Effetti Protettivi tad-Decoction Wenshen Shengjing Ġdid Fuq Indeboliment Indott minn Ċiklosporina Tas-Sinteżi tat-Testosterone U Apoptosi Spermatoġenika
Mar 03, 2022
Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
XIAOYAN PAN , XIYAN WANG , XUENAN WANG , WANSHENG ZHANG4 , ZHANXUAN SUN1 , XUAN XUAN LIANG , XUE ZHANG , WENJUN LI u ZHIXIN LI
Astratt
L-istudju preżenti kellu l-għan li jinvestiga l-effetti protettivi potenzjali ta’ Wenshen Shengjing Decoction il-ġdid (WSSJD ġdid; inkluż Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum, u Angelica Sinensis) fuq indeboliment ikkawżat minn cyclosporine tas-sintesi tat-testosterone u apoptosi spermatoġenika fil-ġrieden. Total ta' 90 ġrieden Kunming maskili adulti ġew maqsuma fis-6 gruppi li ġejjin: Kontroll (l-ebda intervent), dimethylsulfoxide (DMSO; irċieva biss DMSO), cyclosporine A (CSA), clomifene citrate (CC; CsA plus CC, 15 mg/kg). /jum), WSSJD (CsA flimkien ma 'WSSJD, mediċina mhux raffinata 12 g/kg/jum) u WSSJD ġdid (CsA flimkien ma' WSSJD ġdid, mediċina mhux raffinata 12 g/kg/jum). Il-ġrieden kollha ġew ittrattati għal 30 jum permezz ta 'gavage orali. It-testikoli sussegwentement ġew iffissati u mtebbgħin b'ematossilin u eosin biex jiġi vvalutat l-iżvilupp ta 'epitelja seminiferous. Intużaw tekniki immunoistokimiċi biex jiskopru l-espressjoni tar-riċettur tal-ormon luteinizing (LHR) u l-qsim tal-katina tal-ġenb P450 (P450scc) fiċ-ċelloli Leydig testikolari. Barra minn hekk, l-apoptosi taċ-ċelluli spermatoġeniċi fit-testikoli ġiet skoperta bl-użu ta 'assaġġ ta' tikkettjar dUTP nick-end medjat minn deoxynucleotidyl transferase terminali, u ċitometrija tal-fluss intużat biex tanalizza r-rata ta 'sopravivenza u l-apoptosi bikrija tal-isperma fl-epididimi. Meta mqabbel mal-gruppi CsA u CC, l-amministrazzjoni ġdida ta 'WSSJD żiedet b'mod sinifikanti l-livelli ta' testosterone fis-serum u l-espressjonijiet ta 'LHR u P450scc fiċ-ċelloli Leydig testikolari (P<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">
Introduzzjoni
Cyclosporine A (CSA) huwa aġent immunosoppressiv użat b'mod komuni li jimmira speċifikament għaċ-ċelluli T u jinibixxi s-sekrezzjoni ta' interleukin-2, u jżid b'mod drammatiku r-rata ta' suċċess tat-trapjanti tal-fwied, tal-kliewi u tal-kornea, kif ukoll ir-rata ta' sopravivenza ta' riċevituri (1-3). Madankollu, l-immunosoppressjoni indotta minn użi ta 'CsA fit-tul iżżid b'mod sinifikanti r-riskju ta' mard kardjovaskulari, infezzjoni u tumuri malinni (4). Eid et al (5) irrappurtaw li l-konċentrazzjoni u l-motilità tal-isperma kienu korrelatati b'mod negattiv mal-konċentrazzjoni tas-serum CsA f'riċevituri ta 'trapjant tal-kliewi maskili, li jissuġġerixxu li CsA jista' jinduċi disfunzjoni tas-sistema riproduttiva f'riċevituri maskili. Barra minn hekk, ġie dokumentat li CsA jista 'jkun responsabbli għal spermatoġenesi indebolita u ħsara lis-sistema riproduttiva maskili (6).
Studji preċedenti wrew li CsA naqqas il-livelli ta 'testosterone fis-serum billi influwenza l-bijosintesi u t-tnixxija tat-testosterone fit-testikoli. He et al (7) osservaw li l-firien ittrattati b'40 mg/kg/jum CsA urew livelli ogħla b'mod sinifikanti ta 'ormon luteinizing (LH) u livelli sinifikament aktar baxxi ta' testosterone fis-serum, li wasslu għal indeboliment ta 'żvilupp testikolari. Ali et al (8) irrappurtaw li t-trattament b'CsA naqqas l-espressjoni tar-riċettur LH (LHR) fuq il-membrana taċ-ċelloli Leydig, li sussegwentement naqqset is-sintesi u t-tnixxija ta 'testosterone medjata minn LH miċ-ċelloli Leydig. Studju ieħor minn Seethalakshmi et al (9) irrapporta li CsA naqas il-livelli ta 'testosterone billi jinibixxi l-attività ta' 17 alpha-hydroxylase mingħajr kooperazzjoni u 17 -hydroxysteroid dehydrogenase attività kompetittivament matul il-bijosintesi tat-testosterone, u s-sit primarju għall-inibizzjoni ta 'CsA kien interrott adenosine ċikliku stimulazzjoni tal-monofosfat. Barra minn hekk, dan ir-rapport indika li tnaqqis fis-sekrezzjoni ta 'testosterone indotta minn CsA fiċ-ċelloli Leydig influwenzat direttament l-iżvilupp tas-sistema riproduttiva maskili u ż-żamma tal-kapaċità riproduttiva. Seethalakshmi et al (10) injettaw testosterone eżoġenu fil-firien ittrattati b'CsA biex iżidu l-livelli ta 'testosterone endoġenu. Ġie osservat li d-dożi elevati ta 'testosterone eżoġenu rrestawraw b'mod sinifikanti l-piż tal-organi riproduttivi, il-livelli tas-serum tal-ormon li jistimula l-follikulu (FSH), u żiedu l-għadd taċ-ċelluli ġerminali, u b'hekk jindikaw li l-indeboliment tal-ispermatoġenesi kkaġunat minn CsA jista' jiġi parzjalment evitat mill-esoġenu. amministrazzjoni ta 'testosterone (10). Madankollu, testosterone eżoġenu nstab li ma kienx biżżejjed fit-tiswija tat-tessut testikolari bil-ħsara, peress li s-sekrezzjoni ta 'testosterone u l-ispermatoġenesi kienu għadhom influwenzati minn CsA, u rati għoljin ta' apoptożi ġew osservati fl-isperma u ċelluli spermatoġeniċi (10).
