Astratt
Sfond L-AKI hija konsegwenzi komuni ta' infezzjoni bis-SARS-CoV-2 u tikkontribwixxi għas-severità u l-mortalità ta' COVID-19. Hawnhekk, ittestjajna l-ipoteżi lialterazzjonijiet tal-kliewiindott minn AKI assoċjati mal-COVID-19 jistgħu jiġu skoperti fiċ-ċelloli miġbura mill-awrina. Metodi Aħna wettaqna sekwenzar ta' RNA b'ċellula waħda (scRNAseq) fuq ċelloli rkuprati mill-awrina ta' tmien pazjenti rikoverati fl-isptar b'COVID-19 b'(n55) jew mingħajr AKI (n53) kif ukoll erba' pazjenti b'AKI mhux COVID-19 (n54) biex tevalwa d-differenzi fil-kompożizzjoni ċellulari u l-espressjoni tal-ġeni waqt AKI. Analiżi tar-riżultati ta’ 30,076 ċellula wriet firxa diversa ta’ tipi ta’ ċelluli, li ħafna minnhom kienukliewi, ċelluli uroteljali u immuni. Analiżi tal-mogħdija ta 'ċelluli tubulari minn pazjenti b'AKI wriet arrikkiment ta' traskrizzjonijiet assoċjati ma 'mogħdijiet relatati mal-ħsara meta mqabbla ma' dawk mingħajr AKI. L-espressjoni ACE2 u TMPRSS2 kienet l-ogħla fiċ-ċelloli uroteljali fost it-tipi ta 'ċelluli rkuprati. Notevolment, f'pazjent wieħed, skoprejna RNA virali tas-SARS-CoV-2 fiċ-ċelloli uroteljali. Dawn l-istess ċelluli ġew arrikkit għal traskrizzjonijiet assoċjati ma 'mogħdijiet antivirali u anti-infjammatorji. Konklużjonijiet Aħna wettaqna b'suċċess scRNAseq fuq sediment urinarju minn pazjenti rikoverati l-isptar b'COVID-19 biex nistudjaw b'mod mhux invażiv alterazzjonijiet ċellulari assoċjati ma 'AKI u stabbilixxa sett ta' dejta li jinkludi kemm ċelluli tal-kliewi midruba kif ukoll mhux imweġġa. Barra minn hekk, aħna nipprovdu evidenza preliminari ta' infezzjoni diretta taċ-ċelloli tal-bużżieqa tal-awrina minn SARS-CoV-2. Is-sediment urinarju fih ħafna informazzjoni u huwa riżors utli għall-istudju tal-patofiżjoloġija u l-alterazzjonijiet ċellulari li jseħħu fimard tal-kliewi.
IKEL ORGANIKU TAS-SAĦĦA GĦAS-SAĦĦA TAL-KLIEI
Introduzzjoni
L-infezzjoni tal-koronavirus 2 tas-sindromu respiratorju akut sever (SARS-CoV-2) tikkawża patoloġija f'diversi sistemi, inklużi l-kliewi, u l-AKI hija assoċjata ma' morbożità u mortalità sinifikanti fil-marda tal-koronavirus 2019 (COVID-19) (1 –5). Studji multipli wrew rati għoljin ta' AKI fost pazjenti rikoverati fl-isptar b'COVID-19 (6), b'xi wħud jirrappurtaw sa 50% ta' individwi infettati li qed jiżviluppaw AKI (7–9). Ir-riċettur primarju tas-SARS-CoV-2 ACE2 huwa espress fuq ċelluli epiteljali fis-sistema urinarja kollha, inklużi ċelloli tat-tubuli prossimali u ċelloli uroteljali (10–13), għalkemm mhuwiex ċar jekk AKI f'pazjenti b'COVID-19 hija dovuta għal infezzjoni virali diretta tat-tubuli prossimali jew hija riżultat tar-rispons sistemiku għal SARS-CoV-2 (14–22). Bl-istess mod, mhuwiex ċar jekk SARS-CoV-2 jistax jikkawża ċistite virali permezz ta 'infezzjoni diretta ta' ċelluli uroteljali, għalkemm din il-possibbiltà ġiet proposta (23-26). Minkejja l-prevalenza għolja ta 'AKI assoċjata ma' COVID-19, l-alterazzjonijiet ċellulari sottostanti li jseħħu fl-ambjent ta 'AKI għadhom mifhuma ħażin.
