Stabbilizzazzjoni Simultanja taċ-Ċitoskeletru ta' Actin f'Ċelluli Multipli speċifiċi għal Nephron Tħares Il-Kliewi Minn Korriment Diversi Ⅱ

L-istabbilizzazzjoni farmakoloġika tal-actin kortikali permezz tad-dinamina ttejjeb l-AKI.

It-telf tal-bord tal-pinzell tat-tubuli renali minħabba ż-żarmar tal-kortiċi tal-actomijosin huwa karatteristika predominanti tal-AKI2,29. Droga kontra l-kanċer użata ħafna li spiss twassal għal AKI hija cisplatin30. Konsegwenza ċentrali tal-ħsara taċ-ċisplatin fiċ-ċelloli tal-kliewi hija żieda fil-livell ta’ speċi reattivi ta’ ossiġnu (ROS)31. Barra minn hekk, livelli miżjuda ta 'ROS iwasslu għal tnaqqis fid-dinamika ta' l-actin32, li tikkawża tfixkil tal-membrana mitokondrijali; dan aktarjaggrava ROSproduzzjoni33,34. Għalhekk, eżaminajna jekk l-istimulazzjoni farmakoloġika tad-dinamina's cross-linking kapaċità hija sufficient biex jikkontrobattu korriment ikkawżat minn cisplatin.

Kif deher qabel 35, cisplatin naqqas l-għoli taċ-ċelluli MDCK, in-numru tal-mikrovilli u t-tul, u affettwa l-polarità taċ-ċelluli mingħajr ma affettwa l-endoċitożi (Tabella 1, Fig. 7a-d Supplimentari). L-analiżi TEM ssuġġeriet li dawn il-fenotipi jistgħu jiġu attribwiti għal telf ta 'F-actin ikkawżat minn cisplatin (Fig. 4a). Iż-żieda ta 'Bis-T - 23 qabel cisplatin abrogat l-effetti tagħha billi stabbilizza l-kortiċi actomyosin kontra korriment indott minn cisplatin (Fig. 4a-c). Fenotipi simili kienu osservati fil-ħnieżertubuli prossimali tal-kliewi(LLC-PK1) ċelluli (Fig. 8 Supplimentari). Flimkien, din id-dejta tipprovdi evidenza li Bis-T-23 jippreserva l-kortiċi tal-actomyosin minn żarmar indott minn cisplatin.

F'approċċ kumplimentari fiżjoloġikament rilevanti36, Bis T-23 ikkontrobatta l-abbiltà ta 'cisplatin li jnaqqas ir-reżistenza elettrika transepitelijali (TER) kif imkejla madwar il-monosaff epiteljali ħaj bl-użu ta' sistema ta 'kultura transwell (Fig. 4d). Peress li TER ikejjel l-integrità ta 'junctions stretti fil-kultura taċ-ċelluli, din id-dejta tistabbilixxi aktar l-effett ta' benefiċċju ta 'Bis-T-23 fuq l-integrità taċ-ċelluli epiteljali mal-korriment.

Agħfas HAWN BIEX JIKSBU CISTANCHE GĦAL CKD

Peress li d-dinamika tal-actin mibdula tista 'ttejjeb aktar il-produzzjoni tal-ROS, imbagħad eżaminajna jekk l-istabbilizzazzjoni tan-netwerk tal-actin minn Bis-T-23 tistax tikkontrobatti l-istress ossidattiv fiċ-ċelluli midruba b'cisplatin. Aħna għażilna li nevalwaw l-istatus ta 'carbonyls bijomolekula ċellulari, bijomarkatur stabbli ta' ħsara ossidattiva prodotta minn livelli għoljin ta 'ROS, bl-użu tas-sensor fluworexxenti tagħna żviluppat reċentement TFCH37 (Fig. 4e). Tabilħaqq, iż-żieda ta 'Bis-T -23 qabel cisplatin naqqset parzjalment żieda fil-karbonilazzjoni indotta minn cisplatin (Fig. 4f). Xejriet simili fir-rigward tal-karbonilazzjoni ġew osservati wara t-trattament b'Bis-T-23 u d-depolimerizzatur tal-actin LatA (Fig. 9a Supplimentari). Flimkien din id-dejta tipprovdi evidenza li l-istabbilizzazzjoni tan-netwerks ta 'l-actin tista' tikkontrobatti l-linja ta 'rispons bejn l-istress ossidattiv u l-istatus ta' l-actin fiċ-ċelloli midruba.

