Kuntatt:jerry.he@wecistanche.com

Yuto Mitsuhata1, Takaya Abe2, Kazuyo Misaki3,Yuna Nakajima1, Keita Kiriya1,

Miwa Kawasaki4, Hiroshi Kiyonari2, Masatoshi Takeichi4*, Mika Toya1,4,5,6*&

Masamitsu Sato1,6,7

Cistanche jista 'jtejjeb il-funzjoni tal-kliewi

Iċ-ċelloli epiteljali jorganizzaw firxa ordnata ta' mikrotubuli mhux-centrosomali, li t-truf minus tagħhom huma regolati minn CAMSAP3. Ir-rwol ta 'dawn il-mikrotubuli fil-funzjonijiet epiteljali, madankollu, huwa mifhum ħażin. Hawnhekk, nuru li l-kliewital-ġrieden li fihom Camsap3 huwa mutat jiżviluppawċistifit-tubuli konvoluti prossimali (PCTs). Il-PCTs kienu dilatati ħafna fil-mutantkliewi, u wrew ukoll proliferazzjoni msaħħa taċ-ċelluli. F'dawn il-PCTs, iċ-ċelluli epiteljali saru msemmna flimkien ma' perturbazzjoni ta 'arrays tal-mikrotubuli kif ukoll ta' ċerti strutturi subċellulari bħal proċessi bażali interdiġitali. Barra minn hekk, YAP u PIEZO1, li huma magħrufa bħala regolaturi mekkaniċi sensittivi għall-iffurmar u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli, ġew attivati ​​f'dawn iċ-ċelloli PCT mutanti. Dawn l-osservazzjonijiet jissuġġerixxu li n-netwerks tal-mikrotubuli medjati minn CAMSAP3 huma importanti għaż-żamma tal-proprjetajiet mekkaniċi xierqa taċ-ċelluli PCT, u t-telf tiegħu jikkawża deformazzjoni u proliferazzjoni taċ-ċelluli permezz tal-attivazzjoni ta 'mechanosensors, li jirriżulta fid-dilatazzjoni tal-PCTs.

Iċ-ċelloli epiteljali huma komponenti ewlenin ta 'diversi organi. Huma juru polarità apikali għal bażali li hija marbuta mal-funzjonijiet tagħhom, bħall-assorbiment u t-tnixxija. F'ċelluli epiteljali differenzjati, il-maġġoranza tal-mikrotubuli mhumiex centrosomali u huma allinjati tul l-assi apikali għal bażali 1-3. CAMSAP3 huwa membru tal-proteina assoċjata mal-ispettrina regolata mill-calmodulin (CAMSAP)/Nezha/Patronin tal-familja tal-proteini u hija importanti għall-organizzazzjoni tal-mikrotubuli epiteljali4–8. CAMSAP3 jorbot u jistabbilizza t-truf minus tal-mikrotubuli4,6,9. Fiċ-ċelloli tal-musrana ż-żgħira fil-ġrieden, CAMSAP3 huwa kkonċentrat f'reġjuni kortikali apikali, jankra t-truf minus ta 'mikrotubuli mhux centrosomali ma' dawn is-siti10,11, li jirriżulta fil-formazzjoni ta 'matriċi mikrotubuli orjentati lejn id-direzzjoni apikobażali bit-truf plus ippuntati bażikament. . Madankollu, din l-organizzazzjoni karatteristika tal-mikrotubuli tintilef fil-ġrieden li jġorru ġene mutant li jikkodifika Camsap3 maqtugħ (ġrieden Camsap3dc/dc), li fih jitħassar id-dominju C-terminal li jgħaqqad il-mikrotubuli. Iċ-ċelloli epiteljali intestinali f'dawn il-ġrieden għandhom diversi difetti ċitoloġiċi, inkluż għoli mnaqqas taċ-ċelluli u organelli mqiegħda ħażin bħan-nukleu u Golgi10. Minkejja disturbi kbar bħal dawn fl-arkitettura intraċellulari, iċ-ċelluli epiteljali jżommu folji bidimensjonali li jidhru normali10,12, u l-intestini mutati ma kellhom l-ebda difett fiżjoloġiku ovvju.

tubuli (PCTs), il-linja ta 'Henle, tubuli konvoluti distali, u kanal tal-ġbir. Dawn is-sottostrutturi tan-nephron jikkonsistu f'saff wieħed ta' epitelju, li jiffunzjona għall-filtrazzjoni, assorbiment mill-ġdid u sekrezzjoni.

A renali ċistahija leżjoni patoloġika komuni tal-kliewi. Il-leżjoni ċistika hija varjabbli; jew ċisti fokali jew multipli jiffurmaw f'naħa waħda jew bilateralment fil-kliewi, li juru grad differenti ta' sintomi13–15. Ċistika konġenitali diversirenalimard, inkluż poliċistikukliewimard (PKD), mard glomeruloċistiku tal-kliewi (GCKD) u ċistika medullarikliewi(MCKD), huma magħrufa li jikkawżaw multiplirenaliċisti fil-kliewi bilaterali. Fil-PKD, iċ-ċisti huma mqassma b'mod uniformi fuq l-organu kollu inklużi l-PCTs, filwaqt li GCKD u MCKD jiżviluppaw ċisti fil-kapsuli ta 'Bowman u l-kanali tal-ġbir (prinċipalment fir-reġjun tal-medulla), rispettivament16-19.

Fir-rigward tal-PKD, huma magħrufa żewġ kawżi ewlenin: 1) mutazzjonijiet fil-ġene Pkd1 jew Pkd2, u 2) mutazzjonijiet fil-ġeni meħtieġa għall-bijoġenesi taċ-cilium primarja. Pkd1 u Pkd2 jikkodifikaw polycystin1 u polycystin2, rispettivament, li huma kanali katjoniċi mhux selettivi20 li jillokalizzaw f'diversi kompartimenti ċellulari inklużi l-cilia primarji21,22. Fil-ġrieden li jġorru forma mutanti ta' PKD1 jew PKD2, il-proteini polycystin ma jillokalizzawx f'cilia23. Ġeni meħtieġa għall-bijoġenesi taċ-ċilja primarja jinkludu If88 u Kif3a, li huma involuti fit-trasport intrafagellar24-26. Mutazzjonijiet f'dawn il-ġeni jirriżultaw ukollrenalimard ċistic24-27. Għalkemm ir-relazzjoni bejn dawn iż-żewġ mogħdijiet kawżali hija kkumplikata23, mogħdija waħda li ntwera li tinduċi PKD tinvolvi l-effettur ta 'sinjalazzjoni ta' Hippo Yap28. Fil-ġrieden mutanti Pkd1, il-ko-attivatur tat-traskrizzjoni YAP/TAZ u l-effettitur tiegħu c-Myc huma attivati ​​u jippromwovu ċ-ċistoġenesi28. Madankollu, il-mekkaniżmi sottostanti l-iżvilupp tal-poliċistikukliewijibqgħu fil-biċċa l-kbira mhux magħrufa.

Fl-istudju preżenti, investigajna r-rwoli ta 'CAMSAP3 fikliewistruttura u funzjoni. L-osservazzjonijiet tagħna juru li CAMSAP3 lokalizzat apikament jikkontribwixxi għall-orjentazzjoni xierqa ta 'mikrotubuli mhux centrosomali kif ukoll l-istabbiliment tal-arkitettura intraċellulari ta' ċelloli epiteljali fil-PCTs, kif osservat fil-musrana ż-żgħira. B'differenza mill-epitelja intestinali, madankollu, CAMSAP3disfunzjoniikkawża anormalitajiet fil-livell tal-organi fil-kliewi bilaterali—jiġifieri, il-formazzjoni taċ-ċisti fil-PCTs. It-telf tal-funzjoni CAMSAP3 irriżulta f'attivazzjoni ta 'regolaturi mekkaniċi sensittivi li normalment jgħinu biex jippreservaw l-integrità tat-tessut. L-istudju tagħna jissuġġerixxi li l-organizzazzjoni tal-mikrotubuli mhux centrosomali medjata minn CAMSAP3-hija importanti għaż-żamma tal-proprjetajiet mekkaniċi sensittivi tal-PCTs, u t-telf ta 'din is-sistema jikkawża formazzjoni ta' ċisti reġjonali fil-kliewi.

