Assemblaġġ De Novo Transcriptome Ibbażat fuq RNA-Seq U Skoperta tal-Ġene Ta' Zokk Imlaħħam ta' Cistanche Deserticola-Ⅱ

Klassifikazzjoni Funzjonali tat-Traskrizzjonijiet Espressi Kollha Ibbażat Fuq Gene Ontology U Databases KEGG

L-annotazzjoni tal-Ontoloġija tal-Ġene (GO) inkisbet mill-annotazzjoni UniProt u l-fajl tal-assoċjazzjoni tal-identitajiet. B'kollox, 20,907 traskrizzjonijiet, li jammontaw għal 32.69% tas-sekwenzi totali espressi, ġew assenjati għal 1,745 termini funzjonali. Mit-termini GO funzjonali totali, assenjazzjonijiet għall-proċess bijoloġiku għamlu l-maġġoranza (1,116, 63.95%) segwiti minn komponent ċellulari (329, 18.85%) u funzjoni molekulari (300, 17.20%). Il-funzjonijiet assenjati tat-traskrizzjonijiet espressi koprew firxa wiesgħa ta 'kategoriji GO, u l-aqwa 10 termini GO bl-aktar traskrizzjonijiet annotati ġew elenkati fit-Tabella 3. Aħna nipprovdu t-traskrizzjonijiet espressi kollha distribuzzjoni fi tliet kategoriji tal-Ontoloġija tal-Ġene (Funzjoni Molekulari, komponent ċellulari, u proċess bijoloġiku) fil-fajl supplimentari (S3 Dataset). It-termini GO relatati mal-funzjonijiet li jorbtu u l-attività tat-trasferimentażi kienu rappreżentati b'mod predominanti fil-kategorija tal-funzjoni molekulari. Rigward il-funzjonijiet tal-irbit, it-twaħħil tal-katjoni (4,394 traskrizzjonijiet) irrappreżenta l-aktar abbundanti, segwit minn rbit tan-nukleotidi/nukleosidi (3,404 traskrizzjonijiet bħala medja) u t-twaħħil tal-proteini (2,422 traskrizzjonijiet). Filwaqt li fil-grupp ta 'attività ta' transferase, l-aktar huma dawk bi gruppi li fihom il-fosfru li jittrasferixxu (2,256 traskrizzjonijiet, 65.77%). Fost il-kategorija tal-komponenti ċellulari, it-traskrizzjonijiet kienu aktar lokalizzati intraċellulari (10,581 traskrizzjonijiet bħala medja), filwaqt li fost il-kategorija tal-proċess bijoloġiku, it-traskrizzjonijiet kienu aktar involuti fil-proċess metaboliku tal-bijopolimeru (6,683 traskrizzjonijiet bħala medja), segwiti minn regolamentazzjoni tal-proċess ċellulari (4,841 traskrizzjonijiet). ), espressjoni tal-ġeni (4,678 traskrizzjonijiet) u trasport (3,512 traskrizzjonijiet).

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦALL-PREVENTJONI TAL-MARDA ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Għall-ġeni tal-mini involuti fil-bijosintesi tal-lignin u l-PhG, ġew imfittxija 21,358 sekwenzi ta 'proteini potenzjali mhux żejda kontra sekwenzi tal-ġeni ta' 13-il organiżmu tal-pjanti fid-database KEGG, u ġew assenjati għal 275 mogħdija KEGG b'mill-inqas 5 hits. L-aqwa 10 mogħdijiet bl-aktar sekwenzi allinjati huma elenkati fit-Tabella 4. Il-biċċa l-kbira tal-mogħdijiet kienu involuti fi proċessi metaboliċi primarji, bħall-metaboliżmu tal-aċidu amminiku jew tal-proteini (ko01230, ko04141, u ko04120), il-metaboliżmu tal-karboidrati (ko01200 u ko00500), u nuklejodi metaboliżmu tan-nukleosidi (ko03018, ko00230, u ko00240). Barra minn hekk, hemm 27 mogħdijiet sekondarji relatati mal-metaboliżmu (Fig 2), bħal bijosintesi tas-sinsla tat-terpenojdi, bijosintesi tal-fenilpropanoid, bijosintesi tal-karotenojdi, bijosintesi tal-alkaloid isoquinoline, u bijosinteżi tal-alkalojdi ta 'tropane, piperidine u pyridine. Dawn ir-riżultati jipprovdu aktar indikazzjoni li proċessi metaboliċi attivi kienu għaddejjin fl-C. deserticolatessut taz-zokk. It-traskrizzjonijiet kollha espressi assoċjati mal-mogħdijiet KEGG ġew elenkati fil-fajl supplimentari (S4 Dataset). Għalkemm hemm xi mogħdijiet mibdula b'mod sinifikanti bejn C. deserticola u pjanti oħra, bħar-ross (S5 Dataset), l-għan ewlieni tagħna f'dan l-istudju huwa li niżvelaw il-profil kollu tat-traskriptome taz-zokk ta' C. deserticola u li nistampaw il-mogħdijiet relatati tal-bijosintesi PhGs. li jistgħu jkunu utli biex jiggwidaw il-kultivazzjoni.

