Effetti Sinerġistiċi Anti-infjammatorji Ta 'Laminaria Japonica Fucoidan U Estratt ta' Cistanche Tubulosa

Bħala rispons immuni kontra antiġeni barranin, il-makrofagi jirrilaxxaw ċitokini pro-infjammatorji bħal fattur tan-nekrożi tat-tumur- (TNF- ), interleukin-1 (IL{- 1 ), IL-6, u oħrajn. Ċitokini bħal dawn jinduċu influss kimotattiku ta 'granuloċiti, monoċiti, limfoċiti, u ċelluli mast għal tessut bil-ħsara li jippromwovi t-tneħħija tal-antiġen u l-irkupru tat-tessut. Madankollu, l-infiltrazzjoni eċċessiva u l-attivazzjoni taċ-ċelloli jaggravaw il-korrimenti tat-tessuti, li jwasslu għal edema (exsudation vaskulari) u uġigħ li huma fenomeni ta 'infjammazzjoni magħrufa.

TNF- huwa fattur importanti biex jinduċi l-espressjoni tal-ġeni ta 'nitric oxide synthase (iNOS) f'diversi linji taċ-ċelluli. L-attivazzjoni ta 'iNOS twassal għal produzzjoni ta' ossidu nitriku (NO) li mhux biss jimmodula bosta funzjonijiet fiżjoloġiċi bħal batteriċida u vażodilatazzjoni iżda wkoll tikkawża infjammazzjoni. Wara l-ħsara fit-tessut, id-degradazzjoni mill-fosfolipasi tal-fosfolipidi tal-membrana taċ-ċelluli tiġġenera aċidu arakidoniku. L-aċidu arakidoniku huwa aktar dekompost minn cyclooxygenase (COX) għal prostaglandini (PGs). Ammont eċċessiv ta 'PGE2 iffurmat minn COX-II jinduċi diversi ċitokini għall-infjammazzjoni. Peress li kemm NO kif ukoll PGE2 jaġixxu bħala fatturi ewlenin għall-infjammazzjoni u l-induzzjoni tal-uġigħ, il-mogħdijiet TNF--NO u COX-II-PGE2 huma l-flussi ewlenin tal-proċess infjammatorju, li huma inibiti minn kortikosterojdi u mhux sterojdi.mediċini anti-infjammatorji(NSAIDs), rispettivament.

Anke jekk hemm diversi sterojdi u NSAIDs għalit-terapija ta 'mard infjammatorju, dawn il-mediċini jistgħu jagħtu lok għal effetti avversi fuq is-sistema immuni, l-apparat gastrointestinali, il-kliewi, il-fwied, is-sistema nervuża ċentrali, il-pressjoni tad-demm u s-sistema kardjovaskulari. Għalhekk, huwa meħtieġ li jiġu minimizzati l-effetti ħżiena tat-terapewtiċi kimiċi billi jiġu sostitwiti jew jużawhom flimkien ma 'prodotti naturali.

Fucoidan, kumpless ta 'sulfat polysaccharide minn alka tal-baħar bħal Laminaria japonica u Cladosiphon okamuranus imqassma b'mod wiesa' f'ħafna pajjiżi, intuża bħala terapewtiċi fil-mediċina Orjentali għal perjodu twil. Fi studji preċedenti, intwera li fucoidan għandu anti-ossidattiv, anti-koagulattiv, kontra l-kanċer, uattivitajiet anti-infjammatorji. Għaldaqstant, l-effetti ta 'benefiċċju ta' fucoidan fuq mard infjammatorju, iskemija, disfunzjoni immuni, u tumuri qed jiġbdu l-attenzjoni tal-investigaturi. Min-naħa l-oħra,Cistanche tubulosa(CT) intuża wkoll ħafna bħala medikazzjoni tradizzjonali fiċ-Ċina. Ġie rrappurtat li l-estratti CT ibaxxu l-produzzjoni ta 'TNF-á u IL- 4 li huma fatturi ewlenin għall-produzzjoni ta' NO f'mogħdijiet infjammatorji [19].

Sejbiet preċedenti bħal dawn wassluna biex ninvestigaw l-effikaċja kombinazzjonali ta 'fucoidan u estratt CT fuq iż-żewġ mogħdijiet ewlenin ta' infjammazzjoni. Biex niċċaraw il-mekkaniżmu ta 'azzjoni, aħna analizzajna NO u PGE2 fl-exudates minn infjammazzjoni tal-borża ta' l-arja indotta mill-carrageenan.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦALL-PREVENTATTIVITAJIET INFLAMMATORJIPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materjali u Metodi

Materjali

Fucoidan semi-purifikat u estratt ta 'l-ilma ta' CT inkisbu minn Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Korea). Fucoidan u estratt CT inżammu fi gradi 4, imħallta (1:3) maħlul f'ilma purifikat qabel l-użu, u amministrati oralment f'volum ta '5 mL/kg.

