Identifikazzjoni Sistematika U Tqabbil Tal-Profili Espressi Ta' MiRNAs Exosomali fil-Ħnieżer Infettati B'NADC30-bħal PRRSV Strain

Sommarju sempliċi:L-eżosomi għandhom rwol uniku fl-infezzjoni tal-virus, il-preżentazzjoni tal-antiġeni, u t-trażżin/promozzjoni tal-immunità tal-ġisem. Il-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer (PRRSV) huwa wieħed mill-aktar patoġeni ta 'ħsara fl-industrija tal-ħnieżer. Hawnhekk, użajna l-PRRSV NADC30-bħar-razza CHsx1401 biex tinfetta b'mod artifiċjali 42-ħnieżer ta' ġurnata, iżolati eżosomi tas-serum, u nidentifikaw 33 miRNAs eżosomali espressi b'mod differenzjat (DE) b'mod sinifikanti bejn gruppi ta' infezzjoni u ta' kontroll, u 18-il DE miRNAs assoċjati ma 'infezzjoni u immunità PRRSV ġew skrinjati bħala molekuli funzjonali potenzjali involuti fir-regolazzjoni ta' infezzjoni tal-virus PRRSV minn exosomes.

Astratt:L-eżożomi huma vesikli bijoloġiċi mnixxija u rilaxxati minn ċelluli li jaġixxu bħala medjaturi tal-komunikazzjoni interċellulari u għandhom rwol uniku fl-infezzjoni tal-virus, il-preżentazzjoni tal-antiġeni, u t-trażżin/promozzjoni tal-immunità tal-ġisem. Il-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer (PRRSV) huwa wieħed mill-aktar patoġeni ta 'ħsara fl-industrija tal-ħnieżer u jista' jikkawża disturbi riproduttivi fil-majjali nisa, mard respiratorju fil-ħnieżer, prestazzjoni mnaqqsa tat-tkabbir, u mard ieħor li jwassal għal mortalità tal-ħnieżer. F'dan l-istudju, użajna l-PRRSV NADC30-bħar-razza CHsx1401 biex infettaw b'mod artifiċjali 42-ħnieżer ta' ġurnata u niżolaw l-eżosomi tas-serum. Ibbażat fuq teknoloġija ta 'sekwenzjar ta' fluss għoli, 305 miRNAs ġew identifikati f'eżosomi tas-serum qabel u wara l-infezzjoni, li fosthom 33 miRNAs kienu espressi b'mod differenzjat sinifikanti bejn il-gruppi (13 relattivament upregulated u 20 relattivament downregulated). L-analiżi tal-konservazzjoni tas-sekwenza tal-ġenoma CHsx1401 identifikat 8 reġjuni kkonservati, li minnhom total ta’ 16-il miRNA espressi b’mod differenzjali (DE) kienu mbassra li jorbtu mar-reġjun konservat l-eqreb tat-3.0 UTR tal-ġenoma CHsx1401, inklużi 5 DE miRNAs kapaċi jorbot mal-CHsx1401 30 UTR (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, ssc-miR-6529). Analiżi ulterjuri wriet li l-ġeni fil-mira ta 'miRNAs espressi b'mod differenzjat kienu involuti b'mod wiesa' f'mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni relatati mal-funzjoni exosomal u relatati mal-immunità intrinsika, u 18-il DE miRNAs (ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 , ssc-miR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, eċċ.) assoċjati mal-infezzjoni u l-immunità tal-PRRSV ġew skrinjati bħala molekuli funzjonali potenzjali involuti fir-regolazzjoni tal-infezzjoni tal-virus PRRSV mill-eżosomi.

sistema immunitarja li żżid il-pjanti cistanche

Kliem ewlieni:PRRSV; eżosoma tas-serum; miRNAs

1. Introduzzjoni

Il-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer (PRRSV) huwa virus RNA ta 'linja pożittiva b'linja waħda bi struttura ta' envelop li tappartjeni għall-ordni Nidovirales, familja Arteriviridae, ġeneru Betaarterivirus [1,2]. Huwa sferiku jew ellissoidal b'dijametru ta '50-65 nm taħt mikroskopju elettroniku tal-iffriżar [3,4]. Il-ġenoma tal-PRRSV huwa tul ta' madwar 15 kb b'għatu ta' 50 u denb ta' 30 polyA u fih mill-inqas 10 frejms ta' qari miftuħa (ORFs) akkumpanjati minn reġjuni mhux tradotti (UTRs) kemm fil-50 kif ukoll fit-30 termini [5,6] u hija mgeżwra minn proteina nukleokapsid, b'kisja b'saff doppju tal-lipidi biex tifforma partiċelli tal-virus. L-eżosomi jappartjenu għal vesikuli bi strutturi ta 'membrana monosaff u għandhom l-istess struttura topoloġika bħaċ-ċelloli [7]. Il-forma hija "forma ta' tazza" jew "forma ta' diska" taħt mikroskopju elettroniku [8,9]. Exosomes jistgħu jeżistu fis-sistema ċirkolatorja għal żmien twil, u sustanzi fl-exosomes jistgħu jiġu assorbiti minn ċelluli maġenb jew ċelluli riċetturi mbiegħda u mbagħad jirregolaw iċ-ċelluli riċetturi biex jipparteċipaw fl-iskambju ta 'materjali ġenetiċi bejn iċ-ċelloli [10,11]. Huma magħmulin prinċipalment minn sustanzi tal-wiċċ tal-membrana u kontenuti li jinġarru, inklużi riċetturi tal-wiċċ taċ-ċelluli, proteini tal-membrana, proteini solubbli, lipidi, RNA (mRNA, miRNA, lncRNA, u RNA virali, eċċ.), DNA ġenomika, DNA mitokondrijali [12–14] ]. MicroRNAs (miRNAs) huma klassi ta '18-25 nukleotide (nt) RNAs żgħar b'linja waħda endoġeni mhux kodifikati kkonservati evoluzzjonalment, li jinibixxu l-proċess ta' traduzzjoni billi jinduċu d-degradazzjoni ta 'mRNA fil-mira jew billi jorbtu ma' 30 UTR ta 'mRNA fil-mira, li jwassal għal sajlenser tal-ġeni ta 'wara t-traskrizzjoni, imbagħad tirregola l-espressjoni tal-ġeni fil-livell ta' wara t-traskrizzjoni [15-17]. Huwa stmat li l-miRNAs jirregolaw aktar minn 60% tal-ġeni tal-mammiferi wara t-traskrizzjoni [18,19]. Il-MiRNAs għandhom rwol importanti fil-komunikazzjoni interċellulari u jistgħu jintużaw ukoll bħala molekula funzjonali potenzjali għall-infezzjoni, it-trażmissjoni u d-difiża tal-mard u l-virus [20]. Numru dejjem jikber ta 'studji wrew li l-miRNAs jistgħu jkunu preżenti fil-fluwidi tal-ġisem, bħall-bżieq, l-awrina, il-ħalib tas-sider u d-demm, u jaġixxu permezz tas-sistema ċirkolatorja tal-fluwidu tal-ġisem [21,22]. Il-miRNAs eżosomali huma kkunsidrati bħala regolaturi endoġeni tal-espressjoni tal-ġeni u l-metaboliżmu u jistgħu jindikaw kundizzjonijiet patoloġiċi varji [23,24].