Ġeni Kandidati Jikkodifikaw Enżimi Involuti Fil-Bijosintesi Tal-Lignin

Lignin huwa t-tieni polimeru terrestri naturali l-aktar abbundanti fir-renju tal-pjanti, li jikkomponi sa terz tal-materjal misjub fil-ħitan taċ-ċelluli tal-pjanti. Bħala komponent importanti tal-ħitan taċ-ċelluli, il-lignins jgħinu fit-trasport bl-ilma, jipprovdu appoġġ mekkaniku u integrità strutturali, u jiddefendu kontra patoġeni u erbivori. Dawk ir-rwoli tal-lignin huma siewja ħafna fl-appoġġ tat-tkabbir erettiv taħt l-art ta 'C. deserticola fid-deżert. F'dan l-istudju, ippreżentajna l-istampa sħiħa tal-mogħdijiet tal-bijosintesi tal-lignin f'C. deserticola (Fig 3), li fiha l-monomeri tal-lignin huma bijosintetizzati minn fenilalanina permezz ta 'serje ta' reazzjonijiet enżimatiċi, inklużi idrossilazzjoni, metilazzjoni, tnaqqis u proċess ta 'polimerizzazzjoni ossidattiva. L-enzimi relatati mal-bijosintesi tal-lignin ġew skoperti għal tliet forom prinċipalment sintetizzati fit-tessut vaskulari (p-hydroxyl-phenyl (H), guaiacyl (G) u syringyl (S) lignin) u 5-hydroxyl-guaiacyl lignin li kien identifikat biss f'pjanti COMT (caffeic acid 3-O-methyltransferase, EC 2.1.1.68) defiċjenti (bħal knock-down).

Phenylalanine ammonja-lyase (PAL, EC 4.3.1.24) hija l-ewwel enzima ewlenija fil-mogħdija tal-bijosintesi tal-lignin (Fig 3) li tittrasforma phenylalanine f'aċidu cinnamic permezz ta 'deamination mhux ossidattiva. Total ta '6,297 qari PAL ġew sekwenzati u 7 traskrizzjonijiet PAL ġew assemblati f'C. deserticola (Tabella 5). Permezz ta' paragun tas-similaritajiet tas-sekwenza, sibna li 4 minnhom (comp28550_c1_seq1/2/3/5) kellhom aktar minn 95% xebh mas-sekwenza tal-mRNA magħrufa ta' C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), filwaqt li comp28550_c1_seq4 u comp25940_c{0_seq1 kellhom 77% u 82% xebh, rispettivament. Tbassir ORF żvelat 5 traskrizzjonijiet kellhom potenzjali ta 'kodifikazzjoni ta' proteini u mwettqa b'dominju aromatic amino acid lyase (PF00221.14). Fosthom, it-traskrizzjoni comp28550_c{1_seq4 biss tista' tikkodifika sekwenza ta' proteina kompluta ta' 718-il residwi ta' aċidu amminiku. Ġie rrappurtat li PAL kien kodifikat minn familja multiġenika żgħira fil-biċċa l-kbira tal-ispeċi tal-pjanti, bħal 4 f'Arabidopsis thaliana, 5 f'Populus trichocarpa, 3 f'Scutellaria baicalensis, u 7 Cucumis sativus, eċċ. L-analiżi filoġenetika tagħna ssuġġeriet li kien hemm 4. Ġeni li jikkodifikaw PAL f'C.

deserticola u semmejnahom CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 u CdPAL4, rispettivament (S2 Fig). 4-coumarate-CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12) u trans-cinnamate 4-monooxygenase (CYP73A, EC 1.14.13.11) huma żewġ enżimi responsabbli għat-trasformazzjoni tal-aċidu cinnamic għal dicoumarol-CoA f'żewġ reverse ordnijiet. Huma wkoll fis-sinsla, u l-valuri tal-FPKM tal-espressjoni tagħhom huma 39.57 u 51.93, rispettivament.