Wenshen Shengjing Decoction (WSSJD) jikkonsisti fi 15-il mediċina erbali, primarjament inklużi Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicorneum, u Angelica Sinensis (11). WSSJD intwera li ttaffi l-apoptosi spermatoġenika indotta minn cyclophosphamide (11). Biex itejjeb aktar l-effett terapewtiku ta 'WSSJD, l-istudju preżenti żviluppa WSSJD ġdid ibbażat fuq il-mekkaniżmu ta' ħsara fit-tessut testikolari indotta minn CsA billi jaġġusta d-dożaġġ tal-komponenti WSSJD. Studji farmakoloġiċi moderni wrew li l-bellus tal-antler f'WSSJD jista' jiffunzjona bħala ormon sesswali (12); Radix Astragali jista 'jtejjeb il-proliferazzjoni u l-provvista ta' nutrijenti taċ-ċelloli Sertoli testikolari (13), u Panax ginseng jista 'jnaqqas il-livelli ta' iperossidu testikolari u jinibixxi l-apoptosi spermatoġenika (14). Il-mediċini msemmija hawn fuq jistgħu wkoll iżidu l-funzjoni tal-kliewi u jagħtu spinta lill-iżvilupp taċ-ċelloli spermatoġeniċi (12-14). Clomifene citrate (CC) intwera li jeżerċita effett terapewtiku fuq l-infertilità maskili fi studji kliniċi preċedenti (15,16). Barra minn hekk, CC ġie assoċjat ma' parametri mtejba ta' testosterone u semen, u l-mekkaniżmi protettivi ta 'CC jistgħu jkunu simili għal dawk ta' WSSJD (15,16). Barra minn hekk, fi studju minn Wang et al (17), CC intuża bħala kontroll ta 'trattament biex jinvestiga l-effett tal-mediċina Ċiniża Shengjing fuq disturbi tal-ispermatoġenesi fil-ġrieden. Ibbażat fuq dan, CC intuża bħala kontroll pożittiv fl-istudju preżenti.
Fl-istudju preżenti, il-mekkaniżmu sottostanti l-effett protettiv ta 'WSSJD ġdid fit-tessuti testikolari ġie investigat biex tiddetermina l-effikaċja terapewtika tal-mediċina modifikata. L-eluċidazzjoni tal-mekkaniżmu protettiv jista 'jipprovdi bażi għall-użu ta' WSSJD ġdid fit-titjib tal-ħsara spermatoġenika indotta minn CsA.
Effetti ta 'Cistanche deserticola: Prevenzjoniħsara spermatoġenika
materjali u metodi
Annimali. Total ta '90 ġrieden Kunming maskili (8-ġimgħat; 35-40 g) ġew ipprovduti mill-Istitut Changchun tal-Prodotti Bijoloġiċi Co., Ltd. (Changchun, iċ-Ċina). L-istudju preżenti sar b'approvazzjoni mill-Kumitat tal-Etika tal-Università Medika ta 'Jilin (Changchun, iċ-Ċina). Il-ġrieden kienu miżmuma f'21±3˚C u 55-65 fil-mija ta 'umdità relattiva taħt ċiklu ta' dawl skur ta '12-il siegħa. Il-ġrieden ingħataw aċċess liberu għal dieta standard tal-ġrieden tal-laboratorju u ilma sterili.
Preparazzjoni tal-WSSJD. Il-15-il komponent tal-mediċina Ċiniża tal-WSSJD, inklużi Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum, u Angelica Sinensis (11), inxtraw minn Tongrentang (Beijing, iċ-Ċina). Dawn il-materjali ġew decocted skond il-metodu tradizzjonali ta 'decoction mediċinali Ċiniż (18). Fil-qosor, l-ingredjenti ġew miżuna skond ir-riċetta, u total ta '250 ml ilma distillat ġie miżjud biex tgħaddas il-ħxejjex aromatiċi. Ħxejjex aromatiċi kienu mxarrba għal 30 min u sussegwentement imsaħħan. Il-ħwawar l-ewwel ġew mgħollija għal 10 min u mbagħad is-sħana tnaqqset għal ttektek għal 20 min. Wara 30 min ta 'tisħin, id-decoction likwidu ġie sseparat mill-ħxejjex aromatiċi, li ġew aktar decocted b'200 ml ilma distillat f'80˚C għal 30 min oħra. Dan il-proċess ġie ripetut u l-volum finali tal-likwidu tad-decoction ġie ffiltrat minn 4-5 saffi ta' garża. Il-likwidu ġie mbuttat ukoll mill-ħwawar fid-decoction iffiltrat. Id-decoction ġiet sussegwentement imsaħħan f'80˚C f'banju ta 'l-ilma għal 6-7 sigħat sakemm il-konċentrazzjoni laħqet 2 g droga mhux raffinata/ml, u d-decoction inħażen f'4˚C qabel l-użu. WSSJD ġdid kien ippreparat ibbażat fuq il-formulazzjoni ta 'WSSJD b'aġġustamenti minuri għad-dożaġġi ta' Panax ginseng, Cynomorium solarium, Radix Astragali, u Epimedium brevicornum. Il-metodu tad-decocting kien l-istess bħal dak tal-WSSJD. WSSJD ġdid magħmul minn dan li ġej: Panax ginseng, 6 g; Solarium Cynomorium, 9 g; Radix Astragali, 12 g; Epimedium brevicornum, 6 g; Cornu Cervi Nippon Parvum, 1 g;Cistanche deserticola, 9 g; Angelica Sinensis, 6 g; Flatstem Milkvetch Żerriegħa, 9 g; Rhizoma Dioscoreae, 15 g; Kap kbir Atractylodes Rhizome, 6 g; Ligusticum wallichii, 3 g; Radix Paeoniae Alba, 6 g; Cinnamomum cassia, 1 g; Costustoot, 1.5 g, u Fructus Foeniculi, 3 g.
