Immunità Sinerġistika U Protezzjoni fil-Ġrieden Permezz ta' Ko-Tilqim Ma' Vaċċini tad-DNA Li Jikkodifikaw il-Proteina Spike U Proteini Strutturali Oħra Ta' SARS-CoV-2

Astratt:L-emerġenza ta' varjanti ġodda ta' koronavirus 2 tas-sindromu respiratorju akut sever (SARS CoV-2) iġġenerat tifqigħat ta' infezzjoni rikorrenti madwar id-dinja. Dawn il-varjanti b'mutazzjoni kbira jnaqqsu l-effettività tal-vaċċini attwali tal-marda tal-koronavirus 2019 (COVID-19), li huma ddisinjati biex jimmiraw biss il-proteina spike (S) tal-virus oriġinali. Ħlief għall-S tas-SARS-CoV-2, il-potenzjal immunoprotettiv ta 'proteini strutturali oħra (nukleokapsid, N; envelope, E; membrana, M) bħala antiġeni fil-mira tal-vaċċin għadu mhux ċar u denja ta' investigazzjoni. F'dan l-istudju, ġew żviluppati vaċċini tad-DNA sintetiċi li jikkodifikaw erba' proteini strutturali tas-SARS-CoV-2 (pS, pN, pE, u pM), u l-ġrieden ġew immunizzati bi tliet dożi permezz ta 'injezzjoni intramuskolari u elettroporazzjoni. Notevolment, il-ko-immunizzazzjoni b'żewġ vaċċini tad-DNA li esprimew il-proteini S u N indotta antikorpi newtralizzanti ogħla u kienet aktar effettiva fit-tnaqqis tat-tagħbija virali SARS-CoV-2 mill-proteina S waħedha fil-ġrieden. Barra minn hekk, il-ko-immunizzazzjoni pS ma 'pN jew pE + pM indotta immunità ċellulari ogħla speċifika għall-proteina S wara tliet tilqim u kkawża bidliet istopatoloġiċi aktar ħfief minn pS waħdu wara l-isfida. Ir-rwol tal-proteini strutturali kkonservati tas-SARS-CoV-2, inklużi l-proteini N/E/M, għandu jiġi investigat aktar għall-applikazzjonijiet tagħhom fid-disinn tal-vaċċini, bħal vaċċini mRNA.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Kliem ewlieni: COVID-19; SARS-CoV-2; ko-immunizzazzjoni; Vaċċin tad-DNA; proteina spike; proteina strutturali

1. Introduzzjoni

Is-sindromu respiratorju akut sever koronavirus 2 (SARS-CoV-2) huwa l-kawża tal-marda tal-koronavirus 2019 (COVID-19), li kkawża miljuni ta’ infezzjonijiet u mwiet madwar id-dinja u pperikolat is-saħħa tal-bniedem u l-ekonomija globali . Għalkemm approċċi terapewtiċi effettivi għadhom mhux disponibbli, huma avvanzaw malajr, inkluża l-applikazzjoni tat-terapija taċ-ċelluli CAR-T u n-nanoteknoloġija [1,2]. It-tilqim huwa mod effettiv biex tiġi kkontrollata l-pandemija, u diversi vaċċini ġew approvati għall-użu minn diversi korpi regolatorji tas-saħħa [3,4]. Il-ġenoma tal-koronavirus jikkodifika erba' proteini strutturali ewlenin, jiġifieri, il-proteini spike (S), nukleokapsid (N), membrana (M) u envelope (E), li huma responsabbli għall-assemblaġġ tal-virjoni u s-soppressjoni tar-rispons immuni ospitanti [5] ]. Il-proteina S hija magħmula minn 1273 residwi ta 'aċidu amminiku li fihom żewġ subunitajiet, jiġifieri, S1 u S2. Hija medjatur tad-dħul virali u hija mira ewlenija għall-iżvilupp ta 'vaċċini tal-koronavirus [6-11]. Madankollu, il-proteina SARS-CoV-2 S għandha frekwenza għolja ta' mutazzjoni. Mhux ta' b'xejn, f'SARS-CoV-2, virus RNA, il-mutazzjoni hija kontinwa u inevitabbli. Kien hemm ħames varjanti ta' tħassib SARS-CoV-2 (VOC) li ħarġu minn Settembru 2020, inklużi B.1.1.7 (UK, Alpha), B.1.351 (Afrika t'Isfel, Beta), P.1 (Brażil, Gamma), B.1.617.2 (Indja, Delta), u B.1.1.529 (Afrika t'Isfel, Omicron) (Andreano u Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). Kollha għandhom diversi mutazzjonijiet fil-proteina spike [12]. Dawn il-varjanti jheddu l-effettività tal-vaċċini attwali tal-COVID-19, li huma ddisinjati biex jimmiraw biss għall-proteina tal-ispike.

Il-proteina N ta' SARS-CoV-2 tingħaqad ma' RNA virali permezz ta' dominju li jgħaqqad l-RNA ta' 140-amino-acid-long fil-qalba tagħhom b'mod "xoffa fuq spaga". Huwa kkonservat ħafna fost il-koronavirus, jaqsam identità ta 'sekwenza ta' ~ 90% ma 'dik tas-SARS-CoV, u hija wkoll l-unika proteina strutturali ġewwa l-virion [13]. Barra minn hekk, għandu rwol importanti fl-ippakkjar tal-RNA virali fil-kumpless tal-kapsid ribonucleo u huwa meħtieġ għar-replikazzjoni tal-RNA virali, l-assemblaġġ tal-virion, u r-rilaxx miċ-ċelloli ospitanti [14]. Ibbażat fuq ix-xebh ta 'sekwenza għolja tal-proteina N fil-koronavirus, jista' jiġi ssuġġerit bħala mira ta 'vaċċin ta' protezzjoni inkroċjata. Preċedentement sibna li l-koimmunizzazzjoni b'żewġ vaċċini tad-DNA li jesprimu proteini E u M tipprovdi protezzjoni parzjali kontra SARS-CoV-2, u dan il-metodu għandu jiġi kkunsidrat waqt l-iżvilupp tal-vaċċin [15]. Skont id-dokument tal-pajsaġġ mid-WHO, normalment ikun hemm seba' strateġiji għall-kandidati tal-vaċċin tas-SARS-CoV-2, li jistgħu jinqasmu aktar fi tliet kategoriji: l-ewwel, vaċċini bbażati fuq il-proteini, inklużi vaċċini tal-virus inattivati, bħal virus. partiċelli, u vaċċini ta' subunità ta' proteini; it-tieni, vaċċini bbażati fuq il-ġeni, inklużi vaċċini b'vettur tal-virus, vaċċini tad-DNA, u vaċċini mRNA; it-tielet, taħlita ta 'approċċi kemm ibbażati fuq il-proteini kif ukoll ibbażati fuq il-ġeni, bħal vaċċini ta' virus ħajjin attenwati. It-teknoloġiji tad-DNA, bħala strateġiji ġodda ta 'vaċċin ibbażati fuq il-ġeni, jistgħu jqabblu malajr kandidati u strateġiji multipli ta' vaċċin waqt l-ittestjar prekliniku [16,17]. Teoretikament, kważi l-proteini virali kollha huma immunoġeni potenzjali u miri tal-vaċċini. Madankollu, sa fejn nafu tagħna, l-immunoġeniċità u l-potenzjal protettiv tal-vaċċini tad-DNA sintetiċi fil-kodifikazzjoni tal-proteini SARS-CoV-2 S u proteini strutturali oħra għad iridu jiġu rrappurtati b'mod sistematiku. Erba' vaċċini tad-DNA li jesprimu l-proteini SARS-CoV-2 S, N, E, u M l ġew evalwati għall-immunoġeniċità u l-effikaċja protettiva tagħhom fil-ġrieden biex jesploraw l-effetti immunoloġiċi ta 'S flimkien ma' proteini strutturali oħra.