L-erba 'tipi ta' lignins ġew bijosintetizzati minn mogħdijiet differenti li kienu kkontrollati minn tliet enzimi ewlenin, cinnamoyl-CoA reductase (CCR, EC 1.2.1.44), shikimate o-hydroxycinnamoyltransferase (HCT, EC 2.3.1.133), u ferulate{{1{{1} {56}}}}hydroxylase (F5H, EC 1.14.-.-). CCR kien irrappurtat bħala punt ta' kontroll tal-mogħdija tal-lignins [50, 51] li kkatalizza X-CoA (X inkluż dicoumarol, caffeoyl, feruloyl, 5-hydroxyl-feruloyl, u sinapoyl) f'Y-aldehyde (Y inkluż p -cougar, caffeoyl, coniferyl, 5-hydroxyl-coniferyl, u snap), filwaqt li l-HCT kkatalizza p-coumaroyl-CoA għal p-coumaroyl shikimic acid/p-coumaroyl quinic acid. Iż-żewġ enzimi, bħal swiċċ, irregolaw il-bijosintesi ta 'P-hydroxyl-phenyl lignins jew it-tliet tipi l-oħra ta' lignins. F5H kien swiċċ ieħor tal-fergħa li rregola s-syringyl lignin u 5-hydroxyl-guaiacyl lignin. Enżimi importanti oħra inklużi l-aċidu caffeic 3-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-methyltransferase (CCoAOMT, EC 2.1.1.104), u cinnamyl-alcohol dehydrogenase (CAD, EC 1.1.1.195). ) ġew skoperti wkoll espressi. Informazzjoni dettaljata dwar l-espressjoni hija elenkata fit-Tabella 6. Dawn il-ġeni tal-enżimi identifikati f'dan l-istudju se jipprovdu riżors siewi għal studji ġenomiċi funzjonali f'din l-impjant mediċinali importanti. 10 ġeni relatati mal-mogħdija tal-bijosintesi tal-lignins fit-Tabella 6 ġew magħżula għall-verifika RT-qPCR biex jikkonfermaw ir-riżultati RNAseq tagħna (Fig 4), u l-korrelazzjonijiet għolja tagħhom (koeffiċjent ta 'korrelazzjoni Pearson: 0.90343) indikaw preċiżjoni għolja u riproduċibbiltà tal-analiżi tat-traskriptome tagħna. S1 Dataset jelenka s-sekwenzi tal-primer użati f'din l-analiżi.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ġeni Kandidati Jikkodifikaw Enżimi Involuti Fil-Bijosintesi Ta PhGs

Phenylethanoid glycosides (PhGs) huma magħrufa li huma l-ingredjenti attivi primarji f'C. deserticola b'attivitajiet ta 'titjib tal-qawwa sesswali, scavenging radikali ħielsa, u anti-aging. Tliet komponenti kimiċi ta 'PhGs huma aċidu organiku, saccharide, u phenylethanol aglycon (Fig 3). L-aċidi organiċi inklużi l-aċidu caffeic, l-aċidu feruliku u l-aċidu cumaliku huma prodotti tal-mogħdija tal-bijosintesi tal-fenilpropanoid. Il-komponenti ta 'saccharide inklużi glukożju u rhamnose huma prodotti ta' mogħdijiet tal-metaboliżmu tal-karboidrati, bħal metaboliżmu tal-lamtu u sukrożju, zokkor amminiku u metaboliżmu taz-zokkor nukleotidi, metaboliżmu tal-fruttożju u mannożju, eċċ Madankollu, il-mogħdija tal-bijosintesi tal-parti tal-feniletanol għadha mhix ċara. Hawnhekk, ipproponejna żewġ mogħdijiet possibbli ta 'bijosintesi tal-feniletanol ibbażati fuq id-dejta tas-sekwenza tagħna. Wieħed huwa l-passaġġ ta 'l-aċidu caffeic jew l-aċidu ferulic irrappurtat, magħruf ukoll bħala l-mogħdija ta' l-aċidu ċinnamiku li hija simili għall-mogħdija tas-sinsla tal-bijosintesi tal-lignin. Ieħor huwa bbażat fuq il-mogħdija tal-metaboliżmu tal-phenylalanine (Fig 3), li fiha l-phenylalanine għal phenylethanol inkiseb permezz ta ''Enrlich pathway' magħrufa li nstabet għall-ewwel darba fil-ħmira seklu ilu u vvalidata fil-fjuri tal-petunja, it-tadam u l-ward. Erba 'ġeni ta' enzima li jikkodifikaw aspartate/tyrosine aminotransferase, histidine-phosphate aminotransferase, u primary-amine oxidase li huma responsabbli għall-konverżjoni ta 'phenylalanine għal phenylethanol ġew skoperti espressi fiz-zokk ta' C. deserticola. Il-prodott tal-phenyl ethanol jista' jiġi ossidizzat aktar minn monooxygenase jew methylated minn methyltransferase fid-derivati ​​tiegħu (phenyl ethanol aglycon) li jieħdu sehem fil-bijosintesi PhG. Fil-qosor, ġew proposti żewġ mogħdijiet putattivi ta’ bijosintesi ta’ phenylethanol aglycon għalC. deserticolaiżda xorta jeħtieġ aktar studju aktar.

