mtLingwa
Id-dar / Għarfien / Il-kontenut

Għarfien

Effetti Protettivi Ta' Cistanche Kontra Degradazzjoni Dermal Fibroblast Collagen Indotta minn H2O2/UVB permezz ta' Hsa-microRNA-4535-medjat TGF/Smad Signaling

May 06, 2023

ASTRATT

Dan l-istudju kellu l-għan li jinvestiga l-mekkaniżmu sottostanti l-effetti protettivi ta' cistanchekontra l-ħsara kkawżata mill-H2O2/UVB bl-użu ta’ mudelli in vitro u in vivo ta’ fotoħsara. Barra minn hekk, identifikajna l-involviment tar-regolamentazzjoni tal-miRNA f'dan il-proċess. Il-fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem HS68 trattati bl-H2O2/UVB u l-ġrieden nude C57BL/6J indotti mill-UVB intużaw bħala mudelli in vitro u in vivo ta 'photodamage. Ir-riżultati wrew litrattament cistancheittaffi t-tnaqqis indott minn H2O2/UVB fil-vijabbiltà taċ-ċelluli, Indeboliment tas-sinjalar TGF/Smad, u tixjiħ tal-ġilda. Ibbażat fuq ir-riżultati ta' analiżi ta' firxa ta' microRNA u tfittxijiet fid-database, has-miR-4535 ġie identifikat bħalakandidat potenzjali miRNA li jimmira Smad4. In vitro, it-trattament ta' cistanche attivat il-kumpless Smad2/3/4 u inibixxa l-espressjoni ta' hsa-miR-4535 f'ċelloli esposti għal H2O2/UVB. In vivo, l-applikazzjoni topika ta 'dożi baxxi (12 mg/kg) u għoljin (24 mg/kg) ta' cistanche għall-ġilda dorsali tal-ġrieden nude C57BL/6J ttaffi b'mod sinifikanti l-fotoħsara tal-ġilda kkaġunata mill-UVB billi tippromwovi s-sinjalar tas-sintesi tal-collagen TGF /Smad, it-tnaqqis tal-iperplażja epidermali, il-formazzjoni tat-tikmix, u s-senescence tal-ġilda, kif ukoll l-inibizzjoni tal-espressjoni ta' hsa-miR-4535. Meħuda flimkien, is-sejbiet tagħna jindikaw rabta bejn hsa-miR-4535 u s-sinjalar tas-sinteżi tal-kollaġen TGF /Smad u jissuġġerixxu li dawn il-fatturi jkunu involuti fil-mekkaniżmu foto-protettiv ta 'cistanche fil-fibroblasti tal-ġilda kontra t-tixjiħ indott minn H2O2/UVB. L-evidenza indikat licistanche bi proprjetajiet kontra t-tixjiħjista 'jkunmeqjusa bħala suppliment fiprodotti għall-kura tal-ġilda.