L-AKI assoċjata mal-COVID-19 baqgħet fil-biċċa l-kbira mhux studjata peress li l-aċċess għat-tessut tal-kliewi jeħtieġ bijopsija jew analiżi postmortem (27). Studji riċenti sabu firxa diversa ta 'ċelluli tal-kliewi, tal-bużżieqa tal-awrina u tal-immunità fl-awrina (28-30). Għalhekk, l-awrina tista 'toffri ħarsa siewja dwar l-istudju mhux invażiv tal-bidliet fil-kliewi waqt AKI assoċjata mal-COVID-19. Hawnhekk, għamilna sekwenzar ta 'RNA b'ċellula waħda (RNA-Seq) biex nikkaratterizzaw id-diversità ċellulari fl-awrina ta' pazjenti rikoverati l-isptar b'COVID-19 bi u mingħajr AKI. Aħna ttestjajna l-ipoteżi li alterazzjonijiet fil-kliewi fl-AKI assoċjati mal-COVID-19 jistgħu jiġu skoperti fiċ-ċelloli miġbura mill-awrina. Ġbarna wkoll kampjuni minn pazjenti mingħajr COVID-19 u b'AKI (AKI mhux COVID-19). Sibna diversi popolazzjonijiet ta' ċelluli immuni infjammatorji u mogħdijiet attivati b'mod differenzjat f'AKI assoċjata ma' COVID-19 kif ukoll evidenza preliminarigħal infezzjoni diretta ta' ċelluli uroteljali minn SARS-CoV-2.
Materjali u Metodi
Parteċipanti u Varjabbli Adulti ta' 18-il sena 'l fuq ġew skrinjati waqt id-dħul jew it-trasferiment fl-isptar tal-Università ta' Alabama f'Birmingham (UAB) bejn Marzu u Mejju 2021. Każijiet ta' AKI ġew identifikati bl-użu tal-Mard tal-KliewiTitjib tad-definizzjoni tar-Riżultati Globali bħala żieda fil-krejatinina fis-serum (sCr) .0.3 mg/dl fi żmien 48 siegħa jew .1.53 fil-linja bażi tal-krejatinina. Kontrolli bl-ebda bidla fil-krejatinina ġew magħżula abbażi tat-tqabbil tal-età u s-sess fejn possibbli u pproċessati ma' kull kampjun AKI rispettiv. L-sCr tal-linja bażi ġiet iddeterminata bl-użu tal-valur sCr l-aktar reċenti 7-365 jum qabel l-isptar. Dejta klinika addizzjonali dwar id-demografija, l-istorja medika, il-karatteristiċi kliniċi, u l-valuri tal-laboratorju ġiet estratta mill-mapep tal-pazjenti permezz tat-tim i2b2 taċ-Ċentru UAB għax-Xjenzi Kliniċi u Translazzjonali. Tmien pazjenti rikoverati l-isptar b'COVID-19, ħamsa b'AKI u tlieta mingħajr AKI, ġew inklużi. Dan l-istudju u l-ġbir tal-kampjuni ġew approvati mill-Bord ta 'Reviżjoni Istituzzjonali tal-UAB. L-UAB Acute Nephrology Consult Team ġabar ukoll kampjuni minn pazjenti b'AKI mhux COVID-19 (n54) biex iqabbel il-bidliet ċellulari ma 'AKI assoċjati mal-COVID-19. Dawn inġabru taħt protokoll ta' bord ta' reviżjoni istituzzjonali differenti li jippermetti l-ġbir ta' kampjuni ta' awrina fdal u għalhekk, huwa anonimu.