2. Materjali u Metodi

2.1. Ċelloli

Iċ-ċelloli Huh7.5 u ċ-ċelloli 293T tal-kliewi tal-embrijun tal-bniedem ġew ikkultivati ​​f'37 ◦C f'atmosfera umidifikata f'5% CO2 matul l-istudju. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'medja DMEM (HyClone, Logan, UT, USA), supplimentati b'10% FBS (GEMINI Co., Shanghai, China) u 1% penicillin-streptomycin (Gibco, New York, NY, USA). Il-linji taċ-ċelluli kollha ġew ikkonfermati negattivi għall-kontaminazzjoni tal-mikoplażma.

2.2. Kostruzzjoni ta' Vaċċini tad-DNA Kodifikazzjoni tas-SARS-CoV-2 S/N/E/M

Il-ġene li jikkodifika l-proteini SARS-CoV-2 S/N, li fih sekwenza Kozak N-terminal (GCCACC) segwita minn kodon ta’ bidu (ATG), ġie sintetizzat bl-użu ta’ kodon ottimizzat għall-mammiferi (GenScript Co., Nanjing). , iċ-Ċina). Imbagħad ġie kklonat fil-vettur tal-espressjoni pcDNA3.1 (+) permezz tad-diġestjoni EcoRI u XbaI u jismu pS/pN (vaċċini tad-DNA) (Figura 1A). Il-proteina pE/PM ġiet mibnija u identifikata kif deskritt qabel [15]. Il-vaċċini ġew ippreparati bl-użu ta 'kits Maxiprep mingħajr endotossini (Qiagen, Beijing, iċ-Ċina), u s-sekwenzi ġew ikkonfermati bl-użu ta' sekwenzar tad-DNA Sanger. L-espressjoni tal-proteina S/N ġiet ikkonfermata bl-użu ta 'western blotting u anti-S (Sino Biological, Beijing, China)/anti-N antikorpi dilwiti f'1:1000. Dawn l-esperimenti twettqu kif deskritt qabel [15,18].

Figura 1. Disinn u espressjoni ta' vaċċini tal-proteini SARS-CoV-2 rikombinanti bbażati fuq DNA. (A) Dijagramma skematika tal-vaċċini rikombinanti bbażati fuq DNA li jikkodifikaw il-proteini tas-SARS-CoV-2 spike (PS), nukleokapsid (pN), envelope (pE), u/jew proteini tal-membrana (PM). (B) L-espressjoni tal-proteina fil-mira fil-vaċċini tad-DNA ġiet ivvalidata permezz tal-analiżi tal-western blot ta 'ċelluli 293T trasfettati bil-plasmidi pS/pN/pE/pM.

2.3. Immunizzazzjoni u Sfida

Ġrieden BALB/c femminili (Laboratorji tax-Xmara Charles, Franza) ta '6 ġimgħat kienu miżmuma fl-Istitut Nazzjonali tas-Saħħa tax-Xogħol u Kontroll tal-Velenu f'ambjent 21 ◦C u kkontrollat ​​bl-umdità b'ċikli ta' dawl/dlam ta '12-il siegħa. Sadanittant, ikel u ilma ġew ipprovduti ad libitum, u l-esperimenti kollha fuq l-annimali ġew approvati mill-Kumitat dwar l-Etika ta 'Esperimenti fuq l-Annimali taċ-Ċentru Ċiniż għall-Kontroll u l-Prevenzjoni tal-Mard (Ċina CDC). Ir-riċerka kkonformat mar-regolamenti etiċi rilevanti.

Ġrieden kienu maqsuma b'mod każwali f'ħames gruppi u immunizzati b'pS/pN waħdu jew ko-immunizzati b'pS + pN jew pS + pE + PM fil-jiem 0, 21, u 42 permezz ta' injezzjoni ġol-muskoli flimkien ma' elettroporazzjoni (35 mg/50 mL) (Figura 2) [19,20]. Fil-qosor, il-vaċċini tad-DNA ġew injettati fil-muskolu tibialis anterior (TA) u immedjatament pulsati bl-elettriku bl-użu ta 'elettrodu ta' firxa ta 'żewġ labar 5 mm 'il bogħod minn xulxin (ECM830; BTX) bil-labar. Sera mill-ġrieden inġabru għall-analiżi tar-rispons immuni umorali, u l-milsa tal-ġrieden ġiet ipproċessata biex titkejjel ir-rispons immuni ċellulari (Figura 2).

Figura 2. Skematika tal-isfida tal-immunizzazzjoni u tas-SARS-CoV-2. Kors tal-ħin tat-tilqim, sfida, u teħid ta' kampjuni tad-demm/tessut. Il-ġrieden BALB/C ġew maqsuma b'mod każwali fi gruppi.

Sars esperimenti ta' sfida SARS-CoV-2 saru kif deskritt qabel [15,21]. Fil-qosor, il-ġrieden ġew anestetizzati u mbagħad trażdotti fl-imnieħer b'2.5 × 108 PFU ta' Ad5-hACE2 f'volum totali ta' 45 µL. Ħames ijiem wara t-trasduzzjoni, il-ġrieden ġew anestetizzati u mbagħad ġew ikkontestati fl-imnieħer b'1 × 105 TCID50 ta' SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB{-02/2019) f'volum totali ta' 50 µL ta' salina buffer. Ix-xogħol kollu b'SARS-CoV-2 ħaj f'mudelli tal-ġrieden sar f'laboratorji tal-Livell 3 ta' Bijosigurtà tal-Annimali (ABSL-3).