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Matul l-aħħar għoxrin sena, intwera li l-miRNAs għandhom rwoli kruċjali fir-regolamentazzjoni tal-iżvilupp taċ-ċelluli immuni, risponsi immuni intrinsiċi, u risponsi immuni akkwiżiti. Xi miRNAs oħra huma rrappurtati li jfixklu l-infezzjoni tal-PRRSV permezz tal-modi li ġejjin, jimmiraw direttament il-ġenoma tal-PRRSV jew ir-riċettur tal-PRRSV, jew għandhom rwol billi jirregolaw ir-rispons immuni innat tal-ospitant. Il-familja miR-26 tista' tagħmel ħsara sinifikanti lir-replikazzjoni tal-virus, u miR-26a tista' tinibixxi r-replikazzjoni ta' razez PRRSV tat-tip 1 u tat-tip 2 f'makrofaġi alveolari tal-ħnieżer (PAMs) billi tirregola l-interferon tat-tip I (IFN) mogħdija, li hija aktar effiċjenti minn miR-26b [25,26]. miR-30ċ u miR{-125b huma identifikati biex jimmodulaw ir-rispons immuni innat tal-host billi jimmiraw il-mogħdija IFN tat-tip I u l-mogħdija NF-κB, rispettivament [27–29]. MiR-23, miR{-378, u miR-505 huma fatturi ospitanti antivirali li jimmiraw għall-PRRSV u għandhom siti mmirati konservattivi f'razez ta' PRRSV tat-tip 2 [30]. Fl-istess ħin, l-host miR-506 ġie identifikat biex jinibixxi r-replikazzjoni tal-PRRSV billi jimmira direttament ir-riċettur CD151 tal-PRRSV fiċ-ċelloli MARC-145 [31]. miR-181 jista' wkoll jinibixxi indirettament ir-replikazzjoni ta' PRRSV billi jirregola r-riċettur CD163 ta' PRRSV fil-monoċiti tad-demm u l-PAMs [32]. Barra minn hekk, il-miRNAs jistgħu jippromwovu r-replikazzjoni tal-PRRSV billi jinterferixxu mal-fiżjoloġija bażika taċ-ċelluli. MiR-24-3p u miR-22 jimmiraw direttament 30 UTR ta' HO-1 waqt l-infezzjoni PRRSV biex jaħarbu mill-inibizzjoni ta' heme oxygenase-1 (HO-1), a proteina ta 'xokk tas-sħana (magħrufa wkoll bħala HSP32) fuq PRRSV [33,34]. Il-ħnieżer huma magħrufa li huma aktar suxxettibbli għal PRRSV u inqas kapaċi jiddefendu lilhom infushom kontra d-dħul ta 'dan il-patoġenu fl-organiżmu [35]. Fl-istudju preżenti, l-immunità intrinsika u l-immunità miksuba tal-ħnieżer infettati b'dan il-virus ġew studjati fil-livell molekulari bl-użu ta 'razza prevalenti fil-qasam. Kit ta 'iżolament ta' exosome tas-serum, mikroskopija elettronika ta 'trażmissjoni (TEM), analiżi ta' traċċar ta 'nanopartiċelli (NTA) u Western blot (WB) intużaw biex jiżolaw u jidentifikaw eżosomi tas-serum qabel u wara l-infezzjoni bil-PRRSV, segwiti minn analiżi ta' sekwenzar ta 'RNA żgħir, identifikazzjoni, u analiżi ta 'riżultati ta' espressjoni differenzjali bl-użu ta 'metodi bijoinformatiċi biex jinkisbu diversi miRNAs ta' exosome tas-serum assoċjati ma 'PRRSV, segwiti minn identifikazzjoni tar-riżultati tad-dejta bl-użu ta' PCR kwantitattiv f'ħin reali (qRT-PCR).

2. Materjali u Metodi

2.1. Esperimenti fuq l-Annimali

Sitt antiġenu PRRSV u antikorp b'saħħithom doppji negattivi 42-ħnieżer bojod kbar ta' jum tqiegħdu fis-sistema ta' tmigħ nadif tal-ħnieżer għal iżolament, kura tas-saħħa, u adattament ambjentali. Il-ħnieżer kollha kienu ħielsa li jieklu u jixorbu mingħajr restrizzjonijiet. Meta kienu familjari mal-kundizzjonijiet fl-iżolatur, il-ħnieżer ġew imlaqqma mill-imnieħer b'2 ​​mL 105 TCID50/mL PRRSV NADC30-bħal CHsx1401, li ssemma minn predeċessuri [36,37]. Id-demm tal-ħnieżer qabel (grupp ta' kontroll, n=6) u 7 ijiem wara (grupp ta' trattament, n=6) it-tilqim tal-virus inġabar mill-vena cava anterjuri għall-iżolament tas-serum. Id-debris ċellulari fis-serum tneħħa biċ-ċentrifugazzjoni fi 3000 g għal 15-il minuta. L-esperimenti kollha tal-annimali fl-istudju tagħna ġew approvati mill-Kumitat tal-Etika tal-Annimali tal-Istitut tax-Xjenza tal-Annimali, l-Akkademja Ċiniża tax-Xjenzi Agrikoli (CAAS) (Beijing, iċ-Ċina), IAS2022-130.

2.2. Iżolament u Purifikazzjoni ta 'Eżosomi tas-Serum

L-iżolament u l-purifikazzjoni tal-exosome twettqu bl-użu tal-kit exoEasy Maxi (QIAGEN, Hilden, il-Ġermanja, cat. Nru 76064) skont il-protokoll tal-manifattur.

2.3. Mikroskopija Elettronika ta' Trażmissjoni (TEM)

Is-sospensjonijiet ta 'exosome estratti ġew spotted fuq il-malja tar-ram miksija bil-carbo formvar, u l-eżosomi ġew mlaħalħa b'PBS u soġġetti għal tbajja standard ta' uranyl acetate għal 3 min f'temperatura tal-kamra. Wara t-tnixxif għal diversi minuti f'temperatura tal-kamra, il-grilja ġiet viżwalizzata u fotografata f'100 kV permezz ta 'mikroskopju elettroniku ta' trażmissjoni (HT-7700, Hitachi-High Tech, Tokyo, Ġappun).

2.4. Analiżi tat-Traċċar tan-Nanopartiċelli (NTA)

Exosomes estratti ġew dilwiti b'1 × PBS billi nbidel il-volum minn 10 għal 30 µL. Wara li l-kampjun ġie ttestjat, il-konċentrazzjoni u d-daqs tal-eżosomi tas-serum ġew analizzati minn nano-analizzatur tal-fluss N30E wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur (NanoFCM, Xiamen, iċ-Ċina).

2.5. Western Blot

Il-kampjuni estratti ta 'exosome ġew miżjuda ma' RIPA lysate imħallat ma 'inibitur tal-protease (Invitrogen, Waltham, MA, USA) u phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) biex tiġi estratta l-proteina exosome, li ġiet lysed fuq is-silġ għal 30 min. Imbagħad, skont l-istruzzjonijiet tal-kit Bradford, aħna kkwantifikajna l-konċentrazzjoni tal-proteina exosome tas-serum. Proteini exosome għaddew minn denaturazzjoni termali. L-istess ammont ta 'proteina ġie separat fuq ġel SDS-PAGE ta' 12% u mbagħad trasferit għal membrana tal-fluworidu tal-polyvinylidene (PVDF) (Millipore, Burlington, MA, USA). Ġie mxarrba f'TBST li kien fih 5% trab tal-ħalib xkumat u ssiġillat għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Xarrabna l-membrana fl-antikorp primarju dilwit (antikorp anti-CD9, Abcam, Boston, MA, USA, #ab92726; antikorp anti-CD81, Abcam, Boston, MA, USA, #ab109201) matul il-lejl f'4 ◦C, u rkupraw l-antikorp primarju. Xarrabna l-membrana fl-antikorp sekondarju dilwit, inkubatha f'temperatura tal-kamra għal siegħa, u rkupraw l-antikorp sekondarju. Poġġejna l-film maħsul ta 'PBST fuq il-film li jżomm il-frisk, żidna soluzzjoni kromoġenika mħallta ECL a/b ta' volum ugwali, u poġġieh fil-imager tal-kimiluminixxenza.

benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.6. Sekwenzar ta' RNA Żgħir Exosomal u Analiżi tad-Data

L-RNA totali mill-eżosomi ġie estratt bi Trizol skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Imbagħad skoprejna l-konċentrazzjoni tal-RNA u l-valur tad-densità ottika (OD) u skoprejna d-degradazzjoni u l-purità tal-RNA b'elettroforesi tal-ġel tal-agarose 1%. Sadanittant, Agilent Bioanalyzer 2100 intuża biex jiskopri l-integrità tal-RNA. Aħna użajna l-RNA totali ta 'eżosomi wara spezzjoni ta' kwalità. Skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur, użajna s-sett ta 'preparazzjoni tal-librerija żgħira tal-RNA multiplex NEB NEXT għal Illumina® (Illumina, San Diego, CA, USA). Il-kit ħejja librerija żgħira tal-RNA cDNA u sekwenzaha biex tipproduċi 50 nt single-end reads mill-pjattaforma Illumina Novaseq 6000. Il-proċeduri kollha għall-preparazzjoni tal-libreriji RNA żgħar twettqu minn Novogene (Beijing, iċ-Ċina). Id-dejta wara l-kontroll tal-kwalità ġiet allinjata mal-ġenoma ta 'referenza tal-ħnieżer (Sus scrofa 11.1) bl-użu ta' bowtie. MiRNAs magħrufa ġew identifikati mid-database miRbase (v22.0) [38] (https://www.mirbase.org, aċċessata fl-14 ta’ Jannar 2022), miRdeep2 (v0.0.5) [39], u miRevo (v1.1). ) [40] u ntużaw biex ibassru miRNAs ġodda. Fl-istess ħin, l-analiżi tal-espressjoni differenzjali għall-miRNAs saret minn DESeq (v1.24.0) [41], li teħtieġ |bidla darbiet| > 1.6 u p < 0.05. L-allinjament sar bl-użu ta' MEGA (V11) [42] segwit minn punteġġ ta' bażi waħda bl-użu ta' PHAST (v1.6.9) [43] u evalwazzjoni tal-aktar reġjuni kkonservati ta' 10 ġeni tal-virus, inkluż WUH3 (nru ta' adeżjoni GenBank HM853973), VR2332 ( Nru adeżjoni GenBank U87392), JXA1 (Nru adeżjoni GenBank EF112445), CH-1a (Nru adeżjoni GenBank AY032626), NADC30 (Nru adeżjoni GenBank HN654459), HUN4 (Nru adeżjoni GenBank EF6350D6), HLJZ0D6 22-1812 (Nru ta’ adeżjoni tal-GenBank MN648450), SC/DJY (Nru ta’ adeżjoni tal-GenBank MT075480), u Lelystad (Nru ta’ adeżjoni tal-GenBank M96262.2). RNAhybrid (V2.0) [44] intuża biex ibassar l-irbit tas-sekwenza miRNA identifikata mal-3 0 UTR tal-ġenoma tal-virus CHsx1401. Miranda (v3.3a) u RNAhybrid intużaw biex jimmiraw il-previżjoni tal-ġeni. Il-pakkett tal-profil tal-cluster [45] R intuża għall-analiżi tal-arrikkiment funzjonali GO (Gene Ontology) tal-ġeni fil-mira u l-analiżi tal-arrikkiment tal-mogħdija KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes).