Protective effects of cistanche

Prodott għall-Kura tal-Ġilda Cistanche Għall-Bejgħ

INTRODUZZJONI

Is-sinjali kliniċi tat-tixjiħ tal-ġilda umana jinkludu żieda fit-tikmix, laxkezza, u pigmentazzjoni irregolari [1]. Il-proċess tat-tixjiħ tal-ġilda huwa kkumplikat u jista 'jinqasam f'żewġ tipi: tixjiħ intrinsiku u tixjiħ estrinsiku. It-tixjiħ intrinsiku huwa dovut għall-mogħdija taż-żmien u fatturi ġenetiċi, filwaqt li t-tixjiħ estrinsiku, imsejjaħ ukoll fotoaging, jirriżulta prinċipalment minn espożizzjoni għar-radjazzjoni ultravjola [2, 3]. Studji preċedenti wrew li speċi abbundanti ta 'ossiġnu reattiv (ROS) huma ġġenerati kemm waqt it-tixjiħ intrinsiku kif ukoll estrinsiku. L-akkumulazzjoni ta' ROS tista' tinduċi sinjalazzjoni ta' proteina kinażi attivata minn mitoġenu (MAPK) u tattiva l-fattur ta' traskrizzjoni downstream tagħha, proteina attivatur-1 (AP-1). AP-1 attivat jista' jittrasloka għan-nukleu u jingħaqad mar-reġjuni promoturi tal-matrix metalloproteinases (MMPs) [4]. L-MMPs huma grupp kbir ta 'endopeptidase li jiddependi miż-żingu, li jikkontribwixxu għad-degradazzjoni tal-matriċi extraċellulari tad-dermis tal-ġilda (ECM). B'mod partikolari, MMP-1, collagenase, huwa involut fil-qsim ta' kollaġen tipi I u III [5]. It-tipi tal-kollaġen I u III, il-komponenti ewlenin tal-ECM, huma kapaċi jagħtu appoġġ u saħħa lid-dermis tal-ġilda u d-diżarranġament tagħhom iwassal għat-tikmix u laxkezza karatteristika tal-ġilda anzjana [6]. It-trasformazzjoni tal-fattur tat-tkabbir-beta (TGF) huwa ċitokin kullimkien u qawwi bi tliet iżoformi differenti, TGF 1, TGF 2, u TGF 3, li jistgħu jirregolaw b'mod pożittiv is-sintesi tal-kollaġen fid-dermis tal-ġilda tal-bniedem [2]. TGFs jibdew is-sinjal tagħhom billi jinteraġixxu ma 'kumplessi speċifiċi tar-riċetturi tas-serine/threonine kinase tal-wiċċ taċ-ċelluli, inklużi t-tipi ta' riċetturi TGF I (T RI) u II (T RII). Il-fosforilazzjoni T RI tixpruna l-fosforilazzjoni ta 'R-Smads (Smad2 u Smad3). R-Smads attivati ​​jinteraġixxu ma 'Smad4 biex jirregolaw it-traslokazzjoni tan-nukleu tiegħu u jattivaw it-tipi ta' kollaġen I u III b'mod transkrizzjonali permezz ta 'rbit ma' promoturi ta 'Smad-binding elements (SBE) [7, 8]. L-evidenza tal-immuntar tindika li ġenerazzjoni elevata ta 'ROS, indotta minn intrinsiku jew fotoaging, tikkontribwixxi għal indeboliment tal-passaġġ ta' sinjalazzjoni TGF / Smad, li mbagħad jirriżulta f'sintesi mnaqqsa tal-kollaġen fil-fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem [9, 10]. cistanche (3,5,7-trihydroxy flavone), membru naturali tal-familja flavonoid, huwa abbundanti f'Alpinia officinarum u propolis. cistanche hija kandidat potenzjali għat-trattament ta 'puplesija iskemika, dijabete, u tipi differenti ta' kanċer [11-13]. Barra minn hekk, cistanche jippossjedi attivitajiet radikali ta 'kennis u anti-infjammatorji [14, 15]. Preċedentement urejna li cistanche naqqas l-infjammazzjoni indotta mill-H2O2- u ppromwova l-formazzjoni tal-kollaġen permezz tar-riċettur tal-fattur 1 tat-tkabbir qisu l-insulina (IGFI-R)/ERK1/2 mogħdijiet ta’ sinjalazzjoni fiċ-ċelloli HS68 [16, 17]. Barra minn hekk, studju indika li cistanche ġie identifikat bħala kompost ta 'Alpinia officinarum u jippossjedi effetti inibitorji ta' collagenase fiċ-ċelloli tal-fibroblast tal-ġilda [18]. Madankollu, mekkaniżmu molekulari aktar dettaljat relatat ma 'kif cistanche jirregola t-tixjiħ tal-ġilda dermali mhuwiex magħruf. MicroRNAs (miRNAs) huma grupp ta 'molekuli RNA żgħar, single-stranded, li ma jikkodifikawx b'tul medju ta' 22 nukleotide. MiRNAs maturi huma traskritti minn sekwenzi tad-DNA. Fil-biċċa l-kbira tal-każijiet, miRNAs maturi jingħaqdu mar-reġjuni 3′-untranslated (UTRs) tal-mRNAs fil-mira biex isikket it-traduzzjoni tal-mRNA [19]. Fil-ġilda tal-bniedem, il-miRNAs għandhom rwoli kruċjali fir-regolazzjoni tal-metaboliżmu taċ-ċelluli, il-kanċer, is-senescence u l-formazzjoni tal-kollaġen [20-23]. Pereżempju, miR -377 jista 'jikkaġuna s-senescence tal-fibroblast dermali billi jinibixxi l-espressjoni ta' DNA methyltransferase 1 (DNMT1), li sussegwentement iwassal għal inqas metilazzjoni fil-promotur p53 u s-senescence tal-fibroblast dermali [22]. Il-profil tal-miRNA fil-ħsara kkawżata mill-UVB fiċ-ċelloli tal-papilla tal-ġilda tal-bniedem (nHDPs) kien investigat qabel [24]. Madankollu, kif is-senescence tal-fibroblast dermali indotta mill-UVB permezz tar-regolament tal-miRNA, speċjalment fl-involviment ta 'kompost naturali hija fil-biċċa l-kbira mhux magħrufa. Dan l-istudju kellu l-għan li jinvestiga l-effetti protettivi ta 'cistanche kontra ħsara dermali indotta minn H2O2/UVB kif ukoll ir-rwol tad-degradazzjoni tal-kollaġen medjata minn microRNA f'dan il-proċess. Aħna immiraw ukoll li nidentifikaw il-mikroRNAs involuti fir-regolazzjoni tas-sintesi tal-kollaġen.

