħra ta' ċelluli (eż. fibroblasti) b'interdipendenzi manifolb. Għalhekk, ir-reazzjoni għal sustanza osservata meta jintuża tip ta' ċellula waħda biss tista' ma tkunx l-istess bħal fil-preżenza taċ-ċelloli fil-qrib fit-tessut oriġinali. F'mudell li jikkonsisti f'żewġ tipi differenti ta 'ċelluli tal-kliewi tal-firien, intwera li teżisti cross-talk bejn iċ-ċelluli tat-tubuli u tal-fibroblasti, li jwassal għal reazzjonijiet li jidhru biss meta ż-żewġ tipi ta' ċelluli kienu qrib [20]. Madankollu, meta tqabbel ir-riżultati ta 'dik l-istitdy ma' sejbiet osservati bl-użu ta 'ċelluli tat-tubuli renali umani jirriżulta li ċ-ċelloli tal-firien ovvjament huma aktar robusti milli jgħidlek il-bniedem dwar ir-reazzjoni tagħhom għat-trattament b'nefrotossina kullimkien, ochrafoxin A (OTA) [7]. Għalhekk, huwa meħtieġ mudell ta 'ko-kultura li jikkonsisti f'ċelloli umani. Stabbilijna mudell bħal dan billi nużaw il-linja taċ-ċelluli tat-tubuli prossimali tal-bniedem HK2 u fibroblasti umani. Ċelloli HK2 imkabbra wete fuq inserzjonijiet ta 'filtri u miġjuba flimkien ma fibroblasts, imkabbra fuq il-qiegħ ta' 6-pjanċa bir-bir. Wara li rreġistraw parametri bażiċi bħala apoptożi u nekrożi, użajna dan il-mudell biex nakkwistaw dejta inizjali dwar l-effett ta 'ochratoxin A fuq l-espeesrion ta' xi proteini u RNAs relatati maċ-ċiklu taċ-ċelluli, EMT u metaboliżmu ċellulari.

Sopravivenza taċ-Ċelloli  Ibbażat fuq il-kontenut tal-proteini, deher li la l-OTA u lanqas il-kundizzjoni tal-kultura ma kellhom effett notevoli. Madankollu, ir-relazzjoni bejn l-apoptożi u n-nekrożi ġiet imċaqlaq lejn nekrożi fiż-żewġ tipi ta 'ċelluli meta ċ-ċelloli kienu kkultivati ​​flimkien. L-OTA huwa magħruf li jinduċi apoptożi fiċ-ċelloli tat-tubuli [29] u b'mod inqas estiż ukoll fil-fibroblasti [7]. Dan huwa rifless ukoll fir-riżultati preżenti. Interessanti, il-preżenza tat-tip ta 'ċelluli l-oħra rispettivi wasslet għal tnaqqis fir-rati ta' apoptożi fiż-żewġ tipi ta 'ċelluli iżda għal rilaxx mtejjeb ta' LDH. Din hija l-ewwel ħjiel li diġà l-preżenza ta’ tip ieħor ta’ ċellula tista’ tinfluwenza l-funzjoni ċellulari u li r-reazzjoni taċ-ċelloli għal sustanza tossika tista’ tkun differenti fil-kokultura meta mqabbla mal-monokultura.

Proteina u Espressjoni RNA Estendejna l-istudji tagħna bid-determinazzjoni tal-espressjoni tal-proteini u l-RNA ta 'xi proteini magħżula b'mod eżemplari u l-RNAs li jikkodifikaw għalihom. Peress li l-OTA intweriet li tinfluwenza ċ-ċiklu taċ-ċelluli [21,30], l-espressjoni ta 'CDKN1A/p21 ġiet studjata. Skont is-sejbiet minn Dubourg et.al [21], OTA wasslet għal espressjoni msaħħa mhux biss ta 'mRNA CDKN1A iżda wkoll ta' proteina CDKN1A/p21 fiċ-ċelloli tat-tubuli. F'dawn iċ-ċelloli, il-preżenza ta 'fibroblasti ma influwenzatx l-espressjoni ta' mRNA CDKN1A, filwaqt li fil-fibroblasti effett ċar ta 'ko-kultura kien viżibbli b'abbundanza mRNA msaħħa viżibbli biss f'ko-kultura. Madankollu, din iż-żieda fl-abbundanza tal-mRNA ma kinitx riflessa kompletament mill-espressjoni tal-proteini, li tissuġġerixxi aktar mekkaniżmi regolatorji. Jistgħu jiżdiedu studji taċ-ċiklu taċ-ċelluli biex tinkiseb aktar għarfien dwar l-impatt fuq iċ-ċiklu taċ-ċelluli. Kinase 2 dipendenti fuq iċ-ċiklin (CDK2) instab li għandu rwol fid-disregolazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli indotta mill-OTA [21]. Fiċ-ċelluli tat-tubuli, l-espressjoni tal-mRNA tagħha ġiet imsaħħa mill-OTA fil-ko-kultura filwaqt li l-fibroblasti ma kinux influwenzati minn ċelluli tat-tubuli. Flimkien, ir-riżultati jissuġġerixxu li ċ-ċiklu taċ-ċelluli fiċ-ċelloli tat-tubuli huwa influwenzat mill-preżenza ta 'fibroblasti.