Kultura taċ-ċelluli u kwantifikazzjoni NO

Il-linja taċ-ċelluli RAW 264.7 tal-makrofagi murini nxtrat mill-Kollezzjoni tal-Kultura tat-Tip Amerikana (Manassas, USA), u kkultivata fil-mezz Eagle modifikat ta' Dulbecco (Sigma, St. Louis, USA) li fih 10% serum tal-fetu bovin u antibijotiċi [100 U/mL peniċillina (Sigma) u 100 µg/mL streptomycin (Sigma)]. Iċ-ċelloli ġew inkubati f'atmosfera umidifikata ta '5% CO2 f'37 grad.

Biex jiġu vvalutati l-effetti ta 'fucoidan u estratt CT fuq is-sekrezzjoni ta' NO, ċelluli RAW 264.7 (1 × 106 ċelluli/mL) ġew inkubati b'fucoidan jew estratt CT (1-320 µg/ mL) għal 5 min. , segwit minn interferon- (IFN- , 10 U/ mL) u lipopolysaccharide (LPS, 10 µg/mL) għal 24 siegħa. Fl-istudji preliminari tagħna, ġie kkonfermat li t-trattament b'IFN- plus LPS għall-attivazzjoni taċ-ċelluli RAW 264.7 ma affettwax il-vijabbiltà taċ-ċelloli sa 24 siegħa u li fucoidan u estratt CT ma kinux ċitotossiċi sa 1 mg/mL. Il-konċentrazzjoni ta 'nitrit (NO2 - ), il-prodott ossidizzat ta' NO, ġiet imkejla bħala indikatur ta 'NO. Il-medja tal-kultura tħallat ma 'volum ugwali ta' reaġent Griess (1% sulfanilamide, 0.1% naphthyl ethylenediamine f'2.5% aċidu fosforiku) [21], u inkubat f'temperatura tal-kamra għal 10 min. Il-konċentrazzjoni tan-nitrit ġiet analizzata f'540 nm, fejn intuża NaNO2 biex jiġġenera kurva standard.

Annimali u trattament

Ġrieden ICR maskili (7 ġimgħat) inxtraw mid-Daehan Biolink (Eumseong, Korea), u miżmuma f'kamra b'kundizzjonijiet ambjentali kostanti (22±2ºC; 40-70% umdità relattiva; 12-siegħa dawl -ċiklu skur; 150-300 lux luminożità). L-għalf tal-pellet u l-ilma purifikat kienu disponibbli ad libitum. L-esperimenti kollha fuq l-annimali ġew approvati mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali (IACUC) tal-Università Nazzjonali ta 'Chungbuk (CBNU), il-Korea, u mwettqa skont il-Proċeduri ta' Operazzjoni Standard (SOP) taċ-Ċentru tar-Riċerka tal-Annimali tal-Laboratorju, CBNU.

Il-ġrieden (n=8/grupp) ġew ittrattati oralment b'fucoidan (18 jew 54 mg/kg), estratt CT (54 jew 162 mg/kg), jew it-taħlita tagħhom (18+54, {{6 }} jew 90+270 mg/kg) darba kuljum għal 7 ijiem. Dożi baxxi ta' fucoidan (18 mg/kg) u estratt CT (54 mg/kg) kienu minn dożi umani stmati ta' 100 mg/ġisem (70 kg) u 300 mg/ġisem wara t-traduzzjoni tal-erja tas-superfiċje tal-piż tal-ġisem (Km{14). }} għall-bniedem/Km=3 għall-ġurdien), rispettivament. Dożi għoljin ta 'fucoidan u estratt CT ġew stabbiliti fi 3 darbiet, waħedhom jew f'taħlita, u t-taħlita ta' l-ogħla doża ġiet iffissata f'5 darbiet biex jiġu vvalutati l-effetti sinerġistiċi massimi.

Fl-1 jum ta 'fucoidan u trattament ta' estratt CT, ġrieden ġew injettati taħt il-ġilda b'10 mL ta 'arja sterili fin-naħa ta' wara biex jiffurmaw borża [22,23]. Wara jumejn u 5 ijiem, il-borża ġiet injettata mill-ġdid b'5 mL ta 'arja. Siegħa wara t-trattament finali, 1 mL ta 'carrageenan (1% fis-salina; Sigma) jew il-vettura tiegħu (salina) ġie injettat fil-borża.