2.7. Validazzjoni tal-espressjoni tal-miRNA permezz ta' RT-qPCR

L-RNA totali ġie iżolat minn exosomes tas-serum bl-użu ta 'Trizol (Invitrogen, Shanghai, iċ-Ċina) skont il-protokoll tal-manifattur. L-RNA iżolat ġie vverifikat permezz ta' RT-qPCR fuq kampjuni (n=6 għal kull grupp). cDNA ġie sintetizzat skond l-istruzzjonijiet ta 'sinteżi ta' cDNA miRNA 1st strand (b'stem-loop) kit (Vazyme, Nanjing, China), u l-kwantifikazzjoni tal-fluworexxenza twettqet bl-użu ABI 7500 skont il- istruzzjonijiet ta 'miRNA universal SYBR qPCR master mix (Vazyme, Nanjing, iċ-Ċina). Il-parametri taċ-ċiklu termali użati kienu kif ġej: l-ewwel stadju: 95 ◦C għal 30 s; Stadju 2: 95 ◦C għal 5 s, 60 ◦C għal 34 s, u 40 ċiklu; Stadju 3: 95 ◦C għal 15 s, 60 ◦C għal 1 min, u 95 ◦C għal 15 s. Sekwenzi Primer ta 'miRNAs, il-ġene U6, intużaw bħala referenza [46] u elenkati fit-Tabella Supplimentari S1. Il-verifiki qRT-PCR kollha saru bl-użu ta' tliet repliki bijoloġiċi u bi tliet repliki għal kull kampjun. L-abbundanza relattiva tat-traskrizzjonijiet ġiet ikkalkulata bil-metodu 2-Ct, u SPSS (v22.0) u GraphPad Prism (v8.0) intużaw għall-analiżi tad-dejta u l-immappjar, rispettivament. p < 0.05 tfisser li d-differenza hija statistikament sinifikanti.

3. Riżultati

3.1. Valur Relattiv ta 'Antiġen u Antikorp wara Inokulazzjoni tal-Virus

Ir-riżultati tat-testijiet tal-antiġen u tal-antikorpi tal-PRRSV qabel (jum 0) u wara l-isfida (jum 7) huma murija fit-Tabella 1. L-iskoperta seroloġika tal-antiġen u l-antikorp tal-PRRSV qabel l-isfida kienet negattiva, u l-antiġen kien pożittiv wara l-isfida, li jindika li l-ħnieżer ġew infettati b'suċċess b'CHsx1401.

3.2. Iżolament u Identifikazzjoni ta 'Eżosomi tas-Serum

Il-vesikoli iżolati mis-serum ġew skoperti minn TEM. Il-biċċa l-kbira tal-vesikuli jistgħu jaraw l-eżosomi konkavi f'forma ta' saucer jew diska fin-nofs. It-tarf tal-membrana tal-eżosomi huwa viżibbli, u l-morfoloġija hija relattivament kompluta (Figura 1A, B). L-analiżi tat-traċċar tan-nanopartiċelli wriet li 95.73% tal-eżosomi kellhom dijametru ta '30-150 nm, prinċipalment madwar 72.25 nm, b'dijametru medju ta' 76.22 nm, li kien konsistenti mal-karatteristiċi tad-daqs tal-eżosomi (Figura 1C). Din il-firxa tad-daqs kienet simili għal dik misjuba minn TEM u kkonfermat aktar l-identità ta 'dawn il-vesikoli bħala exosomes. Analiżi Western blot wriet li l-vesikoli iżolati mill-kampjuni tas-serum kienu pożittivi għall-proteini CD9 u CD81 (Figura 1D). Il-karatteristiċi ta 'hawn fuq jikkonformaw mal-istandards ta' identifikazzjoni tal-eżosomi fformulati mis-Soċjetà Internazzjonali għall-Veżiċi tal-Estrat (ISEV) f'MISEV2018 [47].

Tabella 1. Antiġen u antikorp ta' (jum 0) u (jum 7) bil-virus ta' sfida.

Figura 1. Karatteristiċi ewlenin tal-eżosomi tas-serum. (A, B) juru l-karatteristiċi morfoloġiċi tal-vesicles minn TEM. Il-vireg tal-iskala huma 500 nm u 100 nm, rispettivament. (C) NTA juri d-dijametru u l-konċentrazzjoni tal-biċċa l-kbira tal-vesikoli. (D) Western blot wera l-preżenza ta 'markaturi exosome CD81 u CD9 fl-eżosomi tas-serum. Nota: Ħallat fir-riżultati WB hija s-sospensjoni mħallta tal-kampjun iżolata mill-kit exoEasy Maxi

3.3. Sekwenzar RNA Żgħir ta 'Eżosomi tas-Serum

Għal kull kampjun, id-dejta nadifa laħqet 0.5 Gb, u l-perċentwal bażi Q30 kien ogħla minn 96.20%. Il-qari nadif ta 'kull kampjun kien allinjat mal-ġenoma ta' referenza tal-majjal. Fost it-12-il kampjun, il-grupp ta 'kontroll kiseb 10,920,887, 10,248,696, 10,109,117, 10,655,494, 9,217,285, u 9,782,523 jaqra, rispettivament. Il-grupp ta 'trattament kiseb 11,889,518, 10,593,504, 10,593,504, 12,846,080, 10,105,325, 11,729,451, u 9,789,542 qari, rispettivament. Bħala medja, 77.96% tal-qari nadif totali kien jinkludi 19-22 nukleotide (nt) fit-tul (Figura 2A). Il-qari wara l-kontroll tal-kwalità ammontaw għal aktar minn 92.59% tal-qari totali. Il-qari nadif ipproċessat kien allinjat mal-ġenoma ta 'referenza tal-ħnieżer, u r-rata mappjata ta' 12-il librerija fuq il-ġenoma kienet aktar minn 92.30%, u r-rata mappjata kienet 94.98% (Figura 2B). Indika li l-librerija miRNA exosomal miRNA tas-serum mibnija kienet ta 'kwalità għolja u adattata għal aktar analiżi. Id-dettalji huma elenkati fit-Tabella Supplimentari S2.

Figura 2. Ħarsa ġenerali tad-dejta tat-transcriptome tal-RNA żgħir. (A) Distribuzzjoni tat-tul tal-għadd tal-qari tal-kampjuni tal-eżosomi tas-serum (nt=nukleotidi); (B) rata ta' 12-il kampjun mappjati mal-ġenoma ta' referenza

3.4. Analiżi Differenzjali ta 'Espressjoni ta' miRNAs

Wara analiżi kwantitattiva tal-espressjoni tal-miRNA identifikata, il-miRNAs ġew skrinjati mil-limiti deskritti qabel fit-Taqsima 2.6. Total ta' 305 miRNAs inkisbu qabel u wara t-tilqim tar-razza CHsx1401 (kontroll, n=6; trattament, n=6). Total ta '33 miRNAs espressi b'mod differenzjat (DE) ġew identifikati bejn iż-żewġ gruppi, 13 DE miRNAs ġew regolati 'l fuq, u 20 DE miRNAs ġew regolati 'l isfel fil-grupp ta' trattament (Figura 3 u Tabella Supplimentari S3).

