L-immirar ta' Cathepsin B Permezz ta' Cycloastragenol Ittejjeb l-Immunità Antitumorali taċ-Ċelloli T CD8 permezz ta' Degradazzjoni MHC-I li Inibixxi l-Parti 1

ASTRATT

SfondIt-telf tal-antiġeni tat-tumur u t-tnaqqis taċ-ċelluli T CD8 ikkawżat mill-mogħdija PD-1/PD-L1 huma fatturi importanti għall-ħarba immuni tat-tumur. F'dawn l-aħħar snin, kien hemm żieda fir-riċerka dwar il-mediċina tradizzjonali Ċiniża fit-trattament tat-tumur. Cycloastragenol (CAG), molekula attiva effettiva f'Astragalus membranaceus, instab li għandu funzjonijiet antivirali, antiaging, anti-infjammatorji u oħrajn. Madankollu, l-effett u l-mekkaniżmu antitumorali tiegħu mhumiex ċari.

Glycoside ta 'cistanche jista' wkoll iżid l-attività ta 'SOD fit-tessuti tal-qalb u tal-fwied, u jnaqqas b'mod sinifikanti l-kontenut ta' lipofuscin u MDA f'kull tessut, li jneħħi b'mod effettiv diversi radikali reattivi ta 'ossiġnu (OH-, H₂O₂, eċċ.) u jipproteġi kontra ħsara fid-DNA kkawżata. minn OH-radikali. Cistanche phenylethanoid glycosides għandhom kapaċità qawwija ta 'scavenging ta' radikali ħielsa, kapaċità ta 'tnaqqis ogħla minn vitamina C, itejbu l-attività ta' SOD fis-sospensjoni ta 'l-isperma, inaqqsu l-kontenut ta' MDA, u għandhom ċertu effett protettiv fuq il-funzjoni tal-membrana ta 'l-isperma. Cistanche polysaccharides jistgħu jtejbu l-attività ta 'SOD u GSH-Px fl-eritroċiti u tessuti tal-pulmun ta' ġrieden senescent sperimentali kkawżati minn D-galactose, kif ukoll inaqqsu l-kontenut ta 'MDA u kollaġen fil-pulmun u fil-plażma, u jżidu l-kontenut ta' elastin, għandhom effett tajjeb għat-tħaffir fuq DPPH, itawwal iż-żmien ta 'ipoksja fil-ġrieden senescent, itejjeb l-attività ta' SOD fis-serum, u jdewwem id-deġenerazzjoni fiżjoloġika tal-pulmun fi ġrieden senescent b'mod sperimentali B'deġenerazzjoni morfoloġika ċellulari, esperimenti wrew li Cistanche għandu l-abbiltà antiossidant tajba u għandu l-potenzjal li jkun mediċina biex jipprevjeni u jikkura mard tal-ġilda li qed tixjieħ. Fl-istess ħin, echinacoside f'Cistanche għandu kapaċità sinifikanti li jneħħi r-radikali ħielsa DPPH u għandu l-abbiltà li jneħħi speċijiet ta 'ossiġnu reattiv u jipprevjeni d-degradazzjoni tal-kollaġen indotta minn radikali ħielsa, u għandu wkoll effett tajjeb ta' tiswija fuq il-ħsara ta 'anjoni radikali ħielsa tat-timina.

Ikklikkja fuq il-vantaġġi u l-iżvantaġġi ta' cistanche

【Għal aktar informazzjoni:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

MetodiL-effett antitumorali ta 'CAG ġie investigat f'mudelli ta' tumur MC38 u CT26 trapjantati bil-ġrieden. L-effett antitumorali ta 'CAG ġie analizzat aktar permezz ta' sekwenzar multi-omics b'ċellula waħda. It-teknoloġija tal-profili tal-aċċessibbiltà li tirreaġixxi għall-mira ntużat biex tinstab il-proteina fil-mira ta 'CAG. Sussegwentement, il-mekkaniżmu antitumorali ta 'CAG ġie esplorat bl-użu ta' mikroskopija konfokali, immunopreċipitazzjoni, u trasfezzjoni ta 'plażmidi mutanti. Fl-aħħarnett, ġie investigat l-effett kombinat kontra t-tumur tal-antikorpi CAG u PD-1 fil-ġrieden jew organoids.

RiżultatiSibna li l-CAG inibixxi b'mod effettiv it-tkabbir tat-tumur in vivo. L-atlas multi-omics tagħna b'ċellula waħda wera li CAG ippromwoviet il-preżentazzjoni ta 'antiġeni tal-wiċċ taċ-ċelluli tat-tumur u kien ikkaratterizzat mill-funzjoni mtejba tal-qtil taċ-ċelluli CD8 flimkien ma' T. B'mod mekkaniku, CAG ingħaqad mal-proteina fil-mira cathepsin B tagħha, li mbagħad inibixxi d-degradazzjoni lisosomali tal-kumpless maġġuri ta 'istokompatibilità I (MHC-I) u ppromwova l-aggregat n ta' MHC-I mal-membrana taċ-ċellula, u saħħaħ il-pre-stazzjon tal-antiġen tat-tumur. . Sadanittant, il-kombinazzjoni ta 'CAG ma' antikorp PD-1 tejbet b'mod effettiv it-tumur li joqtol it-tumur CD8 flimkien ma 'ċelluli T fil-ġrieden xenograft u organoids tal-kanċer tal-kolorektum. Konklużjoni Id-dejta tagħna rrapportat għall-ewwel darba li r-regolazzjoni baxxa tal-cathepsin B tagħti immunità kontra t-tumur u l-exp data l-mekkaniżmu kontra t-tumur tal-prodott naturali CAG.