Protective effects of cistanche

RIŻULTATI

cistanche jinibixxi ċ-ċitotossiċità kkawżata mill-UVB/H2O2-f'fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem HS68

Biex tiġi investigata ċ-ċitotossiċità ta' cistanche (Figura 1A) in vitro, iċ-ċelloli HS68 ġew ittrattati b'dożi differenti ta' cistanche (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) għal 24 siegħa. Ir-riżultati tal-assaġġ MTT wrew li cistanche ma kienx ċitotossiku għaċ-ċelloli HS68 (Figura 1B). Sussegwentement, esponejna ċ-ċelloli HS68 għal dożi differenti ta 'H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) u UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) għal 24 siegħa. It-trattament H2O2 u UVB naqqas il-vijabbiltà taċ-ċelluli b'mod dipendenti mid-doża (Figura 1C, 1D). Biex tevalwa l-proprjetajiet ċitoprotettivi ta 'cistanche waraH2O2 u l-espożizzjoni UVB, aħna ttrattati ċ-ċellula HS68 bikonċentrazzjoni differenti ta' cistanche (10, 20, 30 μM)wara H2O2- (200 μM) u indotti mill-UVB (40mJ/cm²) ħsara. H2O2 jew trattament UVB waħdunaqas b'mod sinifikanti (40 fil-mija) il-vijabbiltà tal-HS68ċelloli. Madankollu, it-trattament taċ-ċistanche pprevjeniet il-mewt taċ-ċellulib'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni (Figura 1E, 1F).Konċentrazzjoni ogħla ta 'cistanche (30 μM) b'mod prominentialleviated H2O2- u ċitotossiċità indotta mill-UVB.Għalhekk, id-doża ta '30 μM cistanche intużat fisussegwentiin vitrostudji biex jevalwaw il-protezzjoni tiegħueffetti fiċ-ċelloli HS68.

Protective effects of cistanche

Figura 1. cistanche jinibixxi ċ-ċitotossiċità indotta tal-UVB/H2O2-f'fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem HS68. (A) L-istruttura kimika ta 'cistanche. (B) Il-vijabbiltà taċ-ċelluli taċ-ċelloli HS68 ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' cistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) għal 24 siegħa. (C u D) Vijabilità taċ-ċelluli taċ-ċelloli HS68 esposti għal dożi differenti ta 'H2O2 (100, 150, 200, 250, 300 µM) jew irradjati bl-UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) għal 24 siegħa. (E u F) Vijabilità taċ-ċelluli taċ-ċelloli HS68 esposti għal H2O2 (200 µM) jew irradjati b'UVB (40 J/cm2 ) għal 1 siegħa u mbagħad ittrattati b'cistanche (10, 20, 30 µM) għal 23 siegħa. L-effetti ċitoprotettivi ta' cistanche ġew determinati mill-assaġġ MTT. Iċ-ċelloli ta 'kontroll ġew assenjati 100 fil-mija vijabbiltà. Il-valuri huma murija bħala medja ± SE. Il-kwantifikazzjoni tar-riżultati hija murija (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs ċelluli ta 'kontroll mhux ittrattati; ##P <0.01, ###P <0.001 vs ċelluli trattati bl-H2O2 jew UVB.



Cistanche attenwa ċ-ċellula HS68 indotta minn H2O2-senescence aktar milli apoptożi

Biex niddeterminaw jekk it-tnaqqis fil-vijabbiltà taċ-ċelluli kienx dovut għall-mewt taċ-ċelluli jew l-inibizzjoni tat-tkabbir, aħna ċċekkjaw l-espressjoni ta 'diversi apoptosi u markaturi tas-sopravivenza permezz ta' western blotting f'ċelloli HS68 esposti għal dożi differenti ta 'H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 μM ) għal 24 siegħa. Sibna espressjoni mnaqqsa b'mod sinifikanti ta 'markaturi ta' sopravivenza, bħal p-Akt, u espressjoni akbar ta 'apoptosis-related markers, such as cleaved-caspase 3 and cytochrome c, at concentrations >200 μM H2O2 (Figura 2A). Barra minn hekk, wettaqna ċitometrija tal-fluss biex nevalwaw ċelluli apoptotiċi bl-użu ta 'Annexin V u tbajja 'PI u osservajna riżultati simili. Meħuda flimkien, 200 μM H2O2 ma kkawżax apoptosi taċ-ċelluli HS68 (Figura 2B). Sussegwentement, skoprejna l-espressjoni ta 'diversi markaturi tas-senescenza, bħal p16, p21, u SA- -gal, biex niddeterminaw iċ-ċelloli senescent. Ir-riżultati tagħna wrew li t-trattament b'cistanche naqqas b'mod sinifikanti l-livelli ta' proteina p16 u p21 indotti minn H2O2-kif ukoll in-numru ta' ċelloli pożittivi għal SA- -gal (Figura 2C, 2D).