Il-konċentrazzjonijiet ta 'estratti tad-droga mhux raffinati ġew determinati kif ġej: Piż tal-materjal mhux raffinat/volum finali. Dan il-metodu ta' kalkolu huwa użat ħafna fl-istudju tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża (19-21). L-amministrazzjoni tad-droga. Il-ġrieden kienu maqsuma b'mod każwali f'6 gruppi (15-il ġrieden għal kull grupp) u ġew amministrati b'mediċina intragastrika. Il-gruppi kienu kif ġej: Kontroll (salina normali); dimethylsulfoxide (DMSO); CsA; CC; WSSJD; u WSSJD ġdid. Ġrieden fil-gruppi CsA, CC, WSSJD, u WSSJD ġodda ġew injettati intraperitonealment (ip) bi 15 mg/kg/jum CsA (Shanxi Powerdone Pharmaceutics Co., Ltd., Datong, iċ-Ċina) għal 30 jum, kif deskritt qabel (8 ). Ġrieden fil-gruppi ta 'kontroll u DMSO għaddew minn injezzjoni ip ta' kuljum b'volum ugwali ta 'salina normali jew solvent DMSO, rispettivament, matul il-perjodu sperimentali ta' 30-jum. Il-konċentrazzjoni ta 'DMSO dilwit f'salina normali kienet 3.25 fil-mija (v/v). Il-grupp CC ingħata b'21.6 mg/kg/jum CC (GKH Pharmaceutical, Ltd., Guangzhou, Ċina) kif deskritt qabel (13), li kien ukoll dilwit fi 3.25 fil-mija (v/v) DMSO (pH{{14} }.2). Ġrieden fil-gruppi WSSJD u WSSJD ġodda ġew amministrati bi 12 g mediċina mhux raffinata / kg / jum ta 'WSSJD u WSSJD ġodda, rispettivament.Tbajja ta' ematossilina u eosina (H&E). It-testikoli tal-ġrieden ġew maħsuda u immedjatament iffissati f'4 fil-mija paraformaldehyde (pH=7.2) f'temperatura tal-kamra għal 24 siegħa, segwit minn deidrazzjoni ta 'l-etanol, trattament ta' xylene biex tneħħi l-etanol, inkorporazzjoni tax-xama ', u sezzjoni. Sezzjonijiet istoloġiċi (5 µm) inkisbu permezz ta' mikrotomu li jdur. Dawn kienu mwaħħla ma 'slajds tal-ħġieġ għat-tbajja' H&E. Sezzjonijiet testikolari ġew osservati bl-użu ta 'mikroskopija istopatoloġika ta' enfasi biex jiġi evalwat l-iżvilupp ta 'tubuli seminiferous u tinkiseb data istometrika. L-iżvilupp ta 'tubuli seminiferous ġie vvalutat bl-użu tas-sistema ta' punteġġ Johnsen (22).
ELISA. Fit-3 0 jum tat-trattament, il-ġrieden ġew anestetizzati b'10 fil-mija chloral hydrate (Shanghai Guoyao Chemical Reagent Co., Ltd) f'0.004 ml/g ta 'piż tal-ġisem ip qabel l-ewtanasja b'CO2. Inġabar id-demm tat-trunk u s-serum ġie separat u maħżun f'-20˚C. Fil-qosor, id-demm inġabar f’tubi ta’ 1.5-ml u nħażen f’4˚C matul il-lejl. It-tubu mbagħad ġie ċentrifugat f'1,300 xg f'4˚C għal 6 min u s-serum inġabar. Kitts ELISA (Shanghai Elisa Biotech Co., Ltd., Shanghai, iċ-Ċina) intużaw biex jiddeterminaw il-kontenut tas-serum ta' testosterone (kat. nru EIA-2380) u LH (kat. nru EIA-2385 ) skond il-protokoll tal-manifattur. Id-densità ottika (OD) ġiet iddeterminata bl-użu ta 'qarrej tal-mikroplate Mudell 680 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), u l-livelli ta' testosterone u LH ġew determinati abbażi tal-kurva standard.