INTRODUZZJONI

Il-kanċer tal-kolorektum huwa wieħed mill-aktar kanċers komuni madwar id-dinja. Ir-rata ta’ inċidenza u r-rata ta’ mortalità tagħha jikklassifikaw fost l-aqwa tlieta, u jheddu serjament il-ħajja u s-saħħa tal-bniedem.1 Metodi ta’ trattament komuni jinkludu kimoterapija u radjuterapija kirurġika, mediċini mmirati, u immunoterapija.2–4 Madankollu, iċ-ċelloli tal-kanċer normalment juru telf ta’ antiġeni tal-wiċċ u jesprimu livelli għoljin ta' molekuli jinibixxu biex jaħarbu mis-sorveljanza taċ-ċelloli immuni. Għalhekk, biex isolvu l-problema tal-ħarba immuni tat-tumur, ir-riċerkaturi żviluppaw inibituri tal-punt ta 'kontroll immuni u terapija neoantiġen biex jimblokka l-masking taċ-ċelloli tal-kanċer għal ċelloli immuni. ċelluli ma ġiex im ved b'mod sinifikanti. Għalhekk, huwa partikolarment importanti li jinstabu mediċini li jistgħu jippromwovu e preżentazzjoni ta 'antiġeni tal-wiċċ tat-tumur Ir-rikonoxximent taċ-ċelluli tal-kanċer minn ċelluli ċitotossiċi CD8 flimkien ma' T jiddependi fuq il-passaġġ TCR/CD3/kumpless ta 'istokompatibilità maġġuri (MHC-I). TCR jirċievi l-antiġen preżenti miċ-ċellula dendritika/proteina tal-membrana taċ-ċellula tal-kanċer CI u jittrasmetti s-sinjal biex jgħaqqad sewwa CD3, li mbagħad jestendi aktar fil-fond fiċ-ċitoplasma.9 10 Fl-istess ħin, bl-attivazzjoni tas-sinjal CD28/B7 , CD8 flimkien ma 'ċelluli T jistgħu jiġu koattivati ​​biex jirrikonoxxu u joqtlu ċelluli tal-kanċer. antiġeni preżenti.12 13 Liu et al irrappurtaw li l-inibizzjoni ta 'PCSK9 tista' tipprevjeni d-degradazzjoni ta 'MHC-I fil-liżosomi u tippermetti li MHC-I jirritorna lejn il-membrana taċ-ċellula biex jippreżenta l-antiġeni.12 Għalhekk, ir-restawr tal-funzjoni li tippreżenta l-antiġeni ta 'MHC-I huwa partikolarment importanti għall-imblukkar tal-ħarba immuni tat-tumur.

Numru dejjem jikber ta 'studji sabu li l-applikazzjoni ta' molekuli attivi tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża n intervent kontra t-tumur għandha prospetti kbar.14 15 Cycloastragenol (CAG) hija molekula attiva effettiva n Astragalus membranaceus, li għandha antivirali, antibatteriċi, anti- infjammatorji, u effetti farmakoloġiċi oħra, iżda l-effett antitumorali tiegħu rarament huwa rrappurtat. cathepsin B (CTSB), li jippromwovi l-preżentazzjoni tal-antiġen taċ-ċelluli tal-kanċer, u mbagħad ittejjeb il-kapaċità tal-qtil taċ-ċelluli CD8 flimkien ma 'T.

MATERJALI U METODI

Antikorpi u reaġenti

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 fil-mija). Antikorpi ta' CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929 ), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB{_1557426 ), Actin (Cat#{{{{ 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), Tubulin (Cat#10094-1-AP, PRID: AB{_2210695 ), u Kit ta' Sejbien ta' Immunoistokimika kontra l-ġrieden/fniek (Cat#PK10006) inxtraw mingħand Proteintech. Antikorpi ta' H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB{_626853), u CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) inxtraw minn Santa Cruz Biotechnology. Antikorp ta' Ki-67 (Cat#12202, PRID: AB_2620142 ) inxtara minn Cell Signaling Technology. Antikorp ta' Na/K ATPase (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) inxtara mingħand Abcam. Antikorpi taċ-ċitometrija tal-fluss ta' CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB{_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB{_2833003) u CD{ {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802 ) inxtraw mingħand BD Bioscience. Antikorp taċ-ċitometrija tal-fluss ta 'Gzmb-FITC (Cat# 515403, RRID: AB_2114575) inxtara minn BioLegend. Antikorpi taċ-ċitometrija tal-fluss ta' NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) u IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID :AB_466192) inxtraw mingħand Thermo Fisher Scientific. Medja DMEM (Cat#01-052-1ACS), PenicilinStreptomycin (Cat#15140122), u Serum Bovini Fetali (Cat#C04001-500) inxtraw mill-Industriji Bijoloġiċi. Serum tal-mogħoż (Cat#88RNG001) u Pierce BCA protein assay Kit (Cat#23225) inxtraw minn Thermo Fisher Scientific. L-antikorpi tal-PD-1 kontra l-bniedem (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) u PD kontra l-ġrieden-1 (Cat#BE0146, RRID: AB{_1094905 3) inxtraw minn Bio X cell. MACS Tumor Tissue Dissociation Kit (Cat#130-095-929) inxtara mingħand Miltenyi Biotec.

Kultura taċ-ċelluli

Il-linji taċ-ċelluli tal-kanċer tal-kolon tal-ġurdien MC38 u CT26 inżammu fil-laboratorju tagħna.20 Il-linji tal-kanċer tal-kolon uman l HCT-116 inkisbu mill-Kollezzjoni tal-Kultura tat-Tip tal-Akkademja tax-Xjenzi Ċiniża (Shanghai, iċ-Ċina). Iċ-ċelloli MC38, CT26, u HCT-116 ġew ikkultivati ​​f'mezz DMEM li kien fih 10 fil-mija serum bovin tal-fetu u 1 fil-mija penicillin/streptomycin f'37 grad f'inkubatur ta' 5 fil-mija CO2.

Esperiment tat-tumur tat-trapjant

Ġrieden femminili C57BL/6JGpt ta’ sitt tmien ġimgħat, ġrieden BALB/c, u ġrieden nude BALB/,c inxtraw minn GemPharmatech (Nanjing, iċ-Ċina). Ċelloli tal-kanċer MC38 jew CT26 (1 × 106) ġew imlaqqma taħt il-ġilda f'kull ġurdien. Fuq it-tumur jikber għal 100 mm3, il-mic kien maqsum b'mod każwali fi grupp saline buffered phosphate (PBS) (eż. darba kuljum) u l-grupp CAG (eż., 50mg/kg darba kuljum). Il-volumi tat-tumur ġew determinati bil-kejl tal-kalibru bl-użu tal-formula V=tul × wisa2 /2. Meta l-volum tat-tumur tal-ġrieden tal-grupp PBS laħaq 1000 mm3, it-tumur tal-ġrieden inħareġ, ġie fotografat, u miżun.