2.4. Assaġġ Immunosorbent Marbut ma' Enżimi

Assays immunosorbenti marbuta ma' enzimi (ELISA) saru kif deskritt qabel [15]. Fil-qosor, il-proteini S (mixtrija minn Sino Biological)/N (rigal minn Song) dilwiti f'buffer karbonat (0.1 M, pH 9.6) ġew miksija fuq 96-well EIA/RIA plates (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) matul il-lejl f'4 ◦C. Il-pjanċi ġew imblukkati b'200 µL ta' 10% serum tal-mogħoż f'PBS f'37 ◦C għal 2 sigħat, segwit minn ħasil ħames darbiet b'PBST. Imbagħad, kampjuni tas-serum dilwiti serjament f'2% serum tal-mogħoż f'PBS ġew miżjuda u inkubati għal 2 sigħat f'37 ◦C, segwiti minn ħames ħasliet b'PBST. Mogħoż konjugat bl-HRP kontra l-ġurdien IgG Ab (1:5000) ġie miżjud f'37 ◦C għal siegħa. Total ta '100 µL ta' sottostrat TMB ġie miżjud ma 'kull bir u mitfija b'50 µL ta' 2M H2SO4. L-assorbiment inqrat f'wavelength ta '450 nm bl-użu ta' SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Hong Kong, iċ-Ċina).

sistema immunitarja li żżid il-pjanti cistanche

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Infezzjoni tal-psewdovirus u Esperimenti ta' Newtralizzazzjoni

L-assaġġ tan-newtralizzazzjoni tal-psewdovirus sar kif deskritt qabel [21,22]. Plasmid li jesprimi l-proteina S tal-virus antenati kien inbena qabel [22]. Il-ġene tal-proteina spike SARS-CoV-2 tal-varjant Omicron (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) ġie sintetizzat (rigal minn Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, iċ-Ċina) bl-użu ta 'codon ottimizzat għall-mammiferi u kklonat fil-vettur pcDNA3.1, kif deskritt qabel [22]. Fil-qosor, plasmidi li jesprimu reporter luciferase u plasmidi li jesprimu l-proteina S ġew ko-trasfettati f'ċelluli HEK 293T bl-użu tar-Reaġent tat-Trasfezzjoni tad-DNA X-treme GENE HP. Il-kultura taċ-ċelluli ġiet aggornata 6 sigħat wara t-trasfezzjoni, u s-supernatant li kien fih pseudovirus inħasad wara 48 siegħa u nħażen f'-70 ◦C. Fl-assaġġ tan-newtralizzazzjoni tal-psewdovirus, taħlita ugwali serum-virus imbagħad ġiet inkubata f'37 volum tas-supernatant li fih il-psewdovirus u mbagħad ġiet miżjuda mas-serum dilwit. ◦C għal siegħa. Il-midja tal-kultura taċ-ċelluli Huh7.5 imbagħad ġew sostitwiti b'100 µL tat-taħlita tas-serum-virus u ġew inkubati f'37 ◦C għal 12-il siegħa. Ċelloli kkultivati ​​b'psewdoviruses SARS-CoV-2 kienu mħaddma b'mod parallel. Il-midja mbagħad ġiet sostitwita b'DMEM (2% FBS), u l-inkubazzjoni ġiet inkubata f'37 ◦C għal 48 siegħa. Imbagħad, is-sinjal tal-luċiferażi tkejjel bl-użu tal-kit tal-luċiferażi tal-firefly Bright-Glo (Promega).

2.6. Assaġġ ta' Newtralizzazzjoni tas-SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019) intuża f'dan l-esperiment. Fil-qosor, is-sera ġew dilwiti darbtejn minn dilwizzjoni tal-bidu ta' 1:10, imħallat ma' volum ugwali (10–15 pfu/bir) ta' SARS-CoV ħaj-2, u inkubati għal siegħa f'37 ◦C, wara li ġew miżjuda maċ-ċelluli Vero miżrugħa. Wara l-inkubazzjoni f'37 ◦C għal 48 siegħa, ġie osservat effett ċitopatiku (CPE), u 100 µL tas-supernatant tal-kultura nħasdu għall-estrazzjoni ta 'aċidu nuklejku u PCR ta' traskrizzjoni inversa tal-fluworexxenza f'ħin reali (RT-PCR). Id-doża medjana tan-newtralizzazzjoni (ND50) ġiet ikkalkulata bl-użu tal-metodu Reed-Munch [15].

2.7. Assaġġ IFN- ELISpot

Il-gruppi ta' peptidi li jkopru l-proteina S/N/E/M kollha bħala 15-mers konsekuttivi fuq lapping b'10 aċidi amminiċi ġew sintetizzati minn Scilight Biotechnology, LLC. Madwar 2.5 mg ta' kull peptide purifikat fil-ġabra ta' peptidi kien preżenti għal kull kunjett. L-esperiment sar kif deskritt qabel [18]. Fil-qosor, 96- pjanċi sew (BD ELISPOT Set, USA) ġew miksija b'anti-IFN-capture Ab u inkubati matul il-lejl f'4 ◦C. Il-pjanċi ġew imblukkati bil-medium tal-kultura kompluta wara l-ħasil tliet darbiet. L-isplenoċiti nħasdu wara li l-ġrieden ġew ewtanizzati fil-ġranet 35 u 120 Sospensjonijiet friski ta 'ċellula waħda minn kull grupp ġew indurati f'5 × 106 għal kull bir, u ġew miżjuda peptidi. Il-pjanċi mbagħad ġew inkubati f'37 ◦C f'5% CO2 għal 22 siegħa u skoperti bl-użu ta 'qarrej tal-pjanċa ELISpot (Biosys, So. Pasadena, CA, USA). Unità li tifforma spot (SFU) tirrappreżenta IFN- li jxerred iċ-ċelluli T.

2.8. Evalwazzjoni tal-Protezzjoni fil-Ġrieden Post-SARS-CoV-2 Challenge

L-esperimenti twettqu kif deskritt qabel [15,21]. Fil-qosor, il-pulmuni nħasdu wara li l-ġrieden ġew ewtanizzati. Nofs it-tessuti ntużaw għall-estrazzjoni ta 'aċidu nuklejku, RT-PCR ta' fluworexxenza f'ħin reali u TCID50. In-nofs l-ieħor intbagħat lill-Kulleġġ tal-Mediċina Veterinarja, l-Università Agrikola taċ-Ċina għal evalwazzjoni patoloġika.

2.9. Analiżi Statistika

T-testijiet mhux imqabbla, testijiet ANOVA f'żewġ direzzjonijiet, u t-test ta' paraguni multipli ta' Dunnett saru bl-użu ta' GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). valuri p < 0.05 tqiesu statistikament sinifikanti (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0.001; **** p < 0.0001).

3. Riżultati

3.1. Karatterizzazzjoni ta' Vaċċini tad-DNA

Il-livelli ta 'proteina E u M ġew skoperti bl-użu ta' western blotting. Aħna kejlu l-espressjoni tal-proteini S/N/E/M kodifikati ta' SARS-CoV-2 fiċ-ċelloli HEK-293T trasfettati bi plasmidi pS/pN/pE/pM permezz ta' analiżi tal-western blot, bl-użu ta' anti -S/anti-N antikorpi u anti-6 x Tiegħu, fil-lysates taċ-ċelluli. Il-meded approssimati l-piż molekulari previst tal-proteini S (140-142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) u M (22-25 kDa) (Figura 1B).