3.5. Analiżi ta' Arrikkiment Funzjonali tal-Ġeni tal-MiRNA Target

Total ta '7283 ġeni fil-mira kienu mbassra minn 33 DE miRNAs, u l-funzjonijiet tal-ġeni fil-mira kienu prinċipalment ikkonċentrati fir-regolamentazzjoni pożittiva tal-kaskata MAPK, proċess ta' metaboliżmu tal-lipidi, regolazzjoni tat-trasduzzjoni tas-sinjali intraċellulari, kaskata ERK1 u ERK2, eċċ (Figura 4A). ). F'termini ta 'funzjonijiet molekulari, il-ġeni fil-mira tal-miRNA espressi b'mod differenzjat jiffokaw prinċipalment fuq attività regolatorja ta' GTP-enzyme, attività ta 'kinase, attività regolatorja ta' nucleoside triphosphatase, u funzjonijiet oħra relatati mat-trasduzzjoni tas-sinjali u l-metaboliżmu tal-enerġija (Figura 4B). Barra minn hekk, fost il-komponenti taċ-ċelluli, il-ġeni fil-mira prinċipalment jipparteċipaw fil-funzjonijiet bijoloġiċi ta 'polimeri supramolekulari, Golgi, autophagosomi, wiċċ taċ-ċelluli, endosomi bikrija, eċċ. (Figura 4C). Il-funzjonijiet ta 'dawn il-komponenti huma relatati mill-qrib mal-formazzjoni ta' exosomes, li jispjega wkoll l-eżattezza tas-sekwenzjar. L-analiżi tal-arrikkiment tal-mogħdija KEGG wriet li l-ġeni fil-mira kienu arrikkit b'mod sinifikanti fl-endoċitosi, il-mogħdija tas-sinjalar MAPK, il-mogħdija tas-sinjalar Rap1, il-mogħdija tas-sinjalar tal-isfingolipidi, u l-mogħdija tas-sinjalazzjoni PI3K Akt (p <0.05) (Figura 5A) ). Fl-istess ħin, il-mogħdijiet arrikkit ġew ikklassifikati u analizzati. Ir-riżultati wrew li l-mogħdija KEGG tal-ġene fil-mira kienet arrikkita prinċipalment fl-ipproċessar ta 'informazzjoni ambjentali, mard tal-bniedem, u sistemi bijoloġiċi (Figura 5B).

Figura 3. Espressjoni differenzjali ta 'miRNAs f'eżosomi. (A) Plott tal-vulkan ta 'miRNAs bejn gruppi ta' kontroll u trattament; (B) heatmap ta 'raggruppament ġerarkiku ta' miRNAs DE bejn gruppi ta 'kontroll u trattament.

Figura 4. Analiżi ta 'arrikkiment tal-funzjoni GO tal-ġeni tal-mira tal-miRNAs DE. (A) Proċess bijoloġiku tal-ġeni tal-mira DE miRNAs; (B) funzjonijiet molekulari tal-ġeni tal-mira DE miRNAs; (C) komponenti ċellulari tal-ġeni tal-mira DE miRNAs

Figura 5. Analiżi tal-arrikkiment tal-mogħdija KEGG tal-ġeni fil-mira. (A) Mogħdija KEGG arrikkita b'mod sinifikanti b'ġeni fil-mira ta 'DE miRNAs; (B) klassifikazzjoni ta 'mogħdijiet KEGG arrikkit b'mod sinifikanti.

3.6. Tbassir tal-Immirar tas-Serum Exosomal miRNA u PRRSV CHsx1401 Genome

Skont il-punteġġ phastCons ta 'bażi ​​waħda wara l-allinjament minn PHAST, total ta' tmien segmenti l-aktar konservati (meded suwed 'il fuq mill-mappa tal-quċċata) inkisbu fost il-ġenomi virali (Figura 6). Total ta '31 DE miRNAs instabu li jorbtu mas-segment konservat billi tbassar il-miRNAs marbuta mas-segment konservat. Fosthom, fir-reġjun konservat (14,644–15,020 nt) l-eqreb għat-30 UTR (14,870–15,020) tal-ġenoma CHsx1401, 16-il DE miRNAs huma mbassra li jorbtu miegħu, inklużi 5 miRNAs (ssc-miR-34 c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, u ssc-miR{-6529) li jistgħu jorbtu mat-30 UTR ta' CHsx1401. Fost dawn il-miRNAs, ssc-miR-223 biss kien regolat 'l fuq wara l-infezzjoni, u miRNAs oħra ġew irregolati 'l isfel wara l-infezzjoni. Ara Tabella Supplimentari S4 għad-dettalji.

Figura 6. Segmenti kkonservati fil-ġenoma tar-razza CHsx1401 mbassra minn PHAST

3.7. Screening DE miRNAs Relatati mal-Funzjoni Exosome u PRRSV

Instabu varjetà ta 'miRNAs espressi b'mod differenzjat relatati mal-funzjoni ta' exosomes u PRRSV permezz ta 'analiżi ta' arrikkiment funzjonali ta 'ġeni fil-mira. Fosthom, 11-il DE miRNA bħal ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744, u ssc-miR-320 huma involuti fl-assorbiment ta' exosome, u l-ġeni fil-mira tagħhom huma prinċipalment ikkonċentrati f' il-familja tal-ġeni Ras, il-familja tal-annessin, u l-familja tal-ġeni tar-ribosilazzjoni ADP. Tmintax-il DE miRNA, inklużi sscmiR-10b, ssc-miR-124a, u ssc-miR{-128, jipparteċipaw f'mogħdijiet relatati mal-immunità, u l-ġeni fil-mira tagħhom huma prinċipalment ikkonċentrati fil-MAPK familja tal-ġeni, familja tal-ġeni PIK3, u familja tal-ġeni tal-fosfatażi tal-proteina. Filwaqt li 11-il DE miRNAs huma involuti fl-invażjoni tal-virus, il-ġeni fil-mira relatati huma prinċipalment ikkonċentrati fil-familja tal-ġeni MAPK u l-familja tal-ġeni tal-fosfatażi tal-proteina. Barra minn hekk, miRNAs multipli espressi b'mod differenzjat, bħal ġodda_102. Sitt DE miRNAs, inklużi ssc-miR-320, ssc-miR-423-5p, ssc-miR-4331-3p,ssc-miR-7137-3p, u ssc-miR{{ 25}}, huma ko-espressi f'funzjoni exosome, invażjoni tal-virus PRRSV, u mogħdijiet relatati mal-immunità, kif muri fil-Figura 7. Id-dettalji huma murija fit-Tabella Supplimentari S5.

Figura 7. DE miRNAs relatati ma 'assorbiment ta' exosome, invażjoni ta 'PRRSV, u immunità

3.8. QRT-PCR Assay ta 'DE miRNAs bejn iż-Żewġ Gruppi

Ħames DE miRNAs ġew magħżula b'mod każwali għall-verifika. Skont ir-riżultati tal-qRT-PCR, l-espressjoni ta' ssc-miR-19a u ssc-miR-32 żdiedet fil-grupp tat-trattament, filwaqt li ssc-miR-124a, ssc-miR{ {8}}, u ssc-miR-34c wrew espressjoni ogħla fil-grupp ta 'kontroll, konsistenti mad-dejta tas-sekwenzjar (Figura 8).

Figura 8. Ħames DE miRNAs validati minn qRT-PCR

4. Diskussjoni

PRRSV għadu patoġenu stubborn fl-industrija globali tal-ħnieżer, li jikkawża telf ekonomiku kbir fid-dinja. Fil-preżent, it-tilqim jintuża prinċipalment biex jipprevjeni u jikkontrolla l-PRRSV, fosthom il-vaċċin tal-virus ħaj modifikat (MLV) huwa l-aktar użat [48]. Għalkemm dan il-vaċċin kien effettiv biex inaqqas it-tifqigħat u l-inċidenza tal-PRRS, żied ukoll ħafna l-varjazzjoni ġenetika u d-diversità tal-virus u wassal għal rikombinazzjoni virali bejn viruses tal-vaċċin selvaġġi u ħajjin fil-qasam [49,50]. F'dawn l-aħħar snin, it-tixrid u l-prevalenza tal-virus rikombinanti NADC30-bħar-razza PRRSV ikkawżaw tifqigħat multipli tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer fiċ-Ċina. Ix-xebh bejn CHsx1401 u NADC30 użat f'dan l-istudju baqa' 92.2-99.1%. Minn dakinhar, saret razza epidemika fiċ-Ċina. L-eżosomi, bħala medjaturi tal-komunikazzjoni taċ-ċelluli, jinsabu ħafna f'diversi fluwidi tal-ġisem u għandhom vantaġġi uniċi fid-dijanjosi u t-trattament tal-mard [51,52]. Skont rapporti preċedenti, l-eżosomi għandhom rwol importanti ta’ komunikazzjoni fil-preżentazzjoni tal-antiġeni [53], ir-rispons immuni [53,54], ir-replikazzjoni tal-virus [54], il-kanċer [55], il-mard newrodeġenerattiv [56], l-anġjoġenesi [57], iċ-ċelluli tat-tumur migrazzjoni [58] u invażjoni [59], u għandhom valur għoli ta’ riċerka.