Immunoistokimika. It-tessuti testikolari ġew iffissati f'4 fil-mija formaldehyde f'temperatura tal-kamra għal 24 siegħa u inkorporati fil-paraffin. Sezzjonijiet tal-paraffin inqatgħu f'sezzjonijiet ta' 5 µm u sussegwentement ġew dewaxed. L-irkupru ta' l-antiġeni nkiseb bl-inkubazzjoni ta' sezzjonijiet f'0.01 M citrate buffer (pH=6.0) f'95-98˚C għal 5 min. It-taqsimiet sussegwentement ġew imblukkati b'5 fil-mija albumina tas-serum bovin (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, il-Ġermanja; A3675) f'temperatura ambjentali għal siegħa. Wara l-imblukkar, is-sezzjonijiet ġew inkubati b'antikorpi poliklonali tal-fenek kontra LHR (nru tal-kat L6792; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; 1:200) jew qsim tal-katina tal-ġenb P450 (P450scc; nru tal-kat ab75497; Abcam, Cambridge, UK) ; 1:200) f'4˚C matul il-lejl fid-dlam. Il-metodu streptavidin-biotin complex (SABC) intuża biex jikxef l-espressjoni ta 'LHR u P450scc bl-użu ta' kit SABC (SA2010; Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA), skond il-protokoll tal-manifattur. Għat-tessuti iżolati minn ġrieden ta 'kontroll negattiv, l-antikorp primarju ġie sostitwit b'PBS. Iċ-ċelloli Leydig bi tbajja’ safra jew kannella fuq il-membrana jew il-plażma kienu kkunsidrati bħala ċelloli pożittivi għall-LHR. Ħames slides inkisbu minn kull kampjun u ħames oqsma fiż-żoni tat-tessuti Leydig ġew magħżula bl-addoċċ u vvalutati taħt mikroskopju fluworexxenti (ingrandiment, x400). L-OD medju ta 'ċelluli pożittivi fiż-żoni tat-tessut Leydig inkiseb bl-użu ta' softwer Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). L-espressjonijiet ta 'LHR u P450scc kienu proporzjonali għall-valuri OD, b'valuri OD ogħla jirrappreżentaw espressjonijiet ogħla ta' proteini.
Assaġġ ta' tikkettar tan-nick-end dUTP (TUNEL) medjat minn terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT). It-testikoli tal-ġrieden ġew imqassma, inkorporati fix-xama ', u sezzjoni. Is-sezzjonijiet (5-µm ħoxnin) imbagħad ġew imtebbgħin bl-użu tal-kit tal-assaġġ TUNEL (MK1024; Boster Biological Technology), skont il-protokoll tal-manifattur. Fil-qosor, tessuti testikolari mill-kontroll (salina normali), DMSO, CsA, CC, WSSJD, u gruppi ġodda WSSJD ġew imtebba bl-użu ta 'dilwizzjoni 1:100 ta' antikorp digoxin ittikkettat bil-bijotina għal 30 min f'37˚C. Tessut epiteljali interstizjali tal-far imtebba' (provdut fil-kit) intuża bħala kontroll pożittiv, u kampjuni inkubati b'PBS minflok antikorp digoxin ittikkettat bil-bijotina ntużaw bħala kontroll negattiv. Il-frekwenza taċ-ċelluli pożittivi għal TUNEL li juru tbajja nukleari ħadra ġiet evalwata bl-użu ta 'mikroskopju konfokali tal-iskannjar bil-lejżer. Total ta '10 oqsma każwali ġew ivvalutati taħt ingrandiment għoli (x400) u ċelluli pożittivi ġew magħduda. In-numru medju ta' ċelloli pożittivi għal kull qasam ġie kkalkulat.
Propidium iodide (PI) jew Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) tbajja u analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss. Il-cauda epididymis inħasad is-sagrifiċċju li ġej u l-epidermide inqatgħet b'xafra biex tirrilaxxa l-isperma mill-epididimi f'2 ml PBS f'37˚C biex jinkisbu sospensjonijiet tal-epididimi. Is-sospensjonijiet ġew sussegwentement inkubati f'37˚C għal 10 minuti biex jippermettu lill-isperma tgħum 'il barra. Aggregazzjonijiet ta 'l-isperma ġew mormija u l-kampjuni ta' l-isperma li kien fadal ġew iżolati u sospiżi mill-ġdid f'PBS biex jagħtu konċentrazzjoni ta '106 ċelluli/ml. L-apoptosi ta 'l-isperma ġiet analizzata bl-użu ta' kit ta 'Sejbien ta' Apoptosis Annexin V-FITC (Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, iċ-Ċina), skont il-protokoll tal-manifattur. Fil-qosor, 1 ml ta' suspensjoni ta' l-isperma ttebba' b'10 µl PI jew b'500 µl buffer li torbot u 5 µl Annexin V-FITC fid-dlam għal 10 min f'temperatura tal-kamra. Iċ-ċelloli ġew analizzati immedjatament permezz ta 'ċitometrija tal-fluss Epics XL (Beckman Coulter, Inc.) u bl-użu ta' Sistema TetraONE™ (6915050; Beckman Coulter, Inc.). Iċ-ċelluli fl-istadji bikrija tal-apoptożi ġew identifikati permezz ta 'tbajja' pożittiva tal-Annexin V u ċ-ċelloli nekrotiċi ġew identifikati permezz ta' tbajja 'pożittiva ta' PI.