3.2. Produzzjoni robusta u Sostnuta ta' Anti-S u/jew anti-N IgG Indotta minn DNA pS u/jew pN

Vaċċini Serum inġabar minn ġrieden BALB/c f'35, 56, 96, u 120 jum (Figura 2). Livelli ta' anti S/anti-N IgG ġew skoperti bl-użu ta' ELISA. Il-kobor tar-rispons IgG speċifiku S- jew N indott minn pS jew pN żdied fis-serum wara l-ewwel u t-tieni boosts. It-titri IgG anti-S u anti-N kienu ogħla fil-grupp pS + pN milli kienu fil-gruppi l-oħra; madankollu, id-differenza ma kinitx statistikament sinifikanti (Figura 3A, B). Ma nstabu l-ebda rispons robust għall-antikorpi speċifiċi għall-proteini E/M, li huwa konsistenti mar-riżultati ta 'studju preċedenti (dejta mhux murija) [15].

Figura 3. Reazzjonijiet taċ-ċelluli B għal SARS-CoV-2 fil-ġrieden BALB/c. (A) Titri tal-endpoint li jorbtu IgG fis-serum għall-proteini SARS-CoV-2 S (A) u N (B). (C) It-titri ta' newtralizzazzjoni ġew determinati abbażi ta' sistema ta' virus pseudotyped SARS-CoV-2. (D) Tittri ta' newtralizzazzjoni kontra s-SARS-CoV-2 ġew determinati bl-użu ta' virus SARS-CoV-2. (E) Assaġġ ta' newtralizzazzjoni bbażat fuq sistema ta' virus pseudotyped ta' SARS-CoV-2 Omicron. Il-proporzjonijiet ta' inibizzjoni għas-sera mill-gruppi finta (blu), pS (aħmar), pS + pN (aħdar), pS + pE + pM (roża), u pN (oranġjo). Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw is-SEM, u l-valuri p ġew ikkalkulati bl-użu ta' ANOVA f'żewġ direzzjonijiet u analiżi post hoc ta' Sidak, fejn * p < 0.05

3.3. Livelli Għoli ta' Antikorp Newtralizzanti Indotti minn Ko-Tilqim ma' Vaċċini pS u pN

It-titri newtralizzanti tal-kampjuni tas-serum dilwiti serjament ġew determinati bl-użu tal-virus SARS-CoV-2 psewdotipizzat. L-ogħla livelli ta 'antikorpi newtralizzanti (nAbs) ġew osservati fil-grupp pS + pN, bit-titri medji ġeometriċi reċiproċi EC50 jilħqu 2988 (f'jum 35) u 3578 (f'jum 56) (Figura 3C). Riżultati simili ġew osservati bl-użu tal-assaġġ ta' mikronewtralizzazzjoni tal-virus ħaj (MN), fejn il-livelli ta' nAbs fil-grupp pS + pN kienu ogħla minn dawk fil-grupp S fil-jiem 56 u 96 (p <0.05; Figura; 3D). Barra minn hekk, il-livelli ta 'nAbs fil-grupp pS + pN fil-jum 56 (it-tieni spinta) kienu ogħla b'mod sinifikanti minn dawk fil-jum 35 (p <0.05; Figura 3D).

L-attività newtralizzanti ta' kull reġim ta' vaċċin kontra l-varjant Omicron SARS-CoV-2 ġiet determinata aktar bl-użu tal-pjattaforma psewdotipata u l-kampjuni tas-serum. Il-profil tan-newtralizzazzjoni kontra l-virus Omicron fil-jiem 35 u 56 kien simili għal dak kontra l-virus antenati (Figura 3E), li jissuġġerixxi li t-trattament PS + pN kellu qawwa newtralizzanti inkroċjata.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

3.4. Rispons taċ-Ċelloli T Indotti minn Vaċċinazzjoni tad-DNA

Kif deskritt qabel, ir-risponsi taċ-ċelluli T kontra l-antiġeni SARS-CoV-2 S/N/E/M ġew stmati bl-użu ta' IFN-ELISpot, kif deskritt qabel [15]. Kif mistenni, kemm il-korsijiet PS + pN kif ukoll pS + pE + pM indoxxew livelli ogħla b'mod sinifikanti ta' ċelluli IFN + T speċifiċi għall-proteina S fit-12 jum0 milli fil-jum 35 (p <0). 05; Figura 4A). Barra minn hekk, in-numru ta 'ċelluli IFN + T speċifiċi għall-proteina N fil-jum 120 (it-tieni spinta) kien ogħla b'mod sinifikanti minn dak fil-jum 35 fil-grupp pS + pN (p <0.05; Figura 4B). Fl-aħħarnett, in-numru ta 'ċelluli IFN + T speċifiċi għall-proteina M fil-jum 120 (it-tieni spinta) kien ogħla b'mod sinifikanti minn dak fil-jum 35 fiż-żewġ gruppi (p <0.05; Figura 4D).

Figura 4. Risposti taċ-ċelluli T għal proteini strutturali individwali tas-SARS-CoV-2 fil-ġrieden BALB/c. (A) Ir-reazzjonijiet taċ-ċelluli T ġew imkejla bl-użu ta' IFN- ELISpot fi splenoċiti stimulati għal 20 sigħat b'pools ta' peptidi li jikkoinċidu li jkopru s-SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, u (D) proteini M. Il-vireg jirrappreżentaw il-medja ± SD. Analiżi statistiċi saru bl-użu ta' ANOVA f'żewġ direzzjonijiet u t-test post hoc ta' Sidak, fejn * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.01, u **** p < 0.0001.

3.5. Protezzjoni Sinerġistika Indotta minn Ko-Ttilqim ma pS/pN jew pS/pE/pM

Imbagħad evalwajna l-effikaċja protettiva tal-vaċċini tad-DNA bl-użu ta’ ġrieden hACE2 immunizzati wara l-isfida bil-virus antenati SARS-CoV-2. Wara l-isfida, il-ġrieden fil-grupp finta wrew telf ta 'piż gradwali. B'kuntrast, il-ġrieden immunizzati jew b'pS jew pS + wrew telf ta 'piż ħafif immedjatament wara l-infezzjoni, segwit minn irkupru (Figura 5A). Ma nstab l-ebda virus ħaj fil-ġrieden imlaqqma b'pS, pS + pN, jew pS + pE + pM. Barra minn hekk, it-tilqim pS + pN naqqas b'mod sinifikanti n-numri tal-kopji tal-RNA virali meta mqabbla ma 'dawk miksuba bit-tilqim pS waħdu (p=0.0228; Figura 5B). Barra minn hekk, l-istopatoloġija tal-pulmun wriet li l-ġrieden kemm fil-gruppi finta kif ukoll f'pN wrew irqajja fokali ta 'infjammazzjoni, invaġinazzjoni plewrali, kollass alveolari, livelli għoljin ta' infiltrazzjoni taċ-ċelluli infjammatorji, u żoni emorraġiċi. B'paragun, ġrieden ittrattati jew b'pS + pN jew pS + pE + pM urew bidliet istopatoloġiċi aktar ħfief u punteġġi INHAND aktar baxxi wara l-isfida mill-grupp l-ieħor (Figura 5C).