Riżultati

Ċistiformazzjoni filkliewital-ġrieden mutanti Camsap3. Analiżi fenotipika tal-ġrieden mutanti Camsap3dc/dc żvelat likliewifl-età (~ 2 snin) ġrieden Camsap3dc/dc kienu ipertrofiċi u skulurati (Fig. 1a). Biex tanalizza aktar l-anormalitajiet f'Camsap3dc/dckliewi, eżaminajna ġrieden iżgħar. Fil-21 jum ta' wara t-twelid (P21), il-kliewi Camsap3dc/dc kellhom dehra normali. Madankollu, is-sezzjoni tal-kliewi żvelat strutturi taċ-ċisti fir-reġjuni kortikali (Fig. 1b u Fig. Supplimentari S1a), kif ikkonfermat bil-kalkolu tal-indiċi ċistika, li huwa l-proporzjon taż-żoni li fihom iċ-ċisti mal-erja totali tal-kliewi (Fig. 1c). Aħna eżaminajna embrijuni mutanti biex niddeterminaw meta ċ-ċisti jibdew jiffurmaw matul l-iżvilupp, li żvela sinjal ta 'żieda fil-formazzjoni taċ-ċisti f'jum bejn wieħed u ieħor embrijoniku 17.5 (E17.5) (Figura Supplimentari S1a, vleġeġ). F'P0, ċisti kortikali saru faċilment dixxernibbli (Fig. Supplimentari S1a, vleġeġ), u d-daqs u n-numru tagħhom żdiedu b'P21 (Fig. 1b, Fig. Supplimentari S1a, vleġeġ). Hekk kif il-ġrieden kibru, il-fenotipi taċ-ċisti saru aktar evidenti, għalkemm il-grad ta 'formazzjoni taċ-ċisti varja fost l-individwi (Fig. 1c u Fig. Supplimentari S1b). Barra minn hekk, il-proporzjon tal-piż tal-kliewi għall-ġisem kien ogħla għall-ġrieden Camsap3dc/dc minn ġrieden tat-tip selvaġġ (WT) matul ħajjithom (Fig. 1d u Fig. Supplimentari S1c, d). Tus, il-kliewi Camsap3dc/dc urew formazzjoni ta 'ċisti, li ġiet imsaħħa maż-żmien, li rriżultat f'ipertrofija fil-kliewi ta' età.

Il-ġrieden Camsap3dc/dc jesprimu dominju C-terminal-maqtugħ CAMSAP3 (CAMSAP3-dc)10, li jista' jkun involut fil-fenotip ċistika osservat tal-kliewi tal-ġrieden. Biex ninvestigaw din il-possibbiltà, iġġenerajna ġurdien Camsap3–/– (Camsap3-null) (Figura Supplimentari S2a, b) (ara wkoll Metodi fid-dettall). Dawn il-ġrieden kellhom ukollkliewib'ċisti multipli, u l-fenotip tagħhom ma kienx distint minn dak osservat fil-ġrieden Camsap3dc/dc; notevolment, ġrieden eterozigoti (Camsap3 plus /–) ma wrew l-ebda sinjali ta 'kliewi poliċistiċi (Figura Supplimentari S2c).

Formazzjoni taċ-ċisti fil-PCTs ta' Camsap3dc/dckliewi. Biex tiddetermina liema strutturi saru ċistika fil-mutantkliewi, wettaqna immunostaining ta 'tliet segmenti nephron għal tliet proteini, jiġifieri Megalin (jilokalizza għal PCTs), kotrasportatur Na plus / Cl- (tubuli konvoluti distali), u aquaporin -2 (kanali tal-ġbir). Ir-riżultati wrew li d-dilatazzjoni seħħet esklussivament f'tubuli pożittivi għal Megalin f'P21 (Fig. 1e u Fig. Supplimentari S1e), li jindika li ċ-ċistoġenesi kienet ristretta għal PCTs. Il-PCTs huma suddiviżi fi tliet segmenti, jiġifieri S1, S2 u S3, u aħna ddistingwejna bejniethom permezz ta 'immunostaining għat-trasportaturi tal-glukosju SGLT1 u SGLT2, li lokalizzati f'segmenti S3 u S1/S2, rispettivament29,30. It-tubuli dilatati kienu mmarkati biss minn SGLT2 (Fig. 1f), li jindika li ċ-ċistoġenesi sseħħ fis-segmenti S1/S2. Fi ġrieden mutanti anzjani, madankollu, il-formazzjoni taċ-ċisti estiża wkoll għall-kapsula tal-Bowman (Fig. 1g).

Arkitettura ċellulari diżorganizzata f'PCTs ċistika. Biex nesploraw id-difetti fil-livell ċellulari fil-PCTs taċ-ċistiċi, l-ewwel eżaminajnahom permezz tal-mikroskopija elettronika tal-iskannjar, u sibna li popolazzjoni ta’renalitubuli nefħa b'mod notevoli fil-kliewi Camsap3dc/dc (Fig. 2a), għalkemm il-firxa ta 'nefħa varjat minn pożizzjoni għal pożizzjoni tat-tubuli. Cross-sections wrew li, f'porzjonijiet minfuħin ta 'tubuli, il-lumen tiegħu ġie estiż flimkien ma' traqqiq tas-saff epiteljali li jikkomponu t-tubuli (Fig. 2a). Il-kwantifikazzjoni bl-użu ta' kampjuni mtebbgħin bl-ematossilin u bl-eosina kkonfermat li l-għoli taċ-ċellula tnaqqas fit-tubuli dilatati (Fig. 2b), filwaqt li l-perimetru apikali ta' kull ċellula żdied (Fig. 2c), li jindika li ċ-ċelloli mutanti kienu fatter minn dawk f'WT.kliewi.

Imbagħad eżaminajna jekk l-arkitettura taċ-ċelluli u/jew l-istrutturi subċellulari tal-PCTs ġewx affettwati minn mutazzjoni Camsap3. Immunostaining għal DPP IV, markatur tal-membrana apikali, u għal Na plus /K plus -ATPase, markatur tal-membrana basolaterali, indika li l-polarità ġenerali taċ-ċellula kienet normali f'kullrenaliċellula tat-tubuli ta' Camsap3dc/dc

Figura 1. Formazzjoni taċ-ċisti fit-tubuli konvoluti prossimali ta 'Camsap3dc/dckliewi. (a) Morfoloġija tal-kliewi tal-ġrieden WT ( plus / plus ) u mutanti Camsap3 (Camsap3dc/dc) f'P666. (b) Tbajja H&E tal-kliewi WT u Camsap3dc/dc f'P21. Ċisti multipli ffurmati fil-kortiċi tal-kliewi Camsap3dc/dc. (c) Bidla fl-indiċi ċistika tal-ġrieden WT u Camsap3dc/dc maż-żmien. Ġew eżaminati 9 ġrieden għal WT jew Camsap3dc/dc. Ara l-MATERJALI U METODI għad-definizzjoni tal-indiċi ċistika. (d) Proporzjon tal-kliewi mal-piż tal-ġisem. Ġew eżaminati 11-il ġrieden għal WT jew Camsap3dc/dc. (e) Immunostaining għal markaturi ta 'tubuli konvoluti prossimali (PCT) (Megalin), tubuli konvoluti distali (DCT), ko-trasportatur NaCl, u kanali tal-ġbir (CD) (aquaporin-2; AQP2) f'WT u Camsap3dc/ dckliewif'P21. Immaġini tal-veduta eżaltata ta 'Megalin juru Megalin delokalizzat f'ċelloli ċstiċi fil-kliewi Camsap3dc/dc, kif indikat mill-vleġġa. Linji miksura u kontinwi jindikaw il-marġini apikali u bażali taċ-ċellula, rispettivament. (f) Immunostaining għal markaturi tas-segmenti S1/S2 (SGLT2, aħdar) u segment S3 (SGLT1, aħmar) fil-kliewi WT u Camsap3dc/dc f'P21. Immaġini tal-veduta mkabbra ta 'SGLT2 juru intensità mnaqqsa tas-sinjal SGLT2 fiċ-ċelloli ċstiċi fil-kliewi Camsap3dc/dc, kif indikat minn arrowheads. (g) Morfoloġija tal-glomerulus f'P21 u P487. Arrowheads jindikaw il-glomerulus dilatat. Ara wkoll il-Figuri S1 u S2.

Figura 2. Arkitettura ċellulari diżorganizzata f'ċelluli PCT ċistika. (a) Immaġini tal-mikroskopija elettronika tal-iskannjar ▸