F'dan l-istudju, intużat teknoloġija ta 'sekwenzjar ta' produzzjoni għolja biex jinbena l-profil ta 'espressjoni ta' miRNA ta 'eżosomi tas-serum, u ġew identifikati 33 DE miRNAs. Kif nafu lkoll, il-miRNA kodifikat mill-host jista 'jorbot mal-ġenoma virali u mbagħad jirregola r-replikazzjoni, is-sintesi u r-rilaxx tal-virus biex jillimita l-infezzjoni u jaffettwa l-proċess patoloġiku [15]. Studji ta 'miRNAs li jimmiraw il-ġenoma virali ġew ukoll irrappurtati ripetutament fl-annimali. gga-miR-454 u gga-miR{-130b fil-marda bursal infettiva tat-tiġieġ jistgħu jimmiraw il-ġenoma virali biex jinibixxu r-replikazzjoni virali, filwaqt li gga-miR-21 jimmira direttament lill-proteina virali VP1 biex jinibixxi traduzzjoni tal-proteini virali [60,61]. Fi studji PRRSV, ssc-miR-181 jeħel speċifikament ma' reġjun konservat ħafna 'l isfel mill-ġenoma virali ORF4 u jinibixxi b'mod qawwi r-replikazzjoni tal-PRRSV [62]. F'dan l-istudju, id-differenza ta' espressjoni ta' ssc-miR-181 bejn iż-żewġ gruppi ma laħqitx livell sinifikanti. Fl-istudju tagħna, il-ġenomi ta 'disa' viruses PRRSV differenti tqabblu ma 'dawk tar-razza CHsx1401, u ġew identifikati l-aktar tmien segmenti kkonservati. Kien mbassar li 31 DE miRNAs jistgħu jorbtu mat-8 segmenti l-aktar konservati ta 'CHsx1401, u 16 DE miRNAs jistgħu jorbtu mas-sekwenzi kkonservati qrib it-30 UTR ta' CHsx1401. Fosthom, 5 DE miRNAs (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, u ssc-miR{{{ 36}}) jistgħu jingħaqdu simultanjament mal-CHsx1401 30 UTR. Barra minn hekk, l-espressjoni upregolata ta' ssc-miR-223 kienet mbassra li torbot mal-mira 30 UTR tal-ġenoma PRRSV. Ir-riżultati wrew li s-sekwenzi kkonservati tal-ġenoma tal-virus jista 'jkollhom rwol ewlieni fil-patoġeniċità tiegħu, u l-miRNAs li jistgħu jorbtu mas-sekwenzi kkonservati bejn il-ġenomi ta' razez PRRSV differenti jista 'jkollhom sinifikat importanti fil-kontroll tal-patoġeniċità tal-virus. Xi miRNAs espressi b'mod differenzjat ġew ippruvati li huma relatati mal-PRRSV minn studji preċedenti u anke direttament involuti fir-regolamentazzjoni tal-PRRSV, inklużi ssc-miR-10b [63], ssc-miR-378 [30] , ssc-miR-124a [64], let-7f{-5p [65], ssc-miR{-744 [66], u ssc-miR{{57 }}a [67].

PRRSV jista' jevadi d-difiża tal-host billi jinterferixxi mar-rispons immuni intrinsiku. Dan il-proċess huwa rregolat minn ħafna mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni, inkluża l-mogħdija ta' sinjalazzjoni MAPK, mogħdija ta 'sinjalazzjoni PI3K Akt, awtofaġija, chemokine, u mogħdija ta' sinjalazzjoni TNF. Fil-preżent, il-mogħdija tas-sinjalar MAPK tinkludi tliet mogħdijiet ewlenin: mogħdija ERK1/2, JNK, u p38. L-attivazzjoni tal-kaskata MAPK tista 'tippromwovi l-apoptożi taċ-ċelluli ospitanti, tassisti lill-virus biex jaħrab mir-rispons tad-difiża immuni tal-ospitanti, u tippromwovi r-replikazzjoni tal-PRRSV [68]. Barra minn hekk, l-attivazzjoni ta 'c-Jun N-terminal kinases (JNKs) u p38 tista' wkoll tippromwovi r-rilaxx tal-fattur infjammatorju IL-10 [68-70] u ttejjeb l-effett infjammatorju. Minbarra li jinduċi l-apoptożi, il-PRRSV jista 'wkoll jinduċi awtofaġija, li tista' tippromwovi r-replikazzjoni tal-PRRSV. L-attivazzjoni ta 'PI3K/Akt hija meħtieġa għad-dħul tal-virus u l-promozzjoni tar-replikazzjoni tal-virus, u Akt attivat minn PRRSV jinibixxi l-apoptosi taċ-ċelluli ospitanti billi jirregola b'mod negattiv il-passaġġ JNK [71]. TNF Jista' jkollu rwol importanti fl-induzzjoni u r-regolamentazzjoni tar-rispons infjammatorju flimkien ma' fatturi infjammatorji oħra, iżda l-Espressjoni TNF hija affettwata mir-regolamentazzjoni negattiva tar-replikazzjoni tal-PRRSV [72]. Fl-istudju preżenti, miRNAs (ssc-miR-10b, ssc-miR-122-5p, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, ssc-miR-124 {24}}a-5p, eċċ.) mogħnijin f'dawn il-mogħdijiet huma involuti f'apoptożi, awtofaġija u infjammazzjoni kkaġunati minn PRRSV u huma assoċjati mill-qrib ma' rispons immuni virali, evażjoni immuni, u replikazzjoni.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Il-membrana tal-plażma taċ-ċelluli hija rikka f'varjetà ta 'ċattri tal-lipidi, u sfingolipidi sinjuri fil-kolesterol u sfingolipidi (sphingomyelin u glycosphingolipidi) huma molekuli ewlenin ta' ċattri tal-lipidi. Ir-rikonoxximent tal-lipidi minn xi proteini tal-virus jista' jkun kundizzjoni meħtieġa għad-dħul tal-virus [73]. Il-viruses tal-pakketti jdaħħlu glikoproteini tal-envelope virali f’ċattri tal-lipidi fl-istadju tad-dħul tal-virus, jinteraġixxu ma’ riċetturi li jinsabu f’ċattri tal-lipidi, jew jibdlu mill-istat naturali tagħhom għal forma attivata biex jibdew jew jippromwovu l-internalizzazzjoni/fużjoni virali, bħal HSV, coronavirus SARS, u virus tad-dijarea epidemika tal-qżieqeż [73,74]. Studji preċedenti sabu li t-tneħħija tal-kolesterol mill-wiċċ taċ-ċelloli MARC-145 naqqset b'mod sinifikanti l-infezzjoni tal-PRRSV, u wrew li l-inibizzjoni tal-infezzjoni tal-PRRSV kienet medjata speċifikament bit-tneħħija tal-kolesterol ċellulari. It-tnaqqis tal-kolesterol tal-membrana taċ-ċelluli inibixxi b'mod sinifikanti d-dħul tal-virus, partikolarment it-twaħħil tal-virus, u r-rilaxx [75]. Il-metaboliżmu ta 'l-isfingolipidi jista' jirregola l-istruttura u l-adeżjoni tal-membrana, li hija ta 'sinifikat kbir fl-invażjoni tal-virus PRRSV. L-endoċitosi kienet l-aktar arrikkiment sinifikanti f'dan l-istudju. L-endoċitosi hija mekkaniżmu importanti ta' teħid ta' exosome miċ-ċelloli fil-mira. Studji preċedenti wrew li l-assorbiment tal-exosome huwa proċess li jitlob l-enerġija u li jiddependi miċ-ċitoskeletru, li jenfasizza r-rwol potenzjali tal-endoċitosi f'dan il-proċess [76]. Ġie ppruvat li diversi mogħdijiet jistgħu jimmedjaw dan il-proċess, inklużi fagoċitosi, makropinoċitosi, clathrin, eċċ. [77,78], li wasslu għal klassifikazzjonijiet u rwoli differenti ta 'sustanzi endoċitosi. L-arrikkiment ta 'miRNAs eżosomali espressi b'mod differenzjat f'din il-mogħdija jindika li l-eżosomi għandhom rwol importanti fl-infezzjoni tal-PRRSV, u r-regolazzjoni tat-trasport tal-kontenut u l-assorbiment f'eżosomi tista' twassal għal bidliet patofiżjoloġiċi fiċ-ċelloli u l-organi fil-mira.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

5. Konklużjonijiet

Permezz tal-identifikazzjoni u l-analiżi bijoinformatika ta 'miRNAs eżosomali fis-serum minn ħnieżer infettati bil-PRRSV, inkisbu varjetà ta' mogħdijiet relatati mal-PRRSV u miRNAs espressi b'mod differenzjat f'dan l-istudju, bħal ssc-miR-4331-3p, ssc-miR{{{{ 5}}, sscmiR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, eċċ., li għandhom rwoli funzjonali potenzjali fil-PRRSV -rispons immuni indott, invażjoni, u teħid ta 'exosome. Barra minn hekk, minħabba li miRNA wieħed jista 'jimmira ġeni multipli u ġene wieħed huwa wkoll regolat minn miRNAs multipli, diversi miRNAs iwettqu funzjonijiet multipli fil-mogħdijiet ta' hawn fuq. Xi miRNAs ġew ivverifikati biex jirregolaw l-infezzjoni tal-PRRSV billi jaġixxu fuq riċetturi ewlenin jew jimmiraw direttament lejn il-ġenoma tal-virus, bħal ssc-miR-10b, ssc-miR-378, miR-124a, let-7f-5p, ssc-miR-744, ssc-miR-19a, eċċ. Sadanittant, l-istudju preżenti bassar ukoll varjetà ta' miRNAs li jistgħu jorbtu ma' l-aktar framment konservat tat-30 UTR tal-ġenoma tal-virus CHX1401, inkluż ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR{{34} }, u ssc-miR-6529, li jistgħu jkunu importanti għar-regolazzjoni tal-patoġeniċità virali.