Far ex vivomudell tal-kliewiimbgħad ġie utilizzat biex jiġi viżwalizzat il-preservazzjoni mmexxija mill-BiT-23-tal-kortiċi tal-actomyosin fil-bord tal-pinzell. Cisplatin indotta telf sinifikanti ta 'tbajja' F-actin fil-bord tal-pinzell tat-tubuli prossimali (Fig. 4g). Telf simili ta 'F-actin fil-fruntiera tal-pinzell mal-bidu ta' ħsara severa iskemija-riperfużjoni kien osservat reċentement bl-użu ta 'immaġni intravirali38. Trattament minn qabel b'Bis-T-23 parzjalment protett telf ta' F-actin indott minn cisplatin fil-bord tax-xkupilji tat-tubuli tal-kliewi (Fig. 4g), li juri aktar l-effett ta' Bis-T-23 fuq actomyosin kortiċi fil-membrana apikali taċ-ċelloli epiteljali renali. Kif jidher fil-kultura taċ-ċelluli, Bis-T-23 ma affettwax l-endoċitożi fil-flieli tat-tessuti (Fig. 9b Supplimentari), li juri aktar li Bis-T-23 ma jaffettwax ir-rwol tad-dinamina fl-endoċitożi fil-kliewi tubuli prossimali.

Fl-aħħarnett, eżaminajna l-effett reno-protettiv ta 'Bis-T-23 f'mudell tal-ġurdien ta' AKI39 indott minn cisplatin. Ġrieden BL6 ġew injettati jew bis-T-23 jew DMSO darba kuljum li bdew 24 siegħa qabel l-injezzjoni ta 'cisplatin. Kif deher qabel40, il-livelli tal-kreatinina fis-serum (SCr) u tan-nitroġenu tal-awrina tad-demm (BUN) żdiedu b'mod sinifikanti 3 ijiem wara l-injezzjoni ta 'cisplatin (Fig. 4h). DMSO wera reno-protezzjoni ħafifa kif deher qabel41, minħabba l-kapaċità tiegħu ta 'keħni ta' ossidant42. L-amministrazzjoni ta 'kuljum ta' Bis-T-23 qabeż lil DMSO fir-rigward tar-reno-protezzjoni (Fig. 4h). Peress li l-annimali kollha ġew sagrifikati fil-jum 5 minħabba t-tossiċità sistemika ta 'cisplatin (Figura Supplimentari 9c), ma stajniex neżaminaw il-benefiċċji fit-tul ta' Bis-T-23 fuqfunzjoni tal-kliewi. Flimkien, dawn l-istudji juru b'mod konvinċenti li l-preservazzjoni tal-integrità taċ-ċelluli tal-kliewi permezz tal-istabbilizzazzjoni tal-kortiċi tal-actomyosin fil-membrana apikali tikkontrabatta n-nefrotossiċità indotta minn cisplatin.

L-istabilizzazzjoni tan-netwerks tal-actin tikkontrobatti l-AKI indotta minn iohexol.

Filwaqt li l-mekkaniżmu eżatt ta 'AKI indott minn żebgħa tal-kuntrast mhuwiex deċifrat għal kollox, jibqa' kawża ewlenija ta 'AKI43 akkwistat fl-isptar. Fiżjoloġikament, iż-żebgħa tal-kuntrast iżid it-tagħbija osmotika, inaqqas il-fluss tad-demm renali, u jinduċi kostrizzjoni arterjali renali44. Fil-livell ċellulari, ROS huwa attur kritiku b'kuntrast ma 'AKI45 indott miż-żebgħa. Minħabba r-rwol ta 'ROS fir-regolamentazzjoni taċ-ċitoskeletru ta' l-actin u l-ipoteżi tagħna li l-istabbilizzazzjoni tal-kortiċi ta 'actomyosin tista' tikkontrobatti l-ħsara ossidattiva, eżaminajna l-effetti ta 'Bis-T-23 fuq AKI46 indott minn żebgħa ta' kuntrast, iohexol.