Figura 5. Effikaċja protettiva tal-immunizzazzjoni wara l-isfida bil-virus SARS-CoV-2 ħaj. (A) Il-ġrieden kienu jintiżnu kuljum (medja ± żball standard tal-medja (SEM), n=4) għal tlett ijiem wara l-isfida. (B) Titer infettiv ta' SARS-CoV-2 f'omoġenati tal-pulmun fit-tielet jum wara l-isfida, kif determinat permezz tal-assaġġ TCID5{{10}} u n-numru tal-kopja RNA. Differenzi statistikament sinifikanti bejn il-gruppi ġew determinati bl-użu ta' ANOVA one-way segwita mill-korrezzjoni ta' tqabbil multiplu ta' Dunnett (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, u **** p < 0.0001). (C) Analiżi istopatoloġika tal-pulmun bl-użu ta 'tbajja' H&E.

4. Diskussjoni

F'dan l-istudju, il-ko-immunizzazzjoni b'żewġ vaċċini tad-DNA li jesprimu l-proteini S u N indott livelli għoljin ta 'nAbs u kienet effettiva ħafna fit-tnaqqis tat-tagħbija virali SARS-CoV-2 fil-ġrieden. Vaċċini tad-DNA li jesprimu l-proteina S indotti żieda fil-livelli ta 'immunità ċellulari speċifiċi għall-proteina S wara tliet tilqim meta l-ġrieden ġew ko-immunizzati mal-proteini N/E u M u ttaffi l-bidliet istopatoloġiċi wara l-isfida. Sa fejn nafu aħna, dan huwa l-ewwel rapport li jiżvela t-titjib sinerġistiku tal-immunità u l-protezzjoni fil-ġrieden li jużaw vaċċin tad-DNA li jikkodifika l-proteina S meta jkunu ko-immunizzati ma’ vaċċini tad-DNA li jikkodifikaw proteini strutturali oħra ta’ SARS-CoV{{8 }}.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Epitopi taċ-ċelluli B immunodominanti f'reġjuni tal-antiġen N ġew osservati f'diversi studji. Vaċċini bbażati fuq N normalment ma jistgħux jinduċu nAbs, x'aktarx minħabba li l-proteina N ma tintwerax fuq il-wiċċ virali. Notevolment, il-ko-immunizzazzjoni mal-proteini S u N indotta livelli ogħla ta 'nAbs kontra l-vajrus antenati u Omicron SARS-CoV-2 mill-gruppi l-oħra. Żieda fir-risponsi ta 'nAb huma assoċjati ma' tneħħija virali aħjar u effikaċja protettiva. Ir-riżultati tagħna wrew li t-trattament pS + pN kien aktar effettiv mit-trattament pS waħdu fit-tnaqqis tat-tagħbija virali SARS-CoV-2 wara l-isfida. Studju preċedenti rrapporta li ħamsters immunizzati b'vaċċin li jesprimi flimkien il-proteini M u N kienu protetti kontra telf ta' piż sever u patoloġija tal-pulmun u naqqsu b'mod sinifikanti t-titri virali fl-orofarinġi u l-pulmuni wara l-isfida tas-SARS-CoV-2, li huwa konsistenti mar-riżultati tagħna [23]. Sfortunatament, it-tnaqqis fit-titri tal-virus ma jistax jiġi attribwit speċifikament għall-proteina M jew N, u l-livelli ta 'nAb ma ġewx evalwati f'dan l-istudju. Studju wieħed dwar il-vaċċin tal-mRNA SARS-CoV-2 irrapporta li l-ko-immunizzazzjoni S + N indotta rispons miżjud taċ-ċelluli CD8+ T-S speċifiċi u attività tal-antikorpi newtralizzanti, li pprovdiet protezzjoni aħjar fil-pulmuni kontra d-Delta varjant meta mqabbel ma 'S waħdu, li huwa konsistenti mar-riżultati ta' dan l-istudju [24]. Studju ieħor irrapporta li l-proteina N tal-koronavirus tal-gastroenterite trażmissibbli ppromwoviet is-sinteżi ta’ antikorpi newtralizzanti meta ċ-ċelluli TGEV-IMMUNE tal-ħnieżer ġew stimulati b’kombinazzjoni ta’ proteini S u N in vitro, u dan l-effett jista’ jiġi spjegat mir-rispons tal-limfoċiti T helper għal il-proteina N [25].

L-epitopi taċ-ċelluli T immunodominanti CD4+/CD8+ fir-reġjuni tal-antiġen N ġew identifikati qabel. Diversi studji rrappurtaw li vaċċini bbażati fuq il-proteina SARS-CoV-2 N effettivament jinduċu reazzjonijiet immuni ċellulari. Il-grupp S + N wera livelli ogħla ta 'immunità ċellulari speċifiċi għall-proteina S wara tliet tilqim. Studju wieħed dwar il-vaċċin tal-mRNA SARS-CoV-2 irrapporta li S + N kombinatorjali kkaġuna rispons miżjud taċ-ċelluli T CD8+ S-specific meta mqabbel ma' S waħdu, li huwa konsistenti mar-riżultati tagħna [24]. Studju ieħor irrapporta li r-reazzjonijiet taċ-ċelluli T għall-antiġeni S u N wara tilqim primarju b'antiġen doppju hAd5 S + N waħdu kienu ekwivalenti għal dawk minn pazjenti li qabel kienu infettati bis-SARS-CoV-2-, u mudelli ta' tbassir in silico ta' ċelluli T it-twaħħil tal-epitope HLA issuġġerixxa li r-risponsi taċ-ċelluli T għall-vaċċin hAd5 S + N se jżommu l-effikaċja tagħhom kontra l-varjant B.1.351. Barra minn hekk, plażma minn pazjenti preċedentement infettati bis-SARS-CoV-2-uriet affinità ta’ rbit ogħla maċ-ċelluli li jesprimu l-kostruzzjoni tal-antiġen doppju S-Fusion + N-ETSD milli għall-hAd5 S-Fusion waħdu, u tissuġġerixxi aktar li l-immunoġeniċità tal- Il-vaċċin S + N b'antiġen doppju huwa aħjar minn dak tal-vaċċin S b'antiġen wieħed [26].