Analiżi tal-exudates

Il-borża ta 'l-arja ġiet maħsula b'1 mL ta' salina kiesħa 6 sigħat wara l-injezzjoni ta 'carrageenan, u l-volum nett ta' fluwidu tal-ħasil ġie rreġistrat. In-numru totali ta 'ċelluli infjammatorji, newtrofili, monoċiti, u limfoċiti, ġew determinati bl-użu ta' counter counter. Il-konċentrazzjonijiet ta 'NO u PGE2 ġew determinati permezz ta' reaġent Griess (Sigma) u immunoassay ta 'enżimi (EIA) bl-użu ta' kit Correlate-EIA (Disinni ta 'Assaġġi, Ann Arbor, Ann ArboUSA), rispettivament.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦALL-AZZJONI TA' BLOCKJAR FUQ ĊELLI INFLAMMATORJI CHEMOTAXIS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Eżami istopatoloġiku

It-tessut tal-kisi tal-borża tneħħa u ġie ffissat f'soluzzjoni newtrali tal-formalina. Slajds tat-tessuti inkorporati fil-paraffin kienu mtebbgħin b'ematoxylin-eosin, u eżaminati taħt mikroskopju tad-dawl għall-leżjonijiet infjammatorji.

Analiżi statistika

Ir-riżultati huma ppreżentati bħala medja±SE. Tqabbil ta 'gruppi sperimentali saru permezz ta' analiżi one-way tal-varjanza segwita minn korrezzjoni tat-test ta 'Tukey. Valur AP<0.05 was considered statistically significant.

Riżultati

In vitro, il-kultura taċ-ċelluli RAW 264.7, it-trattament IFN- , u LPS żiedu ħafna l-produzzjoni ta 'NO (Figura 1). It-trattament minn qabel b'fucoidan (1-320 µg/mL) ma affettwax ir-rilaxx NO mil-linja taċ-ċelluli makrofaġi (Figura 1A). B'paragun, l-estratt CT (32-320 µg/mL) irażżan b'mod sinifikanti l-produzzjoni ta 'NO, indikattiv ta' attività anti-infjammatorja (Figura 1B).

L-injezzjoni ta 'carrageenan fil-borża ta' l-arja tal-ġurdien żiedet b'mod notevoli l-volum ta 'exudate fil-borża (Figura 2). Tali żieda fl-exudation ġiet attenwata bi trattament b'fucoidan (18 mg/kg) u estratt CT (54 u 162 mg/kg). Notevolment, it-trattament kombinattiv ta 'fucoidan u estratt CT naqqas aktar il-volum ta' exudates, meta mqabbel mal-effetti individwali, għalkemm kombinazzjonijiet ta 'dożi ogħla (54+162 mg/kg u 90+270 mg/kg) ma wrewx effikaċja addizzjonali. għall-inqas kombinazzjoni tad-doża (18+54 mg/kg) (Figura 2A). N grad ontent fil-borża wkoll żdied drastikament wara injezzjoni carrageenan (Figura 2B). Meta mqabbel ma 'l-effett ħafif ta' fucoidan, l-estratt CT naqqas b'mod notevoli l-oncentration tal-grad N. Trattament kombinazzjoni ta 'fucoidan u estratt CT naqqas aktar il-livell ta' NO b'mod dipendenti fuq id-doża. Bl-istess mod, il-kontenut miżjud ta 'PGE2 ġie mrażżan b'mod sinerġiku mit-terapija kombinazzjonali ta' fucoidan u estratt CT (Figura 2C).

B'mod parallel mal-medjaturi infjammatorji fil-borża, in-numri ta 'ċelluli infjammatorji żdiedu drastikament b'injezzjoni ta' carrageenan: 37.8, 4.8, u 24.1 darbiet ta 'livelli ta' kontroll għal newtrofili, monoċiti u limfoċiti, rispettivament (Tabella 1). Madankollu, fucoidan u estratt CT naqqsu b'mod sinifikanti l-infiltrazzjoni taċ-ċelluli infjammatorji, li fiha fucoidan kien kemmxejn superjuri għall-estratt CT. B'mod mhux mistenni, l-ebda effett sinerġistiku fl-infiltrazzjoni taċ-ċelluli infjammatorji ma nkiseb permezz ta 'ko-amministrazzjoni ta' fucoidan u estratt CT.