Referenzi

1. Snijder, EJ; Kikkert, M.; Fang, Y. Arterivirus bijoloġija molekulari u patoġenesi. J. Ġen Virol. 2013, 94 Pt 10, 2141–2163. [CrossRef] [PubMed]

2. Lu, Y.; Zhang, Y.; Xiang, X.; Sharma, M.; Liu, K.; Wei, J.; Shao, D.; Li, B.; Tong, G.; Olszewski, MA; et al. Is-sinjalar tal-talja jikkontribwixxi għall-espressjoni ta 'ċitokini infjammatorji indotti minn infezzjoni tal-virus tas-sindromu respiratorju u riproduttiv tal-ħnieżer (HP-PRRSV) f'makrofaġi alveolari tal-ħnieżer. Dev. Komp. Immunol. 2020, 108, 103690. [CrossRef] [PubMed]

3. Dea, S.; Sawyer, N.; Alain, R.; Athanassious, R. Karatteristiċi ultrastrutturali u morfoġenesi tal-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer propagati fil-klonu taċ-ċelluli MARC-145 permissiv ħafna. Adv. Exp. Med. Biol. 1995, 380, 95–98. [PubMed]

4. Dokland, T. Il-bijoloġija strutturali tal-PRRSV. Virus Res. 2010, 154, 86–97. [CrossRef] [PubMed]

5. Johnson, CR; Griggs, TF; Gnanandarajah, J.; Murtaugh, MP Proteina strutturali ġdida fil-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer kodifikata minn ORF5 alternattiv preżenti fl-arteriviruses kollha. J. Ġen Virol. 2011, 92 Pt 5, 1107–1116. [CrossRef] [PubMed]

6. Lee, SC; Lee, S.; Yoo, GW; Choi, HW; Noh, YH; Park, CE; Shin, JH; Yoon, IJ; Kang, SY; Lee, C. Analiżi fenotipiċi u ġenotipiċi ta 'razza attenwata tal-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer wara passaġġi serjali f'makrofaġi alveolari tal-ħnieżer ikkultivati. J. Vet. Sci. 2018, 19, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

7. Zebrowska, A.; Skowronek, A.; Wojakowska, A.; Widlak, P.; Pietrowska, M. Metaboloma ta 'exosomes: Iffoka fuq vesicles rilaxxati minn ċelluli tal-kanċer u preżenti fil-fluwidi tal-ġisem tal-bniedem. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3461. [CrossRef]

8. Bebelman, MP; Smit, MJ; Pegtel, DM; Baglio, SR Bijoġenesi u funzjoni ta 'vesicles extraċellulari fil-kanċer. Pharmacol. Ther. 2018, 188, 1–11. [CrossRef]

9. Zaborowski, MP; Balaj, L.; Breakefield, XO; Lai, CP Vesicles extraċellulari: Kompożizzjoni, rilevanza bijoloġika, u metodi ta 'studju.... Bioscience 2015, 65, 783–797. [CrossRef]

10. Almughlliq, FB; Koh, YQ; Peiris, HN; Vaswani, K.; Holland, O.; Meier, S.; Roche, JR; Burke, CR; Crookenden, MA; Arachchige, BJ; et al. Eżosomi li jiċċirkolaw jistgħu jidentifikaw bijomarkaturi għall-baqar f'riskju għal disfunzjoni metabolika. Sci. Rep 2019, 9, 13879. [CrossRef]

11. Zhang, RC; Du, WQ; Zhang, JY; Yu, SX; Lu, FZ; Ding, HM; Cheng, YB; Ren, C.; Geng, DQ Trattament taċ-ċelluli staminali Mesenchymal għal ħsara fin-nervituri periferali: Reviżjoni narrattiva. Regen newrali. Res. 2021, 16, 2170–2176. [PubMed]

12. Bryzgunova, OE; Zaripov, MM; Skvortsova, TE; Lekchnov, EA; Grigor'eva, AE; Zaporozhchenko, IA; Morozkin, ES; Ryabchikova, EI; Yurchenko, YB; Voitsitskiy, VE; et al. Studju komparattiv ta 'vesicles extraċellulari mill-awrina ta' individwi b'saħħithom u pazjenti bil-kanċer tal-prostata. PLoS ONE 2016, 11, e0157566. [CrossRef] [PubMed]

13. Camussi, G.; Deregibus, MC; Bruno, S.; Grange, C.; Fonsato, V.; Tetta, C. Riprogrammazzjoni epiġenetika taċ-ċelloli medjata minn Exosome/microvesicle. Em. J. Cancer Res. 2011, 1, 98–110. [PubMed]

14. Tamkovich, SN; Tutanov, OS; Laktionov, PP Exosomes: Ġenerazzjoni, struttura, trasport, attività bijoloġika, u applikazzjoni dijanjostika. Biochem. Mosk. Suppl. Ser. Membru. Cell Biol. 2016, 10, 163–173. [CrossRef]

15. Bartel, DP MicroRNAs: Ġenomika, bijoġenesi, mekkaniżmu, u funzjoni. Ċellula 2004, 116, 281–297. [CrossRef]

16. Gordino, G.; Costa-Pereira, S.; Corredeira, P.; Alves, P.; Costa, L.; Gomes, AQ; Silva-Santos, B.; Ribot, JC MicroRNA-181a jirrestrinġi d-divrenzjar taċ-ċelluli δ T tal-bniedem billi jimmira lil Map3k2 u Notch2. EMBO Rep 2022, 23, e52234. [CrossRef]

17. Liu, B.; Yan, L.; Chi, Y.; Sun, Y.; Yang, X. Long non-coding RNA AFAP1-AS1 jiffaċilita l-progressjoni tal-kanċer tal-ovarji billi jirregola l-assi miR-107/PDK4. J. Ovarji Res. 2021, 14, 60. [CrossRef]

18. Kim, Y.; Lee, DH; Park, SH; Jeon, TI; Jung, CH L-interazzjoni ta 'mikroRNAs u fatturi ta' traskrizzjoni fir-regolamentazzjoni tal-awtofaġija f'mard tal-fwied xaħmi mhux alkoħoliku. Exp. Mol. Med. 2021, 53, 548–559. [CrossRef]

19. Kazmierczak, D.; Jopek, K.; Sterzynska, K.; Nowicki, M.; Rucinski, M.; Januchowski, R. Il-profil tal-espressjoni tal-microRNA u r-rwol potenzjali fir-regolamentazzjoni tal-ġeni reżistenti għall-mediċina f'linji taċ-ċelluli tal-kanċer tal-ovarji reżistenti għal cisplatin u paclitaxel. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 526. [CrossRef]

20. Gong, Y.; Wei, X.; Sun, W.; Ren, X.; Chen, J.; Aweya, JJ; Ma, H.; Chan, KG; Zhang, Y.; Li, S. Exosomal miR-224 jikkontribwixxi għall-omeostażi tal-mikrobijota hemolymph waqt infezzjoni batterjali fil-krustaċji. PLoS Pathog. 2021, 17, e1009837. [CrossRef]

21. Cheng, Y.; Kou, W.; Zhu, D.; Yu, X.; Zhu, Y. Direzzjonijiet futuri fid-dijanjosi, il-pronjosi u l-monitoraġġ tal-mard tal-karċinoma adrenokortika: bijomarkaturi ġodda mhux invażivi. Quddiem. Endokrinol. 2022, 12, 811293. [CrossRef] [PubMed]

22. Gallo, A.; Tandon, M.; Alevizos, I.; Illei, GG Il-maġġoranza tal-mikroRNAs li jistgħu jinstabu fis-serum u l-bżieq huma kkonċentrati f'eżosomi. PLoS ONE 2012, 7, e30679. [CrossRef] [PubMed]

23. Fann, B.; Chopp, M.; Zhang, ZG; Liu, XS Rwoli emerġenti ta 'microRNAs bħala bijomarkaturi u miri terapewtiċi għan-newropatija dijabetika. Quddiem. Neurol. 2020, 11, 558758. [CrossRef] [PubMed]

24. Wei, H.; Chen, Q.; Lin, L.; Sha, C.; Li, T.; Liu, Y.; Yin, X.; Xu, Y.; Chen, L.; Gao, W.; et al. Regolament tal-produzzjoni exosome u l-għażla tal-merkanzija. Int. J. Biol. Sci. 2021, 17, 163–177. [CrossRef]

25. Jia, X.; Bi, Y.; Li, J.; Xie, Q.; Yang, H.; Liu, W. Cellular microRNA miR-26a jrażżan ir-replikazzjoni tal-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer billi jattiva l-immunità antivirali intrinsika. Sci. Rep 2015, 5, 10651. [CrossRef]

26. Li, L.; Wei, Z.; Zhou, Y.; Jiang, Y.; Yu, L.; Zheng, H.; Tong, W.; Yang, S.; Zheng, H.; Shan, T.; et al. Ospitanti miR-26a jrażżan ir-replikazzjoni tal-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer billi jirregola interferoni tat-tip I. Virus Res. 2015, 195, 86–94. [CrossRef]