Cistanche jista 'jtejjeb il-funzjoni tal-kliewi

tal-WT u Camsap3dc/dckliewif'P21. It-tubuli tal-kliewi f'Camsap3dc/dckliewihuwa parzjalment minfuħ. (b) Kwantifikazzjoni tal-għoli taċ-ċellula fil-kortiċi [ plus / plus , n=121 ċelluli; dc/dc (dilatata), n=128 ċelluli; dc/dc (mhux dilatat), n=66 ċelluli]. Il-vireg tal-iżbalji jindikaw SD ***p<0.001, t-test.="" see="" materials="" and="" methods="" for="" the="" defnition="" of="" dilated="" and="" non-dilated="" tubules.="" (c)="" quantifcation="" of="" cell="" width="" in="" the="" cortex="" [+="" +="" ,="" n="26" tubules;="" dc/="" dc="" (dilated),="" n="8" tubules;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="14" tubules].="" error="" bars="" indicate="" s.d.="" ***p=""><0.001, t-test.="" (d)="" cell="" polarity="" markers="" were="" visualized:="" dpp="" iv="" (apical="" marker)="" and="" na+/k+-atpase="" (basal="" marker).="" te="" localization="" of="" cell="" polarity="" markers="" in="" camsap3dc/dc="" kidney="" is="" overall="" normal.="" te="" arrowhead="" indicates="" basal="" plasma="" membranes,="" whose="" invagination="" is="" not="" normal.="" (e)="" apical="" structures="" (actin="" and="" ezrin)="" and="" the="" golgi="" were="" visualized.="" arrowheads="" indicate="" disrupted="" structures="" such="" as="" the="" lack="" of="" actin="" signal="" and="" misplacement="" of="" the="" golgi.="" broken="" and="" continuous="" lines="" indicate="" the="" apical="" and="" basal="" margin="" of="" the="" cell,="" respectively,="" in="" d="" and="" e.="" (f)="" transmission="" electron="" microscopy="" images="" of="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" subcellular="" defects="" such="" as="" a="" fattened="" nucleus="" and="" misaligned="" mitochondria="" are="" observed="" in="" camsap3dc/dc="" kidneys.="" arrowheads="" indicate="" invaginated="" basal="" membranes.="" note="" that="" their="" extensive="" invagination="" is="" suppressed="" in="" camsap3dc/dc.="" asterisks="" denote="" mitochondria.="" drawings="" are="" the="" traced="" invagination="" in="" electron="" microscopy="" images.="" (g)="" quantifcation="" of="" the="" shape="" of="" the="" nucleus="" [+="" +="" ,="" n="72" cells;="" dc/dc="" (dilated),="" n="72" cells;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="71" cells].="" (h)="" immunostaining="" for="" acetylated="" tubulin,="" a="" marker="" for="" the="" primary="" cilium,="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" te="" primary="" cilium="" was="" present="" in="" both="" wt="" and="" camsap3dc/dc="">kliewi. (i) Numru ta' cili primarji fil-PCTs. In-numru ta 'cilia primarju ġie kkalkulat bl-użu tat-tul taċ-ċirkonferenza apikali ta' cross sections ta 'PCT, flimkien ma' numri ta 'cilia primarji u nuklei. [ plus / plus , N=340 ċelluli, 63 cross sections ta 'PCT, Nru ta' cili primarji=268; dc/dc, N=221 ċelluli, 29 cross sections ta 'PCT, Nru ta' cili primarji=133].

ġrieden (Fig. 2d). B'kuntrast, għalkemm Megalin akkumulat fir-reġjuni apikali fiċ-ċelluli WT, inxterdet fiċ-ċitoplasma f'uħud miċ-ċelloli Camsap3dc / dc taċ-ċistiċi (Fig. 1e vista mkabbra, u Fig. 2d). It-tbajja’ ta’ fluworexxenza għal F-actin, li jakkumula f’densità għolja fil-mikrovilli apikali, issuġġerixxa li l-mikrovilli kienu okkażjonalment diżarranġati fiċ-ċelloli msemmna tal-mutant.kliewi(Fig. 2e arrowhead), kif ikkonfermat mill-mikroskopija elettronika ta 'trasmissjoni (Fig. 2f). Ezrin, parti mill-kumpless ERM li jassoċja mal-membrana tal-plażma apikali31, kien imnaqqas jew mitluf fiċ-ċelloli ċstiċi ta' Camsap3dc/dckliewi(Fig. 2e), li jissuġġerixxi li ċ-ċitoarkitettura kienet anormali fiċ-ċelloli mutanti. Barra minn hekk, filwaqt li l-apparat ta 'Golgi pożittiv Giantin huwa ġeneralment imqassam bħala linji rqaq magħquda man-nukleu fiċ-ċelloli WT, il-Golgi kultant sar ikkondensat f'ċelloli Camsap3dc / dc (Fig. 2e). Il-mikroskopija elettronika tat-trażmissjoni żvelat difetti subċellulari addizzjonali f'PCTs dilatati ta' Camsap3dc/dckliewi. Fiċ-ċelluli WT PCT, il-mitokondrija kienu tawwalija, u juru orjentazzjoni ordnata tul l-assi apiko-bażali taċ-ċellula, filwaqt li fiċ-ċelluli PCT taċ-ċistiċi, il-mitokondrija kellhom it-tendenza li jkunu tondi —m'għadhomx juru xi orjentazzjoni ordnata (Fig. 2f). F'dawn iċ-ċelloli, l-istriazzjonijiet bażali kienu wkoll diżorganizzati, tilfu l-invaġinazzjonijiet paralleli u profondi tagħhom li huma komuni fiċ-ċelloli WT (Fig. 2f arrowheads u tpinġija traċċata), kif muri wkoll mill-immunostaining għal Na plus / K plus -ATPase (Fig. 2d arrowheads). Barra minn hekk, in-nuklei kienu msemmnin fiċ-ċelloli ċstiċi, meta mqabbla mal-forma tonda tagħhom fiċ-ċelloli WT (Fig. 2f, g). Cilia primarja kienu skoperti fin-naħa luminali ta 'ċelluli PCT kemm fil-kliewi WT u mutanti (Fig. 2h, i), b'differenza mill-każ għall-ġrieden mutanti li huma difettużi għal ċijoġenesi, li tikkawża kliewi poliċistiċi 24-27, li jissuġġerixxi li indeboliment ta' ciliogenesis huwa mhux ir-raġuni probabbli għall-

fenotipi poliċistiċi osservati fil-ġrieden Camsap3dc/dc. Kollettivament, dawn l-osservazzjonijiet indikaw lidisfunzjonita 'CAMSAP3 ifixkel l-arkitettura subċellulari ta' ċelluli ċistiċi PCT.

Il-ġrieden Camsap3dc/dc juru xi difetti fiżjoloġiċi. Wara eżaminajna jekk il-kliewi Camsap3dc/dc kellhomx xi difetti fiżjoloġiċi. L-istudji immunoċitoloġiċi msemmija qabel urew li Megalin, li jiffunzjona bħala riċettur endoċitiku multiligand32,33, kellu t-tendenza li jxerred fiċ-ċitoplasma taċ-ċelluli PCT Camsap3dc/dc (Fig. 1e arrowhead, u Fig. 2d), b'kuntrast mal-lokalizzazzjoni apikali ċara tiegħu f' Ċelloli WT PCT. Barra minn hekk, għalkemm it-trasportatur tal-glukosju SGLT2, li huwa responsabbli għal 90 fil-mija tar-riassorbiment tal-glukosju29, lokalizzat primarjament f'reġjuni apikali taċ-ċelloli Camsap3dc/dc (kif jidher ukoll fiċ-ċelloli WT), l-intensità tas-sinjal tiegħu naqset f'ċerti reġjuni ta 'tubuli ċstiċi ( Fig. 1f arrowheads), li jissuġġerixxi li l-fiżjoloġija tat-tubuli mutanti setgħet ġiet affettwata b'mod negattiv. Għalhekk, għamilna testijiet tal-awrina u tad-demm, użajna ġrieden P396- sa P424-qodma. Testijiet tal-awrina wrew tendenza ta 'ħruġ eċċessiv ta' K plus, Mg2 plus, u nitroġenu tal-urea fil-ġrieden Camsap3dc/dc (Supplimentari Fig. S3a). Testijiet tad-demm urew b'mod aktar konvinċenti li l-ġrieden Camsap3dc/dc kellhom livelli sinjifikament aktar baxxi ta 'K plus u Mg2 plus meta mqabbla ma' ġrieden WT jew Camsap3 plus /dc, għalkemm ma nstabet l-ebda bidla fil-livelli ta 'nitroġenu u glukożju urea (Fig. Supplimentari S3b) . Il-livelli tal-krejatinina fl-awrina u fid-demm ma kinux differenti bejn WT u ġrieden mutanti (Fig. S3c Supplimentari). Għalhekk, osservajna biss difetti fiżjoloġiċi parzjali fil-ġrieden Camsap3dc/dc.