Kif dedott mill-infiltrazzjoni taċ-ċelluli infjammatorji fl-exudates, it-tessut taħt il-ġilda madwar il-boroż ta 'l-arja wera leżjonijiet infjammatorji severi (Figura 3). Ġew osservati ħafna ċelluli fit-tessut taħt il-ġilda mħaxxen esposti għal Carrageenan (Figura 3B), meta mqabbla mal-karatteristiċi kważi normali f'annimali ta 'kontroll (Figura 3A). Tali leżjonijiet infjammatorji kienu attenwati b'mod notevoli permezz ta 'trattament b'fucoidan (Figuri 3C u 3D) jew estratt CT (Figuri 3E u 3F).

Notevolment, inkisbu effetti anti-infjammatorji ogħla b'terapija kombinazzjonali b'fucoidan u estratt CT (Figuri 3G-3I).

Diskussjoni

Bl-użu ta 'mudell ta' infjammazzjoni tal-borża ta 'l-arja indotta mill-arrageenan ta' grad in viv, l-injezzjoni ta 'arja fid-dahar tal-annimali gerriema tinduċi l-proliferazzjoni ta' ċelloli li jistratifikaw fuq il-wiċċ tal-kavità biex jiffurmaw struttura simili għas-sinovju. F'dan il-mudell, l-injezzjoni ta 'infiltrazzjoni taċ-ċelluli infjammatorji indotta mill-carrageenan żiedet l-exudate, li huwa indikattiv ta' tnixxija vaskulari. Il-borża ta 'l-arja sservi bħala ġibjun ta' ċelloli infjammatorji u medjaturi li jistgħu jitkejlu faċilment fil-fluwidu li jakkumula lokalment.

Fost il-medjaturi infjammatorji varji li jistgħu jinduċu permeabilità vaskulari, huwa magħruf sew li NO u PGE2 huma fatturi ewlenin involuti fil-patoġenesi ta 'ħafna mard infjammatorju. Huma magħrufa wkoll bħala medjaturi tal-induzzjoni u l-perċezzjoni tal-uġigħ. iNOS, li huwa espress u attivat f'diversi tipi ta 'ċelluli permezz ta' stimulazzjoni b'TNF- u/jew LPS waqt l-infjammazzjoni, jipproduċi konċentrazzjonijiet għolja u persistenti ta 'NO. NO hija molekula regolatorja importanti f'funzjonijiet fiżjoloġiċi diversi, bħal vażodilatazzjoni li twassal għal tnixxija vaskulari. PGE2, li huwa ġġenerat mill-aċidu arakidoniku permezz ta 'COXs, jikkontribwixxi għall-iżvilupp ta' ħafna mard infjammatorju, u l-produzzjoni żejda ta 'PGE2 bi tweġiba għal diversi stimulazzjonijiet infjammatorji hija assoċjata ma' regolazzjoni 'l fuq tal-livelli ta' COX-II u progressjoni ta 'infjammazzjoni. Għalhekk, il-mogħdijiet TNF- - NO u COX-II-PGE2 ġew ikkunsidrati bħala żewġ flussi ewlenin ta 'proċessi infjammatorji, li huma mblukkati minn inibituri ta' iNOS (kortikosterojdi) u COX (NSAIDs), rispettivament.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦALL-PROJBIZZJONI TAL-MARD INFLAMMATORJU PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Fl-istudju preżenti, l-amministrazzjoni konġunta ta 'fucoidan u estratt CT naqqas il-volum ta' exudate fil-borża, li jissuġġerixxi li għandhom attività soppressiva kontra t-tnixxija vaskulari (Figura 2A). Meta mqabbel ma 'l-effetti individwali ta' kull estratt ta 'fucoidan u CT, it-trattament kombinazzjonali żdied aktar, li jimplika li tw degree jimpenja l-azzjoni b'mod sinerġiku. Tali effetti sinerġistiċi bejn fucoidan u estratt CT kienu appoġġjati mill-attivitajiet tagħhom fuq il-livelli NO u PGE2 fl-exudates (Figuri 3B u 2C).