Dissoċjazzjoni ta 'ċellula waħda mill-ġurdien għal RNA ta' ċellula waħda/ATACseq

Tumuri solidi mill-ġrieden ġew diġeriti bl-użu ta 'Tumor Dissociation Kit biex jinkisbu ċelluli single cell. Ċellula waħdaSingle-cell s b'konċentrazzjoni ta '1000 ċellula/1000 ċellula mgħobbija fuq il-kontrollur tal-kromju 10 × ġenomika ċellula waħda ċellula waħda wara l-protokoll tal-manifattur 10 × ġenomika. Reaġenti tat-traskrizzjoni inversa, żibeġ tal-ġel tal-barcode, u żejt tal-qsim tħalltu maċ-ċelloli biex gen biex jiġġenera żibeġ tal-ġel f'emulsjonijiet (GEM) għal traskrizzjoni inversa. scRNA-seq data preproċessar u qua y kontroll.

Ibbażat fuq il-ġenoma ta' referenza tal-ġurdien GRCm38 (mm10), il-pipeline CellRanger V.4.0.0 (10×Genomics) biex tipproċessa RNA ta' ċellula waħda data tas-sekwenza għal kull esperiment (GSE197229). Matriċi tal-espressjoni tal-ġeni diġitali ġew zed f'R (V.4.0.4) bl-użu tal-pakkett Seurat (V.4.0.0).21 Qabel l-analiżi dBeforem, iċ-ċelloli ġew iffiltrati bin-numru UMI (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

Preproċessar tad-dejta SeaTac-seq u kontroll tal-kwalità

Id-dejta tal-ATAC-seq taċ-ċellula waħda (GSE197229) ġiet ipproċessata minn qabel minn cell ranger-at (V.2.0.0) bil-linja tal-kmand tal-għadd. Għall-ipproċessar u l-analiżi tad-dejta scATAC-seq sussegwenti, użajna l-pakkett ArchR (V.1.0.1).24 Imbagħad, użajna l-funzjoni addArchRGethe nome ('mm10') għall-annotazzjoni tal-ġenoma u ħoloq fajl vleġġa bil-funzjoni cre ArrowFiles bil-parametri default. Sussegwentement, użajna l-funzjoni filterDoublets biex inħassru d-doublets potenzjali u ħloqna proġett ArchR bl-użu tal-funzjoni ArchRPoject b'parametri default. Imbagħad użajna l-pakkett Harmony biex ineħħu l-effett tal-lott mill-funzjoni addHarmony.25 Għal tnaqqis tad-dimensjonalità, nużaw il-funzjoni addIterativeLSI fl-ArchR biex taħdem bil-parametri def t. Għall-inkorporazzjoni ta 'ċellula waħda, għażilna l-oġġett reducedDims b'armonija u użajna l-funzjoni addTSNE bil-parametru 'perplexity=30' għall-viżwalizzazzjoni.

Analiżi integrata ta 'data siRNA-seq u scATAC-seq

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Biex intejbu l-eżattezza tat-tbassir biex nintegraw aħjar iż-żewġ settijiet ta 'dejta, erġajna integrajna d-dejta scATAC-seq u scRNA-seq bl-użu tal-mod 'integrazzjoni ristretta'. Fil-qosor, aħna annotajna d-dejta scATAC-seq b'tipi ta 'ċelluli bbażati fuq il-punteġġi tal-ġeni ta' scATAC-seq. Imbagħad, ħloqna lista ristretta b'tali mod li x-xebh tal-espressjoni tal-ġeni ġie kkalkulat biss fl-istess tip ta 'ċellula kemm għal scATAC-seq kif ukoll għal scRNA-seq. Raggruppament mhux sorveljat b't-SNE żvela 13-il raggruppament ta 'sottoċelluli, li kienu annotati minn markaturi magħrufa jew putattivi fit-Tabella supplimentari onlajn 1.

Trajettorja tal-nisel psewdotime

It-trajettorja tan-nisel taċ-ċelluli taċ-ċelloli tal-kanċer ġiet inferita bl-użu tal-pakkett R Monocle2 (V.2.18.0).26 Il-monoċiti jitgħallmu l-graff prinċipali espliċitu minn dejta tal-ġenomika ta’ ċellula waħda permezz ta’ Inkorporazzjoni tal-Grafika Maqluba biex issolvi ċelloli, u b’hekk isolvu kumplessi proċessi bijoloġiċi b'mod robust u preċiż.27 Aħna użajna l-funzjoni ''differentialGeneTest'' biex niksbu DEG minn kull cluster, u wara li bnew it-trajettorja taċ-ċellula, skoprejna l-ġeni espressi b'mod differenzjali fil-psewdo ħin. Il-ġeni kollha li jiddependu mill-psewdo-ħin ġew viżwalizzati mill-funzjoni tal-plott_pseudotime_heatmap li tieħu oġġett CellDataSet. Plottijiet tat-trajettorja tan-nisel u kurvi ta' espressjoni bla xkiel ibbażati fuq CellDataSet ġew ġġenerati minn traġetorja ta' plot_ċellula_ u plot_ġeni_fi_psewdoħin, rispettivament.28

Ċellula waħda kopja numru varjazzjoni sejħa

Biex nidentifikaw ċelluli malinni b'varjazzjonijiet tan-numru tal-kopji kromosomali fuq skala kbira klonali (CNV), użajna l-pakkett inferCNV R biex niddeduċu l-profili ġenetiċi ta 'kull ċellula bbażati fuq l-espressjoni medja ta' settijiet ta 'ġeni kbar f'kull reġjun kromożomiku tal-ġenoma tat-tumur meta mqabbel ma' ċelloli normali.29 Fuq bażi ta’ kampjun b’kampjun, iċ-ċelloli immuni ntużaw bħala referenza biex jiġu stmati CNVs fiċ-ċelloli relatati mal-kanċer.