L-effetti ċellulari ta 'iohexol ġew eżaminati fil-bniedemtubulari prossimali tal-kliewi(HK-2) ċelluli. Kif deher għal cisplatin, iohexol ikkawża telf ta 'F-actin, li kien akkumpanjat minn żieda sinifikanti fil-livell ta' molekuli karbonilati, konsegwenza irriversibbli ta 'livelli elevati ta' ROS (Fig. 5a, b). Iż-żewġ fenotipi ġew parzjalment ikkontrobattuti minn trattament minn qabel b'Bis-T-23, li stabbilixxiet aktar is-sinerġija bejn l-istatus taċ-ċitoskeletru tal-actin u l-livell ta 'stress ossidattiv f'dawn iċ-ċelloli. Kumplimentari għall-analiżi bbażati fuq iċ-ċelluli, l-amministrazzjoni ta 'kuljum ta' Bis T-23 ippreservat il-funzjoni renali bbażata fuq il-livelli Scr u BUN fil-ġrieden BL6 sfidati b'żebgħa ta 'kuntrast (Fig. 5c). Ġie osservat ukoll rispons tant mixtieq ta 'rata ta' sopravivenza mtejba fl-annimali li rċevew Bis-T-23 flimkien maż-żebgħa tal-kuntrast (Fig. 5d).

Riċentement urejna li livelli elevati tas-serum ta 'riċettur tal-attivatur tal-plażminoġen tat-tip urokinase solubbli (suPAR) jissensibilizzaw il-kliewi għal AKI47 indott minn iohexol. Imbagħad investigajna jekk il-protezzjoni taċ-ċelluli tubulari medjata mid-dinamina tistax ukoll tagħmel reno-protezzjoni fil-ġrieden BL6 li jesprimu livelli għoljin ta 'suPAR minn tessut tax-xaħam (suPAR-Tg)48. Kif mistenni47, il-ġrieden suPAR-Tg urew tnaqqis fil-funzjoni tal-kliewi 24-48 siegħa wara l-injezzjoni ta 'iohexol (Fig. 5e). B'kuntrast, l-annimali li rċevew doża ta' kuljum ta' Bis-T-23 esibixxufunzjoni tal-kliewi ferm aħjarminkejja l-isfida taż-żebgħa tal-kuntrast (Fig. 5e). Notevolment, kien osservat tnaqqis sinifikanti fir-rata tal-mortalità fil-koorti tal-ġrieden li rċevew Bis-T -23 (Fig. 5f). Kif antiċipat, il-firxa tal-ħsara ossidattiva (karbonilazzjoni tal-bijomolekula) fiċ-ċelluli HK-2 ittrattati b'mod konkomitanti b'Bis-T-23 kien ferm aktar baxx milli f'ċelloli li rċevew biss kombinazzjoni ta 'suPAR u Iohexol (Fig. 9d).

