Iżolament Preparattiv U Purifikazzjoni Ta' Erba' Komposti Minn Cistanches Deserticola YC Ma Permezz ta' Kromatografija ta' Kontra-kurrent ta' Veloċità Għolja

1. Introduzzjoni

Cistanches deserticolaYC Ma, speċi taĊistanċili jappartjeni lill-Orobanchaceaefamilja, hija Mediċina Tradizzjonali Ċiniża magħrufa sew għat-trattament ta 'defiċjenza tal-kliewi, infertilità femminili, lewkorrea morboża, neurapraxia, u stitikezza senile [1]. Hija pjanta parassitika li hija mqassma ħafna fil-majjistral taċ-Ċina. S'issa, diversi komposti, inklużiphenylethanoid glycosides (PhGs), iridojdi, u lignans ġew iżolati minn din l-ispeċi [2]. Xi wħud mill-PhGs ġew irrappurtati li għandhom attivitajiet antiossidattivi, epatoprotettivi u newroprotettivi [3-6]. Madankollu, il-proċedura ta 'iżolament u purifikazzjoni ta' PhGs hija diffiċli u tieħu ħafna ħin. Barra minn hekk, il-metodi kromatografiċi multipli klassiċi mhux biss jużaw ammont kbir ta 'solventi organiċi iżda jagħtu wkoll irkupru tal-kampjun aktar baxx. Il-kromatografija kontra-kurrent ta 'veloċità għolja (HSCCC), teknika kromatografika ta' partizzjoni likwidu-likwidu mingħajr appoġġ, toffri rkupru eċċellenti ta 'kampjun meta mqabbla ma' xi metodi konvenzjonali u ntużat ħafna għas-separazzjoni u l-purifikazzjoni ta 'diversi prodotti naturali [7-9] . Għalkemm diversi PhGs ġew ippurifikati minnĊistanċiġeneru u oħrajn minn HSCCC [10–14], l-ebda karta ma rrappurtat il-purifikazzjoni ta 'acteoside, isoacteoside, syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside u 2'-acetylatteoside f'sistema waħda bifażika.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

F'dan id-dokument, nirrapportaw metodu sempliċi għas-separazzjoni u l-purifikazzjoni ta 'erba' PhGs minn C. deserticola. Fl-aħħarnett, 30.9 mg ta 'acteoside, 13.0 mg ta' isoacteoside, 12.5 mg ta 'syringalide A 3'{- -L-rhamnopyranoside u 7.2 mg ta' 2'-acetylatteoside nkisbu f'separazzjoni f'pass wieħed minn 297 mg ta 'frazzjoni b'puritajiet ta' 99%, 95%, 99%, u 98%, rispettivament. L-istrutturi tagħhom kienu kkaratterizzati bbażati fuq data spettrali 1 H- u 13C-NMR u spettri HR-MS. L-istrutturi tal-erba 'PhGs identifikati f'din l-investigazzjoni huma murija fil-Figura 1.

2. Riżultati u Diskussjoni

2.1. Analiżi HPLC tal-Estratt mhux raffinat

Il-frazzjoni arrikkita tal-kostitwent ta 'n-butanol estratt minn C. deserticola ġiet analizzata permezz ta' HPLC-UV. Il-kolonna użata kienet Accurasil C18 (250 mm × 4.6 mm, id 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, belt, stat abbrev, USA), il-fażi mobbli kienet metanol-ilma (30:70, v/v). Ir-rata tal-fluss kienet 1 mL/min. Il-wavelength tad-detector ġie stabbilit għal 254 nm. Il-kromatogramma HPLC tidher fil-Figura 2. Il-qċaċet 1 sa 4 jikkorrispondu għal acteoside (1), isoacteoside (2), syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside (3) u 2'-acetylatteoside (4), rispettivament .