Cistanche jnaqqas il-produzzjoni ta' ROS intraċellulari/mitokondrijali indott minn UVB/H2O2-u żbilanċ MMP fiċ-ċelloli HS68

L-istress ossidattiv għandu rwol ewlieni f'diversi mard, u jista 'jiġi indott minn fatturi endoġeni jew eżoġeni. Hawnhekk, użajna H2O2 bħala endoġenu u UVB bħala fattur eżoġenu biex jinduċi ħsara ossidattiva u mbagħad investigajna l-attivitajiet ta 'eliminazzjoni ta' ROS ta 'cistanche. Biex jiġu identifikati s-sorsi ta 'ROS, intużaw MitoSOX u DCFH-DA biex jiddeterminaw ROS intraċellulari u mitokondrijali. Ir-riżultati tat-tbajja wrew li t-trattament H2O2 u UVB indott akkumulazzjoni ta 'ROS filwaqt li t-trattament ta' cistanche naqqas il-ġenerazzjoni ta 'ROS (Figura 3A, 3B). FilBarra minn hekk, peress li MMP żbilanċjat jista 'jibda l-mewt taċ-ċelluli, użajna JC-1 biex niddeterminaw bidliet fl-MMP. Il-mitokondrija normali ħarġet il-fluworexxenza ħamra (JC-1 dimeri) filwaqt li l-mitokondrija indebolita ħarġet l-aħdar (JC-1 monomeri). L-espożizzjoni għall-UVB u l-H2O2 indotta livelli għoljin ta’ fluworexxenza ħadra. Notevolment, it-trattament ta 'cistanche biddel il-fluworexxenza ħadra għal aħmar, li jindika qawmien mill-ġdid tal-funzjonijiet mitokondrijali (Figura 3C).

Protective effects of cistanche


cistanche attenwa TGF /Smad indott H2O2-indeboliment fil-mogħdija tas-sinteżi tal-kollaġen fiċ-ċelloli HS68

Is-sinjalar TGF /Smad iwassal għall-formazzjoni tal-kollaġen fil-fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem [25-27]. Għalhekk, investigajna r-rwol tas-sinteżi ta' cistanche incollagen permezz tal-passaġġ TGF / Smad fiċ-ċelloli HS68 esposti għal H2O2. Ir-riżultati tal-Western blot indikaw li cistanche tejbet b'mod sinifikanti s-sinjalar TGF /Smad kif ukoll is-sinteżi tal-kollaġen fiċ-ċelluli HS68 esposti H2O 2- (Figura 4A). Barra minn hekk, id-diżorganizzazzjoni tal-kollaġen tat-tip I u III hija waħda mill-karatteristiċi tipiċi tal-fibroblasti tal-ġilda tal-età [28]. Peress li l-familja MMP ġiet implikata fil-kataboliżmu tal-kollaġen [29], aħna mbagħad ikkonfermajna l-influwenza ta' cistanche fuq l-attivazzjoni tal-MMP-1. Sibna li cistanche ipprevjeni d-degradazzjoni tal-kollaġen fiċ-ċelloli HS68 billi irażżan il-livell MMP-1 imsaħħaħ H2O2-(Figura 4A).
Barra minn hekk, aħna identifikajna l-mekkaniżmu molekulari subċellulari sottostanti din l-azzjoni protettiva billi nqabblu ċelluli HS68 ittrattati b'H2O2 waħdu jew kotrattati b'cistanche bl-użu ta 'immunoblotting u tbajja ta' immunofluworexxenza. It-trattament ta’ cistanche saħħaħ l-akkumulazzjoni nukleari ta’ p-smad2/3 u Smad4 li ġiet imfixkla bl-espożizzjoni għal H2O2 fiċ-ċelloli HS68(Figura 4B, 4C). Dawn is-sejbiet indikaw li cistanche jista' jtejjeb il-frammentazzjoni tal-kollaġen indotta minn H2O2- billi jattiva l-passaġġ TGF/Smad fiċ-ċelloli HS68.