Fig. 4 L-agonist tad-dynamin jipproteġi t-tubuli tal-kliewi minn korriment ikkawżat minn cisplatin billi jistabbilizza l-kortiċi tal-actomyosin fil-membrana apikali. immaġni PR-EM ta' lamellipodium f'ċelloli MDCK ittrattati b'DMSO (0.1%) jew Bis-T-23 (5 µM, 0.1% DMSO) għal siegħa qabel għaż-żieda ta' cisplatin (35 µM) għal 23 siegħa. Il-kortiċi tal-actomyosin kien ikkulurit isfar. b Immaġini ta' ingrandiment ogħla ta' reġjuni f'kaxxa f'(a). Livelli distinti ta 'ħxuna huma kkodifikati bil-kulur. Il-pannelli ta 'fuq u t'isfel juru netwerks iffurmati minn filamenti iqsar u filamenti itwal, rispettivament. c Grafika li turi d-densità tal-filamenti ta’ l-aktina fix-xifer ta’ quddiem (kaxxa safra f’(a); 18–20 żoni magħduda). d Grafika tal-bar li turi reżistenza elettrika transepiteljali relattiva (%) f'ċelloli MDCK ħajjin ittrattati kif iddikjarat f'(a) ħlief għal konċentrazzjonijiet ta' cisplatin (50 µM) u Bis-T{-23 (30 µM) (12 qari għal kull kampjun). Id-dejta hija plottjata bħala medja ± SEM (***P < 0.001, ****P < 0.0001, test t-t b'żewġ denbu mhux paired). ns, mhux sinifikanti. e Rappreżentazzjoni skematika ta 'skoperta ta' karbonilazzjoni indotta minn stress ossidattiv bl-użu ta 'assaġġ TFCH. f Stampi li juru l-livelli tal-biomolecule carbonyls determinati minn TFCH. Iċ-ċelloli ġew ittrattati kif deskritt f'(a) ħlief għall-konċentrazzjoni ta' cisplatin (5 µM). Skala bar, 20 µm. Grafika li turi l-livelli relattivi ta' fluworexxenza TFCH assoċjati mal-bijomolekuli karbonili għal kull ċellula (punti tad-dejta (n)=83-116; kull punt jirrappreżenta intensità medja ta' 4-9 ċelluli). g Farflieli tal-kliewiimtebba b'antikorp anti-actin.Flieli tal-kliewiġew inkubati f'buffer, DMSO (0.1%), jew Bis-T-23 (30 µM) għal siegħa qabel ma żżid cisplatin (200 µM) jew buffer għal 8 sigħat. Reġjuni kwadri bojod ġew imkabbra. Vireg tal-iskala, 40 µm. Grafika li turi l-intensità tal-F-actin fil-bord tal-pinzell għal kull tubuli (100-236). Għal c, f, g, id-dejta hija plottjata bħala medja ± SD (il-valuri P huma rrappurtati fil-Figura, ANOVA f'direzzjoni waħda bit-test ta' tqabbil multiplu ta' Tukey). h Scatter dot plots li juru AKI indott minn cisplatin determinat mil-livell ta' nitroġenu urea fid-demm (BUN) jew kreatinina fis-serum (SCr). L-annimali ġew injettati jew b'DMSO (1%) jew bis-T-23 (20 mg/kg) (n=12, għal kull kundizzjoni għal SCr; n=17, għal kull kundizzjoni għal BUN) darba kuljum li tibda 24 siegħa qabel l-injezzjoni ta' cisplatin (15 mg/kg). Il-kejl sar fil-ħinijiet indikati. Id-dejta hija mpinġa bħala medja ± SEM (Il-valuri P huma rrapportati fil-Figura, test t bi debub mhux imqabbad). ns, mhux sinifikanti.

B'kuntrast mal-ħsara ċellulari medjata minn ROS ikkawżata minn cisplatin u iohexol, suPAR jippromwovi l-ħsara taċ-ċelluli tubulari parzjalment billi żżid ir-rata tal-konsum tal-ossiġnu (OCR)47. Biex torbot l-effett fiżjoloġiku ta 'Bis-T-23 fil-ġrieden transġeniċi suPAR mal-effett tiegħu fuq il-metaboliżmu taċ-ċelluli, eżaminajna jekk l-istabbilizzazzjoni tan-netwerk tal-actin permezz tad-dinamin tnaqqasx l-OCR immexxi minn suPAR. L-OCR tkejjel f'ħin reali f'ċelloli HK -2 taħt kundizzjonijiet bażali u bi tweġiba għal injezzjonijiet sekwenzjali ta 'inibituri mitokondrijali bl-użu ta' analizzatur tal-fluss extraċellulari Seahorse XFe24 (Fig. 5g). Iż-żieda ta 'antikorp anti-suPAR jew bis-T-23 imtejjeb immexxi minn suPAR żidiet fir-respirazzjoni bażali mitokondrijali, produzzjoni ta' ATP, rata massima ta 'respirazzjoni, u kapaċità ta' respirazzjoni żejda (Fig. 5f). Din id-dejta turi l-effetti pożittivi ta' Bis-T-23 fuq il-metaboliżmu taċ-ċelluli mal-korriment. Flimkien, dawn l-istudji jkomplu jaffermaw il-fattibbiltà tal-protezzjoni kontra tipi multipli ta 'AKI u b'hekk tittejjeb ir-rata ta' sopravivenza f'mudelli ta 'annimali gerriema permezz tad-dinamina bħala prokura.

