Karatterizzazzjoni Strutturali U Valutazzjoni ta' Attivitajiet Kontra l-Infjammazzjoni U Anti-Tyrosinase Ta' Polifenoli Mill-Melastoma Normale Parti 2

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

Il-kompost 3 kellu l-istess formula molekulari bħall-kompost 2, kif determinat mid-dejta tal-HRSIMS tiegħu. It-tqabbil bejn id-dejta tal-NMR ta’ 3 u 2 (Tabella 2) wera li l-grupp methoxyl f’galloyl-C-4 fi 2 inbidel għal galloyl-C-3' fi 3. Dan kien ikkonfermat mill-korrelazzjonijiet HMBC (Figura 2)tal-protoni methoxyl(8y 3.88) u proton aromatiku (bH7.24)b'galloyl-C-3'(6c 149.1) fi 3, u ċ-ċaqliq kimiċi tal-grupp metoxyl, galloyl-C{ {24}}, galloyl-C-4, u galloyl-C-3' li nbidlu minn bc60.8,151.5,141.3, u 146.5 fi 2tobc56.7,146.6,140.7, u 149.1 in3, rispettivament pożittiv effett tal-qoton f'237nm u wieħed negattiv f'262 nm fl-ispettru CD indika l-(S)konfigurazzjoni tal-grupp HHDP għal 3 [24]. Il-konfigurazzjoni tal-moety taz-zokkor ġiet dedotta mill-kostanti tal-akkoppjar (=8.5 Hz) tal-proton anomeriku tal-moety glucosyl. L-idroliżi ta 'l-aċidu ta' 3 b'1 M HCl tat D-glukożju, li ġie kkonfermat minn analiżi TLC u GC. Għalhekk, il-kompost 3 ġie identifikat bħala 1-O-galloyl-6-O-({3-methoxygalloyl){-2,3-O-(S)-hexahydroxydiphenoyl{{ 66}}D-glukosju.

Il-formula molekulari ta '4 ġiet dedotta mill-ispettru HRESIMS tagħha (m/z 783.1032, [MH]-) bħala C35 H28 O21. Il-piż molekulari tiegħu kien 16-il unità tal-massa inqas minn dak ta '3, li jista' jiġi attribwit għan-nuqqas ta 'hydroxyl u l-preżenza ta' proton aromatiku (6H6.87) f'vanilloyl-C-5' f'4 (Tabella 2) . Dan kien ikkonfermat mill-preżenza ta' frazzjoni aromatika 1,2,4-trisostituta （μ7.60 （dd, J=8.3,1.8 Hz）,6.87 （d, J=8 .3 Hz）, u 7.57 （d, J=1.8 Hz）） u l-bidla ta' bidla kimika ta' galloyl-C-5' f'δc 145.8 in 3 għal vanilloyl-C-5 'f'bc 115.9 in 4. Il-methoxyl protons(6H 3.90)u aromatic proton (H 6.87) korrelazzjonijiet ma' vanilloyl-C-3' fl-ispettru HMBC (Figura 2) ikkonfermaw aktar il-proton aromatic (H 6.87) fi vanilloyl-C-5'. L-atropisomeriżmu tal-HHDP intwera li kien konfigurazzjoni S bid-dehra ta 'effetti pożittivi u negattivi tal-qoton f'239 nm u 263 nm, rispettivament [24]. Il-kostanti tal-akkoppjar tal-proton anomeriku f'4 kienu 8.5 Hz reminixxenti tal-konfigurazzjoni -anomerika. L-idroliżi tal-aċidu wriet li 4 kellu l-istess unitajiet taz-zokkor bħal 3. Għalhekk, il-kompost 4 ġie identifikat bħala 1-O-galloyl-6-O-vanilloyl-2,3-O- (S)-hexahydroxydiphenoyl- -D-glukożju.