Analiżi statistika. L-analiżi tad-dejta saret bl-użu ta' softwer SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) u espressa bħala l-medja b'żieda jew ± devjazzjoni standard kif indikat. Id-differenzi bejn il-gruppi ġew evalwati għas-sinifikat bl-użu ta' analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda segwita mit-test post hoc ta' Tukey. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche deserticola
Riżultati
Effetti ta 'WSSJD ġodda fuq l-iżvilupp ta' tubuli seminiferous testikolari. Biex tinvestiga l-effett protettiv potenzjali ta 'WSSJD ġdid fuq l-iżvilupp ta' tubuli seminiferous testikolari tal-ġurdien, il-morfoloġija tat-testikoli tal-ġurdien imtebba H&E tqabbel taħt mikroskopija tad-dawl. It-tubuli seminiferous tal-ġrieden mill-gruppi CsA u CC urew tnaqqis fil-marġni tat-tubuli, dijametri tat-tubuli mnaqqsa u saffi mnaqqsa ta 'epitelju seminiferous testikolari meta mqabbel mal-kontroll. Barra minn hekk, ċelluli spermatoġeniċi urew arranġament diżordinat, in-numru ta 'ċelluli spermatoġeniċi kien imnaqqas u ftit isperma maturi kienu viżibbli fil-lumen (Fig. 1). Fil-ġrieden mill-gruppi DMSO, WSSJD, u WSSJD ġodda, aktar saffi ta 'epitelija testikulari seminiferous kienu viżibbli u l-marġinali tubuli seminiferous kien integrat mingħajr jinxtorob jew kollass (Fig. 1). Il-punteġġi Johnsen ma kinux differenti b'mod sinifikanti bejn il-grupp DMSO u l-gruppi ta 'kontroll, jew bejn il-gruppi CC u DMSO. Madankollu, il-punteġġ Johnsen naqas b'mod sinifikanti fil-grupp CsA u l-grupp WSSJD meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll, u l-punteġġi tal-gruppi WSSJD u WSSJD ġodda żdiedu b'mod sinifikanti meta mqabbla mal-grupp CC jew CsA (P<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">
Effetti ta 'WSSJD ġodda fuq testosterone fis-serum u LH. Il-livelli ta 'testosterone u LH fis-serum ġew imkejla sussegwentement. Il-livelli tas-serum ta' testosterone u LH ma ġewx affettwati wara l-għoti ta' DMSO. B'kuntrast, it-testosterone fis-serum kien irregolat b'mod sinifikanti, u LH kien regolat b'mod sinifikanti 'l fuq fil-ġrieden ittrattati b'CsA, relattiv għall-kontrolli (P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">
Effetti ta 'WSSJD ġodda fuq l-espressjonijiet ta' LHR u P450scc. L-espressjonijiet ta 'P450scc u LHR ġew ivvalutati fiċ-ċelloli Leydig testikolari permezz ta' immunoistokimika (Figuri 3 u 4). Fil-grupp ta 'kontroll, LHR kien espress fuq il-membrani ta' barra taċ-ċelloli Leydig bejn it-tubuli seminiferous (Fig. 3A), u P450cc kien espress fiċ-ċitoplasma ta 'ċelluli Leydig testikolari (Fig. 4A). It-trattament b'DMSO ma kellu l-ebda effett sinifikanti fuq l-espressjonijiet ta 'LHR u P450scc. B'kuntrast, it-trattament CsA naqqas b'mod sinifikanti l-espressjonijiet ta 'LHR u P450scc meta mqabbla mal-ġrieden ta' kontroll (P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">
Effett ta 'WSSJD ġdid fuq l-apoptosi taċ-ċelluli spermatoġeniċi. L-apoptosi taċ-ċelloli spermatoġeniċi fit-testikoli tal-ġurdien ġiet analizzata b'assaġġ TUNEL. In-nuklei ta 'ċelluli apoptotic kienu prinċipalment osservati fl-ispermatogonija u spermatocytes primarji (Fig. 5A). L-ispermatogonji huma akbar mill-ispermatoċiti u jinsabu eqreb lejn il-membrana tal-kantina (23). It-trattament b'DMSO ma kellu l-ebda effett sinifikanti fuq in-numru ta 'ċelluli spermatoġeniċi apoptotiċi fit-testikoli. B'kuntrast, it-trattament b'CsA żied b'mod sinifikanti n-numru ta 'ċelluli spermatoġeniċi apoptotiċi meta mqabbel mal-gruppi ta' kontroll u DMSO (P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">
Effetti ta 'WSSJD ġodda fuq is-sopravivenza u l-apoptosi bikrija tal-isperma. Biex tivverifika l-effetti protettivi ta 'WSSJD ġdid kontra l-apoptożi tal-isperma indotta minn CsA, ġew determinati s-sopravivenza u l-apoptosi bikrija tal-isperma fl-epididimi. L-isperma epididimali kienu mtebbgħin b'PI jew Annexin V u analizzati b'ċitometrija tal-fluss (Figuri 6 u 7). Wara r-riżultati msemmija hawn fuq, it-trattament CsA naqqas b'mod sinifikanti l-perċentwal ta' sperma ħajja u żied b'mod sinifikanti l-perċentwal ta' sperma apoptotika bikrija (P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">
Diskussjoni
Preċedentement ġie dokumentat li l-użu fit-tul ta 'CsA bħala aġent immunosoppressiv jaffettwa l-kapaċità riproduttiva (6). Xu (24) irrapporta li l-morfoloġija u l-vitalità ta 'l-isperma f'pazjenti kkurati b'CsA kienu aktar baxxi b'mod sinifikanti minn dawk fi grupp mhux ittrattat, kif osservat fil-kampjuni tas-semen ta' 26 riċevitur ta 'trapjant tal-kliewi kkurati b'dożi varji ta' CsA u 12-il voluntier b'saħħithom. Ġie osservat ukoll li r-rati ta' deformità tar-ras tal-isperma kienu ogħla b'mod sinifikanti f'riċevituri kkurati b'CsA(24). Dawn ir-riżultati ssuġġerew li CsA kellu effett dipendenti fuq id-doża fuq il-parametri tas-semen. Għalhekk, studji huma ġġustifikati biex jiġu identifikati aġenti farmakoloġiċi ġodda li kapaċi jtaffu l-ħsara testikolari kkaġunata minn CsA u jtejbu l-kapaċità riproduttiva maskili wara trapjant tal-organi.