Stabbilizzazzjoni simultanja ta 'actin fiċelluli distinti tal-kliewiittaffi l-ħsara tan-nephron. Preċedentement urejna li l-attivazzjoni farmakoloġika tal-polimerizzazzjoni tal-aktina mmexxija mid-dinamina rrestawrat l-istruttura u l-funzjoni tal-podoċiti f'diversi mudelli murini ta 'CKD12. F'dan l-istudju, aħna wrejna l-kapaċità tad-dynamin li tippreserva l-integrità taċ-ċelluli tubulari wara korriment akut billi torbot iċ-ċitoskeletru ta 'l-actin. Flimkien, dawn l-għarfien wassluna biex naħsbu l-possibbiltà li fl-istess ħin nikkontrobattu kemm il-ħsara glomerulari kif ukoll tubulari, billi nimmiraw farmakoloġikament id-dinamina.

Biex nittestjaw din l-ipoteżi, eżaminajna jekk Bis-T-23 jistax jittardja t-telf tafunzjoni tal-kliewifil-mudell tal-ġurdien tas-sindromu ta' Alport (AS). AS hija forma li tintiretinsuffiċjenza progressiva tal-kliewiminħabba mutazzjonijiet fil-ġeni COL4A3, COL4A4, jew COL4A5 li flimkien jikkodifikaw kollaġen tat-tip IV, komponent ewlieni tal-membrana tal-kantina glomerulari (GBM)49,50. Għalkemm id-difett primarju fl-AS huwa t-tħassir tal-proċess tas-saqajn u l-proteinurja.

Biex nittestjaw din l-ipoteżi, eżaminajna jekk Bis-T-23 jistax jittardja t-telf tafunzjoni tal-kliewifil-mudell tal-ġurdien tas-sindromu ta' Alport (AS). AS hija forma li tintiretinsuffiċjenza progressiva tal-kliewiminħabba mutazzjonijiet fil-ġeni COL4A3, COL4A4, jew COL4A5 li flimkien jikkodifikaw kollaġen tat-tip IV, komponent ewlieni tal-membrana tal-kantina glomerulari (GBM)49,50. Għalkemm id-difett primarju fl-AS huwa t-tħassir tal-proċess tas-saqajn u l-proteinurja.

Diskussjoni Peress li l-identifikazzjoni ta 'interazzjonijiet diretti dynamin-actin10, korp dejjem jikber ta' evidenza qed tistabbilixxi dan GTPase bħala wieħed mir-regolaturi ewlenin taċ-ċitoskeletru actin fiċ-ċellula. B'kuntrast mal-ABPs kanoniċi, il-mekkaniżmi li bihom id-dinamina tinfluwenza l-actin huma t-tnejn, versatili ħafna u speċifiċi għat-tip taċ-ċelluli. Dan huwa dovut għall-kombinazzjoni ta 'stati multipli ta' oligomerizzazzjoni tad-dynamin u l-kapaċità tagħha li torbot F-actin minn żewġ siti ta 'rbit differenti. L-interazzjonijiet tal-F-actin maċ-ċrieki tad-dynamin u l-helizes permezz tal-PRD C-terminal tiegħu jirriżultaw f’qatet ta’ actin u iper-qatet, li ġew implikati fil-formazzjoni ta’ filopodia56 u protrużjonijiet tal-membrana waqt il-fużjoni tal-mijoblast28. L-interazzjonijiet bejn id-dominju Nofsani tad-dynamin u l-F-actin ġew implikati fir-regolazzjoni tan-netwerks ta 'l-actin f'lamellipodia26, organizzazzjoni ta' ċitoskeletru postsinaptiku, u żvilupp tal-junction newromuskolari27, riġidità tal-gozz ta 'l-actin f'endosomi waqt fużjoni tal-mijoblast25, u formazzjoni ta' proċessi tas-sieq podoċiti12. Filwaqt li l-formazzjoni tal-proċessi tas-saqajn hija mmexxija minn polimerizzazzjoni tal-actin stimulata mid-dinamina, dan l-istudju jissuġġerixxi li l-mekkaniżmu molekulari li bih id-dinamina tinfluwenza dawn il-proċessi l-oħra mmexxija mill-actin jista’ jkun parzjalment minħabba l-abbiltà tiegħu li jgħaqqad F-actin f’netwerks ramifikati. . L-istudju attwali tagħna jespandi r-rwol tal-formazzjoni tan-netwerk dipendenti mid-dinamina biex jinkludi l-formazzjoni tal-kortiċi tal-actomyosin fil-membrana apikali taċ-ċelloli epiteljali polarizzati u l-istabbiliment ta 'ebusija taċ-ċelluli.