27. Liu, F.; Wang, H.; Du, L.; Wei, Z.; Zhang, Q.; Feng, WH MicroRNA-30c jimmira l-katina beta tar-riċettur interferon–alfa/beta biex jippromwovi infezzjoni PRRSV tat-tip 2. J. Ġen Virol. 2018, 99, 1671–1680. [CrossRef]

28. Zhang, Q.; Huang, C.; Yang, Q.; Gao, L.; Liu, HC; Tang, J.; Feng, WH MicroRNA-30c jimmodula r-risponsi IFN tat-tip I biex jiffaċilita l-infezzjoni tal-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer billi jimmira lil JAK1. J. Immunol. 2016, 196, 2272–2282. [CrossRef]

29. Wang, D.; Cao, L.; Xu, Z.; Fang, L.; Zhong, Y.; Chen, Q.; Luo, R.; Chen, H.; Li, K.; Xiao, S. MiR-125b inaqqas ir-replikazzjoni tal-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer billi jirregola b'mod negattiv il-mogħdija NF-κB. PLoS ONE 2013, 8, e55838. [CrossRef]

30. Zhang, Q.; Guo, XK; Gao, L.; Huang, C.; Li, N.; Jia, X.; Liu, W.; Feng, WH MicroRNA-23 jinibixxi r-replikazzjoni tal-PRRSV billi jimmira direttament lill-RNA tal-PRRSV u possibbilment billi jirregola interferoni tat-tip I. Viroloġija 2014, 450–451, 182–195. [CrossRef]

31. Wu, J.; Peng, X.; Zhou, A.; Qiao, M.; Wu, H.; Xiao, H.; Liu, G.; Zheng, X.; Zhang, S.; Mei, S. MiR-506 jinibixxi r-replikazzjoni ta' PRRSV fiċ-ċelloli MARC-145 permezz ta' CD151. Mol. Ċellula. Biochem. 2014, 394, 275–281. [CrossRef]

32. Gao, L.; Guo, XK; Wang, L.; Zhang, Q.; Li, N.; Chen, XX; Wang, Y.; Feng, WH MicroRNA 181 irażżan l-infezzjoni tal-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer (PRRSV) billi jimmira r-riċettur CD163 tal-PRRSV. J. Virol. 2013, 87, 8808–8812. [CrossRef]

33. Xiao, S.; Du, T.; Wang, X.; Ni, H.; Yan, Y.; Li, N.; Zhang, C.; Zhang, A.; Gao, J.; Liu, H.; et al. MiR-22 jippromwovi r-replikazzjoni tal-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer billi jimmira l-fattur ospitanti HO-1. Vet. Microbiol. 2016, 192, 226–230. [CrossRef]

34. Xiao, S.; Wang, X.; Ni, H.; Li, N.; Zhang, A.; Liu, H.; Pu, F.; Xu, L.; Gao, J.; Zhao, Q.; et al. MicroRNA miR-24-3p jippromwovi r-replikazzjoni tal-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer permezz tat-trażżin tal-espressjoni ta' heme oxygenase-1. J. Virol. 2015, 89, 4494–4503. [CrossRef]

35. Butler, JE; Sinkora, M.; Wang, G.; Stepanova, K.; Li, Y.; Cai, X. It-tfixkil tal-iżvilupp tat-timoċiti huwa l-bażi tal-pandemija tal-PRRS: Ipotesi li tista' tiġi ttestjata. Quddiem. Immunol. 2019, 10, 1077. [CrossRef]

36. Zhou, L.; Wang, Z.; Ding, Y.; Stepanova, K.; Li, Y.; Cai, X. NADC30-bħal razza tal-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer, iċ-Ċina. Emerġenza. Infetta. Dis. 2015, 21, 2256–2257. [CrossRef]

37. Zhou, L.; Yang, B.; Xu, L.; Jin, H.; Ge, X.; Guo, X.; Han, J.; Yang, H. Evalwazzjoni tal-effikaċja ta 'tliet vaċċini tal-virus ħaj modifikat kontra razza ta' virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer NADC30-like. Vet. Microbiol. 2017, 207, 108–116. [CrossRef]

38. Wong, N.; Wang, X. miRDB: Riżors onlajn għat-tbassir tal-mira tal-microRNA u annotazzjonijiet funzjonali. Aċidi Nukleiċi Res. 2015, 43, D146–D152. [CrossRef]

39. Friedländer, MR; Mackowiak, SD; Li, N.; Chen, W.; Rajewsky, N. miRDeep2 jidentifika b'mod preċiż mijiet ta 'ġeni microRNA magħrufa u ġodda f'seba' clades ta 'annimali. Aċidi Nukleiċi Res. 2012, 40, 37–52. [CrossRef]

40. Wen, M.; Shen, Y.; Shi, S.; Tang, T. miREvo: Pjattaforma ta 'analiżi evoluzzjonarja tal-microRNA integrattiva għal esperimenti ta' sekwenzar tal-ġenerazzjoni li jmiss. BMC Bioinform. 2012, 13, 140. [CrossRef]

41. Anders, S.; Huber, W. Analiżi ta 'espressjoni differenzjali għal data ta' għadd ta 'sekwenza. Ġenoma Biol. 2010, 11, R106. [CrossRef] [PubMed]

42. Tamura, K.; Stecher, G.; Kumar, S. MEGA11: Analiżi tal-ġenetika evoluzzjonarja molekulari verżjoni 11. Mol. Biol. Evol. 2021, 38, 3022–3027. [CrossRef] [PubMed]

43. Hubisz, MJ; Pollard, KS; Siepel, A. PHAST, u RPHAST: Analiżi filoġenetika b'mudelli ta' spazju/ħin. Qosor. Bijoinforma. 2011, 12, 41–51. [CrossRef] [PubMed]

44. Krüger, J.; Rehmsmeier, M. RNAhybrid: tbassir tal-mira microRNA faċli, veloċi u flessibbli. Aċidi Nukleiċi Res. 2006, 34, W451–W454. [CrossRef]

45. Yu, G.; Wang, LG; Han, Y.; Hu, QY clusterProfiler: Pakkett R għat-tqabbil ta' temi bijoloġiċi fost gruppi ta' ġeni. OMICS 2012, 16, 284–287. [CrossRef]

46. ​​Que, R.; Ding, G.; Chen, J.; Cao, L. Analiżi ta 'mikroRNAs eżosomali tas-serum u karatteristiċi klinikopatoloġiċi ta' pazjenti b'adenokarċinoma pankreatika. Dinja J. Surg. Oncol. 2013, 11, 219. [CrossRef]

47. Théry, C.; Witwer, KW; Aikawa, E.; Alcaraz, MJ; Anderson, JD; Andriantsitohaina, R.; Antoniou, A.; Għarbi, T.; Archer, F.; Atkin-Smith, GK; et al. Informazzjoni minima għal studji ta 'vesicles extraċellulari 2018 (MISEV2018): Dikjarazzjoni ta' pożizzjoni tas-Soċjetà Internazzjonali għal Vesicles Extraċellulari u aġġornament tal-linji gwida MISEV2014. J. Extracell. Vesicles 2018, 7, 1535750. [CrossRef]

48. Lyoo, K.-S.; Choi, JY; Hahn, TW; Park, KT; Kim, HK Effett tat-tilqim b'vaċċin ħaj modifikat tal-virus tas-sindrome riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer fuq il-prestazzjoni tat-tkabbir fil-ħnieżer tas-simna taħt kundizzjonijiet tal-post. J. Vet. Med. Sci. 2016, 78, 1533–1536. [CrossRef]

49. Bian, T.; Sun, Y.; Hao, M.; Zhou, L.; Ge, X.; Guo, X.; Han, J.; Yang, H. Virus rikombinanti tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer tat-tip 2 bejn NADC30-like u MLV-like: Karatterizzazzjoni ġenetika u patoġeniċità għall-ħnienes. Infetta. Genet. Evol. 2017, 54, 279–286. [CrossRef]

50. Li, Y.; Ji, G.; Wang, J.; Tan, F.; Zhuang, J.; Li, X.; Tian, ​​K. Sekwenza kompluta tal-ġenoma ta' NADC30-Bħal virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer ikkaratterizzat minn rikombinazzjoni ma' razez oħra. Ġenoma Jħabbar. 2016, 4, e00330-16. [CrossRef]

51. Kalluri, R.; Lebleu, VS Il-bijoloġija, il-funzjoni u l-applikazzjonijiet bijomediċi tal-eżosomi. Xjenza 2020, 367, eaau6977. [CrossRef] [PubMed]

52. Miao, XY Avvanzi riċenti fil-fehim tar-rwol tal-miRNAs fl-eżosomi u l-potenzjal terapewtiku tagħhom. J. Integr. Agrikolu. 2017, 16, 753–761. [CrossRef]

53. Shenoda, BB; Ajit, SK Modulazzjoni tar-risponsi immuni minn exosomes derivati ​​minn ċelluli li jippreżentaw l-antiġen. Clin. Med. Intuwizzjonijiet Pathol. 2016, 9 (Suppl. S1), CPath-S39925. [CrossRef] [PubMed]

54. Li, S.; Li, S.; Wu, S.; Chen, L. Exosomes jimmodulaw ir-replikazzjoni virali u r-risponsi immuni ospitanti fl-infezzjoni HBV. BioMed Res. Int. 2019, 2019, 2103943. [CrossRef]

55. Greening, DW; Gopal, SK; Xu, R.; Simpson, RJ; Chen, W. Exosomes u r-rwoli tagħhom fir-regolamentazzjoni immuni u l-kanċer. F'Seminars fil-Bijoloġija taċ-Ċelloli u tal-Iżvilupp; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2015; Volum 40, p. 72–81.