Diskussjonijiet

F'dawn l-aħħar snin, il-ġenomika tal-pjanti żviluppat malajr bl-applikazzjoni tat-teknoloġija tas-sekwenzjar tal-ġenerazzjoni li jmiss, filwaqt li ftit riċerki ġew iffukati fuq il-ġenomika tal-pjanti mediċinali tad-deżert. Huwa meħtieġ b'mod urġenti li titwettaq riċerka ġenomika jew traskrittomika biex tifhem l-adattament tagħha għal ambjenti ta' nixfa u salinità u l-mogħdija tal-bijosintesi tal-komponenti bijoattivi ewlenin. L-iskoperta de novo tat-transcriptome għal xi pjanti mediċi,

bħal Panax ginseng, Ginkgo biloba, u Glycyrrhiza uralensis ġew sfruttati l-ewwel bl-użu tal-pjattaforma Roche 454 għat-tul twil ta 'qari tagħha. Minħabba l-abbiltà effettiva ta 'assemblaġġ b'qari qosra, speċjalment il-qari vantaġġjati paired-end, is-sekwenzjar u l-assemblaġġ tat-traskriptome bbażati fuq Illumina intużaw ukoll b'mod estensiv għal organiżmi mudell u mhux mudell. Fl-istudju preżenti, iġġenerajna madwar 8G ta 'qari paired-end ta' 101 bp u pproduċejna sekwenzi unigene itwal b'tul medju ta '725 bp. Dejta fuq skala kbira tat-traskriptome speċifika għal zokk tista 'tipprovdi dejta ta' referenza utli u tintuża għall-minjiera tal-metaboliżmu sekondarju ta 'komponenti bijoattivi ta' C. deserticola. Hemm 81.62% tat-total tal-qari mhux ipproċessat għadda filtri ta 'kwalità stretti (inkluż it-tirqim tal-adapter u r-rimi ta' qari ta 'kwalità baxxa) qabel l-assemblaġġ, li jissuġġerixxi l-kwalità għolja tad-dejta tas-sekwenzjar tagħna, u 82.08% tal-qari ta' kwalità għolja kienu utli għall-assemblaġġ. Qari oħra li naqsu milli jintużaw għall-assemblaġġ jistgħu jiġu minn żbalji ta 'sekwenzjar, parametri ta' assemblaġġ et al. Dawk il-qari ta' kwalità għolja mhux użati baqgħu ta' għajnuna fit-titjib tal-assemblaġġ de novo flimkien ma' qari itwal minn pjattaforma oħra (bħal Roche 454) fil-futur.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Għadd kbir ta 'traskrizzjonijiet immuntati (30,098) wrew xebh ta' sekwenza għolja ma 'ġeni magħrufa f'databases pubbliċi, li jissuġġerixxu li d-data paired-end tagħna bbażata fuq Illumina kopriet frazzjoni sostanzjali ta' traskrizzjonijiet ta 'C. deserticola. Traskrizzjonijiet mingħajr hits BLAST jistgħu jkunu dovuti għal reġjuni 3' jew 5' mhux tradotti, RNA mhux kodifikanti, jew sekwenzi ta' ġeni ġodda ta' C. deserticola. It-traskrizzjonijiet espressi ġew annotati għal firxa wiesgħa ta 'kategoriji GO u mogħdijiet KEGG (Tabelli 3 u 4), li fihom ħafna traskrizzjonijiet ġew assenjati għal mogħdijiet sekondarji relatati mal-metaboliżmu. Kif nafu, il-phenylpropanoid jista 'jiffunzjona bħala kompost antimikrobiku li jinduċibbli b'salut kbir għal stil ta' ħajja taħt l-art [1], u jaġixxi wkoll bħala molekula ta 'sinjal fl-interazzjonijiet tal-pjanti-mikrobi minbarra l-utilità mediċinali tiegħu [68, 69]. Terpenoid jintuża għall-bijosintesi ta' komponenti bijoattivi (bħal 6- deoxycatalpol) [70]. Sibna ġeni involuti fil-mogħdija tal-bijosintesi tas-sinsla tad-dahar tal-fenilpropanoid u terpenojdi kienu abbundanti ħafna f'C. deserticola. Aktar importanti minn hekk, l-iskoperta ta 'mogħdijiet rappreżentati tajjeb tal-bijosintesi tal-lignin (Fig 3) indikat il-proċess metaboliku attiv tal-lignin fiz-zokk ta' C. deserticola. Il-ġeni tal-enzimi magħrufa kollha involuti fil-bijosintesi tal-lignin (Fig 3) ġew skoperti espressi, u erba 'enzimi ewlenin inklużi PAL, CCR, HCT, u F5H kellhom abbundanza ta' espressjoni aktar baxxa (FPKM 26.47, 3.89, 3.4, u 3.83, rispettivament) meta mqabbla ma ' ġeni ta' enzimi oħra (Tabella 6). Jekk il-bidla fl-espressjoni ta 'dawk it-tliet ġeni tistax tinfluwenza l-produzzjoni tal-lignin f'C. deserticola huwa denju ta' aktar studju. PAL hija enzima ewlenija fil-bijosintesi tal-lignin u hija wkoll involuta fil-bijosintesi ta 'phenylpropanoid, resveratrol, flavonoid, u coumarin [71-74]. Aħna skoprejna erba' ġeni PAL distinti fil-ġenoma ta' C. deserticola (S2 Fig) li kienet koinċidenza ma' li PAL kien ikkodifikat minn familja multiġenika żgħira [39, 43, 45-49] u ppruvajna aktar li jista' jkollu rwoli importanti fil-fluss metaboliku tal-karbonju. .