Organizzazzjoni mikrotubuli firenaliċelluli epiteljali tubuli. Peress li l-mutazzjoni Camsap3 twassal għal diżorjentazzjoni tal-mikrotubuli fiċ-ċelloli epiteljali tal-musrana ż-żgħira10,12, eżaminajna jekk dan iseħħx ukoll f'kliewiċelluli epiteljali. Aħna l-ewwel immunostained -tubulin flimkien ma 'Megalin. Notevolment, kemm fil-kliewi WT u Camsap3dc/dc, tubuli negattivi Megalin, jiġifieri, tubuli konvoluti distali jew kanali tal-ġbir, urew intensità ta 'immunostaining ta' tubulin aktar b'saħħitha milli osservata għal -tubuli f'PCTs pożittivi għal Megalin (Fig. 3a, b) . Kif instab fil-musrana ż-żgħira10, CAMSAP3 lokalizzat apikament fiċ-ċelloli epiteljali kollha tal-WTkliewi, li jikkoinċidu t-tarf api- cal tal-mikrotubuli li huma allinjati tul l-assi apiko-bażali (Fig. 3c lef). Iċ-ċelloli epiteljali tal-kliewi Camsap3dc/dc kienu wkoll kemmxejn immunopożittivi għal CAMSAP3 iżda f'pożizzjonijiet irregolari (Fig. 3c lemin, arrowheads), li jissuġġerixxi li CAMSAP3 mutat jinżamm fiċ-ċelloli, ankrat ma 'xi strutturi mhux identifikati. F'ċelluli ċistiċi tal-kliewi mutanti, il-firxa ta 'mikrotubuli kienet imħabbta u diżorganizzata (Fig. 3c dritt), kif osservat fiċ-ċelloli intestinali tal-ġrieden Camsap3dc/dc10. F'ċelluli mhux ċistika, madankollu, l-organizzazzjoni tal-mikrotubuli ma ġietx affettwata

Figura 3. Mikrotubuli fiċ-ċelloli epiteljali tat-tubuli renali. (a) Immunostaining għal -tubulin, Megalin, u nuklei fil-kliewi WT u Camsap3dc/dc f'P21. (b) Kwantifikazzjoni tal-intensità ta' -tubulin fil-PCT u DCT/CD tal-kliewi WT (PCT, n=28 tubuli; DCT/CD, n=18 tubuli) u Camsap3dc/dc kliewi (PCT, n=28 tubuli; {8}} tubuli; DCT/ CD, n=9 tubuli). Il-vireg tal-iżbalji jindikaw SD ***p<0.001, t-test.="" (c)="" immunostaining="" for="" α-tubulin,="" camsap3,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" arrowheads="" indicate="" camsap3-dc="" proteins="" anchoring="" to="" unidentifed="" structures.="" te="" apical="" localization="" of="" camsap3="" was="" absent="" in="" camsap3dc/dc="" cells.="" see="" also="" figure="">

ħafna anke fin-nuqqas ta 'CAMSAP3 funzjonali, li jista' jispjega għaliex dawn iċ-ċelloli ma wrew l-ebda anormalitajiet ċitoloġiċi. Barra minn hekk, iċ-ċelluli epiteljali tal-kliewi nulli Camsap3-urew ukoll difetti simili tal-mikrotubuli iżda biss fiċ-ċelloli taċ-ċistiċi (Fig. S2d Supplimentari). B'mod kollettiv, dawn ir-riżultati indikaw li CAMSAP3 għandu rwol fiż-żamma tal-organizzazzjoni apiko-bażali tal-mikrotubuli biss għal sottopopolazzjoni ta 'ċelluli epiteljali tal-kliewi.

Proliferazzjoni mtejba taċ-ċelluli fil-PCTs Camsap3dc/dc. Il-formazzjoni taċ-ċisti fil-kliewi hija relatata mill-qrib mal-proliferazzjoni msaħħa taċ-ċelluli tal-kliewi34. Biex tittestja jekk il-proliferazzjoni taċ-ċelluli nbidlitx fil-kliewi Camsap3dc/dc, qabbilna l-proliferazzjoni ta 'ċelluli PCT bejn WT u kliewi mutanti permezz ta' ko-immunostaining għal Megalin u Ki-67, markatur għall-proliferazzjoni taċ-ċelluli. Ċelloli Ki-67-pożittivi rarament kienu osservati fil-PCTs tal-kliewi WT, filwaqt li kienu jidhru faċilment fiċ-ċelloli PCT tal-kliewi Camsap3dc/dc. Madankollu, Ki -67 ġie skopert kemm f'tubuli mhux dilatati kif ukoll f'tubuli dilatati (Fig. 4a, b), li ma juru l-ebda korrelazzjoni bejn il-proliferazzjoni taċ-ċelluli u l-formazzjoni taċ-ċisti. Tus, CAMSAP3disfunzjoniippromwoviet il-proliferazzjoni taċ-ċelluli, iżda dan il-proċess mhux dejjem kien assoċjat mal-formazzjoni taċ-ċisti.

Bidliet fil-lokalizzazzjoni ta 'YAP u myosin mhux tal-muskoli marbuta mad-deformazzjoni taċ-ċelluli. YAP huwa attivatur tat-traskrizzjoni li jirregola l-proliferazzjoni taċ-ċelluli35 kif ukoll l-iffurmar taċ-ċelluli dipendenti mit-tensjoni mekkanika36. YAP huwa attivat flimkien mal-lokalizzazzjoni nukleari tiegħu fil-kliewi ta 'ġrieden Pkd1-defiċjenti, mudell ta' PKD37, u l-attivazzjoni ta 'Yap tippromwovi l-proliferazzjoni taċ-ċelluli u d-dilatazzjoni tubulari fil-kliewi28. Għalhekk ittestjajna jekk YAP kienx attivat ukoll fil-PCTs tal-kliewi Camsap3dc/dc. L-immunostaining għal YAP żvela l-lokalizzazzjoni ċitoplasmika tiegħu fil-PCTs tal-kliewi WT. B'mod notevoli, YAP sar ikkonċentrat fin-nuklei tal-PCTs Camsap3dc/dc, iżda biss fil-porzjonijiet dilatati tagħhom (Fig. 5a), kif ikkonfermat mill-kwantifikazzjoni (Fig. 5b), li jissuġġerixxi li r-ridistribuzzjoni YAP osservata seħħet bi tweġiba għal bidla fiċ-ċellula. morfoloġija aktar milli CAMSAP3disfunzjoniper se.

YAP huwa efector downstream tal-mogħdija ta 'Hippo, li hija rregolata b'indikazzjonijiet mekkaniċi38. Fil-fatt, iċ-ċelloli ċstiċi fil-kliewi Camsap3dc/dc dehru mġebbda, li jissuġġerixxi li setgħu ġew esposti għal tensjoni akbar.

Figura 4. Proliferazzjoni taċ-ċelluli f'PCTs Camsap3dc/dc. (a) Immunostaining għal Ki-67, Megalin, u DAPI fil-kliewi WT u Camsap3dc/dc f'P22. Arrowheads jindikaw ċelluli Ki-67-pożittivi fit-tubuli taċ-ċistiċi. (b) Perċentwal ta' ċelluli Ki-67-pożittivi fi ħdan iċ-ċelluli epiteljali PCT [ plus / plus , n=700 ċelluli; dc/dc (dilatata), n=224 ċelluli; dc/dc (mhux dilatat), n=396 ċelluli]. Il-vireg tal-iżbalji jindikaw SD *p<0.05,>

Għalhekk investigajna jekk seħħux xi tibdil mekkaniku flimkien mal-formazzjoni taċ-ċisti. Minħabba li l-attivazzjoni tal-myosin II mhux tal-muskoli hija proċess sensittiv għat-tensjoni39, aħna vvalutajna d-distribuzzjoni tal-katina ħafifa tal-myosin 2 (MLC2), li hija involuta fl-attivazzjoni tal-myosin II, fil-kliewi. Għalkemm MLC2 imxerred fil-ċito- plażma fil-ċelluli tubuli WT, sar ikkonċentrat ħdejn il-porzjonijiet apikali ta 'ċelluli ċistika fil-kliewi Camsap3dc/dc (Fig. 5c arrowhead), li jissuġġerixxi li dawn iċ-ċelloli kienu soġġetti għal forza ta' tensjoni. Ċelloli f'PCTs mhux dilatati ma wrewx tali konċentrazzjoni MCL2. Dawn is-sejbiet kienu skond l-idea li YAP jidħol fin-nukleu meta ċ-ċelloli jiġu mġebbda mekkanikament40,41.

Bidliet fid-distribuzzjoni PIEZO1 fil-PCTs Camsap3dc/dc. Biex tkompli tittestja jekk iċ-ċelluli taċ-ċistiċi humiex esposti għal forza ta 'tiġbid, eżaminajna d-distribuzzjoni subċellulari ta' PIEZO1, kanal joniku mekkaniku sensittiv42-45, peress li dan huwa markatur tipiku għal stretch mekkaniku; Il-lokalizzazzjoni ta 'PIEZO1 tinbidel mill-membrana tal-plażma/ċitoplasma għall-envelop nukleari meta tħoss sinjali ta' stretch46. Immunostaining għal PIEZO1 wera li PIEZO1 l-aktar lokalizzat fiċ-ċitoplażma taċ-ċelluli WT PCT, filwaqt li l-lokalizzazzjoni tagħha ikkoinċidiet man-nukleu fiċ-ċelloli ċstiċi ta 'PCTs Camsap3dc/dc (Fig. 6a). Immunostaining għal YAP u PIEZO1 f'sezzjonijiet sekwenzjali ssuġġeriet ukoll li l-lokalizzazzjoni nukleari tagħhom ikkoinċidiet fi PCTs dilatati (Fig. S4 Supplimentari, arrowheads). Min-naħa l-oħra, f'PCTs Camsap3dc/dc mhux dilatati, id-distribuzzjoni PIEZO1 dehret ċitoplasmika (Fig. 6a). Madankollu, osservazzjonijiet mill-qrib ta 'l-immaġini immunofuorescence kif ukoll kwantifikazzjoni indikaw li lokalizzazzjoni nukleari tagħha tendenza li tiżdied sa ċertu punt, meta mqabbla ma' ċelluli WT (Fig. 6a, b). Għalhekk, b'differenza YAP, jidher li PIEZO1 jibda jiġi attivat qabel id-deformazzjoni ta 'ċelluli li tista' tinkixef f'Camsap3dc/dc PCTs.