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

2.2. Assays ta' Attività Kontra l-Infjammazzjoni

Four new compounds 1-4 were tested for potential anti-inflammatory activity by measuring the inhibition of nitric oxide (NO) production. Unfortunately, none of them displayed significantly anti-inflammatory activity. The IC5o values for the inhibition of NO production by compounds 1-4 are all>50uM. Ġie rrappurtat li l-flavonoli magħrufa kaempferol(7)[26[, quercetin (10)[27l u myricetin-3-O- -L-rhamnopyranoside(12)28 għandhom attività anti-infjammatorja, iżda kaempferol -3-rhamnoside (8) [26] u quercetin-3-O- -L-rhamnoside (11)[29] m'għandhom l-ebda attività anti-infjammatorja. Mir-riżultati sperimentali u d-dejta tal-letteratura, il-flavonoids fl-impjant tat-titlu għandhom attività anti-infjammatorja aħjar minn ellagitannins, jista 'jkun l-ingredjent attiv li jikkorrispondi għall-effett anti-infjammatorju ta' dan l-impjant.

2.3. Assays ta' Attività Inibitorja tat-Tyrosinase

Il-komposti kollha ġew investigati għal attività inibitorja potenzjali tat-tyrosinase. Kif muri fit-Tabella 3, komposti ġodda 2-4 wrew attivitajiet inibitorji moderati tat-tyrosinase. Kompost ġdid 1 wera attività inibitorja ta 'tyrosinase dgħajfa. Quercetin (10)[30] għandha attività inibitorja sinifikanti tat-tyrosinase, u l-attività tagħha kontra t-tyrosinase hija aħjar minn quercetin-3-OwL-rhamnoside(11)[26] u kaempferol (7) [26], li hija konsistenti bid-dejta tal-letteratura. Dan indika li l-gruppi 3'-u 4/-hydroxy fuq iċ-ċirku B u 3-gruppi hydroxy fuq iċ-ċirku C fil-flavonoli kienu kruċjali għall-attivitajiet tagħhom. L-attività anti-tyrosinase ta’ kaempferol (7)[26] hija aħjar minn kaempferol-3-rhamnoside (8)[26]u l-komposti 8 u 12 [31] m’għandha l-ebda attività sinifikanti kontra tyrosinase, li tkompli tappoġġja dan ta’ hawn fuq relazzjonijiet struttura-attività.

3. Sperimentali 3.1.Materjali

L-għeruq ta 'M.normale inġabru minn Yanshan Town, Guilin City, Provinċja ta' Guangxi, f'Settembru 2018, u awtentikati mill-Professur Yusong Huang (Istitut tal-Botanika ta 'Guangxi). Eżemplari ta 'vawċer (20180912) ġie depożitat fil-Laboratorju Ewlenin ta' Guangxi tar-Riċerka u l-Utilizzazzjoni tal-Fitokimiċi Funzjonali, l-Istitut tal-Botanika ta 'Guangxi, iċ-Ċina.

Cistanche jista 'jtejjeb l-immunità

3.2. Proċeduri Sperimentali Ġenerali

Rotazzjonijiet ottiċi ġew imkejla b'ADP440 flimkien ma' polarimetru （λ 589 nm, tul tal-passaġġ 1.0 ċm). L-ispettri NMR ġew akkwistati fuq spettrometru Bruker Advance 500 （Bruker Biospin AG, Fällanden, l-Isvizzera）, u l-qċaċet tas-solvent residwu ntużaw bħala referenzi. Il-kostanti tal-akkoppjar u ċ-ċaqliq kimiċi ngħataw f'Hz u fuq skala δ (ppm), rispettivament. Id-dejta ESIMS u HIRESIMS ġiet irreġistrata fuq spettrometru tal-massa BRUKER HCT u spettrometru LCMS-IT-TOF (Shimadzu, Kyoto, Ġappun), rispettivament. GC sar fuq sistema Agilent 7890ON(Agilent Technologies, Inc. Chandler, AZ, USA) b'kolonna 0.32 mm id × 25 mL-Chirasil-Val. HPLC Analitiku tħaddem fuq sistema Shimadzu LC-2030C HPLC(Shimadzu, Kyoto, Japan) bl-użu ta' kolonna Agilent Eclipse XDB-C18(5 um) ta' 4.6id×250 mm. HPLC semi-preparattiv sar fuq sistema Shimadzu LC-20AT HPLC bl-użu ta 'kolonna ta' 20.0id × 250 mm Dr. Maisch reprosil 100 C18 (5 um) b'rata ta 'fluss ta' 4 mL/min. Il-kromatografija tal-kolonna(CC)twettqet bl-użu ta' Sephadex LH-20 （25-100 μm; GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, l-Isvezja）, kolonna tal-ġel tas-silika (200-300 malji, Qingdao Marine Chemical Co. Ltd., Qingdao, iċ-Ċina), MCI gel CHP 20P(75-150 um; Mitsubishi Chemical Co, Tokyo, Ġappun), u Chromatorex ODS (50 um, Merck, Darmstadt, il-Ġermanja) kolonni.