Il-mikroambjent speċifiku tat-testikoli jippromwovi l-ispermatoġenesi, u għalhekk l-indeboliment tal-istruttura u l-funzjoni tat-testikoli jista 'jwassal għal arrest spermatoġeniku (25). Monteiro et al(26) ikkuraw firien Wistar b'CsA f'doża ta '15 mg/kg kuljum għal 56 jum, u osservaw żieda fil-proporzjon volumetriku ta' tessut konnettiv u tnaqqis fil-proporzjon volumetriku ta 'ċelluli Leydig fil-firien ittrattati b'CsA. Ġie osservat ukoll li CsA ikkawżat deġenerazzjoni tal-epitelju seminiferous, li rriżultat f'vakuolizzazzjoni taċ-ċelluli Sertoli, spermatidi tondi u tawwali anormali, u l-akkumulazzjoni ta 'ċitoplasma residwa fil-fruntiera tal-epitelju biswit il-lumen (26). Fl-istudju preżenti, il-ġrieden Kunming ġew ittrattati bi 15 mg/kg CsA kuljum għal 30 jum, li jwasslu għal tnaqqis u tnaqqis fid-dijametri tat-tubuli seminiferous, tnaqqis tas-saffi tal-epitelju seminiferous, arranġament diżordinat taċ-ċelloli seminiferous, tnaqqis fil-maturi sperma fil-lumen u punteġġ Johnsen mnaqqas b'mod sinifikanti.
Barra minn hekk, it-trattament bi trattament CsA għamel ħsara kbira lill-istruttura testikolari. L-istudju preżenti evalwa wkoll l-effetti protettivi ta 'WSSJD ġdid, bħala mediċina Ċiniża ġdida, fuq it-testikoli ta' ġrieden ittrattati b'CsA. Ġie osservat li s-saffi epiteljali seminiferous testikolari u l-arranġament taċ-ċelloli seminiferous ġew restawrati wara trattament b'WSSJD ġdid. Barra minn hekk, il-ġrieden fil-grupp il-ġdid tal-WSSJD urew tubuli seminiferous integrati mingħajr ma jinxtorob jew kollass u kellhom punteġġ Johnsen ferm ogħla meta mqabbel ma 'ġrieden ittrattati b'CsA. Dawn ir-riżultati ssuġġerew li WSSJD imsewwija b'mod sinifikanti l-ħsara testikolari indotta minn CsA, li jindika li dan il-kompost tal-mediċina tal-ħxejjex jista 'jkun trattament effettiv fil-prevenzjoni ta' ħsara testikulari indotta minn CsA. Jekk din it-tiswija taċ-ċelluli hijiex jew le dipendenti fuq in-niċċa fi ħdan l-epitelju hija wkoll mistoqsija importanti, li għandha tiġi investigata fi studji futuri.
L-assi ipotalamika-pitwitarja-testikolari jaqdi rwol importanti fir-regolazzjoni tal-attività ġenitali (27). L-iżvilupp u l-funzjonalità tal-organi ġenitali maskili huma regolati minn ormoni mill-ipotalamu u l-glandoli pitwitarji (28). Krueger et al (29) ikkuraw firien Sprague Dawley b'25 mg/kg/kuljum CsA jew 40 mg/kg/kuljum CsA għal 6 ijiem u osservaw li l-livelli fis-serum ta' LH u FSH żdiedu b'{8}} darbiet, filwaqt li l-espressjoni ta' P450scc naqas għal 30 fil-mija ta 'dak fil-grupp ta' kontroll. Barra minn hekk, il-livelli ta 'testosterone fis-serum naqsu b'mod sinifikanti fil-ġrieden ittrattati b'CsA, li rriżultaw fi spermatoġenesi indebolita (29). Fl-istudju preżenti, intwera li t-trattament CsA naqqas b'mod sinifikanti l-espressjoni ta 'LHR fiċ-ċelloli Leydig. Għalkemm l-LH fis-serum żdied, espressjoni mnaqqsa ta 'LHR setgħet imfixkla l-irkupru medjat minn LH tal-bijosintesi tat-testosterone u naqqset l-espressjoni ta' P450scc, bħala l-enzima li tillimita r-rata tal-bijosintesi tat-testosterone (30), u b'hekk affettwaw il-bijosintesi tat-testosterone miċ-ċelloli Leydig. L-ingredjenti ġodda f'WSSJD ġodda, bħal pilose antler, juru effetti simili għall-ormoni sesswali (12), li jistgħu jtejbu l-livelli ta 'testosterone fis-serum u jnaqqsu l-livelli ta' LH fis-serum, u b'hekk iżidu l-espressjoni ta 'LHR u p450scc fiċ-ċelloli Leydig. Notevolment, ir-riżultati preżenti indikaw li WSSJD ġodda stimulaw il-bijosintesi u t-tnixxija tat-testosterone fiċ-ċelloli Leydig biex jippromwovu l-ispermatoġenesi.
Stress ossidattiv indott minn CSA u ħsara fit-testikoli jinduċu d-displasja ta 'l-isperma u ċ-ċelloli spermatoġeniċi (31). Ġie rrappurtat li trattament CsA fit-tul jagħmel ħsara lis-sistema antiossidant fit-tessuti testikolari tal-annimali, li jwassal għal livelli mnaqqsa ta 'glutathione, glutathione peroxidase, u livelli ta' perossidu tal-idroġenu u livelli miżjuda ta 'dialdehyde malonic fit-testikoli (31). Għalhekk, livelli eċċessivi ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv fit-tessuti testikolari ma jistgħux jiġu eliminati, li jwasslu għall-perossidazzjoni tal-lipidi tal-membrana tal-isperma, ħsara fid-DNA, u tnaqqis fil-vitalità tal-isperma. Fl-istudju preżenti, ġie osservat li t-trattament CsA żied b'mod sinifikanti l-ksur tad-DNA u r-rata apoptotika ta 'ċelluli spermatoġeniċi f'tubuli seminiferous. Ir-rata ta 'sopravivenza ta' l-isperma fl-epididimi naqset ukoll, filwaqt li l-perċentwali ta 'sperma apoptotika bikrija żdiedet, li jindika li l-attività spermatoġenika tat-testikoli kienet bil-ħsara b'mod sinifikanti. Türk et al (32) iddokumentaw li l-effett protettiv ta 'l-aċidu ellagiku fuq il-ħsara testikulari indotta minn CsA kien assoċjat ma' stress ossidattiv fil-firien maskili. Il-WSSJD il-ġdid użat fl-istudju preżenti fih diversi komponenti antiossidanti, inkluża l-mediċina tal-ħxejjex Ginseng, li qabel intweriet li tnaqqas b'mod sinifikanti l-livelli ta 'iperossidu fit-testikoli (14).