Diskussjoni

F'dan l-istudju, sibna li l-mutazzjoni CAMSAP3 jew it-telf tagħha rriżultaw f'dilatazzjoni taċ-ċelluli PCT, li kkawżaw li s-sezzjonijiet trasversali tat-tubuli jieħdu dehra ċistika. Sinjal ta 'ċistoġenesi diġà kien osservat kmieni kemm E17.5, b'żieda gradwali ta' dilatazzjoni matul ix-xjuħija u l-estensjoni eventwali tagħha għall-kapsula ta 'Bowman. Iċ-ċelloli epiteljali fir-reġjuni dilatati saru irqaq, urew diversi difetti ċitoloġiċi, kif osservat fiċ-ċelloli tal-musrana ż-żgħira tal-ġrieden Camsap3dc/dc10,12. Ġew osservati wkoll xi difetti speċifiċi għall-kliewi, inkluż it-tfixkil tal-allinjament tal-mitokondrija u l-mudell tal-membrana tal-plażma bażali. Dawn il-bidliet ikkoinċidew ma 'perturbazzjoni ta' l-arranġament tal-mikrotubuli, li jissuġġerixxu li n-netwerks tal-mikrotubuli medjati minn CAMSAP3- huma responsabbli għall-organizzazzjoni normali ta 'dawn l-istrutturi subċellulari fiċ-ċelloli PCT, kif jinstab f'tipi oħra ta' ċelluli. Min-naħa l-oħra, għalkemm CAMSAP3 deher li kien espress fiċ-ċelloli epiteljali tat-tubuli renali kollha, fenotipi strutturali aberranti ġew osservati biss f'PCTs, li jissuġġerixxu l-eżistenza ta 'mekkaniżmu(i) żejda biex jinżammu netwerks tal-mikrotubuli fin-nuqqas ta' CAMSAP3. Huwa possibbli li molekuli minbarra CAMSAP3, bħal CAMSAPs oħra, jistgħu jipparteċipaw fiż-żamma tal-integrità tan-netwerks tal-mikrotubuli f'dawn iċ-ċelloli. Iċ-ċelloli PCT kellhom densità tal-mikrotubuli relattivament aktar baxxa minn ċelloli tat-tubuli oħra. Probabbilment dan iffaċilita d-deformazzjoni taċ-ċelluli, peress li n-netwerks tal-mikrotubuli li kienu jibqgħu wara t-telf ta’ CAMSAP3 setgħu kienu insuffiċjenti biex jinżammu.

l-arkitettura taċ-ċelluli xierqa. Anke fiċ-ċelloli PCT, madankollu, jidhru li jeżistu mekkaniżmi li jikkumpensaw għat-telf ta 'CAMSAP3, peress li d-dilatazzjoni tal-PCTs ma seħħitx b'mod uniformi.

Figura 5. Lokalizzazzjoni ta 'YAP u myosin mhux tal-muskoli assoċjati ma' deformazzjoni taċ-ċelluli. (a) Immunostaining għal YAP, Megalin, u DAPI fil-kliewi WT u Camsap3dc/dc f'P22. Sinjali ta 'fluworexxenza ta' DAPI u YAP ġew skennjati tul il-linja mfassla fl-immaġini mkabbra, u l-bidliet spazjali fl-intensità tal-fuorescenza huma murija bil-blu għal DAPI u aħdar għal YAP. Linji mdawwar jindikaw iż-żona approssimattiva tan-nukleu. Arrowheads jindikaw il-pożizzjoni tan-nukleu fiċ-ċelloli rappreżentattivi. (b) Proporzjon tal-intensità tal-YAP nukleari mal-intensità tal-YAP ċitoplasmika [ plus / plus , n=81 ċelluli; dc/dc (dilatata), n =43 ċelluli; dc/dc (mhux dilatat), n=53 ċelluli]. Box plots jindikaw il-valuri tal-ewwel kwartil, medjan, u t-tielet kwartil. ***p<0.001, t-test.="" (b)="" immunostaining="" for="" mlc2,="" actin,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p22.="" arrowheads="" indicate="" apical="" accumulation="" of="" mlc2="" in="" cystic="">

Figura 6. Bidla fid-distribuzzjoni PIEZO1 f'PCTs Camsap3dc/dc. (a) Immunostaining għal PIEZO1, Megalin, u DAPI fil-kliewi WT u Camsap3dc/dc f'P22. Sinjali ta 'fluworexxenza ta' DAPI u PIEZO1 ġew skennjati tul il-linja mfassla fl-immaġini mkabbra, u l-bidliet spazjali fl-intensità tal-fuorescenza huma murija bil-blu għal DAPI u aħdar għal PIEZO1. Linji mdawwar jindikaw iż-żona approssimattiva tan-nukleu. Arrowheads jindikaw il-pożizzjoni tan-nukleu f'ċelloli rappreżentattivi. (b) Proporzjon tal-intensità tal-piezo1 nukleari mal-intensità tal-piezo1 ċitoplasmika [ plus / plus , n=66 ċelluli; dc/dc (dilatata), n =44 ċelluli; dc/dc (mhux dilatat), n=81 ċelluli]. Box plots jindikaw il-valuri tal-ewwel kwartil, medjan, u t-tielet kwartil. ***p<0.001, **p=""><0.01, t-test.="" see="" also="" figure="">

Kif, allura, il-PCTs ġew dilatati b'mod reġjonali, akkumpanjati minn tismin taċ-ċelluli epiteljali? Notevolment, il-formazzjoni taċ-ċisti saret skoperta f'E17.5, u dan iż-żmien jikkorrelata mal-bidu tal-produzzjoni primittiva tal-awrina fil-ġrieden47. Għalhekk, nistgħu nassumu li 'l-awrina' huwa fattur mekkaniku potenzjali li jinduċi dilatazzjoni tat-tubuli renali. Huwa probabbli li ċ-ċelloli PCT li kienu tilfu ċ-ċitoskeletru tal-mikrotubuli medjat minn CAMSAP3-kienu mekkanikament aktar suxxettibbli għall-forzi esterni, jiġifieri, aktar deformabbli, meta mqabbla maċ-ċelloli WT PCT. Għalhekk, forzi prodotti mill-fow ta 'l-awrina fit-tubuli tal-kliewi jistgħu jikkawżaw dilatazzjoni tat-tubuli, u jġibu s-simna tagħhom. Forzi bħal dawn jistgħu ma jkunux uniformi, li jirriżultaw fi gradi varjabbli ta 'dilatazzjoni tul PCTs. Din l-idea, m'għandniex xi ngħidu, ma teskludix mekkaniżmi oħra possibbli għad-dilazzjoni tal-PCT.

L-osservazzjonijiet tagħna wrew li PIEZO1 huwa rilokalizzat miċ-ċitoplasma għar-reġjun nukleari f'ċelluli PCT dilatati tal-kliewi Camsap3dc/dc, li jissuġġerixxu li dan il-mechanosensor ġie attivat b'reazzjoni għad-deformazzjoni taċ-ċelluli, x'aktarx it-'tiġbid' taċ-ċelloli kif irrappurtat qabel46 . L-istat stirat ta 'ċelluli PCT dilatati ġie kkonfermat mill-osservazzjoni li MLC2 żdied fir-reġjuni kortikali tagħhom. L-analiżi tagħna kompliet indikat li PIEZO1 kien diġà attivat sa ċertu punt f'ċelloli PCT mhux dilatati, li jissuġġerixxi li anke dawn iċ-ċelloli kienu għaddejjin minn bidliet mekkaniċi minkejja d-dehra normali tagħhom. Mechanosensor ieħor, YAP, ġie wkoll attivat fiċ-ċelloli PCT, iżda l-attivazzjoni tiegħu dehret li seħħet biss f'ċelloli mġebbda.

Kif, allura, dawn ir-regolaturi mekkaniċi sensittivi jikkontribwixxu għad-deformazzjoni taċ-ċelluli, kif ukoll il-proliferazzjoni taċ-ċelluli li ġiet promossa fin-nuqqas ta 'CAMSAP3? Intwera li l-attivazzjoni indotta mill-medda ta 'PIEZO1 tippromwovi l-proliferazzjoni taċ-ċelluli fiċ-ċelloli epiteljali46, u tissuġġerixxi li dan il-mekkaniżmu jaħdem ukoll fiċ-ċelloli PCT tal-kliewi Camsap3dc/dc. Din l-idea hija konsistenti ma 'l-osservazzjoni tagħna li l-proliferazzjoni msaħħa taċ-ċelluli u l-attivazzjoni parzjali ta' PIEZO1 seħħew flimkien, anke f'ċelloli mhux dilatati ta 'PCTs Camsap3dc/dc. Rigward YAP, l-attivazzjoni tagħha ġiet ittardjata, u ma wrietx korrelazzjoni ċara mal-bidu tat-titjib tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli. YAP huwa magħruf mhux biss bħala fattur tat-tkabbir taċ-ċelluli iżda wkoll bħala regolatur tal-omeostasi mekkanika, kif muri qabel36,48. Huwa għalhekk possibbli li YAP, li ġie rilokat fin-nukleu flimkien mad-deformazzjoni taċ-ċelluli PCT, jista 'jiffunzjona biex jirregola l-forma tagħhom, jiġifieri, biex jirrestawra l-forma bil-ħsara ta' dawn iċ-ċelloli. Inkella, YAP jista 'jikkoopera ma' PIEZO1 fit-titjib tal-proliferazzjoni ta 'ċelluli dilatati, peress li YAP huwa magħruf li huwa involut fil-formazzjoni ta' kliewi poliċistiċi permezz tat-titjib tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli28.