PhG huwa l-ingredjent attiv primarju f'C. deserticola. Ġeni involuti fil-bijosintesi tal-phenylethanol huma importanti għall-kwalità ta 'C. deserticola. Aħna kkonkludejna żewġ mogħdijiet ta 'bijosintesi differenti ta' phenyl etanol u 17-il ġeni ta 'enżimi involuti fil-bijosintesi PhG fiż-zokk ta' C. deserticola. Il-proċessi possibbli ta 'l-aċidu post-kaffeic/ferulic (Fig 3) ġew ukoll dedotti għall-ewwel darba abbażi ta' formula strutturali ta 'intermedji u proprjetajiet katalitiċi ta' enzimi korrispondenti, li fihom l-aċidu caffeic/ferulic ikun l-ewwel ossidizzat f'derivat ta 'phenylpyruvate; imbagħad, il-grupp carboxyl ġie mċaħħad minn decarboxylases; finalment, il-grupp aldehyde ġie kkonvertit lura fi grupp ta 'alkoħol permezz ta' dehydrogenase. Din hija l-ewwel applikazzjoni tat-teknoloġija tas-sekwenzjar tat-tarf paired Illumina biex tinvestiga t-transcriptome kollu ta 'C. deserticola u biex tgħaqqad il-qari RNA-seq mingħajr ġenoma ta' referenza. Dan l-istudju se jipprovdi riżorsi utli u sekwenzi tal-ġeni għall-ġenomika funzjonali u r-riċerka proteomika fuq C. deserticola fil-futur.

Konklużjonijiet

F'dan l-istudju, aħna pprofilati t-traskriptome ta 'C. deserticola zokk ibbażat fuq data ta' sekwenzar ta 'fluss għoli, identifikajna ġeni involuti fil-mogħdijiet ta' bijosintesi tal-lignin, u ddeduvejna wkoll il-mogħdija ta 'bijosintesi potenzjali ta' PhGs għall-ewwel darba, li ċertament se tħaffef il-fehim tal-proċessi fiżjoloġiċi ambigwi u l-valur mediċinali kbir fil-livell molekulari. S'issa, dan huwa l-ewwel tentattiv biex jinġabar de novo it-traskriptome kollu taz-zokk ta' C. deserticola u biex jinstab il-mogħdija tal-bijosintesi ta' komponenti mediċinali bl-użu ta' settijiet ta' dejta ta' sekwenzar ibbażati fuq Illumina. L-istudju tagħna jista 'jippromwovi l-iżvilupp ta' mediċini naturali u l-għażla ta 'kultivari b'karatteristiċi mediċinali.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%