2.2. Għażla ta 'Sistema ta' Solvent b'żewġ fażijiet

Is-separazzjoni b'suċċess minn HSCCC tiddependi ħafna fuq l-għażla ta 'sistema ta' solvent f'żewġ fażijiet adattata, is-sistema tas-solvent b'żewġ fażijiet intgħażlet skont il-valuri tal-koeffiċjent tal-qsim (K) ta 'kull komponent fil-mira u firxa ottima ta' K għandha tkun minn {{ 2}}.5 sa 2.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-IMMUNITÀ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Fl-esperiment, il-valuri K għall-komponenti fil-mira ta 'diversi sistemi ta' solventi b'żewġ fażijiet huma murija fit-Tabella 1 (għalkemm ftit ogħla għall-quċċata 4, ir-riżultati ntwerew li huma aċċettabbli). Fost dawn, ethyl acetate–n-butanol–ethanol-water (40:6:6:50, v/v/v/v) taw koeffiċjenti ta 'qsim xierqa għall-komposti fil-mira. Eventwalment, is-sistema tas-solvent komposta minn ethyl acetate–n-butanol– etanol-ilma (40:6:6:50, v/v/v/v) intużat biex tiżola u tippurifika erba’ komposti ta’ C. deserticola, kif muri f’ Figura 3. Kif muri fil-Figura 2, l-analiżi HPLC ta’ kull frazzjoni HSCCC wriet li erba’ PhGs puri (acteoside, 99%; isoacteoside, 95%; syringalide A 3′- -L-rhamnopyranoside 99% u 2′- acetylatteoside 98%) jista 'jinkiseb mill-frazzjoni mhux raffinata.

3. Sperimentali

3.1. Apparat L-HSCCC

tagħmir impjegat fl-istudju preżenti kien TBE{{0}}B sistema ta’ kromatografija kontra-kurrent ta’ veloċità għolja (Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, iċ-Ċina) bi tliet kolonni preparattivi ta’ separazzjoni ta’ kolja b’ħafna saffi konnessi f’serje (dijametru ta’ tubu=2.6 mm, volum totali=300 mL) u loop tal-kampjun ta’ 2{{10}} mL. Ir-raġġ tar-rivoluzzjoni jew id-distanza bejn l-assi tad-detentur u l-assi ċentrali taċ-ċentrifuga (R) kien 5 ċm, u l-valur varja minn 0.5 fit-terminal intern għal 0.8 fit-terminal estern (=r / R, fejn r hija d-distanza mill-coil sax-xaft tad-detentur). Implimentazzjoni ta 'ċirkolazzjoni ta' temperatura kostanti HX 105 (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Beijing, iċ-Ċina) intuża biex tikkontrolla t-temperatura fl-esperiment. Is-sistema HSCCC kienet mgħammra b'mudell TBP-5002 pompa ta' fluss kostanti ta' pressjoni medja, mudell TBP-2000 detector UV li jaħdem f'254 nm, u workstation mudell V4.0 (Jinda Bio-chemistry Instrument Kumpanija, Shanghai, iċ-Ċina).

It-tagħmir ta’ kromatografija likwida ta’ prestazzjoni għolja (HPLC) użat kien sistema Agilent 1200 li tikkonsisti minn pompa binarja G1312A, autosampler G1329A, detector ta’ wavelength varjabbli G1314A (VWD), kompartiment ta’ kolonna termostattata G1316A, xogħlijiet ta’ dega G1379B u Agilent. . Alltech 3300 ELSD intuża għall-iskoperta tal-puritajiet. L-ispettrometri Agilent 6520 Q-TOF u Bruker AVANCE III 500-NMR intużaw għall-identifikazzjoni strutturali tal-komposti. Spettri 1 H u 13C-NMR (f'500 u 125 MHz, rispettivament) ġew imkejla f'temperatura tal-kamra (22 grad /295.1 K).

3.2. Reaġenti u Materjali

Ethyl acetate, n-butanol, u etanol kienu grad analitiku u metanol kien grad HPLC. Is-solventi kollha nxtraw minn Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, iċ-Ċina). Milli-Q ilma (18.2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, USA) intuża għas-soluzzjonijiet u d-dilwizzjonijiet kollha. Ir-riżoma ta 'C. deserticola inġabar mill-Provinċja ta' Inner Mongolia, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina, f'Ġunju 2009. L-impjant ġie identifikat mill-Prof. Lijuan Zhang, u kampjun ta 'vawċer (Nru 20091001) ġie depożitat fil-laboratorju tagħna.