Interessanti, madankollu, ġie kkonfermat li fucoidan ma jinibixxix direttament l-attivazzjoni ta 'makrofaġi assaġġi in vitro (Figura 1A). Bl-istess mod, il-potenzjal inibitorju ta 'fucoidan fuq l-akkumulazzjoni ta' NO u PGE2 assay in vivo kien relattivament aktar baxx minn dak tal-estratt CT (Figuri 2B u 2C). Tali mekkaniżmu ta 'azzjoni ta' fucoidan huwa differenti minn inattivazzjoni diretta taċ-ċelloli bl-estratt CT (Figura 1B). B'paragun, fucoidan eżerċita effikaċja għolja fuq l-inibizzjoni tal-infiltrazzjoni taċ-ċelluli infjammatorji fil-boroż (Tabella 1). Fucoidan kien superjuri għall-estratt CT fl-imblukkar tal-migrazzjoni ta 'newtrofili, monoċiti, u limfoċiti lejn is-siti ta' ħsara fit-tessuti kkaġunati mill-carrageenan. Interessanti, ma kien hemm l-ebda effett sinerġistiku kontra l-migrazzjoni, li jindika mekkaniżmi ta 'azzjoni differenti bejn fucoidan u estratt CT: jiġifieri, fucoidan jimblokka l-infiltrazzjoni ta' ċelloli infjammatorji, filwaqt li l-estratt CT jinibixxi l-attivazzjoni taċ-ċelloli.

Iċ-ċelloli polimorfonukleari, speċjalment in-newtrofili, huma l-komponenti ċellulari ewlenin ingaġġati għal siti infjammatorji akuti indotti minn carrageenan. Barra minn hekk, iċ-ċelluli infjammatorji li jirriżultaw bħal makrofaġi u limfoċiti għandhom ukoll rwoli ċentrali fil-proċess infjammatorju billi joħorġu ċitokini. Meta ttrattat minn qabel b'fucoidan jew estratt CT, in-numru ta 'ċelluli bojod tad-demm li emigraw fil-boroż ta' l-arja injettati bil-carrageenan ġie mrażżan b'mod notevoli. Dan ir-riżultat kien konsistenti ma' effett li kien jinkiseb minn kortikosterojdi bħal dexamethasone, iżda mhux minn NSAIDs inkluż indomethacin. Għalhekk, huwa preżunt li l-fucoidan u l-estratt CT għandhom parzjalment proprjetà ta 'sterojdi.

Minbarra l-azzjoni ta 'imblukkar fuq il-kimotassi taċ-ċelluli infjammatorji, l-estratt CT deher li jrażżan l-attivazzjoni tal-makrofaġi. Dan kien ikkonfermat mill-azzjonijiet inibitorji tiegħu fuq NO in vitro u in vivo, li huwa l-medjatur infjammatorju ewlieni prodott mill-makrofagi. Għalhekk, l-effett tal-estratt CT fuq il-makrofaġi jista 'jkun dovut għal soppressjoni tal-espressjoni tal-mRNA u/jew inibizzjoni diretta tal-attività tal-iNOS f'dawn iċ-ċelloli.

PGE2 huwa wkoll wieħed mill-medjaturi infjammatorji ewlenin. Dan jiżdied b'mod parallel ma 'edema tat-tessuti, li hija mrażżna minn NSAIDs, inibituri ta' COX. Carrageenan jista 'jżid il-produzzjoni ta' PGE2 billi jinduċi COX-II mRNA u proteina COX-II fl-exudate tal-borża. F'dan il-mudell, carrageenan żied b'mod sinifikanti l-ammont ta 'PGE2 u kien sostanzjalment mrażżan mill-estratt CT. Huwa interessanti li wieħed jinnota li dan ir-riżultat kien konsistenti ma 'effett li jinkiseb minn NSAID indomethacin. Għalhekk, huwa dedott mir-riżultati li l-estratt CT għandu proprjetajiet addizzjonali ta 'NSAIDs. Meħuda flimkien, huwa maħsub li l-estratt CT eżerċita kemm effetti kortikosterojdi kif ukoll NSAID fil-mudell ta 'infjammazzjoni indotta mill-carrageenan u li fucoidan tejjeb il-effetti anti-infjammatorji tal-estratt CTbilli timblokka l-infiltrazzjoni taċ-ċelluli infjammatorji.

Għalkemm id-definizzjoni tal-mekkaniżmu eżatt ta 'azzjoni teħtieġ aktar studju, taħlita ta' fucoidan u estratt CT attenwat b'mod notevoli sinjali infjammatorji billi timblokka l-mogħdijiet TNF- -NO u COX-II-PGE2 fl-infjammazzjoni tal-borża ta 'l-arja indotta minn carrageenan. Dawn is-sejbiet jipprovdu evidenza li t-trattament kombinattiv ta 'fucoidan u estratt CT jista' jkun kandidat promettenti għas-serħan ta 'diversi tipi ta' infjammazzjoni li jirrispondu għal kortikosterojdi jew NSAIDs.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦALL-PROJBIZZJONI TAL-MARD INFLAMMATORJU PHGS75% ECH 30% ACT 12%