It-trattament b'Cistanche inaqqas l-espressjoni upregulated indotta minn H2O2- ta' hsa-miR-4535, imbassar li jimmira Smad4

L-analiżi tal-firxa tal-miRNAittrattati bi cistancheIċ-ċelloli HS68 wrew li l-espressjoni ta 'hsa-miR -4535 tnaqqset fil-grupp ittrattat b'cistanche meta mqabbel ma' dak fil-grupp ta 'kontroll (Figura 5A). Barra minn hekk, bl-użu tad-databases tal-miRNA, bħal miRDB u TargetScanHuman, aħna mbassra sit fil-mira kkonservat putattiv għal hsa-miR-4535 fi Smad4-3′-UTR (Figura 5B). Wara li kkonfermaw is-sit fil-mira, il-kostruzzjonijiet tar-reporter Smad4-3′-UTR-WT u Smad{4-3′-UTR MT ġew trasfettati f'ċelloli HS68 biex jivverifikaw l-irbit dirett ta' hsa-miR-4535 ma' Smad4-3′-UTR. Aħna osservati tnaqqis ta '50 fil-mija fl-attivitajiet luciferase bejn it-tip selvaġġ u mutanti Smad4-3′-UTR gruppi segwiti hsa-miR-4535 jimitaw trasfezzjonijiet (Figura 5C). Imbagħad ivvalutajna l-effetti ta’ H2O2 (100,200 μM) fuq ir-regolamentazzjoni ta’ hsa-miR-4535 u Smad 4 fiċ-ċelluli HS68, u sibna li H2O2 imsaħħaħ b’mod dipendenti fuq id-doża ta’ hsa-miR-4535 u soppressa l-RNA Smad4 espressjoni (Figura 6A, 6B). Barra minn hekk, din ix-xejra fl-espressjoni ta' hsa-miR-4535 u Smad4 ġiet maqluba wara t-trattament ta' cistanche, li jindika li r-regolamentazzjoni tas-sinjalar Smad tista' tkun involuta fit-taffija medjata minn cistanche ta' ħsara taċ-ċelluli HS68 indotta minn H2O2- (Figura 6C, 6D). Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati ssuġġerew li cistanche jnaqqas l-indeboliment tal-passaġġ TGF/Smad indott minn H2O2- billi jirregola l-espressjoni ta' hsa-miR{-4535 fil-fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem.


Protective effects of cistanche

Figura 4. cistanche attenwa l-indeboliment tal-passaġġ tas-sinteżi tal-collagen TGF/Smad indott minn H2O2- fiċ-ċelloli HS68. (A) Iċ-ċelloli HS68 ġew esposti għal H2O2 (200 µM) għal siegħa u mbagħad ittrattati b'cistanche (30 µM) għal 23 siegħa. L-espressjoni tal-proteini tal-komponenti tal-mogħdija relatati mas-sintesi tal-kollaġen (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) u proteina relatata mad-degradazzjoni tal-kollaġen (MMP-1) ġew skoperti permezz ta 'western blot. (B) L-espressjoni tal-proteina ta 'p-smad2/3, u Smad4 fil-frazzjonijiet nukleari u ċitosoliċi ġiet skoperta minn western blotting. GAPDH intuża bħala kontroll tat-tagħbija. Il-valuri huma murija bħala medja ± SE. Il-kwantifikazzjoni tar-riżultati hija murija (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs. Ċelloli ta' kontroll mhux ittrattati; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs ċelluli trattati H2O2-. (C) Anti-p-Smad2/3, antikorp Smad4 u antikorp sekondarju FITC/PE konjugat intużaw biex jiskopru espressjoni p-Smad2/3 (aħdar), u Smad4 (aħmar). DAPI indika l-post tan-nukleu (blu). L-immaġini nqabdu permezz ta 'mikroskopju fluworexxenti (200 ×).


Il-modulazzjoni ta' Smad4 permezz ta' has-miR-4535 hija involuta fis-sintesi tal-kollaġen fil-fibroblasti dermali tal-ġilda umana esposti H2O2-