Diskussjoni Peress li l-identifikazzjoni ta 'interazzjonijiet diretti dynamin-actin10, korp dejjem jikber ta' evidenza qed tistabbilixxi dan GTPase bħala wieħed mir-regolaturi ewlenin taċ-ċitoskeletru actin fiċ-ċellula. B'kuntrast mal-ABPs kanoniċi, il-mekkaniżmi li bihom id-dinamina tinfluwenza l-actin huma t-tnejn, versatili ħafna u speċifiċi għat-tip taċ-ċelluli. Dan huwa dovut għall-kombinazzjoni ta 'stati multipli ta' oligomerizzazzjoni tad-dynamin u l-kapaċità tagħha li torbot F-actin minn żewġ siti ta 'rbit differenti. L-interazzjonijiet tal-F-actin maċ-ċrieki tad-dynamin u l-helizes permezz tal-PRD C-terminal tiegħu jirriżultaw f’qatet ta’ actin u iper-qatet, li ġew implikati fil-formazzjoni ta’ filopodia56 u protrużjonijiet tal-membrana waqt il-fużjoni tal-mijoblast28. L-interazzjonijiet bejn id-dominju Nofsani tad-dynamin u l-F-actin ġew implikati fir-regolazzjoni tan-netwerks ta 'l-actin f'lamellipodia26, organizzazzjoni ta' ċitoskeletru postsinaptiku, u żvilupp tal-junction newromuskolari27, riġidità tal-gozz ta 'l-actin f'endosomi waqt fużjoni tal-mijoblast25, u formazzjoni ta' proċessi tas-sieq podoċiti12. Filwaqt li l-formazzjoni tal-proċessi tas-saqajn hija mmexxija minn polimerizzazzjoni tal-actin stimulata mid-dinamina, dan l-istudju jissuġġerixxi li l-mekkaniżmu molekulari li bih id-dinamina tinfluwenza dawn il-proċessi l-oħra mmexxija mill-actin jista’ jkun parzjalment minħabba l-abbiltà tiegħu li jgħaqqad F-actin f’netwerks ramifikati. . L-istudju attwali tagħna jespandi r-rwol tal-formazzjoni tan-netwerk dipendenti mid-dinamina biex jinkludi l-formazzjoni tal-kortiċi tal-actomyosin fil-membrana apikali taċ-ċelloli epiteljali polarizzati u l-istabbiliment ta 'ebusija taċ-ċelluli.

Huwa stabbilit sew liCKD u AKI, għalkemm mekkanikament distinti, huma interkonnessi mill-qrib, bl-AKI tiġi rikonoxxuta bħala fattur ta 'riskju għall-iżvilupp u l-progressjoni tas-CKD 66. Minn issa, l-AKI tibqa' ma tistax tiġi ddrogata67. Dan huwa partikolarment rilevanti fid-dawl tal-pandemija attwali tal-marda tal-koronavirus 2019 (COVID-19), fejn pazjenti rikoverati fl-isptar b'COVID-19 u livell għoli fil-plażma ta' suPAR jiżviluppaw AKI b'rati allarmanti. Livelli elevati ta’ suPAR ġew marbuta kemm ma’ AKI47 kif ukoll ma’ CKD69, u b’hekk ikomplu jsaħħu r-rabta molekulari bejn dawn iż-żewġmard distint tal-kliewi. Għalhekk, qed isir dejjem aktar essenzjali li jiġu żviluppati terapewtiċi li jistgħu jipproteġu kontra firxa ta' insulti renali fuq diversi tipi ta' ċelluli70. Hawnhekk nirrapportaw l-effett reno-protettiv ta 'agonist tad-dinamina f'mudell ġenetiku ta' AS, li juri ħsara kemm lill-podoċiti kif ukoll liċ-ċelloli tubulari. L-istudju tagħna jistabbilixxi approċċ komprensiv għall-iżvilupp ta’ terapewtiċi ġodda li jimpenjaw ruħhom man-netwerk ta’ l-actin f’diversi tipi ta’ ċelluli fi ħdan in-nephron u jittrattaw numru kbir.mard tal-kliewiirrispettivament mis-sit tal-korriment.