Analiżi ta' arrikkiment

L-analiżi tal-mogħdija KEGG u l-annotazzjoni GO twettqu bl-użu tal-pakkett R clusterProfiler (V.3.11.1) b'parametri ta' PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10, and MaxGSSize=500.20Analiżi ta' arrikkiment tas-sett ta' ġene (GSEA) ġiet applikata bl-użu ta' 50 sett ta' ġeni ta' karatteristika (h.all.V.7.4.symbols. gmt) biex jiġu identifikati arrikkit b'mod sinifikanti mogħdijiet funzjonali permezz ta' softwer GSEA (V.4.1.0), bi kriterji ta' skrining ta' valur P nominali<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Analiżi PCR kwantitattiva f'ħin reali

Iċ-ċelloli MC38 u HCT-116 ġew miżrugħa fi pjanċi b'sitt reċipjenti għal 6 sigħat u mbagħad ittrattati b'CAG għal 24 siegħa oħra. Iċ-ċelloli ġew maħsula tliet darbiet b'PBS kiesaħ, u ċentrifugati fi 180g għal 5min f'4 gradi. Fl-istess ħin, wara t-tħin tat-tessut tat-tumur. L-RNA totali ġie estratt minn ċelluli MC38, HCT-116, u tessut tat-tumur bl-użu tar-reaġent TRIzol, skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-volum ta' reazzjoni kien 20µL li kien fih: 1µg RNA, 5µL 5×Hiscript III qRT SuperMix, u RNase Free dH2 O. Is-cDNA kien suġġett għal PCR kwantitattiv, b'volum ta' reazzjoni ta' 10µL b'1µL cDNA, 5µL taħlita qPCR, 0.75µL primers (Forward u Reverse), u 3.25µL dH2 O mingħajr RNase. Il-primers ġew sintetizzati minn GenScript Biotech Corporation (Nanjing, iċ-Ċina) skont is-sekwenzi li ġejjin (tabella supplimentari onlajn 2).

Skoperta ta' mira permezz ta' approċċ ta' profiling ta' aċċessibbiltà li jirreaġixxi għall-mira

L-iskrinjar tal-proteini li jorbtu lil CAG sar kif deskritt qabel.31 32 Fil-qosor, l-approċċ tal-profiling tal-aċċessibbiltà li jirreaġixxi għall-mira (TRAP) kien impjegat biex jiskopru l-proteini li jorbtu għal CAG fil-ambjent taċ-ċelluli billi tiġi mmonitorjata l-lysine indotta mill-ingaġġ tal-ligand l-aċċessibbiltà tinbidel fuq livell tal-proteome. Fil-qosor, żewġ dixxijiet taċ-ċelloli ġew ittrattati b'10µM CAG u dimethyl sulfoxide (DMSO), rispettivament. Wara 1-siegħa inkubazzjoni, iċ-ċelloli ġew permeabilizzati minn buffer M-PER (Thermo Xjentifiku) u l-lysates riżultanti ġew ittikkettati b'mod kovalenti biż-żieda ta 'formaldehyde u borane pyridine complex li flimkien speċifikament ittikkettjaw residwi proteinaceous lysine f'temperatura tal-kamra għal profili ta' aċċessibbiltà . Imbagħad, il-lysates ġew preċipitati b'solvent organiku, u l-gerbub miġbura ġew maħlula mill-ġdid fi 8mol/L urea, imnaqqsa b'dithiothreitol (DTT) f'56 grad għal 30min, segwit minn alkilazzjoni bl-użu ta 'iodoacetamide (IAA) fid-dlam għal 30min. Ammont xieraq ta' soluzzjoni DTT reġa' ġie miżjud biex jirreaġixxi ma' IAA żejjed. Sussegwentement, il-proteome ġie dilwit b'soluzzjoni ta 'bikarbonat ta' l-ammonju sakemm il-konċentrazzjoni finali ta 'urea tilħaq 1mol/L. Id-diġesti tal-proteini miġbura ġew imneħħija mill-melħ fuq kolonni C18 HLB (Waters, Milford, Massachusetts, USA), u l-peptidi arrikkit ġew imnixxfa u rikostitwiti f'soluzzjoni milwiema ta '0.1 fil-mija ta' aċidu formiku (FA). Is-sistema AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Ilmijiet) ġiet impjegata biex tanalizza l-kampjuni għal profili kwantitattivi tal-bidliet fl-aċċessibbiltà tal-lysine b'reazzjoni għall-irbit tal-CAG għall-iskoperta tal-mira. L-akkwist tad-dipendenza tad-dejta fil-mod pożittiv kien impjegat għall-akkwist tad-dejta. L-analiżi tad-dejta saret bl-użu ta 'PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Kanada). Speċifikament, l-alkilazzjoni cys intgħażlet bħala modifika fissa, u l-ossidazzjoni tal-methionine u d-dimetilazzjoni tal-lysine, miksuba bit-tikkettar TRAP, ġew stabbiliti bħala modifiki varjabbli. Fil-qosor, peptidi li fihom dimetilazzjoni indotta mit-TRAP u wrew bidliet sinifikanti fl-abbundanza bi u mingħajr inkubazzjoni CAG ġew assenjati bħala peptidi li jirrispondu għall-mira. Il-proporzjon ta 'l-abbundanza ta' kull peptide tikkettat bit-TRAP jindika l-firxa tal-bidla fl-aċċessibbiltà u huwa assoċjat intimament ma 'affinità li torbot il-ligand. It-test t ta' Student sar biex jiġi vvalutat jekk il-bidliet fl-aċċessibbiltà misjuba ta' peptidi ttikkettjati humiex statistikament sinifikanti. Valur p intergrupp (p<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Kultura organoid

L-organoids tal-kanċer tal-kolorektum uman ġew mibnija u kkultivati ​​minn Chongqing Kingbiotech.33 Kampjuni tat-tessut tal-pazjent akkwistati mill-operazzjoni kirurġika ġew ikkapuljati f'biċċiet żgħar kemm jista 'jkun b'imqass sterili. Il-biċċiet tat-tessut tħalltu sewwa ma 'Matrigel (Corning, Cat#356231) fil-proporzjon approssimattiv ta' 1:4 fuq is-silġ. L-ipproċessar sussegwenti rrefera għal protokolli ppubblikati. Fil-qosor, is-sospensjonijiet tal-biċċiet-Matrigel ġew miżrugħa malajr fil-pjanċa multiwell biex jiffurmaw qtar emisferiċi u ttrasferiti għal 37 grad għal 15-20min, li ppermetta li l-qtar jissolidifikaw. Żid l-ammont xieraq ta’ mezz ta’ kultura (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​ma’ kull bir, u biddel il-medium kull 2–4 ijiem.