3.3. Estrazzjoni u Separazzjoni

Għeruq imnixxfa bl-arja, trab (10 kg) ta 'M. normale ġew estratti bi 8{{20}} fil-mija aċetun akweju (3 × 7 ijiem) f'temperatura tal-kamra u kull estratt iffiltrat. Il-filtrati ġew imnixxfa taħt pressjoni mnaqqsa biex jagħtu estratt mhux raffinat (0.6 kg). L-estratt ġie sospiż f'H2O (1 L) u suċċessivament maqsum b'etere tal-petroleum (3×2L), EtOAc (3×2 L). L-EtOAcextract (8{{40}}g)kien maqsum f'għaxar frazzjonijiet( Fr.1-10)bil-ġel tas-silika CC (8 id×2{0 ċm)eluting bi gradjent ta' CH2Cl-MeOH(100:0,95:5,90:10,80:20, 70 :30,50:50,0:100,v/v). Fr.4 (32 g) kien mgħobbi fuq kolonna tal-ġel MCI (6i.d.×20 cm) u eluwit bi gradjent ta 'MeOH-H,O（0∶100-100∶0,v/ø）sa taffordja tmintax-il subfrazzjoni（Fr4-1-4-18）.Separazzjoni tas-subfrazzjoni Fr4-14(3.0g)saret b'kolonna oħra tal-ġel tas-silika (3i.d.×20 ċm) elużjoni bi gradjent ta' CH2Cl{{48 }}MeOH (97:3-80:20, o/v) u Sephadex LH-20 CCeluting b'CH2Cl{2-MeOH(1:1,v/o)biex jaffordja 7(11.3 mg ),8(10.6 mg),9(9.3 mg),10 (20.6 mg),11 (7.6 mg), u 12 (6.2 mg). Fr 6 (4.2 g) ġie applikat għall-kolonna ODS C18 u eluwit b'MeOH-H2O (20:80-80:20) biex jinkisbu 9 subfrazzjonijiet (Fr 6-1-6-9). Separazzjoni ulterjuri tas-subfrazzjoni Fr 6-4(1.2 g) bl-użu ta' Sephadex LH-20 CC (eluż b'MeOH-H2O,10:90-100:0) tat komposti 1(9.6 mg),5( 7.2 mg), u 6 (7.3 mg), rispettivament. Il-komposti 2(tR 130.5 min,5.2mg),3(tR 146.8min,9.6mg),u 4(tR 177.2min,15.3mg)inkisbu minn Fr7(2.5g) permezz ta' HPL semipreparattiv li tilfu bi gradjent ta' MeOH-H2O( 20:80-40:60, / u, 0-250 min).

3.4.Dejta Spettroskopika

Tannin tal-whisky C (1):Trab amorfu kannella; [ ]-12.6 grad (c= 0.16, MeOH);UV （MeOH）λmaxnm （log e）∶203（2.02）,276（1.19）; CD （MeOH）λmax（△e）263（-7.8）,240（10.9）,225(2.9).1Hand 13C NMR data, ara Tabella 1;HRESIMSm/z:[MH]{{24} }.1240(kalkut għal C4sH33O27-, 1005.1215). 1-O-(4-methoxygalloyl)-6-O-galloyl-2,{3-O-(S)-hexahydroxydiphenoyl- -D-glukosju( 2): Trab amorfu kannella trab amorfu; 【 】5-5.5 grad （c=0.17, MeOH）; UV（MeOH） 入max nm (log e）∶203 （2.52）,275（2.01）; CD （MeOH）λmax（△8）264（-8.0）,238（30.6）,218（1.3）.'H u 13C-NMR data, ara Tabella 2; HRESIMS m/z:799.0983[MH]-(kalkulat għal C3sH2O22-, 799.099).