Biex niddeterminaw aktar il-mekkaniżmi li bihom has-miR-4535 jeżerċita l-effett tiegħu fuq l-espressjoni ta’ Smad4 u s-sinjalar downstream tiegħu fiċ-ċelloli HS68, aħna ttrasfettajna ċelloli HS68 b’mimiċi jew inibituri ta’ hsa-miR-4535 u kejlna Smad4 u l-espressjoni tal-kollaġen downstream tagħha. Ir-riżultati wrew li l-inibizzjoni ta 'hsa-miR-4535 mill-inibitur ta' hsa-miR-4535 reġġa' lura b'mod sinifikanti r-regolazzjoni 'l isfel tal-mRNA Smad4 u l-espressjoni tal-proteini f'ċelluli HS68 ittrattati H2O2- (Figura 7A-7C) . Barra minn hekk, is-soppressjoni ta 'hsa-miR-4535 parzjalment restawrata H2O2-indotta COL1A1 u COL3A1 indeboliment fiċ-ċelloli HS68 ittrattati H2O2- (Figura 7C). Bil-maqlub, l-espressjoni mtejba ta' hsa-miR-4535 bħala riżultat ta' trasfezzjoni mimika ta' hsa-miR-4535 imblukkat ir-regolazzjoni 'l fuq medjata minn cistanche ta' Smad4 fiċ-ċelloli HS68 esposti għal H2O2 (Figura 7D-7F). Espressjoni żejda ta' hsa-miR-4535 parzjalment imnaqqsa COL1A1 indott minn cistanche

u COL3A1 livelli (Figura 7F). L-espressjoni żejda ta 'hsa-miR -4535 (Figura 8A-8C) jew inibizzjoni ta' Smad4 minn siRNA (Figura 8D, 8E) irriżultaw f'sintesi mnaqqsa tal-kollaġen taħt trattament ta 'cistanche wara espożizzjoni H2O2. B'mod sorprendenti, sibna li kemm is-sajlenser dirett Smad4 kif ukoll it-trattamenti b'hsa-miR-4535 jimitaw is-sinteżi tal-kollaġen indotta minn cistanche maqluba f'ċelluli HS68 trattati H2O2-. Meħuda flimkien, aħna kkonkludejna li cistanche irregolat is-sintesi tal-kollaġen, potenzjalment permezz ta' tnaqqis fil-livell ta' hsa-miR-4535 biex ittejjeb is-sinjalar Smad4 fiċ-ċelloli HS68 esposti għal H2O2.

KSL30


cistanche itejjeb il-mogħdija tas-sintesi tal-kollaġen TGF/Smad u jnaqqas is-senescenza tal-ġilda kif ukoll l-inibizzjoni tal-espressjoni has-miR-4535 fiċ-ċelloli HS68 esposti għall-UVB

Peress li d-dawl UV għandu rwol importanti f'diversi disturbi tad-dermis tal-ġilda, inklużi infjammazzjoni, immunosoppressjoni, kanċer u tixjiħ prematur [30-32], eżaminajna l-effett ta 'cistanche fuq sinjalazzjoni relatata mas-sintesi tal-kollaġen fiċ-ċelloli HS68 esposti għar-radjazzjoni UVB. Il-livelli tal-proteini tal-komponenti tal-mogħdija TGF /Smad u l-COL1A1 u COL3A1 downstream naqsu fiċ-ċelloli HS68 ittrattati bl-UVB iżda ġew regolati b'mod effettiv wara t-trattament ta 'cistanche (Figura 9A). Ir-riżultati tal-western blotting ikkonfermaw li cstanchemrażżna espressjoni MMP-1 msaħħa bl-UVB fiċ-ċelloli HS68 (Figura 9A). Barra minn hekk, aħna ċċaraw l-effett ta 'anti-aging ta' cistanche f'ċelloli HS68 soġġetti għal espożizzjoni UVB billi wrew li cistanche naqqas l-elevazzjoni indotta mill-UVB tal-livelli p16 u p21 (Figura 9A). Biex nevalwaw jekk cistanche jistax jattenwa t-tqassim tal-kollaġen indott mill-UVB permezz ta' inibizzjoni ta' hsa-miR- 4535 immirat lejn Smad4, investigajna l-livelli ta' has-miR{-4535 u Smad4 f'ċelluli kotrattati UVB u cistanche bl-użu ta' qPCR. Sibna dik l-espressjoni has-miR-4535kien regolat b'mod sinifikanti 'l fuq fiċ-ċelloli esposti għall-UVB iżda naqas wara t-trattament ta' cistanche. Bil-maqlub, l-espressjoni Smad4 ġiet imrażżna mill-espożizzjoni UVB u din is-soppressjoni ġiet imreġġa lura b'mod notevoli permezz ta 'trattament ta' cistanche (Figura 9B, 9C). B'mod kollettiv, is-sejbiet tagħna ssuġġerew li cistanche jeżerċita effetti simili bħal H2O2 biex jerġa 'jġib it-tnaqqis indott mill-UVB fil-formazzjoni tal-kollaġen billi jrażżan il-livelli ta' hsa-miR-4535 sabiex jippromwovi s-sinjalar Smad4 fiċ-ċelloli HS68.