Iżolament u kultura ta 'ċelluli T CD8 umani

Żid l-istess volum ta 'salina normali mad-demm periferali ta' nies b'saħħithom li jkun fihom antikoagulanti biex iddilwixxi d-demm sħiħ. Żid ċertu volum ta 'soluzzjoni ta' separazzjoni għal tubu ċentrifugu ta '15mL, żid bil-mod id-demm sħiħ dilwit tul il-ħajt tat-tubu mal-quċċata tas-soluzzjoni ta' separazzjoni, u ċentrifuga f'750g għal 20min. Wara ċ-ċentrifugazzjoni, uża pipetta biex terda bir-reqqa l-monoċiti fis-saff abjad tan-nofs f'tubu ċentrifugu ta '15mL, żid ċertu volum ta' PBS biex terġa 'tissuspendi, ċentrifuga 250g għal 5min, u armi s-supernatant. Wara li żżid żibeġ manjetiċi CD8 umani mal-preċipitati taċ-ċelluli, iċ-ċelluli T CD8 ġew magħżula bil-kolonna tal-issortjar LS. Ċelloli T CD8 ġew miżjuda mal-pjanċa mtaqqba miksija minn qabel b'5µg/mL CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB{_2865578) antikorp, u mbagħad 10ng/mL IL{{15} } (Peprotech Cat# 212-12) u 5µg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) ġew miżjuda antikorpi funzjonali kkultivati ​​għal 24 siegħa.

Kokultura

Wara li l-organoids ġew inkubati b'CAG għal 24 siegħa, il-mezz tal-kultura frisk ġie sostitwit, u mbagħad l-organoids u ċ-ċelluli T CD8 attivati ​​ġew sospiżi fil-ġel matriċi, imbagħad is-sospensjoni ġiet miżjuda mal-pjanċa ta 'sitt bir u mqiegħda fil-37 inkubatur ta 'grad għal 15min, u mbagħad 2mL mezz ta' kultura komplet mingħajr serum ġie miżjud għal 24 siegħa.

Punent blot

Iċ-ċelloli MC38 u HCT-116 ġew miżrugħa fi pjanċi b'sitt reċipjenti għal 6 sigħat u mbagħad ittrattati b'CAG għal 24 siegħa oħra. Iċ-ċelloli ġew maħsula tliet darbiet b'PBS kiesaħ, u ċentrifugati f'180g għal 5 minuti f'4 gradi. Il-proteina totali ġiet lysed b'liżi WB-IP li fiha 1 fil-mija inibitur tal-protease għal 30min fuq is-silġ. Proteina totali ġiet ivvalutata bl-użu ta 'kit ta' kwantifikazzjoni tal-proteini BCA. Il-kampjuni tal-proteini ġew separati b'elettroforeżi tal-ġel tal-polyacrylamide SDS 10 fil-mija -12 fil-mija u ttrasferiti għal membrani PVDF (fluworidu tal-polyvinylidene) f'350 mA għal 90min. Il-membrani PVDF ġew imblukkati b'5 fil-mija BSA għal siegħa, l-istrixxi bl-antikorp primarju indikat matul il-lejl, u bl-antikorp sekondarju inkubat għal 90min f'temperatura tal-kamra. Fl-aħħarnett, l-istrixxi ġew skoperti bl-użu ta 'sistema ta' sottostrat kimiluminixxenti LumiGLO (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA).

Ċitometrija tal-fluss

Wara d-diġestjoni tat-tessut tat-tumur u s-sospensjoni ta 'ċellula waħda ġiet ippreparata. It-tbajja tal-wiċċ twettqet b'antikorpi tal-antiġen tal-wiċċ fil-buffer FCM (Flow Cytometry) (PBS li fih 1 fil-mija FBS) u mtebbgħin fuq is-silġ b'antikorpi xierqa għal 30min. Żebgħat reattivi (eBioscience) intużaw biex jeliminaw iċ-ċelloli mejta. Tbajja intraċellulari taċ-ċitokini twettqet b'soluzzjoni fissattiva taċ-ċelluli BD / soluzzjoni tal-membrana extraċellulari, u ċ-ċelloli ġew iffissati u permeated, u mbagħad imtebbgħin b'antikorpi kontra ċitokini f'Perm/Wash buffer (BD Biosciences).

Plażmidi mutanti CTSB trasfettati

Iċ-ċelloli HCT-116 ġew miżrugħa fi pjanċi 6-bjar għal 12-il siegħa u mbagħad trasfettati bi plasmidi mutanti CTSB-WT-EGFP jew CTSB (Y75A, A77V, u G198A) għal 36 siegħa.

Interferenza ta' trasfezzjoni jew plasmid ta' espressjoni żejda ta' CTSB f'ċelloli MC38 jew ċelloli HCT-116

Ċelloli MC38 (1 × 106 /bir) ġew imlaqqma fi pjanċi 6-bir għal 6 sigħat, imbagħad trasfettati b'RNA li jinterferixxi CTSB (sekwenza: Forward-GGACAUAGAUCUACCUGAATT u Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) għal 48 siegħa, u l-mRNA jew il-livelli tal-espressjoni tal-proteini ta' Ctsb u H2-k1 ġew skoperti. Iċ-ċelloli HCT-116 (1 × 106 /bir) ġew imlaqqma fi pjanċi 6-bjar għal 6 sigħat, imbagħad trasfettati b'interferenza CTSB (sekwenza: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) jew plasmid ta' espressjoni żejda għal 48 siegħa, u l-mRNA jew livelli ta' espressjoni ta' proteini ta' CTSB u HLA-A ġew skoperti.