{{0}}O-galloyl-6-O-(3-methoxygalloyl)-2,3-O-(S)-hexahydroxydiphenoul-6- D-glukożju (3); Trab amorfu kannella;【 】7-33.5 grad （c=0.12, MeOH）; UV（MeOH）入max nm (log e）∶203 （2.40）,273（1.68）; CD （MeOH）λmax（△e）262（-3.1）,237（11.1）,210（-2.7）.'Hand13CNMR data, ara Tabella 2;HRESIMS m/z:0699 [MH]-(kalkut għal C35H2O22-,799.0999). 1-O-galloyl-6-O-vanilloyl-2,3-O-(S)-hexahydroxydiphenoyl- -D-glucose (4): Trab amorfu kannella; 【 】7-20.6 grad （c=0.15, MeOH）; UV（MeOH）λmax nm （log e）∶203 （2.42）,278（1.86）; CD（MeOH）λmax（△e）263（-12.1）,239 （42.5）, 219（0.9）.'H u 13CNMR data, ara Tabella 2;HRESIMS m/z: 783 [MH]-032. (kalkolat għal C35H27O21-,783.1050).

3.5. Idroliżi Aċidu ta' 2-4

Kompost 2 (2 mg) ġie ttrattat b'1 M HCl (5 mL) fi 8 0 grad għal 4 sigħat, u mbagħad estratt b'ethylacetate (3 × 5 mL). Il-fażi milwiema ġiet imnixxfa taħt fluss ta 'N2 biex tiġġenera residwu newtrali li ġie analizzat bl-użu ta' TLC(SiO2) b'EtOAc-pyridine-EtOH-H, O (7:1:1:2) bħala sistema ta 'solvent. Il-valur R tar-residwu newtrali kien l-istess bħal dak ta 'D-glucose awtentiku li jindika li l-komponent taz-zokkor ta' 2 kien glukosju. Ir-residwu newtrali u 5 mg L-cysteine ​​methyl ester hydrochloride ġew maħlul suċċessivament fi 3 mL ta 'piridina anidruża u msaħħna fi 80 grad għal siegħa. Wara t-tneħħija tas-solvent permezz ta 'evaporazzjoni taħt pressjoni mnaqqsa, it-taħlita ta' reazzjoni sussegwentement ġiet irreaġita b'0.6 mL ta 'N-trimethylsilylimidazole fi 80 grad għal siegħa. It-taħlita ta 'reazzjoni kienet maqsuma b'n-hexane u H, O, u mbagħad is-saff ta' n-hexane ġie analizzat bi strument GC. It-temperaturi tal-injettur u tad-ditekter ġew stabbiliti għal 250 grad u 280 grad, rispettivament. It-temperatura tal-kolonna inizjali nżammet f'160 grad għal 1 min, imbagħad żdiedet għal 280C f'5 gradi / min, u miżmuma għal 10 min. Id-D-glucose awtentiku u l-L-glucose awtentiku ġew sililati u analizzati bl-istess mod, u l-ħinijiet ta 'żamma tagħhom kienu 19.09 u 19.25 min, rispettivament. Ir-riżultati tal-analiżi GC indikaw li l-komponent taz-zokkor ta '2 kien D-glukożju (t 19.1 min). Il-komponenti taz-zokkor ta' 3 u 4 ġew determinati bl-użu tal-istess proċedura.

3.6. Attività Kontra l-Infjammazzjoni

3.6.1.NO Produzzjoni minn LPS-Stimulated RAW 264.7 Cells

Iċ-ċelluli RAW 264.7 ġew ikkultivati ​​f'DMEM supplimentat b'10 fil-mija FBS fi 37 grad f'atmosfera umidifikata ta '5 fil-mija CO2 għal 24 siegħa. Ċelloli fi pjanċa ta' 24-bir (5×104 ċelluli/bir) ġew ittrattati b'200 ng/mL LPS u l-komposti tat-test. Wara 22 siegħa, il-midja nġabret, u l-livell ta 'nitrit tkejjel bl-użu tas-Sistema ta' Reaġent Griess (Promega, Madison, WI, USA).