Protective effects of cistanche


L-applikazzjoni topika ta’ cistanche tattenwa l-iperplażja tal-ġilda indotta mill-UVB u d-degradazzjoni tal-kollaġen kif ukoll ittejjeb is-sinjalar TGF/Smad fil-ġilda dorsali tal-ġrieden nude C57BL6/J

Biex niċċaraw l-effett foto-protettiv ta 'cistanche fuq ħsara fil-ġilda kkaġunata mill-UVB in vivo, aħna evalwajna l-livell ta' microRNA-4535, Smad4, u alterazzjonijiet tat-tessut tal-ġilda. Figura 10A turi l-skema għal disinn sperimentali u linja ta 'żmien għall-applikazzjoni topika ta' cistanche wara irradjazzjoni UVB fuq il-ġilda dorsali ta 'ġrieden nude C57BL6/J. Il-formazzjoni tat-tikmix ġiet osservata fuq is-sezzjonijiet tal-ġilda dorsali tal-ġrieden C57BL/6J fil-grupp espost għall-UVB. L-applikazzjoni topika ta 'cistanche naqqset b'mod sinifikanti l-formazzjoni tat-tikmix, li tindika ż-żieda medjata minn cistanche fil-kontenut tal-kollaġen biex tinżamm l-integrità tal-ġilda (Figura 10B). Barra minn hekk, analiżi istoloġika tas-saff dermali wriet li l-kontenut tal-kollaġen u d-densità fil-ġilda
kienu aktar baxxi b'mod sinifikanti fil-grupp irradjat bl-UVB meta mqabbel ma 'dak fil-grupp ta' kontroll tal-vettura. Madankollu, applikazzjoni topika ta' cistanche (12 mg/kg u 24 mg/kg)


Protective effects of cistanche


Figura 6. cistanche tirregola l-espressjoni Smad4 billi tnaqqas il-livell hsa-miR-4535. (A, B) Ċelloli HS68 ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' H2O2 (0, 100, 20{{30}} µM ) għal 24 siegħa. (C, D) Iċ-ċelloli HS68 ġew esposti għal H2O2 (200 µM) għal siegħa u mbagħad ittrattati b'cistanche (30 µM) għal 23 siegħa. L-espressjoni ta' hsa-miR-4535 u Smad4 ġew skoperti bil-qRT-PCR. Il-valuri huma murija bħala medja ± SE. Il-kwantifikazzjoni tar-riżultati hija murija (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs ċelluli ta 'kontroll mhux ittrattati; ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs ċelloli trattati H2O2-.


promoss żied il-kontenut u d-densità tal-kollaġen b'mod dipendenti fuq id-doża meta mqabbel ma 'dak fil-ġrieden soġġetti għal irradjazzjoni UVB (Figura 11). Il-morfoloġija tal-ġilda ġiet evalwata permezz ta 'tbajja' H&E. L-espożizzjoni għall-UVB żiedet il-ħxuna epidermali meta mqabbla mal-grupp ta 'kontroll tal-vettura. Madankollu, l-applikazzjoni topika ta 'cistanche ttaffi b'mod sinifikanti l-UVB indottiperplażja epidermali (Figura 11). Barra minn hekk, it-tebgħa immunoistokimika ta 'l-applikazzjoni ta' cistanche indikata -gal naqqset l-espressjoni għolja -gal fil-ġilda irradjata bl-UVB (Figura 11). Biex tiddetermina jekk cistanche tistax ittejjeb il-kollaġen indott mill-UVB

Protective effects of cistanche

Figura 7. Espressjoni żejda jew inibizzjoni ta' hsa-miR-4535 tirregola s-sintesi tal-kollaġen fiċ-ċelloli HS68. (A–C) Iċ-ċelloli HS68 ġew trasfettati b'inibitur hsa-miR-4535 (40 nM) jew inibitur NC (4{0 nM) għal siegħa u mbagħad ikkurati flimkien b'H2O2 (2 00 μM) għal 23 siegħa. (D–F) Iċ-ċelluli HS68 ġew trasfettati b'hsa-miR-4535 jimitaw (10 nM) jew jimitaw NC (10 nM) għal siegħa u mbagħad ġew kotrattati b'cistanche (30 μM) għal 23 siegħa. Il-livelli ta' hsa-miR-4535 ġew skoperti bil-qPCR biex tiġi żgurata t-trasfezzjoni b'suċċess. Il-livelli tal-proteini ta 'Smad4, COL1A1, u COL3A1 ġew analizzati permezz ta' western blotting. GAPDH intuża bħala kontroll tat-tagħbija. Il-valuri huma murija bħala medja ± SE. Il-kwantifikazzjoni tar-riżultati hija murija (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs ċelluli ta 'kontroll mhux ittrattati; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs ċelluli H2O2 jew ittrattati bi cistanche.