56. Howitt, J.; Hill, AF Exosomes fil-patoloġija ta 'mard newrodeġenerattiv. J. Biol. Chem. 2016, 291, 26589–26597. [CrossRef]

57. Ribeiro, MF; Zhu, H.; Millard, RW; Fan, G. Exosomes jiffunzjonaw fil-pro-u kontra l-anġjoġenesi. Curr. Angiogenesis 2013, 2, 54–59. [CrossRef]

58. Lan, J.; Sun, L.; Xu, F.; Liu, L.; Hu, F.; Kanzunetta, D.; Hou, Z.; Wu, W.; Luo, X.; Wang, J.; et al. Exosomes derivati ​​mill-makrofagi M2 jippromwovu l-migrazzjoni taċ-ċelluli u l-invażjoni fil-kanċer tal-kolon. Cancer Res. 2019, 79, 146–158. [CrossRef]

59. Aga, M.; Bentz, GL; Raffa, S.; Torrisi, MR; Kondo, S.; Wakisaka, N.; Yoshizaki, T.; Pagano, JS; Shackelford, J. Exosomal HIF1 jappoġġja potenzjal invażiv ta' exosomes pożittivi tal-LMP1-assoċjati mal-karċinoma nasofarinġi. Oncogene 2014, 33, 4613–4622. [CrossRef]

60. Fu, M.; Wang, B.; Chen, X.; Hu, Z.; Wang, Y.; Li, X.; Cao, H.; Zheng, SJ gga-miR-454 irażżan ir-replikazzjoni tal-virus tal-marda infettiva tal-bursal (IBDV) permezz ta' mira diretta tas-segment ġenomic B IBDV u Suppressors ċellulari ta' Sinjali taċ-Ċitokini 6 (SOCS6). Virus Res. 2018, 252, 29–40. [CrossRef]

61. Fu, M.; Wang, B.; Chen, X.; Hu, Z.; Wang, Y.; Li, X.; Cao, H.; Zheng, SJ MicroRNA gga-miR-130b irażżan ir-replikazzjoni tal-virus tal-marda tal-bursal infettiva permezz tal-mira tal-ġenoma virali u s-soppressori ċellulari tas-sinjalar taċ-ċitokini 5. J. Virol. 2018, 92, e01646-17. [CrossRef]

62. Guo, XK; Zhang, Q.; Gao, L.; Li, N.; Chen, XX; Feng, WH Iż-żieda fl-espressjoni tal-microRNA 181 jinibixxi r-replikazzjoni tal-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer u għandha implikazzjonijiet għall-kontroll tal-infezzjoni tal-virus. J. Virol. 2013, 87, 1159–1171. [CrossRef] [PubMed]

63. Cong, P.; Xiao, S.; Chen, Y.; Wang, L.; Gao, J.; Li, M.; Hu, Z.; Guo, Y.; Zhao, G.; Zhang, X.; et al. MiRNA u mRNA transcriptomes integrati ta 'makrofaġi alveolari porċini (ċelluli PAM) jidentifikaw firem molekulari ta' miRNA speċifiċi għar-razza assoċjati ma 'infezzjoni H-PRRSV u N-PRRSV. Mol. Biol. Rep 2014, 41, 5863–5875. [CrossRef] [PubMed]

64. Li, N.; Huang, K.; Chen, Y.; Huang, Z.; Zhang, Y.; Leng, C.; Liu, Y.; Shi, J.; Xiao, S.; Yao, L. MicroRNA ssc-miR-124a juri attività antivirali kontra l-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer permezz tat-trażżin tal-ġeni ospitanti CD163. Vet. Microbiol. 2021, 261, 109216. [CrossRef] [PubMed]

65. Li, N.; Du, T.; Yan, Y.; Zhang, A.; Gao, J.; Hou, G.; Xiao, S.; Zhou, EM MicroRNA let-7f-5p jinibixxi l-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer billi jimmira MYH9. Sci. Rep 2016, 6, 34332. [CrossRef]

66. Zhen, Y.; Wang, F.; Liang, W.; Liu, J.; Gao, G.; Wang, Y.; Xu, X.; Su, Q.; Zhang, Q.; Liu, B. Identifikazzjoni ta 'RNA mhux kodifikanti espress b'mod differenzjat f'makrofaġi alveolari tal-ħnieżer minn Tongcheng u ħnieżer bojod kbar irrispondew għal PRRSV. Sci. Rep 2018, 8, 15621. [CrossRef]

67. Zhou, X.; Michal, JJ; Jiang, Z.; Liu, B. Profiling ta 'espressjoni ta' MicroRNA f'makrofaġi alveolari ta 'ħnieżer Tongcheng Ċiniżi indiġeni infettati bi PRRSV in vivo. J. Appl. Genet. 2017, 58, 539–544. [CrossRef]

68. Lee, YJ; Lee, C. Ir-replikazzjoni tal-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer hija mrażżna bl-inibizzjoni tal-mogħdija tas-sinjalazzjoni tal-kinase regolata bis-sinjal extraċellulari (ERK). Virus Res. 2010, 152, 50–58. [CrossRef]

69. Kanzunetta, S.; Bi, J.; Wang, D.; Fang, L.; Zhang, L.; Li, F.; Chen, H.; Xiao, S. L-infezzjoni tal-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer jattiva l-produzzjoni ta' IL-10 permezz ta' mogħdijiet NF-κB u p38 MAPK fil-makrofaġi alveolari tal-ħnieżer. Dev. Komp. Immunol. 2013, 39, 265–272. [CrossRef]

70. Yin, S.; Huo, Y.; Dong, Y.; Fan, L.; Yang, H.; Wang, L.; Ning, Y.; Hu, H. L-attivazzjoni ta 'c-Jun NH (2)-terminal kinase hija meħtieġa għall-apoptosi indotta mill-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer iżda mhux għar-replikazzjoni tal-virus. Virus Res. 2012, 166, 103–108. [CrossRef]

71. Fan, L. Mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni involuti fir-regolazzjoni tal-induzzjoni tal-apoptożi fiċ-ċelloli ospitanti mal-infezzjoni tal-PRRSV. Ġeni tal-Virus 2019, 55, 433–439. [CrossRef]

72. Lopez-Fuertes, L.; Campos, E.; Domenech, N.; Ezquerra, A.; Castro, JM; Domínguez, J.; Alonso, F. Il-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer (PRRS) jimmodula 'l isfel il-produzzjoni ta' TNF f'makrofaġi infettati. Virus Res. 2000, 69, 41–46. [CrossRef]

73. Teissier, É.; Pécheur, EI Lipidi bħala modulaturi tal-fużjoni tal-membrana medjati minn proteini tal-fużjoni virali. Eur. Biophys. J. 2007, 36, 887–899. [CrossRef]

74. Jeon, JH; Lee, C. Il-kolesterol ċellulari huwa meħtieġ għall-infezzjoni tal-nidovirus tal-ħnieżer. Arch. Virol. 2017, 162, 3753–3767. [CrossRef]

75. Sun, Y.; Xiao, S.; Wang, D.; Luo, R.; Li, B.; Chen, H.; Fang, L. Il-kolesterol tal-membrana ċellulari huwa meħtieġ għad-dħul u r-rilaxx tal-virus tas-sindromu riproduttiv u respiratorju tal-ħnieżer fiċ-ċelloli MARC-145. Sci. Ċina Life Sci. 2011, 54, 1011–1018. [CrossRef]

76. Tian, ​​T.; Zhu, YL; Zhou, YY; Liang, GF; Wang, YY; Hu, FH; Xiao, ZD Assorbiment ta' Exosome permezz ta' endoċitożi u makropinoċitożi medjata minn clathrin u medjazzjoni tal-kunsinna ta' miR-21. J. Biol. Chem. 2014, 289, 22258–22267. [CrossRef]

77. Mulcahy, LA; Roża, RC; Carter, DRF Rotot u mekkaniżmi ta 'assorbiment tal-vesikula extraċellulari. J. Extracell. Vesicles 2014, 3, 24641. [CrossRef]

78. Zhang, M.; Zang, X.; Wang, M.; Li, Z.; Qiao, M.; Hu, H.; Chen, D. Nanocarriers ibbażati fuq Exosome bħala vetturi bijo-ispirati u versatili għall-kunsinna tad-droga: Avvanzi u sfidi riċenti. J. Mater. Chem. B 2019, 7, 2421–2433. [CrossRef]