3.3. Preparazzjoni ta' Kampjun mhux raffinat

Zkuk imnixxfa bl-arja trab ta 'C. deserticola (1 Kg) ġew refluxed darbtejn b'etanol milwiema (8 L, 60% v/v) għal 2 sigħat kull darba. L-estratt ġie evaporat taħt pressjoni mnaqqsa u f'temperatura ta '60 grad sa l-evaporazzjoni totali ta' l-etanol. Ir-residwu ġie sospiż fl-ilma u estratt suċċessivament tliet darbiet bil-kloroform, aċetat etiliku, u n-butanol, li ta 5.16 g ta 'estratt ta' n-butanol wara evaporazzjoni sa nixfa taħt pressjoni mnaqqsa. L-estratt n-butanoic imbagħad ġie separat fuq kolonna tal-ġel tas-silika (malji 200-300) bl-użu ta 'eluzzjoni gradjent progressiva (CHCl3–MeOH, 10:1→1:1) biex tagħti tmien frazzjonijiet. Il-Frazzjoni 6 (297 mg) intużat għal aktar iżolament u separazzjoni ta' HSCCC.

NATURALI CISTANCHE TUBULOSA MEDIĊINI TRADIZZJONALI ĊINIŻI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.4. Għażla tas-Sistemi ta' Solvent f'żewġ fażijiet

Is-sistemi tas-solvent b'żewġ fażijiet intgħażlu skont il-koeffiċjent tal-qsim (K) tal-komponenti fil-mira fil-frazzjoni ta 'C. deserticola. Il-valuri K ġew determinati b'analiżi LC kif ġej: Ammont xieraq ta 'trab ta' estratt mhux raffinat (frazzjoni 6) ġie maħlul fil-fażi t'isfel tas-sistema tas-solvent u analizzat b'HPLC. Iż-żoni tal-qċaċet ġew irreġistrati bħala A1. Imbagħad volum ugwali tal-fażi ta 'fuq ġie miżjud mas-soluzzjoni u mħallat sewwa biex jintlaħaq ekwilibriju ta' partizzjoni. Il-fażi aktar baxxa mbagħad ġiet analizzata mill-ġdid mill-HPLC. Iż-żoni tal-quċċata tal-aħħar ġew irreġistrati bħala A2. Il-valuri K ġew ikkalkulati skond l-ekwazzjoni li ġejja: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. Preparazzjoni ta' Sistema ta' Solvent f'żewġ fażijiet u Soluzzjoni tal-Kampjun

Fl-istudju preżenti, is-sistema ta 'solvent f'żewġ fażijiet komposta minn ethyl acetate–n-butanol– etanol-ilma (40:6:6:50, v/v/v/v) intużat għas-separazzjoni tal-HSCCC. Kull solvent ġie miżjud ma' lembut separatorju u ekwilibrat sewwa f'temperatura tal-kamra. Il-fażi ta 'fuq u l-fażi t'isfel ġew separati u degassed permezz ta' ivvibrar għal 30 minuta ftit qabel l-użu. Is-soluzzjoni tal-kampjun ġiet ippreparata billi tħoll 297 mg ta 'Frazzjoni 6 fi 15 mL tal-fażi t'isfel ta' ethyl acetate–n-butanol–ethanol-water (40:6:6:50, v/v/v/v).

3.6. HSCCC Proċedura ta' Separazzjoni

HSCCC sar kif ġej. Il-kolonna kkoljata b'ħafna saffi kienet l-ewwel mimlija bil-fażi stazzjonarja organika ta 'fuq. Il-fażi mobbli milwiema aktar baxxa mbagħad ġiet ippumpjata fit-tarf tar-ras tal-kolonna b'rata ta 'fluss ta' 1.5 mL/min, u fl-istess ħin, l-apparat HSCCC tħaddem b'veloċità ta 'rivoluzzjoni ta' 900 rpm. Wara li ġie stabbilit ekwilibriju idrodinamiku, kif indikat minn fażi mobbli ċara li elużjoni fl-iżbokk tad-denb (madwar sagħtejn wara), soluzzjoni tal-kampjun ta '15 mL li fiha 297 mg tal-estratt mhux raffinat (frazzjoni 6) ġiet injettata permezz tal-valv tal-injezzjoni. L-effluwent tal-kolonna kien immonitorjat kontinwament taħt 254 nm. Erba' frazzjonijiet tal-ogħla livell inġabru skont il-kromatogramma u mbagħad evaporaw taħt pressjoni mnaqqsa. It-temperatura ta 'l-apparat kienet issettjata għal 25 grad.