Sibna li l-ġrieden Camsap3dc/dc kellhom livelli sinjifikament aktar baxxi ta’ K plus u Mg2 plus fid-demm, li jissuġġerixxu li l-kliewi tagħhom setgħu sofrew minn xi funzjonament anormali. Difetti ċitoloġiċi severi li osservajna fil-membrani tal-plażma apikali u bażali taċ-ċelloli PCT, fejn jinsab il-makkinarju tat-trasport attiv, jistgħu jkunu relatati ma 'din l-anormalità. Madankollu, ma nistgħux neskludu l-possibbiltà li porzjonijiet oħra ta 'tubuli renali jew organi oħra jistgħu wkoll ikunu funzjonalment difettużi, li jinduċu dan il-fenotip. Barra minn hekk, ma ksibna l-ebda evidenza li l-funzjonijiet fltering tal-glomerulus kienu bil-ħsara, peress li l-livelli tad-demm ta 'krejatinina u nitroġenu ta' l-urea, li huma eliminati permezz tal-glomerulus, kienu normali.

It-tfixkil tal-bijoġenesi taċ-cilium primarja jwassal għal PKD24-27. Fil-każ ta' mutazzjoni Camsap3, il-formazzjoni ta' cili primarji dehret li ma kinitx affettata. Studju reċenti wera li t-telf ta 'CAMSAP3 f'ċelluli epiteljali multi-ciliated nażali affettwa l-formazzjoni tal-pari ċentrali ta' mikrotubuli fl-axoneme, u kkawża motilità aberranti f'cilia motile49. Għalkemm il-cilium primarju fuq iċ-ċelluli epiteljali huma nonmotile u m'għandhomx il-pari ċentrali ta 'mikrotubuli50, jibqa' inċert jekk il-cilium primarju fil-ġrieden mutanti Camsap3 għadux funzjonali. Minkejja din l-inċertezza, l-anormalitajiet fil-mutanti PKD u Camsap3 huma pjuttost differenti, peress li l-formazzjoni taċ-ċisti sseħħ b'mod uniformi fuq il-kilwa kollha f'dawk tal-ewwel, filwaqt li hija avveniment lokali f'dawn tal-aħħar. Din id-differenza hija x'aktarx attribwibbli għall-isfondi molekulari distinti tal-formazzjoni taċ-ċisti bejniethom.

Fil-qosor, l-istudju tagħna jiżvela li CAMSAP3 huwa importanti għaż-żamma tal-istruttura u l-funzjoni tat-tubuli tal-kliewi f'reġjuni prossimali, x'aktarx permezz tar-regolamentazzjoni tal-assemblaġġ tal-mikrotubuli mhux centrosomali. Se jkunu meħtieġa aktar studji, madankollu, għal fehim bir-reqqa ta 'kif it-telf ta' din is-sistema ta 'organizzazzjoni tal-mikrotubuli jinterferixxi mal-funzjonijiet fiżjoloġiċi tal-kliewi.

materjali u metodi

L-esperimenti kollha twettqu skont il-linji gwida rilevanti, ir-regolamenti, u ġew approvati miċ-Ċentru RIKEN għar-Riċerka dwar id-Dinamika tal-Bijosistemi u/jew il-Kumitat Istituzzjonali tal-Bijosigurtà tal-Università Waseda.

Ġrieden. Ġrieden mutanti Camsap3 (Camsap3dc/dc) użati f'dan l-istudju ġew iġġenerati fl-istudju preċedenti tagħna10 (nru ta' aċċess CDB0716K; http://www2.clst.riken.jp/arg/mutant percent 20mice percent 20list.html). F'dawk il-ġrieden, ir-reġjun C-terminal ta 'Camsap3, jiġifieri l-esons 14-17, tneħħa, u qabel konna kkonfermajna li ċ-ċelloli tal-ġrieden jesprimu CAMSAP3 maqtugħ b'mod C-terminal mhux funzjonali (CAMSAP3-dc)10. Fl-istudju preżenti, ġrieden tal-ġenerazzjoni N4 u 5 intużaw f'esperimenti.

Ġrieden knockout Camsap3 (Camsap3–/–) (nru ta’ adeżjoni CDB0033E), li m’għandhomx ir-reġjun kollu tal-kodifikazzjoni ta’ 22-kb Camsap3, ġew iġġenerati b’editjar tal-ġenoma medjat minn CRISPR/Cas9- permezz ta’ zygote electroporation51. Fil-qosor, żewġ RNAs gwida u oligodeoxynucleotide b'linja waħda (ssODN) ġew iddisinjati biex iħassru r-reġjun 22-kb, u ġie miżjud sit EcoRI għall-iskop ta 'rikonoxximent għal inserzjoni b'suċċess fil-ġrieden mutanti. Għall-elettroporazzjoni, cRNAs, tracrRNA, ssODN u proteina Cas9 ġew introdotti fiż-żigoti C57BL/6. Wara l-elettroporazzjoni, iż-żigoti ġew trasferiti f'ġrieden nisa pseudopregnant ICR, u l-ġrieden fundaturi ġew skrinjati permezz ta 'PCR u sekwenzar tad-DNA. Ġrieden knockout tas-siġar (#4, #10, #23) ġew miksuba, u wieħed minnhom (#23) kellu l-EcoRI knock-in allele ddisinjat. Is-sekwenzi tal-RNA gwida ġew iddisinjati minn CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp). Is-sekwenzi ta' crRNAs, tracrRNA, u ssODN użati għall-editjar tal-ġenoma ġew sintetizzati kif ġej: 5′-cRNA, 5′-UGA UCC CAC ACA UAU GCA GGg uuu uag agc uau gcu guu uug-3′, 3′-cRNA , 5′-CAGCCACCUCUGAUC UGACCguuuuagagcuaugcuguuuug-3′; tracrRNA, 5′-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC

GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGGUGCU-3′; ssODN, 5′-TAGAACTTACTGTATAGTAAT

ACCACAAACTCCATATGCATATGTGAACTCCACCTGAATTCACCTGGCAAGAGATTCCAGACCAG

CTCTCCTCTCCTGGGCCTCCTCCACCCCCACAT-3′ . L-ittri kbar u żgħar jindikaw kodifikazzjoni u sekwenzi awżiljarji, rispettivament. Il-linja tal-ġurdien #23 kienet qasmet ma 'C57BL/6 tliet darbiet, u l-ġrieden tal-ġenerazzjoni N3 intużaw f'esperimenti.

L-esperimenti li jużaw ġrieden ġew approvati mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali taċ-Ċentru RIKEN għar-Riċerka dwar id-Dinamika tal-Bijosistemi jew l-Università ta 'Waseda, u saru skont il-protokolli pprovduti minn dawk il-kumitati. L-istudju sar f'konformità mal-linji gwida ARRIVE: https: //arriveguidelines.org.

Ġenotipi. Genotyping għall-ġrieden sar permezz tal-PCR. Għall-ġrieden Camsap3dc/dc, użajna primers deskritti f'Toya et al. (2016). Għall-ġrieden Camsap3–/–, użajna l-primers li ġejjin biex niskopru alleli tat-tip selvaġġ (WT) (P1/P2, 411 bp) jew Camsap3–/– (P1/P3, 614 bp) (Figura Supplimentari S2a, b) : P1, 5′- CATGTACCTACCACC ATCC-3′; P2, 5′- GGACCCTGGAGAGGCTTAG-3′; P3, 5′- GCAAGGCTGTAGTGAGCC-3′ . Ir-reġjun P1/P3 f'WT ma ġiex amplifikat taħt il-kundizzjonijiet tal-PCR użati.