Ġie osservat effett ieħor ta 'ko-kultura għall-espressjoni ta' COX2 fil-fibroblasti. Għall-fibroblasts il-preżenza taċ-ċelloli tat-tubuli wasslet għal espressjoni ta' proteina msaħħa b'mod ċar (simili għal riżultati osservati fiċ-ċelloli tal-firien [20]), li ma kinitx viżibbli għaċ-ċelloli tat-tubuli li ma wrew l-ebda dipendenza fuq il-kultura. Dan jindika li r-rwol tal-fibroblasti f'infjammatorjimard tal-kliewisetgħu ġew sottovalutati minn studji li użaw fifibroblasts f'monokultura. Il-vimentin tal-proteina tal-filament intermedju hija espressa b'mod kostituttiv f'fibroblasti u hija dejjem aktar espressa waqt transizzjoni epiteljali għal mesenchymal (EMT) fiċ-ċelloli epiteljali [10]. Għalkemm intwera li l-espożizzjoni fit-tul għall-OTA tista 'twassal għal espressjoni mtejba ta' kollaġen III jew fibronectin fiċ-ċelloli tat-tubuli [7], fl-istudju preżenti l-espressjoni tal-vimentin tal-proteina li tindika l-EMT fiċ-ċelloli tat-tubuli kienet saħansitra aktar baxxa wara espożizzjoni għall-OTA, indipendenti tal-kundizzjonijiet tal-kultura. Barra minn hekk, l-espressjoni ta 'mRNA u proteina fibronectin kienet pjuttost aktar baxxa u mhux imsaħħa. Barra minn hekk, fil-fibroblasts, l-ebda espressjoni mibdula ma kienet murija sabiex dawn is-sejbiet ma jargumentawx favur EMT indott minn OTA, kif muri minn oħrajn [31].

CISTANCHE SE TTEJB IL-FUNZJONI TAL-KLIEI/RENALI

Biex tkompli tittestja jekk il-kokultura tistax tinfluwenza r-risposta ċellulari għall-istress indott mill-OTA, iddeterminajna l-espressjoni ta 'xi RNAs magħżula b'mod eżemplari relatati ma' apoptożi-nekrożi, żvilupp tal-kanċer u metaboliżmu tal-enerġija. RNAs twal mhux kodifikanti għandhom rwol sinifikanti f'ħafna proċessi regolatorji ċellulari u d-derailing tagħhom, u wkoll fil-fibrożi renali jew kanċer [32]. WISP1-AS1 huwa RNA twil li ma jikkodifikax indott mill-OTA u espress fiċ-ċelloli tat-tumur tal-kliewi [24]. Sibna r-regolazzjoni 'l fuq tagħha mill-OTA fiż-żewġ tipi ta' ċelluli u l-kokultura tejbet ir-regolazzjoni 'l fuq. Dan jippermetti l-aggravament tal-effett tal-WISP1-AS1 fuq il-bilanċ apoptożi-nekrożi u probabbilment il-formazzjoni tat-tumur. Ir-rilaxx mtejjeb ta' LDH osservat fil-kokultura jista' għalhekk mill-inqas parzjalment jiġi spjegat mill-kontenut imtejjeb ta' WISP1-AS1, li ntwera li huwa meħtieġ għal nekrożi indotta mill-OTA [24].