3.7. Analiżi HPLC u Identifikazzjoni tal-Frazzjonijiet Peak tal-HSCCC

L-ogħla frazzjonijiet mill-HSCCC ġew analizzati permezz tal-HPLC-ELSD. Il-kolonna użata kienet Accurasil C18 (250 mm × 4.6 mm, id 5 μm), u l-fażi mobbli kienet metanol-ilma (30:70, v/v). Ir-rata tal-fluss kienet 1 mL/min. ELSD tħaddem taħt il-kundizzjonijiet li ġejjin: Temp 45 grad, gass 1.6 L/min. L-identifikazzjoni strutturali tal-erba 'frazzjonijiet tal-ogħla HSCCC twettqet permezz ta' spettroskopija HR-ESI-MS, 1 H, u 13C-NMR.

3.8. L-Identifikazzjoni Strutturali

Frazzjoni I: HR-ESI-MS osservata f'm/z 623.2001 (M-H)-, ikkalkolat għal C29H35O15, 623.1981. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1.09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 ta 'rhamnose), 2.79 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar- CH2-), 4.37 (1H, d, J=8 Hz, H{-1 tal-glukosju), 5.18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34) }} tar-ramnose), 6.27 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH{=CH-), 7.59 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6.5–7.1 (6H, H aromatiku). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131.5 (C-1), 117.2 (C{-2), 146.2 (C{-3), 144.7 (C{-4 ), 116.4 (C{-5), 121.3 (C{-6), 72.4 (C- ), 36.6 (C- ), 127.7 (Caf{-1), 115.3 (Caf{{{89} }}), 146.9 (CAF-3), 149.8 (CAF-4), 116.6 (CAF{-5), 123.2 (CAF{-6), 168.3 (Caf- ), 114.8 (Caf- ), 148.1 (Caf- ), 104.3 (G-1), 76.1 (Glc{-2), 81.7 (Glc{-3), 70.5 (Glc{-4 ), 76.3 (Glc{-5), 62.4 (Glc{-6), 103.1 (Rha{-1), 72.3 (Rha{-2), 72.1 (Rha{-3 ), 73.9 (Rha{-4), 70.7 (Rha{-5), 18.5 (Rha{-6). Meta mqabbla mad-dejta mogħtija fil-letteratura [17], il-frazzjoni I tikkorrispondi għal acteoside.

Frazzjoni II: HR-ESI-MS osservata f'm/z 623.1987 (M-H)-, kalkolat għal C29H35O15, 623.1981. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1.25 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3 ta' rhamnose), 2.78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4.33 (1H, d, J=8 Hz, H-1 tal-glukosju), 5.17 (1H, d, J { {33}} Hz, H-1 ta 'rhamnose), 6.28 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH{=CH-), 7.56 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6.5–7.0 (6H, H aromatiku). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131.5 (C-1), 117.2 (C{-2), 146.2 (C{-3), 144.7 (C{-4 ), 116.5 (C-5), 121.3 (C{-6), 72.4 (C- ), 36.7 (C- ), 127.8 (Caf{-1), 115.2 (Caf{{{89} }}), 146.8 (CAF-3), 149.7 (CAF-4), 116.6 (CAF{-5), 123.2 (CAF{-6), 169.2 (Caf- ), 115.0 (Caf- ), 147.3 (Caf- ), 104.5 (G-1), 75.5 (Glc{-2), 84.2 (Glc{-3), 70.1 (Glc{-4 ), 75.7 (Glc{-5), 64.7 (Glc{-6), 102.8 (Rha{-1), 72.4 (Rha{-2), 72.4 (Rha{-3 ), 74.1 (Rha{-4), 70.5 (Rha{-5), 17.9 (Rha{-6). Id-dejta spettrali 1 H-NMR u 13C-NMR kienu jaqblu ma 'dawk ta' isoacteoside kif irrappurtat fil-letteratura [18].