Teknoloġija ta 'docking

L-istruttura 3D ta 'CTSB ġiet imniżżla mill-Protein Database (PDB ID: 2iPP), u l-istrutturi ta' CAG ġew imniżżla minn PubChem. Il-proċess ta 'docking sar f'Autodock 2 b'docking oħxon bl-użu ta' algoritmu ta 'ttemprar simulat u rfinar sussegwenti bl-użu ta' algoritmu ġenetiku.

Assaġġ taċ-ċaqliq termali ċellulari

Iċ-ċelloli MC38 ġew miżrugħa fi pjanċi ta' 10ċm matul il-lejl u mbagħad ittrattati b'CAG jew 0.1 fil-mija DMSO għal sagħtejn oħra. Iċ-ċelloli nġabru, inħaslu b'PBS kiesaħ, u ġew ċentrifugati f'180g għal 5min. Iċ-ċelloli mbagħad ġew maqsuma indaqs f'tubi ta 'ċentrifugazzjoni (70µL kull tubu) u msaħħna għal 3min fit-temperatura li ġejja: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, u 67 grad, il-kampjuni tkessħu għal 3min f'temperaturi u imbagħad jinżammu fuq is-silġ. Imbagħad, il-kampjuni tpoġġew fi friġġ f'-80 grad matul il-lejl. Il-kampjuni ġew imdewweb f'temperatura tal-kamra għal 30min u mbagħad imkessħa f'-80 grad għal 4 sigħat. Fl-aħħarnett, il-kampjuni ġew ċentrifugati fi 12, 000g għal 25min, is-supernatant miżjud mal-buffer tat-tagħbija, u analizzati permezz ta 'Western blotting.

Tbajja immunoistokimika

Sezzjonijiet tal-paraffin tat-tessut tat-tumur ġew mgħaddsa fil-xylene għal 20min għad-dewax, u mbagħad f'100 fil-mija, 75 fil-mija, u 50 fil-mija etanol għal 10min. Wara li l-flieli ġew soġġetti għal tiswija ta 'antiġeni b'soluzzjoni ta' tiswija ta 'antiġen taċ-ċitrat tas-sodju, il-perossidu tal-idroġenu endoġenu ġie inattivat bi 3 fil-mija perossidu tal-idroġenu. Wara l-imblukkar b'5 fil-mija serum tal-mogħoż għal siegħa, l-antikorp anti-Ki67 (1:200) ġie miżjud u inkubat matul il-lejl f'4 gradi. Ġie miżjud il-polimeru tikkettat HRP kontra l-ġurdien/fenek (100µL) u l-kampjuni ġew inkubati f'37 grad għal 30min, segwit minn 100µL ta 'soluzzjoni ta' ħidma DAB, u inkubazzjoni f'temperatura tal-kamra għal 5min. Wara 1min ta 'tbajja' b'ematossilin, il-kampjuni ġew maħsula f'50 fil-mija, 75 fil-mija, u 100 fil-mija etanol u xylene għal 5 min, u ntużat gomma newtrali biex tissiġilla l-film. Il-film ġie osservat u fotografat taħt mikroskopju.

Statistikaanaliżi

Analiżi statistika saret bl-użu tas-softwer GraphPad Prism (V.8.0). Ir-riżultati kollha huma espressi bħala l-medja ± SEM ta 'tliet esperimenti indipendenti. Analiżi one-way tal-varjanza segwita mit-test post hoc ta' Dunnett intużat biex tevalwa d-differenzi meta kien hemm aktar minn żewġ gruppi. It-test t tal-Istudent intuża biex jevalwa d-differenza sinifikanti bejn iż-żewġ gruppi. Sinifikat statistiku ġie stabbilit f'p<0.05.

RIŻULTATI

Analiżi multi-omics ta 'ċellula waħda ta' CAG li jinibixxi t-tkabbir ta 'kanċer tal-kolon trapjantat fil-ġrieden

Biex ninvestigaw jekk il-CAG għandux effett kontra t-tumur, l-ewwel trapjantajna ċelluli tal-kanċer MC38 fi ġrieden C57BL/6. Aħna nnutajna li CAG inibixxi b'mod sinifikanti t-tkabbir ta 'tumuri (figura supplimentari onlajn S1A, B). Sussegwentement, aħna trapjantajna ċelloli CT26 fi ġrieden BALB/c u sibna li CAG inibixxi wkoll it-tkabbir ta 'tumuri (figura supplimentari onlajn S1C, D).

Biex tiżvela aktar il-mekkaniżmu speċifiku li bih il-CAG jinibixxi t-tkabbir tat-tumur, analiznajna bl-użu tat-tekniki scRNA-seq u scATAC-seq (figura 1A). Qassamna l-popolazzjoni taċ-ċelluli f'erba 'gruppi: ċelluli tal-kanċer, fibroblasti, ċelluli majelojdi, u limfoċiti (figura 1B, figura supplimentari onlajn S2A, B). Sibna li ċ-ċelloli tal-kanċer (52 fil-mija) u l-fibroblasti (41 fil-mija) kienu prinċipalment infiltrati fit-tessuti tat-tumur, filwaqt li ċ-ċelloli immuni kienu jammontaw għal 7 fil-mija biss. Imbagħad qsamna ċ-ċelloli tal-kanċer fi tmien sottosettijiet u fibroblasti fi tliet sottosettijiet (figura 1C–E). Sussegwentement, l-analiżi ta 'arrikkiment ta' ġeni espressi ħafna f'kull popolazzjoni taċ-ċelluli wriet li l-mogħdijiet molekulari MHC-I fiċ-ċelloli tal-kanċer ġew arrikkit, kif kienu s-sinjali antitumorali ta 'ċelluli T u ċelluli NK (figura supplimentari onlajn S2C). Imbagħad, instabu wkoll erba 'gruppi ta' ċelloli bl-użu ta 'analiżi ta' integrazzjoni scATAC-seq u scRNA-seq (figura 2D-G). Wara t-tqabbil, sibna li ċ-ċelluli tal-kanċer (ċelluli C01, C03), CD8 flimkien ma 'ċelluli T, Spp1 flimkien ma' ċelluli TAM, u fibroblasti (ċelluli F01 u F02) dehru fis-sekwenzjar ATAC (figura 1F, G), u aktar, espressi ħafna fatturi ta 'traskrizzjoni ġew arrikkit f'dawn iċ-ċelloli (figura 1H). Permezz ta 'dawn l-analiżi, aħna nispekulaw li l-inibizzjoni tat-tkabbir tat-tumur minn CAG hija relatata mill-qrib ma' bidliet f'dawn iċ-ċelloli.