WISP1-AS1kien ukoll issuspettat li għandu rwol fil-metaboliżmu inkluż mitochon dria [24]. Fiċ-ċelloli tal-epitelju gastriku, l-OTA intwera li tikkawża disfunzjoni mitokondrijali [33]. Għalkliewiċelluli, hemm riżultati kontroversjali dwar jekk l-espożizzjoni OTA għandhiex influwenza fuq il-potenzjal mitokondrijali jew le [21,24]. Potenzjal mitokondrijali mnaqqas jista 'jkun ir-riżultat ta' mitokondrija indebolita jew jista 'jipproċedi ħsara mitokondrijali. L-espressjoni mnaqqsa ta 'proteini mitokondrijali tista' twassal għal funzjoni indebolita riflessa jew segwita minn potenzjal mitokondrijali mibdul. Funzjoni mitokondrijali indebolita ġġiegħel liċ-ċellula tuża mogħdijiet alternattivi biex tiżgura l-provvista tal-enerġija. Il-provvista ta 'enerġija taħt kontribuzzjoni mitokondrijali mhux xierqa tista' tinżamm b'użu akbar ta 'glikolisi li jwassal għal produzzjoni msaħħa ta' lactate. Madankollu, fiċ-ċelloli HEK293, embrijun umankliewilinja taċ-ċelluli, instab li l-OTA wassal pjuttost għal tnaqqis tal-glikolisi u l-ammont imsaħħaħ ta 'lactate minħabba l-produzzjoni tal-lactate mill-glutamina kien dipendenti fuq l-espressjoni tal-lncRNA WISP1-AS1 [24]. B'kuntrast, fiċ-ċelloli epiteljali gastriċi, jista 'jintwera li l-espożizzjoni għall-OTA twassal għal riprogrammazzjoni tal-metaboliżmu tal-glukożju lejn glikolisi u attività taċ-ċiklu tal-aċidu trikarbossiku inqas [34]. Nistgħu nuru hawnhekk li (1) OTA twassal għal espressjoni mRNA mnaqqsa ta 'żewġ proteini mitokondrijali magħżula b'mod rappreżentattiv, li għandhom rwol fis-sintesi tal-proteini mitokondrijali (MRPS16) u l-produzzjoni tal-enerġija (NDUFB10) u (2) li l-enzimi li jimmaniġġjaw il-glikoġenu kienu regolati b'mod li l-glukożju msaħħaħ jista' jiġi mobilizzat (GYS1 'l isfel u PYGM 'il fuq). Barra minn hekk, kapaċità ta 'trasport GLUT1 ogħla tidher li hija indotta. Madankollu, dawn l-alterazzjonijiet indotti mill-OTA kienu kważi indipendenti mill-kundizzjonijiet tal-kultura.

Bħala konklużjoni, urejna li taħt kundizzjonijiet ta 'ko-kultura, ir-reazzjoni taċ-ċelloli tista' tkun differenti mir-reazzjonijiet osservati fil-mono-kultura, għalkemm mhux il-parametri kollha studjati hawn kienu dipendenti fuq il-kultura. Madankollu, abbażi tas-sejbiet ippreżentati hawn, l-użu tal-kokultura għandu jkun preferut jekk ikun possibbli, u b'hekk tiġi evitata l-possibbiltà li jiġu ssorveljati l-effetti li ma jseħħux meta jiġi studjat tip ta' ċellula waħda biss. Il-mistoqsija tibqa 'ta' kif iċ-ċelloli jikkomunikaw bejniethom. Studji f'mudell ta' ko-kultura tal-firien żvelaw mekkaniżmu dipendenti fuq COX2-[20] u fil-ġrieden, l-aċidu retinojku jidher li jipparteċipa fit-taħdit inkroċjat ċellulari ta'kliewiċelluli [35]. Barra minn hekk, il-mistoqsija tibqa ', jekk, għaliex u kif l-OTA tinterferixxi mal-metaboliżmu tal-enerġija ċellulari u r-rwol tal-mitokondrija fih.