Frazzjoni III: HR-ESI-MS osservata f'm/z 6{{108}}7.2032 (M-H)-, ikkalkolat għal C29H35O14, 607.2032. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1.09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 ta 'rhamnose), 2.84 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar- CH2-), 4.37 (1H, d, J=8 Hz, H{-1 tal-glukosju), 5.19 (1H, d, J=1.5 Hz, H{ {35}} tar-ramnose), 6.27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH{=CH-), 7.59 (1H, d, J=16 Hz, Ar- CH=CH-), 6.6–7.1 (7H, H aromatiku). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 130.8 (C-1), 116.2 (C{-2), 130.9 (C{-3), 156.8 (C{-4 ), 130.8 (C{-5), 116.2 (C{-6), 72.4 (C- ), 36.4 (C- ), 127.8 (Caf{-1), 114.8 (Caf{{{88} }}), 149.8 (Caf-3), 146.9 (Caf{-4), 116.6 (Caf{-5), 123.2 (Caf{-6), 168.3 (Caf{-6), 168.3 (Caf- ), 115.4 (Caf- ), 148.0 (Caf- ), 104.3 (G-1), 76.3 (Glc{-2), 81.7 (Glc{-3), 70.4 (Glc{-4 ), 76.1 (Glc{-5), 62.5 (Glc{-6), 103.0 (Rha{-1), 72.3 (Rha{-2), 72.2 (Rha{-3 ), 73.9 (Rha{-4), 70.7 (Rha{-5), 18.4 (Rha{-6). Skont il-letteratura [18], il-frazzjoni III kienet tikkorrispondi għal syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside.

Frazzjoni IV: HR-ESI-MS osservata f'm/z 665.21{{20}} (M−H)−, ikkalkolat għal C31H37O16, 665.2087. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1.09 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3 ta 'rhamnose), 2.00 (3H, s, OAc), 2.72 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar-CH2-), 4.55 (1H, d, J=8 Hz, H-1 tal-glukosju), 4.90 (1H, d, J=1 Hz, H{-1 tar-ramnose), 6.29 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH{=CH-), 7.62 (1H, d , J=15.5 Hz, Ar-CH{=CH-), 6.5–7.0 (6H, H aromatiku). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131.9 (C-1), 117.3 (C{-2), 146.1 (C{-3), 144.7 (C{-4 ), 116.4 (C{-5), 121.4 (C{-6), 72.7 (C- ), 36.4 (C- ), 127.7 (Caf{-1), 115.4 (C{{93} }}), 146.9 (CAF-3), 149.9 (CAF-4), 116.6 (CAF{-5), 123.2 (CAF{-6), 168.1 (Caf- ), 114.7 (Caf- ), 148.2 (Caf- ), 101.8 (G-1), 75.3 (Glc{-2), 80.3 (Glc{-3), 70.8 (Glc{-4 ), 76.2 (Glc{-5), 62.3 (Glc{-6), 103.3 (Rha{-1), 72.0 (Rha{-2), 71.8 (Rha{-3 ), 73.7 (Rha{-4), 70.8 (Rha{-5), 18.5 (Rha{-6), 171.5 (C{=O), 20.9 (OAC). Id-dejta spettrali 1 H-NMR u 13C-NMR kienu jaqblu ma 'dawk ta' 2'-acetylatteoside [17].

4. Konklużjonijiet

Ġie stabbilit metodu HSCCC għas-separazzjoni preparattiva u l-purifikazzjoni ta 'acteoside, isoacteoside, syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside u 2'-acetylacteoside minn Cistanches deserticola YC Ma. L-istudju preżenti jindika li HSCCC hija teknika qawwija ħafna għas-separazzjoni preparattiva u l-purifikazzjoni ta 'komponenti bijoattivi minn materjali tal-pjanti. Ukoll, il-komposti jistgħu jiġu iżolati fuq skala kbira biżżejjed b'puritajiet għoljin u mbagħad jistgħu jintużaw bħala sustanzi ta' referenza għall-kromatografija jew studji tal-bijoattività. Il-metodu huwa teknika fattibbli, ekonomika u effiċjenti għal iżolament preparattiv rapidu ta 'prodotti naturali kkumplikati.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%