Il-virus ħaj ma nstabx fil-pulmuni, u t-telf ta 'piż wara l-isfida ġie mtaffi fil-gruppi pS, pS + pN, u pS + pE + pM, filwaqt li t-trattament pN ma naqqasx b'mod effettiv it-titer tal-virus. Dawn is-sejbiet jenfasizzaw l-indispensabbiltà u l-effettività tal-proteina S bħala mira tal-vaċċin. Notevolment, il-ko-immunizzazzjoni b'pS u pN kellha effetti aħjar minn jew pS jew pN fuq it-tneħħija virali. Il-grupp pS + pE + pM indika inqas bidliet istopatoloġiċi fil-pulmuni, li huwa konsistenti mar-riżultati tal-istudju preċedenti tagħna [15]. Il-grupp S + N kellu kopji baxxi ta’ RNA virali fil-pulmun, tnaqqis fil-piż, u ħin ta’ rkupru rapidu wara l-isfida tas-SARS-CoV-2 meta mqabbel mal-grupp immunizzat b’S/N waħdu, li kien konsistenti mal- riżultati ta’ dan l-istudju. Madankollu, l-ebda wieħed mill-gruppi ma skopra t-titri tal-antikorpi newtralizzanti, li jistgħu jiġu spjegati b'differenzi fil-varjetà tal-vaċċin u l-annimali sperimentali [26]. Studju wieħed dwar il-vaċċin tal-vettur tal-adenovirus SARS-CoV-2 irrapporta li l-vaċċin S ipprovda biss protezzjoni akuta tal-moħħ meta ko-immunizzat ma’ vaċċin N [27]. Studju ieħor żviluppa vaċċini Tri: ChAd, Bi: ChAd, u Mono: ChAd li jesprimu l-proteini S1/N/RdRp, N/RdRp, u S1, rispettivament, u ttestjahom f'mudell ta 'annimali B.1.351. Patoloġija grossa estensiva ġiet osservata fil-Mono: ChAdlungs, filwaqt li l-pulmuni Bi: ChAd u Tri: ChAd dehru kważi ħielsa minn din il-patoloġija [28].

Barra minn hekk, annimali mhux imlaqqma kellhom tagħbijiet virali fil-pulmun għoljin, filwaqt li t-trattament Tri: ChAd naqqas b'mod sinifikanti t-tagħbijiet virali bi 3.5 zkuk. B'paragun, iż-żewġ vaċċini Bi: ChAd u Mono: ChAd naqqsu biss b'mod moderat it-tagħbija virali. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-effett protettiv tal-vaċċin ta 'antiġen doppju S/N kontra varjanti jista' jkun aħjar minn dak tal-vaċċin ta 'antiġen wieħed S, li huwa konsistenti mar-riżultati tagħna [28]. Ftit studji rrappurtaw li ġrieden immunizzati bil-proteina N jiżviluppaw infjammazzjoni severa tal-pulmun wara infezzjoni SARS-CoV [29-31]. Studji preċedenti rrappurtaw ukoll li l-immunizzazzjoni b'vaċċin tal-vettur tal-adenovirus li jesprimi l-proteina N tal-Virus tal-Epatite tal-Ġurdien tipproteġi l-ġrieden kontra infezzjoni letali, li turi li l-proteina N tista 'tiġġenera effett protettiv [32]. Barra minn hekk, il-grupp immunizzat bil-vaċċin tad-DNA CRT/N kellu titer virali mnaqqas b'mod sinifikanti wara l-isfida, b'virus vaccinia li jesprimi l-proteina N SARS-CoV [33].

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Studju wieħed fuq il-proteina S wera li t-tilqima magħquda tad-DNA/proteina indotta kemm immunità umorali kif ukoll ċellulari aħjar mill-vaċċin tad-DNA/proteini waħdu [8]. Vaċċini li jimmiraw biss il-proteina S wrew effikaċja mnaqqsa fil-protezzjoni kontra COVID-19 minn ħafif għal moderat ikkawżat minn varjanti emerġenti. Ir-rwoli tal-proteini strutturali tas-SARS-CoV-2 konservati, inklużi l-proteini N/E/M, jistħoqqilhom attenzjoni fid-disinn u l-applikazzjonijiet tal-vaċċini, peress li r-risponsi taċ-ċelluli T indotti mill-vaċċin kontra epitopi kkonservati ġeneralment mhumiex affettwati minn mutazzjonijiet . Studju wieħed irrapporta li pazjenti rkuprati mis-SARS (n=23) xorta kellhom ċelluli T tal-memorja fit-tul reattivi għall-proteina N SARS-CoV 17-il sena wara t-tifqigħa tal-2003, li wriet reattività inkroċjata robusta għas-SARS CoV{ {15}} Proteina N, li tkompli tivvalida l-użu tal-proteina N bħala mira ta' vaċċin ta' protezzjoni trasversali [34]. Dan l-istudju wera li l-koimmunizzazzjoni pS/pN kienet assoċjata ma’ risponsi ogħla ta’ nAb, tneħħija virali aħjar, u risponsi immuni ċellulari mtejba u tista’ tipprovdi protezzjoni aħjar wara l-isfida tas-SARS-CoV-2 meta mqabbla ma’ pS waħdu. Barra minn hekk, intwera varjanti tas-SARS-CoV-2 li jinfettaw ħafna speċi ta' annimali, u t-trażmissjoni minn bniedem għal annimal ġiet osservata f'xi annimali selvaġġi u annimali domestiċi [7]. Għalhekk, il-vaċċin veterinarju SARS-CoV-2 jeħtieġ aktar attenzjoni. Barra minn hekk, in-nanoteknoloġija tista' tkun għodda b'saħħitha fl-ottimizzazzjoni tal-vaċċini u hija denja ta' aktar attenzjoni [2].

Dan l-istudju għandu diversi limitazzjonijiet. L-ewwel, osservajna biss l-istrateġija tal-vaċċin tad-DNA fil-ġrieden BALB/c, u studji futuri għandhom jivvalutaw l-effetti immunoġeniċi ta 'dawn il-korsijiet ta' vaċċin f'mudelli oħra ta 'annimali. It-tieni, riċerka addizzjonali hija meħtieġa biex jifhmu bis-sħiħ il-mekkaniżmi molekulari sottostanti r-risponsi miżjuda taċ-ċelluli T CD8 speċifiċi nAb u S indotti mill-koimmunizzazzjoni bl-użu tal-proteini S u N u biex jiġi sfruttat dan l-għarfien biex jiġi ottimizzat COVID-19 disinn tal-vaċċin. Fl-aħħarnett, il-funzjoni ta 'antikorpi speċifiċi għall-proteini N jistħoqqilha aktar studju.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Bħala konklużjoni, dan l-istudju evalwa l-potenzjal immuni protettiv tal-ko-immunizzazzjoni mal-proteini SARS-CoV-2 S, N, E, u M. Diversi vaċċini li jimmiraw biss il-proteina S għandhom effett protettiv imnaqqas fuq ir-razez varjanti emerġenti. Ir-riżultati tagħna se jqiegħdu l-pedament għall-iżvilupp ta’ vaċċin transreattiv għall-COVID-19 biex jikkontrolla l-varjanti attwali u emerġenti ta’ SARS-CoV-2 u jipprevjeni pandemiji potenzjali tal-coronavirus.