Istoloġija: Preparazzjoni ta 'sezzjonijiet tat-tessuti ffriżati. Tessut tal-kliewi mqassam ġie fxed f'2 fil-mija paraformaldehyde (Termo Fisher) / 0.1 M sorbitol (Nacalai Tesque) / PEM buer għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Ir-riċetta għal PEM hija: 100 mM PIPES (Nacalai Tesque), 5 mM EGTA (Nacalai Tesque), u 5 mM MgCl2 (Wako), aġġustati għal pH 6.9 b'2 M KOH. Wara l-fxation, it-tessut tal-kliewi tlaħlaħ tliet darbiet b'PEM għal 10 min. Għaxar, krijoprotezzjoni twettqet b'sukrożju / PEM: 15 fil-mija sukrożju f'soluzzjoni PEM għal 2 h f'4 gradi, segwit minn 20 fil-mija sukrożju f'soluzzjoni PEM matul il-lejl f'4 gradi, u sostituzzjoni b'30 fil-mija sukrożju f'soluzzjoni PEM għal ~ 2 h. f'4 gradi. It-tessut tal-kliewi kien iffriżat f'kompost OCT f'moffa inkorporata (Polysciences, Inc.) f'nitroġenu likwidu u maħżun f'-80 grad. Kampjuni ffriżati tqattgħu bi ħxuna ta' 5 µm bi Kriostat CM1850 (Leica). Sezzjonijiet fuq slides tal-ħġieġ inżammu f'-80 grad sakemm tbajja.

Istoloġija: Preparazzjoni ta 'sezzjonijiet tat-tessuti inkorporati parafn. Tessut tal-kliewi dissettjat ġie fxed f'soluzzjoni Super Fix (Kurabo) għal 2 sigħat f'temperatura tal-kamra, imbagħad trasferit għal 4 gradi matul il-lejl. Kull kampjun kien espost għal tliet soluzzjonijiet milwiema ta' etanol ta' konċentrazzjoni dejjem tiżdied f'temperatura tal-kamra: 30 fil-mija etanol għal 3{{20}} min darbtejn, 5{0 fil-mija etanol għal 3{ {35}} min, u fl-aħħarnett 70 fil-mija etanol għal 30 min. Kull kampjun ġie pproċessat bi ASP300 Tissue Processor (Leica). Għaxar, il-kampjuni tat-tessut tal-kliewi ġew inkorporati f'xama' parafn (Sakura Fine-tek) b'EG1160 (Leica) u maħżuna f'4 gradi. Kampjuni inkorporati fil-parafn tqattgħu bi ħxuna ta' 6 µm b'Mikrotomu Rotatorju RV240 (Yamato Kohki). Sezzjonijiet fuq slides tal-ħġieġ inżammu f'4 gradi sakemm tbajja. Tbajja immunofuorexxenti. Sezzjonijiet tal-kliewi ffriżati ġew mgħaddsa f'0.1 fil-mija Triton X-100 (Nacalai Tesque) / PEM għal 10 minuti f'temperatura tal-kamra. Għaxar, kampjuni ġew permeabilizzati bl-applikazzjoni ta '0.2 fil-mija Triton X-100 / PEM għal 10 min f'temperatura tal-kamra. Għal darb'oħra, il-kampjuni ġew mgħaddsa f'0.1 fil-mija Triton X-100 / PEM għal 10 minuti f'temperatura tal-kamra. Sussegwentement, il-kampjuni ġew imblukkati bi 3 fil-mija albumina tas-serum bovin (BSA; Roche) / 0.1 fil-mija Triton X-100 / PEM għal 30 min f'temperatura ambjentali, segwita minn reazzjoni primarja tal-antikorpi għal matul il-lejl f'4 gradi. Antikorpi primarji ġew dilwiti fi 3 fil-mija BSA / 0.1 fil-mija Triton X-100 / PEM. Għall-antikorpi primarji mqajma fil-ġrieden, imblukkar addizzjonali b'Reaġent tal-Imblukkar MOM (Vector Laboratories) sar qabel l-imblukkar fi 3 fil-mija BSA / 0.1 fil-mija Triton X-100 / PEM. MOM Blocking Reagent ġie dilwit f'0.1 fil-mija Triton X-100 / PEM u applikat għall-kampjuni għal 30 min f'temperatura tal-kamra. Wara t-trattament MOM, il-kampjuni ġew maħsula b'0.1 fil-mija Triton X-100 / PEM tliet darbiet għal 5, 10 u 15-il minuta f'temperatura tal-kamra. Wara r-reazzjoni primarja tal-antikorpi, il-kampjuni ġew maħsula għal 15-il minuta f'temperatura tal-kamra b'0.1 fil-mija Triton X-100 / PEM tliet darbiet. Ir-reazzjoni sekondarja tal-antikorpi twettqet għal sagħtejn f'temperatura tal-kamra fid-dlam. Antikorpi sekondarji ġew dilwiti fi 3 fil-mija BSA / 0.1 fil-mija Triton X-100 / PEM. Wara r-reazzjoni, il-kampjuni ġew maħsula b'0.1 fil-mija Triton X-100 / PEM tliet darbiet għal 5, 10 u 15-il minuta f'temperatura ambjentali u ssiġillati b'VECTASHIELD Mounting Medium (Vector Laboratories). Antikorpi u reaġenti. Id-DNA kien imtebba b'soluzzjoni DAPI (Dojindo, D523, 1:1000). F-actin kien imtebba b'Alexa Fluor 594 phalloidin (Termo Fisher, A12381, 1:400). Il-mikrotubuli kienu mtebbgħin bil-ġurdien anti- -tubulin-FITC (DM1A; Sigma Aldrich, F2168, 1:200). Intużaw l-antikorpi primarji li ġejjin: mogħoż anti-Megalin (P-20; Santa Cruz Biotechnology, sc-16478, 1:200), ko-trasportatur tal-fenek anti-NaCl (MERCK, AB3533, 1:500). ), kontra l-akkwaporina tal-fenek-2 (abcam, AB3274, 1:400), anti-SGLT1 tal-mogħoż (M-19; Santa Cruz Biotech- nology, sc-20582, 1:200) , fenek anti-SGLT2 (Novus Biologicals, NBP1-92384, 1:200), ġrieden anti-ezrin (3C12; abcam, ab4069, 1:500), fenek anti-giantin (Covance, PRB-114 C, 1:700), fenek anti-aPKC (Santa Cruz Biotech- nology, sc-216, 1:400), mogħoż anti-DPP IV (R&D Systems, AF954, 1:100), ġurdien anti-Na plus /K plus -ATPase (abcam, ab7671, 1:100), tubulin anti-acetylated tal-ġurdien (Sigma Aldrich, T6793, 1:200), fenek anti-CAMSAP3 (Tanaka et al., 2012, 1:400), ġurdien tubulin anti-tyrosinated (Sigma Aldrich, T9028, 1:200), fenek anti-Ki-67 (SP6; abcam, ab16667, 1:250), fenek anti-YAP (Cell Signaling, #4912, 1:100 ), katina ħafifa kontra l-mijosin tal-fenek 2 (Cell Signaling, #8505, 1:100), fenek anti-piezo1 (Novus Biologicals, N BP1-78446, 1:100), far anti-E-cadherin (52, 1:400), u fenek anti-merlin (Sigma Aldrich, HPA003097, 1:100). Intużaw l-antikorpi sekondarji li ġejjin: ħmar Dylight 594–konjugat kontra l-mogħoż IgG (Jackson, 1:500), mogħoż Alexa Fluor 488/594–konjugat kontra l-fenek IgG (Termo Fisher, A-11034, A -11037, 1:500), mogħoż Alexa Fluor 488/594–konjugat kontra l-ġurdien IgG (Termo Fisher, A-11029, A{-11032, 1:500), u mogħoż Alexa Fluor 488–IgG kontra l-firien konjugat (Termo Fisher, A-11006,