Cag jippromwovi l-preżentazzjoni tal-antiġen taċ-ċelluli tat-tumur

Biex tanalizza l-mekkaniżmu kontra t-tumur ta 'CAG, l-ewwel analizzajna l-popolazzjoni taċ-ċelluli tat-tumur u qsamna ċ-ċelloli tal-kanċer fi tmien sottogruppi (figura 2A, B, figura supplimentari onlajn S3A). Ir-riżultati wrew li, meta mqabbla mal-grupp PBS, iċ-ċelloli tal-grupp C05 naqsu b'mod sinifikanti filwaqt li ċ-ċelloli tal-grupp C07 żdiedu (figura 2C). Sadanittant, biex tivverifika l-eżattezza tar-raggruppament taċ-ċelluli tat-tumur tagħna, qabbilna s-CNV ta 'limfoċiti u ċelluli majelojdi bħala ċelloli ta' referenza. Ir-riżultati wrew li s-CNV taċ-ċelloli tal-kanċer kien ogħla b'mod sinifikanti minn dak taċ-ċelloli immuni (figura supplimentari onlajn S3B). Meta analizzajna s-sottosettijiet ta 'ċelluli tal-kanċer, sibna li l-ġeni tar-rispons għall-interferon Isg15, Irf7, Ifit3 u Ifi47 kienu espressi ħafna fil-popolazzjonijiet taċ-ċelluli C07 u C08 tal-grupp CAG meta mqabbla mal-grupp PBS (figura supplimentari onlajn S3C). L-analiżi tal-popolazzjoni taċ-ċelluli tat-tumur sabet li l-mogħdijiet relatati mal-preżentazzjoni tal-antiġeni kienu arrikkit b'mod sinifikanti f'popolazzjonijiet ta 'ċelluli multipli. Għalhekk, aħna nispekulaw li CAG jista 'jippromwovi l-preżentazzjoni tal-antiġen taċ-ċelloli tal-kanċer biex ikollhom rwol antitumorali (figura 2D). Imbagħad, għażilna l-ġeni relatati mal-preżentazzjoni tal-antiġen u sibna li l-livell ta 'espressjoni fil-grupp CAG kien ogħla b'mod sinifikanti minn dak fil-grupp PBS (figura 2E, figura supplimentari onlajn S3D). Sibna wkoll li CAG ippromwova l-preżentazzjoni tal-antiġeni fit-tessuti tat-tumur (figura 2F, G).

Sussegwentement, użajna scATAC-seq biex tanalizza r-raġunijiet speċifiċi wara l-preżentazzjoni tal-antiġeni taċ-ċelluli tat-tumur li jippromwovu l-CAG. Sibna li l-popolazzjoni taċ-ċelluli tat-tumur espressa ħafna l-fatturi ta 'traskrizzjoni Fos, Junb, Jund, Fosb, u Fosl1 (figura 2H, I). Sussegwentement, bnejna mappa tal-interazzjoni bejn fatturi ta 'traskrizzjoni u ġeni korrispondenti biex nispjegaw li CAG ippromwoviet l-espressjoni ta' ġeni relatati mal-preżentazzjoni tal-antiġen taċ-ċelluli tat-tumur (figura 2J). Fit-tessuti tat-tumur, sibna wkoll li l-fatturi ta 'traskrizzjoni Junb, Fos, Jund u Fosb kienu espressi żżejjed b'mod sinifikanti fil-grupp PBS taħt trattament CAG (figura 2K-N, figura supplimentari onlajn S3E-I). S'issa, sibna li CAG jista 'jippromwovi l-espressjoni ta' fatturi ta 'traskrizzjoni ta' ġeni relatati mal-preżentazzjoni tal-antiġenu, u b'hekk ittejjeb il-funzjoni li tippreżenta l-antiġenu taċ-ċelloli tal-kanċer. Madankollu, kif dawn iċ-ċelloli tal-kanċer jirrispondu għar-reazzjonijiet taċ-ċelloli immuni għadu mhux ċar.

Biex niskopru l-fenomenu li bih il-CAG jippromwovi l-preżentazzjoni tal-antiġen taċ-ċelloli tal-kanċer, għamilna analiżi tat-trajettorja biex ninvestigaw kif iċ-ċelloli tal-kanċer jibdlu lil xulxin b'reazzjoni għar-reazzjonijiet taċ-ċelloli immuni. Sibna li, maż-żmien, iċ-ċelloli tal-kanċer C07 trasformati f'ċelloli C05, C06, u C08, u l-arrikkiment tal-ġeni wera wkoll li ċ-ċelloli tal-kanċer jittrasformaw għal preżentazzjoni ta 'antiġen (figura 3A–E).