Determinazzjoni ta' Attivitajiet ta' LDH u Caspase-3 u ta' Kontenut ta' ProteinaGħal-liżi, iċ-ċelloli ġew maħsula darbtejn f'buffer PBS kiesaħ bis-silġ, miġbura u lisati f'MOPSTriton buffer (20 mM 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid, pH 7.4, 0. 1 fil-mija Triton X100). Il-kontenut tal-proteini f'lisati taċ-ċelluli ġie ddeterminat bl-użu ta 'aċidu bicinchoninic [36,37]. L-attività tal-LDH fil-midja jew lisati taċ-ċelluli bħala miżura għan-nekrożi ġiet iddeterminata skont Bergmeyer [38] kif deskritt fid-dettall f'[20]. L-attività ta' caspase-3 bħala miżura għall-apoptożi ġiet iddeterminata bl-użu tas-sottostrat ta' caspase-3 floriġeniku (DEVD-AFC) kif deskritt f'[39]. Fil-qosor, 60 µL lisat taċ-ċelluli ġew inkubati b'65 µL buffer ta' reazzjoni (20 mmol/L piperazine-1,4-bis(2ethanesulfonic acid (PIPES), 4 mmol/L EDTA, 0.2 fil-mija {{26}) }[(3-cholaminopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfate (CHAPS), 10 mmol/L dithiotreitol (DTT), pH 7.4) li fih 42 µmol/L DEVD-AFC (Aspglu-val-asp{{{ 36}}amino-4-trifluoromethylcoumarin, end-concentration) f'37 ◦C. Il-fluworexxenza tal-prodott imnaqqas (AFC) kienet imkejla f'eċitazzjoni ta' 400 nm u emissjoni ta' 505 nm. L-AFC imnaqqsa ġiet kwantifikata permezz ta' kurva ta' kalibrazzjoni bl-użu ta' AFC magħruf konċentrazzjonijiet.

RT-PCR  L-iżolament ta 'aċidu ribonuklejku totali (RNA) sar bl-użu ta' reaġent Trizol (Life Technologies, Darmstadt, il-Ġermanja). Iċ-ċelloli ġew maħsula u wara lissaw b'reaġent Trizol u ttrasferiti f'tubu ta' reazzjoni. Wara ż-żieda tal-kloroform u ċ-ċentrifugazzjoni (12,000× g), il-fażi ta 'fuq ġiet miġbura u mħallta ma' isopropanol kiesaħ bis-silġ. Wara ċ-ċentrifugazzjoni (12,000× g) is-supernatant tneħħa u l-pellet maħsul darbtejn b'75 fil-mija etanol u finalment solvut fl-ilma. It-traskrizzjoni inversa twettqet bl-użu ta 'kit kummerċjali minn Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) skond l-istruzzjonijiet tagħhom. PCR f'ħin reali twettqet bl-użu ta' reaġent SYBR Green (Invitrogen). Primers ġew sintetizzati minn Microsynth AG, Balgach, l-Isvizzera. Is-sekwenzi tal-primer huma murija fit-Tabella 1. Il-bidla tal-ħin tal-espressjoni tal-ġeni ġiet ikkalkulata bil-metodu 2∆∆Ct bl-użu tal-espressjoni ta 'EEF2 u RPS17 bħala referenzi. L-espressjoni ta 'dawn iż-żewġ ġeni rriżulta li kienet l-inqas mibdula (jekk xejn) fid-dejta tas-sekwenzjar tal-RNA meta tqabbel OTA ttrattata ma' ċelloli HK2 mhux ittrattati (riżultati mhux ippubblikati).

Western Blots  Wara s-separazzjoni tal-proteini permezz ta 'elettroforesi tal-ġel tas-sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE), il-proteini ġew trasferiti fuq membrana tan-nitrocellulose. Minn hemm 'il quddiem, is-siti ta' rbit ħielsa tal-membrana ġew imblukkati b'soluzzjoni ta' 5 fil-mija ta' ħalib niexef mingħajr xaħam f'salina buffered TRIS (3 mM bażi TRIS, 140 mM NaCl, 0.17 mM Tris -HCl, pH 7.4) li fih 0.1 fil-mija Tween20. L-ewwel antikorpi dilwiti fis-salina TRIS flimkien ma' 5 fil-mija albumina tas-serum bovin (TRIS-BSA, għal dilwizzjonijiet ara Tabella 2) ġew miżjuda u membrani inkubati matul il-lejl. Wara l-ħasil, ġew miżjuda antikorpi sekondarji akkoppjati bil-fluworexxenza fi TRIS-BSA għal 90 min. Il-fluworexxenza tat-tieni antikorpi ġiet irreġistrata permezz ta' sistema ta' skoperta LICOR.

CISTANCHE SE TTEJB L-UĠIGĦ TAL-KLIEI/KLIEWA