Fl-istudju preżenti, ġew investigati l-effetti ta 'WSSJD ġodda fuq indeboliment indott minn CsA tas-sinteżi tat-testosterone u l-apoptosi spermatoġenika, u ġie osservat li WSSJD il-ġdid naqqas b'mod sinifikanti r-rati apoptotiċi ta' ċelluli spermatoġeniċi u isperma, u b'hekk imsewwew il-ħsara lis-seminiferous testikolari. epitelju. Il-morfoloġija tat-tubuli seminiferous testikolari u l-apoptosi taċ-ċelloli spermatoġeniċi u l-isperma ġew investigati bl-użu ta 'istokimika u ċitometrija tal-fluss. Għalkemm id-distribuzzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli u l-produzzjoni ta 'l-isperma ta' kuljum ma ġewx investigati, se jkunu l-fokus ta 'studji futuri mill-grupp tagħna.
WSSJD żied b'mod sinifikanti l-livelli ta 'testosterone fit-testikoli u naqqas l-apoptosi taċ-ċelluli spermatoġeniċi u l-isperma, li ssewwew b'mod effettiv il-ħsara testikolari indotta minn CsA. Dawn ir-riżultati jindikaw li l-WSSJD il-ġdid jista 'jkun aġent farmakoloġiku utli fit-trattament u l-prevenzjoni ta' ħsara testikulari indotta minn CsA.
Cistanche deserticola roorts sħaħ
Referenzi
1. Pedersen M u Seetharam A: Infezzjonijiet wara trapjant ortotopiku tal-fwied. J Clin Exp Hepatol 4: 347-360, 2014.
2. Vora GK u Ciolino JB: Reazzjoni ta 'allograft tal-kornea assoċjata ma' infjammazzjoni mhux okulari. Digit J Ophthalmol 20: 29-31, 2014.
3. De Pasquale C, Veroux M, Indelicato L, Sinagra N, Giaquinta A, Fornaro M, Veroux P, u Pistorio ML: Aspetti psikopatoloġiċi ta 'trapjant tal-kliewi: Effikaċja ta' tim multidixxiplinarju. World J Transplant 4: 267-275, 2014.
4. El-Gowelli HM u El-Mas MM: Modulazzjoni ċentrali ta 'pressjoni għolja indotta minn cyclosporine. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 388: 351-361, 2015.
5. EidMM, Abdel-Hamid IA, SobhMA u el-SaiedMA: Valutazzjoni tal-karatteristiċi tal-moviment tal-isperma f'riċevituri ta' trapjant renali infertili bl-użu ta' analiżi kompjuterizzata. Int J Androl 19: 338-344, 1996.
6. Zahra A, Gholamreza N, Farokhi F, u Shalizar Jalali A: Attenwazzjoni ta 'indeboliment ta' l-isperma ikkawżat minn cyclosporine u embrijotossiċità minn estratt milwiema tal-frott ta 'crataegus monogyna. Ċellula J 15: 198-205, 2013.
7. He Z, Qiu J, LiJ, Zhao D, Chen G, and Chen L: Effetti fit-tul ta 'konverżjoni minn cyclosporine għal rapamycin fuq il-funzjoni testikolari u l-morfoloġija f'mudell ta' trapjant tal-firien. Trapjant Proc 45: 763-769, 2013.
8. AliRB, KlouzA, Boubaker S, LakhalM u BelkahiaC: Mudell ta 'annimali ta' tossiċità testikolari minn cyclosporine: Evalwazzjoni u protezzjoni. Fundam Clin Pharmacol 23: 241-246, 2009.
9. Seethalakshmi L, Flores C, Malhotra RK, Pallas JD, Tharakan D, Khauli RB u Menon M: Il-mekkaniżmu ta 'azzjoni ta' cyclosporine fl-inibizzjoni tal-bijosintesi tat-testosterone minn ċelluli Leydig tal-firien in vitro. Trapjant 53: 190-195, 1992.
10. SeethalakshmiL, FloresC, CarboniAA u Menon M: Manutenzjoni kwantitattiva tal-ispermatoġenesi fil-firien ittrattati b'cyclosporine permezz ta 'amministrazzjoni eżoġena ta' testosterone propionate. J Androl 11: 491-497, 1990.
11. Pan XY, Wang XY, Wang XN, Sun ZX, Wang D, Wang X, Yang YY u Li ZX: Effetti ta '"Wenshen Shengjing Decoction" fuq l-apoptosi taċ-ċelluli spermatoġeniċi indotta minn cyclophosphamide u d-dimetilazzjoni tal-histone H3K9. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi 48: 82-86, 2014 (Biċ-Ċiniż).
12. Xu ZH, Li SF, Wang JY, Zhou R u Tian SJ: Estrazzjoni ta 'ormon sesswali mill-bellus antler b'CO2 superkritiku. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32: 2000-2003, 2007 (Biċ-Ċiniż).
13. Zhao LP, Xu Z, Zhang M, Sun HC u Tang F: Effetti ta 'Fructus Lycii u Radix astragali fuq il-funzjoni taċ-ċelloli Sertoli fit-testikoli tal-firien. Zhonghua Nan Ke Xue 13: 82-86, 2007 (Biċ-Ċiniż).