CAG isaħħaħ il-funzjoni tal-qtil taċ-ċelloli immuni

Dawn ir-riżultati juru li CAG jista 'jippreżenta antiġeni taċ-ċelluli tat-tumur, għalhekk it-titjib tal-preżentazzjoni tal-antiġeni taċ-ċelluli tat-tumur se jwassal għat-titjib tal-funzjoni taċ-ċelluli immuni? Biex insemmu dan, analizzajna l-limfoċiti u ċ-ċelloli majelojdi, rispettivament. Ir-riżultati wrew li CAG ippromwova l-infiltrazzjoni ta 'ċelluli CD8 flimkien ma' T fit-tessuti tat-tumur, u l-infiltrazzjoni ta 'ċelluli CD8 flimkien ma' T u ċelluli NK żdiedet ukoll, misjuba permezz ta 'ċitometrija tal-fluss (figura supplimentari onlajn S4A-F). Aħna osservajna wkoll li CAG tejjeb l-espressjoni tal-ġeni Ifitm2, Cxcr6, u S100a6 fiċ-ċelluli CD8 flimkien ma 'T,

Ġeni Fcer1g, Gzmb, AW112010, u Zfp36i2 f'ċelloli NK, u ġeni Nfkbia u Junb f'ċelloli CD4 flimkien ma 'T (figura supplimentari onlajn S4G). L-espressjoni ta 'Ifng u Gzmb fiċ-ċelluli CD8 flimkien ma' T tjiebet ukoll b'mod sinifikanti, kif misjuba minn ċitometrija tal-fluss (figura supplimentari onlajn S4H, I). Barra minn hekk, sibna li wara t-trattament CAG, l-espressjoni tar-riċetturi inibitorji Lag3, Tigit, u Havcr2 fuq il-wiċċ taċ-ċelluli CD8 flimkien ma 'T naqset, u l-espressjoni tal-ġeni Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5, u Pdcd1, li tikkaratterizza l- attivazzjoni ta 'ċelluli CD8 flimkien ma' T, żdiedet b'mod sinifikanti (figura supplimentari onlajn S4J). Biex nivverifikaw aktar li CAG tejbet il-funzjoni tal-qtil taċ-ċelluli CD8 flimkien ma 'T billi ppromwoviet preżentazzjoni mtejba tal-antiġen tat-tumur, aħna trapjantajna ċelluli CT26 f'tumuri trapjantati fi ġrieden nude u osservajna li CAG ma setax jinibixxi b'mod effettiv it-tkabbir ta' tumuri (figura supplimentari onlajn S4K-M ).

Wara dan, analizzajna ċ-ċelloli majelojdi u sibna li ċ-ċelloli Spp1 flimkien ma 'TAM żdiedu wara t-trattament CAG, filwaqt li n-numru ta' ċelloli C1qc flimkien ma 'TAM naqas u n-numru ta' Il1b flimkien ma 'monoċiti żdied (figura supplimentari onlajn S5A-D). Wara t-trattament CAG, Spp1 flimkien ma 'TAM u C1qc flimkien ma' ċelluli TAM kienu aktar suxxettibbli għal trasformazzjoni TAM pro-infjammatorja. L-analiżi ta 'arrikkiment sabet li ffokat prinċipalment fuq Tnf-, Ifn-g, u l-mogħdija ta' sinjalazzjoni ta 'rispons infjammatorju (figura supplimentari onlajn S5E-H). Abbażi tar-riżultati msemmija hawn fuq, aħna niddeduċu li l-CAG isaħħaħ ir-rikonoxximent u l-funzjoni tal-qtil taċ-ċelloli immuni billi jippromwovi l-preżentazzjoni tal-antiġen fiċ-ċelloli tal-kanċer. Madankollu, kif huwa regolat is-CAG mhuwiex ċar.

Skoperta tal-proteina fil-mira CAG CTSB permezz ta' nassa

Sussegwentement, se ninvestigaw il-proteina speċifika fil-mira CAG li għandha rwol kontra t-tumur. Aħna għażilna ċelluli tal-kanċer bħala l-oġġett ta 'riċerka għaliex sibna li l-CAG jista' jtejjeb il-preżentazzjoni tal-antiġen taċ-ċelloli tal-kanċer, u b'hekk ittejjeb il-funzjoni tal-qtil taċ-ċelloli immuni. L-ewwel sintetizzajna d-derivattiv tal-bijotina ta 'CAG u sibna li 3-OH biss jista' jirreaġixxi (figura supplimentari onlajn S6A). Imbagħad investigajna jekk CAG-biotin jippromwovix ukoll l-espressjoni ta 'ġeni relatati mal-preżentazzjoni tal-antiġen fil-linja taċ-ċelluli tat-tumur MC38 tal-ġurdien. Ir-riżultati juru li CAG-biotin ma affettwax l-espressjoni tal-ġeni H2-K1, Cd74, u Anxa1 (figura supplimentari onlajn S6B-D).

Għalhekk, użajna l-metodu ta 'tfittxija tal-mira TRAP preċedenti fil-laboratorju.32 CAG u DMSO kienu t-tnejn inkubati bil-linja taċ-ċelluli MC38 (figura 4A). Aħna għażilna l-proteina b'FC akbar minn jew ugwali għal 2 u ap Inqas minn jew ugwali għal 0.05 bħala l-proteina fil-mira kandidata ta 'CAG. Wara l-prinċipju li l-irbit ta 'molekuli żgħar mal-proteini se jwassal għall-effiċjenza baxxa tat-tikkettar tal-lysine, għażilna s-CTSB għall-istudju (figura 4B). Sussegwentement, użajna assaġġ taċ-ċaqliq termali ċellulari (figura 4C) u termoforeżi mikroskala (MST) (figura 4D) biex nivverifikaw ir-rabta bejn CAG u CTSB, u sibna li l-affinità bejn CAG u CTSB kienet 26.6nM (figura 4D). Sussegwentement, aħna mbassra s-siti ta 'rbit bejn CAG u CTSB skont l-istruttura tal-kristall tal-proteina ta' CTSB fil-librerija PDB. Sibna li l-gruppi hydroxyl fiż-żewġt itruf ta 'CAG u s-siti ALA77 u GLY198 ta' CTSB kienu marbuta b'bond ta 'idroġenu, filwaqt li s-siti TYR75, PRO76, u ALA173 ta' CAG u CTSB kienu marbuta bil-forza ta 'van der Waals (figura 4E) . Biex nivverifikaw is-sit ta' rbit bejn CAG u CTSB, aħna ttrasfettajna l-plasmid mutant ta' CTSB fiċ-ċelloli HCT-116. Ir-riżultati juru li l-affinità bejn il-plasmid mutant f'A77V u G198A u CAG kienet mijiet ta 'darbiet ogħla minn dik tal-plasmid WT (figura 4F, G). Fit-taqsima li jmiss, nesploraw il-mekkaniżmu speċifiku li bih CAG għandu rwol kontra t-tumur permezz ta 'CTSB.

【Għal aktar informazzjoni:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】