1:400). L-ispeċifiċità tal-irbit tal-antikorpi anti-YAP (Cell Signaling, #4912) u anti-PIEZO1 (Novus Biologicals, NBP1-78446) użati fl-istudju ġew ivverifikati minn xogħol preċedenti46,53. Tbajja ta' ematossilina u eosina (H&E). Slajds tal-ħġieġ b'sezzjonijiet tal-kliewi tqiegħdu fuq pjanċa ta '55 grad għal 30 min biex tiġġebbed il-parafn. Il-kampjuni mbagħad ġew mgħaddsa fi xylene għal 15-il minuta darbtejn segwiti minn immersjoni f'serje ta' 70-100 fil-mija etanol: 100 fil-mija etanol għal 5 min darbtejn, 90 fil-mija etanol għal 5 min, 80 fil-mija etanol għal 5 min, u 70 fil-mija etanol għal 5 min. Wara t-tlaħliħ fl-ilma għal 20 min u f'H2O distillat/dejonizzat (ddH2O) għal 1 min, il-kampjuni kienu mtebbgħin fis-soluzzjoni ematoxylin ta 'Mayer (Wako) għal 5 min. Il-kampjuni ġew mgħaddsa f'ddH2O darbtejn, imbagħad laħlaħ b'ddH2O għal 10 min. Il-kampjuni reġgħu ġew mgħaddsa f'ddH2O u mbagħad imtebbgħin f'soluzzjoni ta 'eosina (Merck) għal 2 min. Għall-ħasil, il-kampjuni ġew mgħaddsa f'ddH2O għal 30 s, segwiti minn immersjoni f'serje ta' 70-100 fil-mija etanol u xylene: 70 fil-mija etanol għal 5 s, 80 fil-mija etanol għal 5 s, 90 fil-mija etanol għal 5 s, 100 fil-mija etanol għal 5 s darbtejn, u xylene għal 10 min. Fl-aħħarnett, il-kampjuni ġew issiġillati fil-gliċerol. Mikroskopija. L-immaġini ġew akkwistati bil-Mikroskopju tal-Fluworexxenza BZ-X710 All-in-one (Keyence) jew mikroskopju konfokali tal-iskannjar bil-laser LSM880 (Zeiss). Għal BZ-X710, il-lentijiet oġġettivi użati kienu Nikon CFI Plan Apo λ 2 × , 10 × , 40 × , 100 × u Nikon CFI Plan Fluor 4 × . Immaġini miksuba ġew ipproċessati b'software BZ-X Analyzer. Te LSM880 kien mgħammar b'mikroskopju invertit Axio Observer Z1 b'lenti oġġettiva ta' immersjoni taż-żejt Plan-Apochromat 63 × /1.40 NA (Zeiss). L-immaġini ġew ipproċessati u analizzati bl-użu ta 'ImageJ u Adobe Photoshop CC2019. Analiżi tal-indiċi ċistika. L-indiċi ċistika ġie analizzat minn ImageJ bl-użu ta 'immaġini mtebbgħin H&E tas-sezzjoni orizzontali tal-kliewi. Bħala kejl taż-żona li fiha ċ-ċisti, il-perimetru tal-lumen tubulari dilatat ġie ntraċċat bl-użu tal-funzjoni "Selezzjonijiet ta 'Freehand", u l-erja tagħha kienet imkejla mill-funzjoni "Kejl". Dan ix-xogħol sar għaċ-ċisti kollha fi ħdan is-sezzjoni tal-kliewi, u ż-żoni taċ-ċisti kollha ġew miżjuda flimkien biex jiddeterminaw iż-żona li fiha ċ-ċisti. L-erja totali tal-kliewi kienet imkejla bl-istess mod. Iċ-ċirkonferenza ta' barra tal-kliewi ġiet traċċata bl-użu tal-funzjoni "Freehand selections", u l-erja tagħha ġiet ivvalutata. Fl-aħħarnett, aħna kkalkulajna l-indiċi taċ-ċisti billi naqsam iż-żona li fiha ċ-ċisti bl-erja totali tal-kliewi.

Definizzjoni ta' tubuli dilated u tubuli mhux dilated. F'din ir-riċerka, tubuli b'erja tal-lumen ta' akbar minn jew ugwali għal 500 µm2 ġew iddefiniti bħala "dilatati", filwaqt li dawk b'erja tal-lumen ta'<500 µm2="" have="" been="" defned="" as"non-dilated".="" when="" selecting="" a="" "dilated"="" tubule="" in="" camsap3dc/dc="" samples,="" we="" frst="" visually="" picked="" up="" a="" cyst="" that="" was="" not="" recognized="" in="" wt="" samples="" and="" then="" roughly="" measured="" its="" lumen="" area="" using="" imagej.="" if="" the="" value="" was="" ≧500="" µm2,="" it="" was="" regarded="" as="">

Mikroskopija elettronika. Għall-mikroskopija elettronika, ġew eżaminati ġrieden maskili P21. Ġew ippreparati kampjuni għall-mikroskopija tal-elettronika tal-iskannjar skont Takahashi-Iwanaga54 b'ċerti modifikazzjonijiet, kif ġej. Ġrieden ġew anestetizzati b'isofurane u mxerrda b'2 fil-mija (w/vol) formaldehyde u 2.5 fil-mija (vol/vol) glutaraldehyde f'0.1 M cacodylate buer, pH 7.4. Kull kilwa ġiet imnaqqsa u maqtugħa f'kubi li ġew mgħaddsa fl-istess fxative matul il-lejl, u mbagħad laħlaħ b'0.1 M cacodylate buer. Kampjuni ffissati ġew trasferiti permezz ta' 30 fil-mija soluzzjoni akwea ta' dimethyl sulfoxide f'60 fil-mija dimethyl sulfoxide, u mbagħad maqsuma f'likwidu N2. Il-kampjuni miksura tlaħlaħ b'0.1 M cacodylate buer u mqiegħda f'6 N NaOH għal 1{{3{0}}–20 min f'60 grad. Wara l-maċerazzjoni fis-soluzzjoni ta 'NaOH, kull kampjun tlaħlaħ b'0.1 M cacodylate buer li fih 0.05 fil-mija Tween 20 u postfxed b'1 fil-mija OsO4 f'0.1 M cacodylate buer fuq is-silġ għal 2 h. Il-kampjuni postfxed kienu: (1) imlaħlaħ b'ddH2O u mqiegħda f'1 fil-mija thiocarbohydrazide akweju għal 20 minuta f'temperatura tal-kamra, u (2) mlaħalħa b'ddH2O u postfxed mill-ġdid f'1 fil-mija OsO4 f'0.1 M cacodylate buer għal siegħa f'temperatura ambjentali. . Wara li tirrepeti l-passi (1) u (2), il-kampjuni ġew laħlaħ b'ddH2O, u mtebbgħin b'0.5 fil-mija uranyl acetate soluzzjoni matul il-lejl f'temperatura tal-kamra. Il-blokok tat-tessut ġew mlaħalħa b'ddH2O u deidrati permezz ta 'serje gradata ta' etanol, trasferiti għal isopentyl acetate, u mnixxfa f'punt kritiku bl-użu ta 'CO2 likwidu. Il-kampjuni mnixxfa ġew miksija bl-evaporazzjoni bl-osmju u eżaminati b'mikroskopju elettroniku tal-iskannjar JSM-5600LV f'vultaġġ li jaċċellera ta' 10 kV. L-immaġini ġew ipproċessati bl-Adobe Photoshop.

Għall-mikroskopija elettronika ta 'trasmissjoni, kubi ta' kliewi dissected ġew fxed għal mill-inqas 2 h f'2 fil-mija (w/vol) formaldehyde u 2.5 fil-mija (vol/vol) glutaraldehyde f'0.1 M cacodylate buer f'temperatura tal-kamra. Il-kampjuni ġew maħsula bi 0.1 M cacodylate buer u postfxed b'1 fil-mija OsO4 fi {{1{0}}.1 M cacodylate buer fuq is-silġ għal 2 sigħat. Il-kampjuni ġew imbagħad maħsula b'ddH2O u mtebbgħin matul il-lejl b'0.5 fil-mija uranyl acetate akweju f'temperatura tal-kamra. Il-kampjuni mtebbgħin ġew deidrati b'serje gradata ta 'etanol, trasferiti għall-ossidu tal-propilene, u inkorporati f'Polybed 812 (Polysciences). Sezzjonijiet ultrarqaq inqatgħu b'sikkina tad-djamanti, imtebba doppja b'uranyl acetate u ċomb citrate, u osservati f'vultaġġ ta' aċċelerazzjoni ta' 100 kV bl-użu ta' mikroskopju elettroniku ta' trażmissjoni (JEM-1010; JEOL) mgħammar b'kamera ta' apparat akkoppjat bi ħlas ( BioScan mudell 792; Gatan). L-immaġini ġew ipproċessati bl-Adobe Photoshop.

Test tal-awrina u test tad-demm. Għal tqabbil mal-ġrieden Camsap3dc/dc, ġrieden WT ( plus / plus ) u eterozigoti ( plus / dc) intużaw bħala kontrolli f'dawn l-analiżi. Ġrieden eterozigoti ma juru l-ebda sinjali ta 'Camsap3disfunzjoni10u organizzaw arrays apiko-bażali ta 'mikrotubuli. Il-ġrieden kellhom 56-60 ġimgħa.

Il-ġrieden kienu miżmuma f'gaġġa metabolika (TECNIPLAST). Inġabru kampjuni tal-awrina kuljum għal ħamest ijiem konsekuttivi, u l-kampjuni miġbura nħażnu f'-80 grad. Fl-aħħarnett, il-ħames kampjuni kollha għal kull ġurdien tħalltu sabiex it-taħlita finali tirrifletti l-kundizzjoni medja ta 'kull ġurdien matul dak il-perjodu.

Għall-ġbir tad-demm, il-ġrieden amministraw {{0}}.02 mL anestesija għal kull gramma ta' piż tal-ġisem. Il-kompożizzjoni tal-anestesija kienet Domitor (ZENOAQ) 30 µL, Midazolam (Sandoz) 80 µL, Vetorphale (Meiji Seika Pharma) 100 µL, u 0.9 fil-mija NaCl akweju għal 1 mL. Id-demm inġabar permezz ta’ titqib tal-qalb. Biex tiġi evitata l-emolisi, is-siringa ddaħħlet u ħarġet bil-mod. Kull kampjun tad-demm inżamm f'temperatura tal-kamra għal siegħa biex tikkoagula. Kull kampjun imbagħad ġie ċentrifugat (10,000×g, 25 grad, 15 min), u s-serum inġabar u maħżun f'-80 grad. Il-kampjuni kollha tal-awrina u tad-demm ġew analizzati minn Oriental Yeast Co.