Referenzi

1. Zmievskaya, E.; Valiullina, A.; Ganeeva, I.; Petukhov, A.; Rizvanov, A.; Bulatov, E. Applikazzjoni ta 'CAR-T Cell Therapy lil hinn mill-Onkoloġija: Mard Awtoimmuni u Infezzjonijiet Viral. Bijomediċini 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Rashidzadeh, H.; Danafar, H.; Rahimi, H.; Mozafari, F.; Salehiabar, M.; Rahmati, MA; Rahamooz-Haghighi, S.; Mousazadeh, N.; Mohammadi, A.; Ertas, YN; et al. Nanoteknoloġija kontra l-koronavirus ġdid (sindrome respiratorju akut sever koronavirus 2): Dijanjosi, trattament, terapija u perspettivi futuri. Nanomedicine 2021, 16, 497–516. [CrossRef]

3. Fontanet, A.; Cauchemez, S. COVID-19 immunità tal-merħla: Fejn qegħdin? Nat. Dun Immunol. 2020, 20, 583–584. [CrossRef] [PubMed]

4. Jeyanathan, M.; Afkhami, S.; Smaill, F.; Miller, MS; Lichty, BD; Xing, Z. Konsiderazzjonijiet immunoloġiċi għall-istrateġiji tal-vaċċin COVID-19. Nat. Dun Immunol. 2020, 20, 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. Vandelli, A.; Monti, M.; Milanetti, E.; Armaos, A.; Rupert, J.; Zacco, E.; Bechara, E.; Delli Ponti, R.; Tartaglia, GG Analiżi strutturali tal-ġenoma tas-SARS-CoV-2 u tbassir tal-interatomi tal-bniedem. Aċidi Nukleiċi Res. 2020, 48, 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Mekkaniżmi tad-dħul tas-SARS-CoV-2 fiċ-ċelloli. Nat. Dun Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]

7. Conforti, A.; Sanchez, E.; Salvatori, E.; Lione, L.; Compagnone, M.; Pinto, E.; Palombo, F.; D'Acunto, E.; Muzi, A.; Roscilli, G.; et al. Kandidat lineari għal vaċċin tad-DNA li jikkodifika d-Dominju tal-Irbit tar-Riċetturi tas-SARS-CoV-2 iqanqal rispons immuni qawwi u antikorpi newtralizzanti fil-qtates domestiċi. Mol. Ther. Metodi Clin. Dev. 2023. [CrossRef]

8. Borgoyakova, MB; Karpenko, LI; Merkulyeva, IA; Shcherbakov, DN; Rudometov, AP; Starostina, EV; Shanshin, DV; Isaeva, AA; Nesmeyanova, VS; Volkova, NV; et al. Immunoġeniċità tad-DNA/Protein Kombinat Vaċċin kontra COVID-19. Bull. Exp. Biol. Med. 2023, 1–4. [CrossRef]

9. Qu, L.; Yi, Z.; Shen, Y.; Lin, L.; Chen, F.; Xu, Y.; Wu, Z.; Tang, H.; Zhang, X.; Tian, ​​F.; et al. Vaċċini ċirkolari RNA kontra SARS-CoV-2 u varjanti emerġenti. Ċellula 2022, 185, 1728–1744.e16. [CrossRef]

10. Corbett, KS; Edwards, DK; Leist, SR; Abiona, OM; Boyoglu-Barnum, S.; Gillespie, RA; Himansu, S.; Schäfer, A.; Ziwawo, CT; DiPiazza, AT; et al. Disinn tal-vaċċin tal-mRNA tas-SARS-CoV-2 attivat minn tħejjija ta' prototip ta' patoġenu. Natura 2020, 586, 567–571. [CrossRef]

11. Tian, ​​JH; Patel, N.; Haupt, R.; Zhou, H.; Weston, S.; Hammond, H.; Logue, J.; Portnoff, A.; Norton, J.; Guebre-Xabier, M.; et al. Sars-CoV-2 spike glycoprotein vaċċin kandidat NVX-CoV2373 immunoġeniċità fil-babuni u protezzjoni fil-ġrieden. Nat. Komun. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Andreano, E.; Paciello, I.; Piccini, G.; Manganaro, N.; Pileri, P.; Hyseni, I.; Leonardi, M.; Pantano, E.; Abbiento, V.; Benincasa, L.; et al. L-immunità ibrida ttejjeb iċ-ċelluli B u l-antikorpi kontra l-varjanti ta' SARS-CoV-2. Natura 2021, 600, 530–535. [CrossRef]

13. Naqvi, AAT; Fatima, K.; Mohammad, T.; Fatima, U.; Singh, IK; Singh, A.; Atif, SM; Hariprasad, G.; Hasan, GM; Hassan, MI Tagħrif dwar il-ġenoma, l-istruttura, l-evoluzzjoni, il-patoġenesi u t-terapiji tas-SARS-CoV-2: Approċċ tal-ġenomika strutturali. Biochim. Biophys. Acta Mol. Bażi. Dis. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Abbasi, J. Il-vaċċin tad-DNA Ġdid tal-COVID-19 tal-Indja għall-Adolexxenti u l-Adulti Huwa l-Ewwel. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, J.; Deng, Y.; Huang, B.; Han, D.; Wang, W.; Huang, M.; Zhai, C.; Zhao, Z.; Yang, R.; Zhao, Y.; et al. Vaċċini tad-DNA li jesprimu l-proteini tal-pakkett u tal-membrana jipprovdu protezzjoni parzjali kontra SARS-CoV-2 fil-ġrieden. Quddiem. Immunol. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. Tebas, P.; Kraynyak, KA; Patel, A.; Maslow, JN; Morrow, MP; Sylvester, AJ; Knoblock, D.; Gillespie, E.; Amante, D.; Racine, T.; et al. Il-vaċċin tad-DNA SynCon®Ebola GP intradermali huwa stabbli fit-temperatura u juri b'mod sigur Vantaġġi ta 'immunoġeniċità ċellulari u umorali f'voluntiera b'saħħithom. J. Infetta. Dis. 2019, 220, 400–410. [CrossRef]

17. Smith, TRF; Patel, A.; Ramos, S.; Elwood, D.; Zhu, X.; Yan, J.; Gary, EN; Walker, SN; Schultheis, K.; Purwar, M.; et al. Immunoġeniċità ta' vaċċin tad-DNA kandidat għall-COVID-19. Nat. Komun. 2020, 11, 2601. [CrossRef]