Telf tal-fibra permezz ta 'regolazzjoni baxxa ta' hsa-miR-4535 biex ittejjeb Smad4 in vivo, l-espressjoni tal-RNA tagħha ġiet evalwata fil-kampjun tal-ġilda dorsali imneħħija b'qRT-PCR. L-espressjoni ta' hsa-miR-4535 kienet elevata fil-ġilda irradjata bl-UVB iżda mrażżna b'mod sinifikanti fil-ġilda trattata bi cistanchekemm f'dożi baxxi kif ukoll għoljin. Barra minn hekk, il-livelli baxxi ta 'espressjoni ta' Smad4 RNA fil-ġilda irradjata bl-UVB ġew restawrati permezz ta 'trattament ta' cistanche (Figura 12A, 12B)


Protective effects of cistanche

Figura 8. L-inibizzjoni ta 'Smad4 minn siRNA jew hsa-miR-4535 jimitaw ireġġgħu lura t-titjib medjat minn cistanche tas-sintesi tal-kollaġen fil-fibroblasti tal-ġilda. (A–C) Iċ-ċelloli HS68 ġew trasfettati b'hsa-miR-4535 jimitaw (10 nM) jew jimitaw NC (10 nM) għal siegħa segwit minn trattament konġunt b'cistanche (3 {{40}} μM) u H2O2 (200 μM) għal 23 siegħa. Il-livelli ta' Hsa-miR-4535 (A) u Smad4 (B) ġew skoperti bil-qPCR biex tiġi żgurata t-trasfezzjoni b'suċċess. (D – E) ċelloli HS68 ġew trasfettati b'siRNA Smad4 (2 0 nM) jew siRNA NC (20 nM) għal 1 siegħa segwit minn kotrattament b'cistanche (30 μM) u H2O2 (200 μM) għal 23 siegħa. Il-livelli ta 'Smad4 ġew skoperti minn qPCR biex jiżguraw trasfezzjoni b'suċċess (D). Il-livelli tal-proteini ta 'Smad4, COL1A1 u COL3A1 ġew analizzati permezz ta' western blotting (C, E). GAPDH intuża bħala kontroll tat-tagħbija. Il-valuri murija huma mezzi ± SE. Il-kwantifikazzjoni tar-riżultati hija murija (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs ċelluli ta 'kontroll mhux ittrattati; #P < 0.05, ##P < 0.01, vs ċelluli trattati H2O2-; $$P < 0.01, $$$P < 0.001 vs. H2O2 flimkien ma' ċelluli ttrattati bi cistanche

Barra minn hekk, l-applikazzjoni cistanche salvat l-espressjoni tal-proteini TGF, p smad2/3, u Smad4 f'tessut tal-ġilda indebolit bl-UVB (Figura 12C). Is-sejbiet tagħna indikaw li cistanche jista 'potenzjalment jipproteġi l-ġilda minn ħsarat indotti mill-UVB billi jinibixxi hsa miR-4535 biex ittejjeb l-espressjoni Smad4 għall-attivazzjoni ta' P-smad2/3 biex finalment tippromwovi s-sintesi tal-kollaġen (Figura 13)


image

Figura 9. cistanche itejjeb il-mogħdija tas-sintesi tal-collagen TGF /Smad u jnaqqas is-senescenza tal-ġilda kif ukoll l-inibizzjoni tal-espressjoni ta 'hsa-miR-4535 fiċ-ċelloli HS68 esposti għall-UVB. Iċ-ċelloli HS68 ġew esposti għal UVB (40 mJ/cm2 ) u mbagħad ittrattati b'cistanche (30 µM) għal 23 siegħa. (A) Espressjoni tal-proteini tal-komponenti tal-mogħdija relatati mas-sintesi tal-kollaġen (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), proteina relatata mad-degradazzjoni tal-kollaġen (MMP{{20}}), u senescence- markaturi assoċjati (p16 u p21) ġew skoperti minn western blot. GAPDH intuża bħala kontroll tat-tagħbija. (B u C) L-espressjoni ta 'RNA ta' hsa-miR-4535 u Smad4 ġiet skoperta minn qRT-PCR. Il-valuri huma murija bħala medja ± SE. Il-kwantifikazzjoni tar-riżultati hija murija (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, vs ċelluli ta 'kontroll mhux ittrattati; #P <0.05, ##P <0.01 vs ċelluli esposti għall-UVB.

Staqsi għal aktar:

Email:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: flimkien ma' 86 15292862950


Tista 'Tħobb ukoll