Metodi Kultura taċ-ċelluli. Ċelloli MDCK (Madin-Darby tal-kliewi tal-kliewi) (ATCC CCL-34) u ċelluli tal-kanal tal-ġbir medulari ta' ġewwa tal-ġurdien (mIMCD-3) (ATCC CRL-2123) tkabbru f'DMEM/F12 (ThermoFisher) Xjentifiku) li fih 10% serum bovin fetali (FBS) u 1X Antibijotiku-Antimikotiku (peniċillina, streptomycin, u Amphotericin B; Gibco). Ċelloli LLC-PK1 (Lilly Laboratories Cell-Porcine Kidney 1) (ATCC CL- 101) tkabbru f'DMEM b'4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate (Corning), 10% FBS, u 1X Antibijotiku -Antimikotiku. Iċ-ċelloli MDCK u LLC-PK1 tkabbru għal ~ 24 siegħa u ~ 72 siegħa, rispettivament, qabel ma bdew l-esperimenti. HK-2 (Kilwa tal-Bniedem 2) ċelluli tubulari prossimali (ATCC CRL-2190) ġew ikkultivati ​​f'medja DMEM/Ham's F12 (Corning) li fiha 10% FBS, 100 U/ml peniċillina, u 100 ug/ml streptomycin meta użat għal esperimenti bijoenergetiċi. Għall-analiżi tal-istatus taċ-ċitoskeletru tal-actin u l-karbonilazzjoni ċellulari, ċelluli HK-2 tkabbru f'DMEM F-12 (ATCC) li kien fihom 10% FBS, 1X Antibijotiku-Antimikotiku, u 1X ITS (insulina, transferrin, u sodium selenite) suppliment tal-midja likwida (Sigma-Aldrich). Biex tiġi stabbilita linja taċ-ċelluli knock-down tad-dinamin 2 (Dyn2) (mIMCD Dyn2KD), iċ-ċelluli ġew infettati b'lentiviruses li jġorru shRNA li jikkodifika l-ġene DNM2 (5′CGGCCTAGTGGACATGACAATGAACTCGAGTTCATTGTCATGTC CACTAGGTTTTTG3′)10 jew scrambled media (scrambled) ikkodifikat (5′CGGCCTAGTGGACATGACAATGAACTCGAGTTCATTGTCATGTC CACTAGGTTTTTG3′) µg/ml). Wara 24 siegħa, il-midja ġiet mibdula kull jum ieħor b'midja li kien fiha puromicin biex tagħżel għal transfettanti stabbli. L-estent ta' knock-down ta' Dyn2 ġie vvalutat permezz ta' western blot. Il-linji taċ-ċelluli kollha tkabbru fuq coverslips tal-ħġieġ miksija bil-kollaġen.