Ġbir u Ipproċessar tal-Kampjuni
Il-passi kollha saru fuq is-silġ. L-awrina nġabret jew bħala kampjun imneħħi jew minn kateter tal-awrina. Il-kampjuni ġew trasferiti immedjatament għal laboratorju ta' livell ta' bijosigurtà 21 għall-ipproċessar. Kampjuni ta 'l-awrina ġew trasferiti għal tubu koniku 50-ml u ċentrifugati f'10003g għal 10 minuti f'4 C. Il-gerbub taċ-ċelluli ġew maħsula b'PBS kiesaħ bis-silġ, iffiltrati minn filtru 40- mm, u ċentrifugati mill-ġdid. Iċ-ċelloli ħajjin ġew ippurifikati bl-użu tal-Kit tat-Tneħħija tad-Debris MACS (Miltenyi Biotec) segwit mill-Kit tat-Tneħħija taċ-Ċelluli Mejta EasySep Annexin V (StemCell). Fil-qosor, iċ-ċelloli ġew sospiżi mill-ġdid f'PBS kiesaħ bis-silġ u mħallta ma 'soluzzjoni għat-tneħħija tad-debris. PBS kiesaħ ġie miksi fuq it-taħlita u ċentrifugat fi 3003g għal 10 minuti f'4 C. Iż-żewġ fażijiet ta 'fuq ġew aspirati, u mbagħad, iċ-ċelloli li kien fadal ġew maħsula bil-PBS. Iċ-ċelloli ġew sospiżi mill-ġdid u mħallta ma 'Dead Cell Removal Cocktail, Biotin Selection Cocktail, u mbagħad, RapidSpheres qabel is-separazzjoni f'kalamita EasySep. Iċ-ċelloli ġew maħsula u sospiżi mill-ġdid fi 52 ml ta' PBS (l-ebda kalċju jew manjesju) 10.04% BSA (Fisher Scientific) għall-ipproċessar ta' scRNAseq
scRNAseq
Ċelloli purifikati ġew trasferiti għall-UAB Flow Cytometry u Single Cell Core u immedjatament ipproċessati bl-użu tal-Chromium 39 Single-Cell RNA Sequencing Kit (103Genomics) skond il-manifattur'istruzzjonijiet s.Is-sospensjoni taċ-ċelluli kienet magħduda, flimkien mal-103 Taħlita ta 'reaġent tal-kromju, u mgħobbija f'mikrofluidicapparat ta 'qsim ta' ċellula waħda li fih liżi u reversetraskrizzjoni jseħħu f'microdroplets. Is-cDNA li jirriżultakien amplified mill-PCR u sussegwentement ipproċessat biex jagħti
libreriji ta' sekwenzar bil-bar-code. Is-sekwenzjar ta 'paired-end sar fuq il-pjattaforma ta' sekwenzar Illumina NovaSeq6000 jew NextSeq500 (Illumina). Qari ġew ipproċessatibl-użu tal-103 Ġenomika Cell Ranger Softwer b'Ċellula UnikaSuite verżjoni 6.0 fuq l-UAB Cheaha High-PerformanceCluster tal-Kompjuter. BCLfiles ġew konvertiti għal FASTQfiles li jużaw il-funzjoni veloċi CellRanger. CellRangerfast intuża biex jallinja FASTQfiles għal ġenoma tad-dwanali jikkonsisti mill-ġenoma uman hg38 (GRCh38.p13) bil
il-ġenoma tas-SARS-CoV-2 (NC_045512.2) imdaħħal bħala exon (31). It-tabella tal-ġeni, it-tabella tal-barcode, u l-matriċi tal-espressjoni tat-traskrizzjoni nħolqu għall-analiżiindikat hawn taħt.
Analiżi tad-Data
L-analiżi twettqu bl-użu ta 'pakketti maħluqa għall-ambjent ta' analiżi statistika R (verżjoni 4.06). Id-dejta ġiet analizzata primarjament fil-verżjoni Seurat 3.2.3 (32,33) u tagħhadipendenzi assoċjati. Dejta minn kull pazjentġew importati bl-użu tal- Read103 funzjoni u mbagħad structrasformat f'oġġett Seurat billi tuża CreateSeuratObject. Għalkontroll tal-kwalità, ċelluli b'fattur uniku jgħodd aktar minn 2500jew taħt 200 u ċelluli bi proporzjonijiet mitokondrijali ta.15% kienufiltered. Id-dejta ġiet normalizzata bl-użu ta' LogNormalizza u skalat biex tipprepara għal dimensjonali linearitnaqqis. Oġġetti minn pazjenti individwali ġew ittikkettatimal-grupp uniku identifikatjoni u mbagħad magħquda fi aoġġett wieħed bl-użu tal-funzjoni Seurat merge. Pazjent samples ġew integrati mal-funzjoni RunHarmony bl-użuil-pakkett Harmony R (34). Analiżi tal-komponenti prinċipalitwettqet, u mbagħad, iċ-ċelloli ġew miġbura bbażati fuqespressjoni tal-ġeni differenzjali kif determinata mis-SeuratFunzjoni FindAllMarkers stabbilita għal riżoluzzjoni ta 'wieħed. Dimenit-tnaqqis sozzjonali sar bl-użu ta' manifold uniformiapprossimazzjoni u projezzjoni. It-tipi taċ-ċelluli kienu identifiedbilli tqabbel it-traskrizzjonijiet espressi b'mod differenzjat għalkull cluster bi traskrizzjonijiet magħrufa assoċjati ma 'specific tipi ta' ċelluli (29,35,36). Il-pakkett Escape R intuża biex jaħdemAnaliżi ta' Arrikkiment tas-Sett tal-Ġene (GSEA) (37). WebGestaltRintuża għall-analiżi tal-ontoloġija tal-ġeni biex jiġu identifikati mogħdijietbl-użu tal-Proċess Bijoloġiku u l-Enċiklopedija ta’ Kyoto ta’Ġeni u databases tal-Ġenomi (38).