14. Xu L, Liu XH, u Zhang L: Effetti ta 'ġinsenosidi totali fuq il-kapaċità ta' antiossiġnu NO, NOS u totali fit-testikoli tal-ġurdien. Acta Academiae Medicinae CPAPF 5: 507-508, 2006 (Biċ-Ċiniż).
15. Patel DP, Brant WO, Myers JB, Presson AP, Johnstone EB, Dorais JA, Aston KI, Carrell DT u Hotaling JM: Is-sigurtà u l-effikaċja ta 'clomiphene citrate f'irġiel iperandroġeniċi u subfertili. Int J Impot Res 27: 221-224, 2015.
16. ElSheikh MG, Hosny MB, Elshenoufy A, Elghamrawi H, Fayad A u Abdelrahman S: Kombinazzjoni ta 'vitamina E u clomiphene citrate fit-trattament ta' pazjenti b'oligo idjopatiku bħala l-azoospermia: Prova prospettiva, randomised. Androloġija 3: 864-867, 2015.
17. Wang R, Xu L, Zhang WX, Wu YF, Shi JH u Zhang YX: Shengjing Granule: An Effective Chinese Medicine for Spermatogenic Disturbance in Mice. Zhonghua Nan Ke Xue 14: 1046-1049, 2008 (Biċ-Ċiniż).
18. Fan BT: Chinese Medicine Pharmacy, Shanghai Science and Technology Press 12: 62-68, 1997 (Biċ-Ċiniż).
19. Zhang J, Li H, Lu L, Yan L, Yang X, Shi Z u LiD: Il-Formula Yiqi u Yangyin ittejjeb il-ħsara lis-sistema ematopojetika indotta mill-irradjazzjoni totali tal-ġisem. J Radiat Res 58: 1-7, 2017.
20. Minami M, Konishi T, Jiang Z, Arai T u Makino T: Effett ta 'Shin'iseihaito fuq reazzjoni allerġika murina indotta minn sensitizzazzjoni nażali. J Tradit Complement Med 6: 252-256, 2015.
21. Rong R, Li RR, Hou YB, Li J, Ding JX, Zhang CB, u Yang Y: Mahuang-xixin-fuzi decoction inaqqas l-infezzjoni tal-virus tal-influwenza a fil-ġrieden tas-sindromu ta 'defiċjenza tal-kliewi-yang. J Ethnopharmacol 192: 217-224, 2016.
22. Johnsen SG: Għadd tal-punteġġ tal-bijopsija testikolari - metodu għar-reġistrazzjoni tal-ispermatoġenesi fit-testikoli umani: valuri normali u riżultati fi 335 raġel ipogonadi. Ormoni 1: 2-25, 1970.
23. Mays-Hoopes LL, Bolen J, Riggs AD, u Singer-Sam J: Preparazzjoni ta' spermatogonja, spermatoċiti, u spermatidi tondi għall-analiżi tal-espressjoni tal-ġeni bl-użu ta' għażla taċ-ċelluli attivati bil-fluworexxenza. Biol Reprod 53: 1003-1011, 1995.
24. Xu LG: Influwenza ta 'cyclosporin A fuq il-parametri tas-semen tal-pazjenti wara trapjant renali. J Clin Urol 20: 603-605, 2005.
25. Pintus E, Ros-Santaella JL, u Garde JJ: Lil hinn mid-daqs tat-testikoli: Rabtiet bejn l-ispermatoġenesi u l-karatteristiċi tal-isperma f'mammiferu tat-tnissil staġjonali. PLoS One 10: e0139240, 2015.
26. Monteiro JC, Predes FS, Matta SL, u Dolder H: L-infużjoni ta 'Heteroperys aphrodisiaca tnaqqas l-effetti kollaterali ta' cyclosporine A fuq it-testikoli. Anat Rec (Hoboken) 291: 809-817, 2008.
27. Oseko F, Nota S, Morikawa K, Endo J, Taniguchi A, u Imura H: Influwenza ta 'iperprolaktinemija kronika indotta minn sulpiride fuq l-assi ipotalamo-pitwitarja-testikolari fl-irġiel normali. Fertil Steril 44: 106-111, 1985.
28. Wisniewski P, Romano RM, Kizys MM, Oliveira KC, Kasamatsu T, Giannocco G, Chiamolera MI, Dias-da-Silva MR, u Romano MA: L-espożizzjoni tal-adulti għall-bisfenol A (BPA) fil-firien Wistar tnaqqas il-kwalità tal-isperma b'tfixkil tal-assi ipotalamika-pitwitarja-testikolari. Tossikoloġija 329: 1-9, 2015.
29. Krueger BA, Trakshel GM, Sluss PM, u Maines MD: Dipressjoni medjata minn Cyclosporin ta 'riċetturi ta' l-ormoni luteinizing u biosintesi heme fit-testikoli tal-firien: Mekkaniżmu possibbli għat-tnaqqis fit-testosterone fis-serum. Endokrinoloġija 129: 2647-2654, 1991.
30. Nolan CJ u Payne AH: Ġenotip fil-locus P450scc jiddetermina differenzi fl-ammont ta 'proteina P450scc u produzzjoni massima ta' testosterone fiċ-ċelloli Leydig tal-ġrieden. Mol Endocrinol 4: 1459-1464, 1990.
31. Türk G, Ateşşahin A, Sönmez M, Yüce A, u Ceribaşi AO: Il-lycopene jipproteġi kontra t-tossiċità testikolari indotta minn cyclosporine A fil-firien. Theriogenology 67: 778-785, 2007. 32. Türk G, Sönmez M, Ceribaşi AO, Yüce A, u Ateşşahin A: Attenwazzjoni ta' ħsarat testikolari u spermatozoali indotti minn cyclosporine A assoċjati ma' stress ossidattiv mill-aċidu ellagiku. Int Immunopharmacol 10: 177-182, 2010.