18. Zhao, Z.; Deng, Y.; Niu, P.; Kanzunetta, J.; Wang, W.; Du, Y.; Huang, B.; Wang, W.; Zhang, L.; Zhao, P.; et al. Il-Ko-Tilqim Ma' CHIKV VLP u Vaċċini tad-DNA Tinduċi Rispons Umorali Promettant fil-ġrieden. Quddiem Immunol. 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. Guan, J.; Deng, Y.; Chen, H.; Yin, X.; Yang, Y.; Tan, W. L-ipremjar b'żewġ vaċċini tad-DNA li jesprimu l-proteina NS3 tal-virus tal-epatite Ċ li jimmiraw lejn iċ-ċelloli dendritiċi jġib potenzjal protettiv eterologu superjuri fil-ġrieden. Arch. Virol. 2015, 160, 2517–2524. [CrossRef]

20. Chen, H.; Wen, B.; Deng, Y.; Wang, W.; Yin, X.; Guan, J.; Ruan, L.; Tan, W. Effett imsaħħaħ tal-immunizzazzjoni tad-DNA flimkien ma 'elettroporazzjoni in vivo b'kombinazzjoni ta' plasmidi tal-qalba tal-virus tal-epatite B-PreS1 u S-PreS1. Clin. Vaċċin Immunol. 2011, 18, 1789–1795. [CrossRef]

21. Yang, R.; Deng, Y.; Huang, B.; Huang, L.; Lin, A.; Li, Y.; Wang, W.; Liu, J.; Lu, S.; Zhan, Z.; et al. Vaċċin tal-mRNA tal-COVID-19 strutturat bil-qoxra b'mudell ta' bijodistribuzzjoni favorevoli u immunità promettenti. Transduct tas-Sinjal. Target Ther. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Yang, R.; Huang, B.; A, R.; Li, W.; Wang, W.; Deng, Y.; Tan, W. Żvilupp u effettività ta 'sistema psewdotipata SARS-CoV-2 kif determinata mill-effiċjenza newtralizzanti u test ta' inibizzjoni tad-dħul in vitro. Biosaf. Saħħa 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. Jia, Q.; Bielefeldt-Ohmann, H.; Maison, RM; Masleša-Gali´c, S.; Cooper, SK; Bowen, RA; Horwitz, MRA Vaċċin replikat b'vector batterju li jesprimi proteini SARS-CoV-2 Membrana u Nukleokapsid jipproteġi kontra mard sever bħal COVID-19- fil-ħamsters. Vaċċini NPJ 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Hajnik, RL; Plante, JA; Liang, Y.; Alameh, M.-G.; Tang, J.; Zhong, C.; Adam, A.; Scharton, D.; Rafael, GH; Liu, Y.; et al. It-tilqim mRNA kombinatorju jtejjeb il-protezzjoni kontra l-varjant delta tas-SARS-CoV-2. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Antón, IM; González, S.; Bullido, MJ; Corsín, M.; Risco, C.; Langeveld, JP; Enjuanes, L. Kooperazzjoni bejn proteini strutturali tal-koronavirus tal-gastroenterite trasmissibbli (TGEV) fl-induzzjoni in vitro ta 'antikorpi speċifiċi għall-virus. Virus Res. 1996, 46, 111–124. [CrossRef]

26. Deschambault, Y.; Lynch, J.; Warner, B.; Tierney, K.; Huynh, D.; Vendramelli, R.; Ħajta, N.; Ġlata, K.; Booth, S.; Sajesh, B.; et al. Immunizzazzjoni waħda b'viruses ACAM2000 vaccinia rikombinanti li jesprimu l-ispike u l-proteini nukleokapsid jipproteġu l-ħamsters kontra mard kliniku kkawżat minn SARS-CoV-2-. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster, P.; Klassi, J.; Dangi, T.; Richner, JM A SARS CoV-2 vaċċin nukleokapsid jipproteġi kontra t-tixrid virali distali. bioRxiv 2021.

28. Afkhami, S.; D'Agostino, MR; Zhang, A.; Stacey, HD; Marzok, A.; Kang, A.; Singh, R.; Bavananthasivam, J.; Ye, G.; Luo, X.; et al. It-twassil tal-mukuża respiratorja tal-vaċċin COVID-19 tal-ġenerazzjoni li jmiss jipprovdi protezzjoni b'saħħitha kemm kontra razez antenati kif ukoll varjanti ta' SARS-CoV-2. Ċellula 2022, 185, 896–915.e19. [CrossRef]

29. Zheng, N.; Xia, R.; Yang, C.; Yin, B.; Li, Y.; Duan, C.; Liang, L.; Guo, H.; Xie, Q. Espressjoni msaħħa tal-proteina nucleocapsid SARS-CoV fit-tabakk u l-immunoġeniċità tagħha fil-ġrieden. Vaċċin 2009, 27, 5001–5007. [CrossRef]

30. Yasui, F.; Kai, C.; Kitabatake, M.; Inoue, S.; Yoneda, M.; Yokochi, S.; Kase, R.; Sekiguchi, S.; Morita, K.; Hishima, T.; et al. Immunizzazzjoni minn qabel b'proteina nukleokapsid tal-koronavirus (SARS-CoV) assoċjata mas-sindromu respiratorju akut sever (SARS) tikkawża pnewmonja severa fil-ġrieden infettati bis-SARS-CoV. J. Immunol. 2008, 181, 6337–6348. [CrossRef]

31. Deming, D.; Sheahan, T.; Heise, M.; Yount, B.; Davis, N.; Sims, A.; Suthar, M.; Harkema, J.; Whitmore, A.; Pickles, R.; et al. Effikaċja tal-vaċċin fil-ġrieden senescent ikkontestati b'varjanti ta 'spike epidemija u żoonotika li jkollhom SARS-CoV rikombinanti. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Wesseling, JG; Godeke, GJ; Schijns, VE; Prevec, L.; Graham, F.; Horzinek, MC; Rottier, PJ Spike tal-virus tal-epatite tal-ġurdien u proteini nukleokapsid espressi minn vettori tal-adenovirus jipproteġu l-ġrieden kontra infezzjoni letali. J. Ġen Virol. 1993, 74, 2061–2069. [CrossRef] [PubMed]

33. Kim, TW; Lee, JH; Mdendla, CF; Peng, S.; Roden, R.; Wang, MC; Viscidi, R.; Tsai, YC; Hu, L.; Chen, PJ; et al. Ġenerazzjoni u karatterizzazzjoni ta 'vaċċini tad-DNA li jimmiraw il-proteina nukleokapsid tal-koronavirus tas-sindromu respiratorju akut sever. J. Virol. 2004, 78, 4638–4645. [CrossRef] [PubMed]

34. Le Bert, N.; Tan, AT; Kunasegaran, K.; Tham, CYL; Hafezi, M.; Chia, A.; Chng, MHY; Lin, M.; Tan, N.; Linster, M.; et al. Sars-CoV-2-immunità taċ-ċelluli T speċifiċi f'każijiet ta' COVID-19 u SARS, u kontrolli mhux infettati. Natura 2020, 584, 457–462. [CrossRef]