3.6.2. Vijabilità taċ-Ċelloli

Assaġġ MTT sar biex titkejjel iċ-ċitotossiċità tal-kampjuni tat-test fuq il-linja taċ-ċelluli RAW264.7. Iċ-ċelluli li kienu fil-fażi tat-tkabbir logaritmiku ġew miżrugħa fi 96-platt bir-bir fid-densità ta’ 5× 10 flimkien ma’ -6×10* ċelluli/bir u inkubati f’37 grad b’5 fil-mija CO, għal 24 h. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'100 μL ta 'medja tal-kultura f'diversi konċentrazzjonijiet ta' kampjuni tat-test għal 24 siegħa. Il-medju ġie mormi u 100 uL ta 'medja ħielsa FBS li fih MTT (1 mg/mL) ġew miżjuda ma' kull bir. Wara l-inkubazzjoni fl-inkubatur għal 4 sigħat, is-supernatant ġie mormi u 100 μL ta 'DMSO ġew miżjuda ma' kull bir biex jinħall il-formazan. L-assorbiment tkejjel f'570 nm bl-użu ta 'microplate reader.

3.7. Anti-Ty/rosinase Attività

L-attivitajiet anti-tyrosinase tal-iżolati ġew investigati skond il-proċedura deskritta minn Aoki et al. b'modifiki ħfief [21]. L-DOPA u l-aċidu kojic intużaw bħala sottostrat u kontroll pożittiv, rispettivament. Soluzzjoni ta 'L-DOPA f'5.0 mM, tyrosinase tal-faqqiegħ f'100 U/mL, kif ukoll kampjuni f'konċentrazzjonijiet differenti ġew ippreparati f'buffer tal-fosfat (pH6.8) .20 μL tas-soluzzjoni tal-kampjun u 10 μL ta 'soluzzjoni ta' tyrosinase tal-faqqiegħ tħalltu u ġew inkubati minn qabel f'37 grad għal 10 min, imbagħad ġew miżjuda 40 uL ta 'soluzzjoni L-DOPA u inkubati f'37 grad għal 5 min. Is-sistema ta 'reazzjoni ta' l-esperiment ta 'attività anti-tyrosinase hija murija fit-Tabella 4. L-assorbiment tkejjel f'475 nm bl-użu tal-qarrej tal-mikroplate multimode Spark 10M (Tecan Trading AG, Zurich, l-Isvizzera). L-assaġġi kollha ġew ripetuti tliet darbiet u kull darba fi tliet kopji. Il-perċentwali ta' inibizzjoni tal-attività tyrosinase ġiet ikkalkulata bl-użu tal-formula li ġejja:

fejn T tirrappreżenta l-assorbiment mal-kampjun u tyrosinase; To jirrappreżenta l-assorbanza b'kampjun iżda l-ebda tyrosinase; C jirrappreżenta l-assorbenza b'tyrosinase iżda l-ebda kampjun; Co jirrappreżenta l-assorbiment mingħajr tyrosinase u kampjun.

4. Konklużjonijiet

L-istudju huwa maħsub biex jesplora aktar attivitajiet anti-infjammatorji u inibitorji ta 'enżimi ta' polifenoli mill-għeruq ta 'M.normale fuq il-bażi tax-xogħlijiet preċedenti tagħna [20]. Kif mistenni, tnax-il polifenol inkisbu mill-impjant tal-madum għall-ewwel darba u l-kompost 1-4 kien ellagitannin ġdid. L-iżolament b'suċċess u l-identifikazzjoni tal-istruttura tal-ellagitannin jipprovdu materjali għall-iskrinjar ta 'mediċini anti-infjammatorji u inibituri tal-enżimi u jikkontribwixxu wkoll għall-iżvilupp u l-utilizzazzjoni ta' M.normale. Ellagitannins 1-4 m'għandhom l-ebda attivitajiet inibitorji sinifikanti tat-tyrosinase u attivitajiet anti-infjammatorji, li jagħmilha inqas probabbli li tkun mediċina anti-infjammatorja potenzjali jew inibitur tal-enżimi. Fortunatament, għandhom effetti ġodda, bħal kontra l-obeżità [6,7]. Flavonoids għandhom attivitajiet aħjar ta 'enżimi anti-infjammatorji u inibitorji minn ellagitannins fl-għeruq ta' M. normale, u huma aktar probabbli li jkunu inibituri anti-infjammatorji u anti-enżimi. L-istudju tar-relazzjoni struttura-attività huwa ta 'għajnuna biex jinstabu mediċini anti-infjammatorji ġodda u inibituri ta' l-enżimi.

Dan l-artikolu huwa estratt minn Molecules 2021, 26, 3913. https://doi.org/10.3390/molecules26133913 https://www.mdpi.com/journal/molecules