Fig. 6 L-attivazzjoni farmakoloġika tad-dynamin fl-istess ħin timmira lejn iċ-ċitoskeletru ta' l-actin f'żewġ ċelloli distinti tan-nephron. ġrieden Col4a3-/- ġew injettati b'DMSO (1%) jew Bis-T-23 (20 mg/kg) darba kuljum meta kellhom 42 jum (Jum 0). Intuża numru ugwali ta' ġrieden ittrattati b'DMSO jew Bis-T-23 (n=10 għal ACR; n=8 għal BUN). L-ispert dot plot juri l-livell ta’ proteinurja (proporzjon ta’ albumina għal krejatinina, ACR) ukorriment fil-kliewideterminat mil-livell ta 'BUN. Bars tal-iżbalji, medja ± SD (Il-valuri P huma rrappurtati fil-Figura, test t-t b'żewġ denbu mhux paired). b Sar test Log-Rank (Mantel-cox) biex janalizza l-kurvi tas-sopravivenza taż-żewġ gruppi ta 'trattament. c Istopatoloġija rappreżentattiva tal-kliewi ddeterminata permezz ta’ tbajja perjodika ta’ acid-Schiff (PAS) u H&E fuq kampjuni miksuba minn ġrieden Col4a3-/- deskritti f’(a). L-annimali kellhom 62 jum (jum 20 ta' trattament bis-T-23 jew DMSO). Il-glomerulopatija f'annimali kkurati b'Col4a3-/- DMSO kienet ikkaratterizzata minn espansjoni mesanjali osservata fuq it-tbajja' PAS (vleġġa sewda), żieda fiċ-ċellulità, u żieda fl-ispazju ta' Bowman. Bidliet deġenerattivi fit-tubuli inkludew il-formazzjoni ta 'casts (*) u l-preżenza ta' sklerożi tubulari. Trattament bis-T-23 fuq 20 jum ippreservat parzjalment il-morfoloġija tal-glomeruli (espansjoni mesanġjali mnaqqsa) u tubuli (assenza ta 'casts). d Skematika tan-nephron (immaġni kkreditata lill-Istitut Nazzjonali tad-Dijabete u Diġestiva uMard tal-Kliewi, Istituti Nazzjonali tas-Saħħa) u l-mekkaniżmu involut fir-reno-protezzjoni regolata mid-dinamina. F'ċelluli epiteljali polarizzati ta 'tubuli tal-kliewi, dynamin jistabbilixxi polarità taċ-ċelluli billi cross-linking filamenti actin f'netwerks (dan l-istudju). Il-kapaċità ta 'Dynamin li cross-link filamenti f'qatet hija implikata fil-formazzjoni ta' microvilli. Ħsara akuta żżid il-produzzjoni ta 'ROS, tbiddel il-metaboliżmu taċ-ċelluli, u tfixkel id-dinamika ta' l-actin, li tkompli ttejjeb il-produzzjoni ta 'ROS li twassal għal ħsara ossidattiva ċellulari aktar evidenti (karbonilazzjoni tal-bijomolekula). Żieda fil-kapaċità ta 'cross-linking tad-dynamin fil-kortiċi tal-actomyosin tippreserva l-integrità taċ-ċelluli tubulari, li tipproteġihom parzjalment minn insult ossidattiv. Barra minn hekk, id-dinamina hija essenzjali għall-istruttura u l-funzjoni tal-podoċiti. L-attivazzjoni farmakoloġika tad-dinamina tirrestawra l-proċessi tas-sieq billi tinduċi polimerizzazzjoni tal-aktina. L-istudju tagħna juri li l-attivazzjoni farmakoloġika tal-oligomerizzazzjoni tad-dinamina turi effett ta 'benefiċċju doppju fuq in-nephron billi timmira żewġ mekkaniżmi molekulari distinti: preservazzjoni tal-integrità tal-podoċiti (polimerizzazzjoni tal-actin) u ċelluli tubulari renali (cross-linking tal-filamenti tal-actin).

Referenzi

1. Basile, DP, Anderson, MD & Sutton, TA Patofiżjoloġija ta 'korriment akut tal-kliewi.Kompr. Physiol. 2, 1303–1353 (2012).

2. Bonventre, JV & Yang, L. Patofiżjoloġija ċellulari ta 'ħsara akuta fil-kliewi iskemika.J. Clin. Invest. 121, 4210–4221 (2011).

3. Campanale, JP, Sun, TY & Montell, DJ Żvilupp u dinamika tal-polarità taċ-ċelluli f'daqqa t'għajn.J. Cell Sci. 130, 1201–1207 (2017).

4. Salbreux, G., Charras, G. & Paluch, E. Mekkanika tal-kortiċi ta 'l-Actin u morfoġenesi ċellulari.Xejriet Cell Biol. 22, 536–545 (2012). 

5. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, RS & Horwitz, AR Nonmuscle myosin II jieħu l-istadju ċentrali fl-adeżjoni taċ-ċelluli u l-migrazzjoni.Nat. Dun Mol. Cell Biol. 10, 778–790 (2009). 

6. Chugh, P. et al. L-arkitettura tal-kortiċi tal-actin tirregola t-tensjoni tal-wiċċ taċ-ċellula.Nat. Cell Biol. 19, 689–697 (2017). 7. Nguyen, LT & Hirst, LS Polimorfiżmu ta 'netwerks F-actin inkroċjati ħafna: probing skali ta' tul multipli.Phys. Dun E Stat. Materja Artab Nonlin Phys. 83, 031910 (2011).

Servizz ta 'Appoġġ Ta' Wecistanche-L-akbar esportatur ta' cistanche fiċ-Ċina:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Ħanut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop