Nanoassemblies fotosensittivi favur id-droga li jħaddnu funzjoni ta’ rqad kimoterapewtiku jsaħħu l-immunoterapija tal-kanċer

Astratt

L-immunoterapija flimkien ma’ terapewtiċi effettivi bħal kimoterapija u terapija fotodinamika hija strateġija ta’ suċċess biex jiġu attivati ​​risponsi immuni kontra t-tumur għal trattament imtejjeb kontra l-kanċer. Madankollu, l-iżvilupp ta 'nano-immunostimulanti trasformati multifunzjonali bijodegradabbli, bijokompatibbli, tossiku baxx iżda effiċjenti ħafna, u klinikament disponibbli jibqa' sfida u huwa fid-domanda kbira. Hawnhekk, aħna nirrapportaw u niddisinjaw nano-prodrug foto-kemoterapewtiku ġdid mingħajr trasportatur COS-BA/Ce6 NPs billi ngħaqqdu tliet komponenti multifunzjonali aċidu betuliniku ta' molekula żgħira naturali (BA) immuntati waħedhom, oligosakkarid chitosan (COS) li jinħall fl-ilma, u klorin fotosensibilizzatur tossiku baxx e6 (Ce6) biex iżid l-effikaċja kontra t-tumur tal-immunoterapija tal-kanċer medjata kontra l-PD-L1-adjuvant immuni. Aħna nuru li n-nanodrogi ddisinjati kellhom karatteristika ta '"rqad" intelliġenti u distintiva f'effett kimoterapewtiku b'ċitotossiċità aktar baxxa mixtieqa, u karatteristiċi terapewtiċi favorevoli multipli inkluż ġenerazzjoni mtejba ta' 1 O2 indotta mid-differenza tal-enerġija mnaqqsa ta 'Ce6, rispons għall-pH, bijodegradabilità tajba, u bijokompatibilità, li tiżgura fotokimoterapija effiċjenti ħafna u sinerġistika. Barra minn hekk, meta kkombinat ma 'terapija anti-PD-L1, kemm kimoterapija bbażata fuq nano-coassembly kif ukoll kimoterapija/terapija fotodinamika (PDT) jistgħu jattivaw b'mod effettiv l-immunità antitumorali meta jittrattaw tumuri primarji jew imbiegħda, u jiftħu possibbiltajiet potenzjalment attraenti għal immunoterapija klinika.

Benefiċċji ta 'cistanche tubulosa-Antitumor

KLIEM EWLENIN

Immunoterapija tal-kanċer; Nano-immunostimulanti; Irqad kimoterapewtiku; Pro-droga; Awto-assemblaġġ; Molekula żgħira naturali; Aċidu betuliniku; Terapija fotodinamika

1. Introduzzjoni

L-immunoterapija tal-kanċer, bħall-istrateġija tal-imblokk tal-punt ta 'kontroll immuni bl-użu ta' PD-L1 jew CTLA-4 biex tiġġieled il-kanċer billi tattiva s-sistema immuni tal-ospitant, bla dubju rrivoluzzjonat it-trattament tal-kanċer1,2. Sfortunatament, ir-rispons immuni dgħajjef u l-effetti terapewtiċi ineffettivi llimitaw ħafna l-prospetti kliniċi tagħha3,4. Riċentement, studji attwali wrew li kombinazzjoni ta 'immunoterapija ma' modalitajiet oħra bħal kimoterapija5, terapija fotodinamika (PDT)6, terapija fototermali (PTT)7, u radjuterapija8, tista 'tqajjem b'mod effettiv immunoġeniċità kontra t-tumur billi tinduċi ċelluli tal-kanċer jgħaddu minn mewt taċ-ċelluli immunoġeniċi ( ICD)9, li jissuġġerixxi l-potenzjal tal-modulazzjoni immuni biex jattiva risponsi immuni kontra t-tumur. Bosta disinji innovattivi ta 'nanomaterjali bbażati fuq dawn il-kombinazzjonijiet sinerġistiċi ta' strateġiji ta 'immunoterapija kisbu attività kontra l-kanċer imtejba b'mod sinifikanti inklużi nanopartiċelli inorganiċi10, polimeri11 u bijomimetiċi12 (NPs). Madankollu, l-iżvilupp ta 'nano-immunostimulanti trasformati bijodegradabbli multifunzjonali, bijokompatibbli, tossiċità baxxa iżda effiċjenti ħafna, u klinikament disponibbli jibqa' sfida kbira u domanda kbira. Materjali bijoloġiċi naturali bħal aċidi nuklejċi13, proteini12, peptidi14,15, u prodotti naturali molekulari żgħar16,17 minħabba l-benefiċċji inerenti tagħhom (eż., bijokompatibilità, non-tossiċità) ġibdu interess sinifikanti ta 'riċerka għal applikazzjonijiet mediċi. Speċjalment f'dawn l-aħħar snin, molekuli żgħar naturali (NSMs) terpenojdi bijoattivi kontra l-kanċer li għandhom funzjoni ta 'awto-assemblaġġ ġew skoperti suċċessivament18,19. Pereżempju, l-aċidu betuliniku (BA), l-ergosterol (ET), u l-aċidu abietiku (AA) jistgħu jinġabru waħedhom f'partiċelli mikron jew nanostrutturati. Dawn l-NSMs huma elementi ta' bini attraenti biex jintużaw biex jiġu żviluppati aġenti kontra t-tumur għal kimoterapija sinerġistika u PDT. Ġie ppruvat li juru benefiċċji sinifikanti ta 'nano-fabbrikazzjoni faċli, bijokompatibilità u bijodegradabilità aħjar, tossiċità aktar baxxa b'ħsara fil-fwied imnaqqsa, u sinerġiżmu għoli fit-terapija kontra t-tumur20e23. Dan jipprovdi alternattivi promettenti għall-iżvilupp ta' nano-immunostimulanti li jistgħu jiġu tradotti klinikament disponibbli għal immunoterapija sinerġistika. Madankollu, il-lipofiliċità ġeneralment aktar b'saħħitha ta 'dawn l-NSMs wasslet għal endoċitosi ċellulari ineffiċjenti, li dgħajfet l-attività tagħhom kontra l-kanċer u llimitat il-valur kliniku tagħhom għat-trattament tal-kanċer24. Simili għan-nanokomposti rrappurtati b'mod komuni, in-nano-formulazzjonijiet NSMs korrispondenti promossi l-assorbiment ċellulari biex itejbu l-effetti kimoterapewtiċi, iżda żiedu wkoll involontarjament ir-riskju ta 'ċitotossiċità mhux speċifika għal ċelloli normali22. Għalhekk, kif timmassimizza l-effikaċja kontra l-kanċer tan-nano-aġenti terpenojdi NSM filwaqt li timminimizza t-tossiċità tagħha għal tessut normali ta 'min taħseb fil-fond dwarha bħala kwistjoni kruċjali fil-proċess ta' immunoterapija sinerġistika.

benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni

Strateġiji pro-droga ġew applikati b'mod estensiv biex itejbu l-assorbiment taċ-ċelluli ta 'molekuli żgħar lipofiliċi billi tiżdied l-idrofiliċità25. Ġeneralment, drogi anfifiliċi partikolarment ikollhom effiċjenza ogħla ta 'assorbiment ċellulari minn drogi idrofiliċi jew lipofiliċi26. Aktar ma tkun għolja l-fagoċitożi ċellulari, aħjar tkun l-effikaċja terapewtika24. Għalhekk, l-iżvilupp ta 'molekuli pro-droga ta' terpenojdi amfifiliċi NSMs jista 'jkun metodu potenzjali biex jiġu mmassimizzati l-effetti terapewtiċi tagħhom. Barra minn hekk, nanodrugs li jirrispondu għall-istimoli għall-mikroambjent speċifiku tat-tumur (eż., aċidu, rispons redox) għandhom wegħda kbira għall-kontroll tar-rilaxx tad-droga, li huwa vantaġġuż fit-trażżin taċ-ċitotossiċità tad-drogi kimoterapewtiċi27,28. Sadanittant, coassembly supramolekulari (eż., approċċ ta 'ripreċipitazzjoni) kien strateġija effettiva biex tipprepara nanodrogs ħielsa minn trasportatur solubbli ħafna fl-ilma22,29, li jista' jkun mistenni li jnaqqas xi ftit l-effiċjenza tal-fagoċitosi ta 'NSMs amfifiliċi sa ċertu punt, u b'hekk attenwaw il-pre- ċitotossiċità mfassla. Aħna nipoteżi li n-nanodrogi li jirrispondu għall-istimoli u li huma kompletament idrofiliċi ġew stabbiliti aktar ibbażati fuq NSMs amfifiliċi pro-droga u jistgħu jrażżnu b'mod effettiv iċ-ċitotossiċità mhux speċifika tiegħu għal ċelloli normali filwaqt li jistimulaw ir-rilaxx ta 'NSMs amfifiliċi tossiċi ħafna fiċ-ċelloli tat-tumur, li jiffaċilitaw ir-rqad tagħhom f'tessuti normali u attivazzjoni fis-sit tat-tumur. Huwa importanti li jintgħażel il-prekursur xieraq li jinħall fl-ilma u li jirrispondi għall-istimoli biex jimmodifika NSMs terpenojdi biex jipprepara molekuli anfifiliċi pro-droga. Għal bosta snin, chitosan oligosaccharides (COS), bħala l-prodotti degradati ta 'chitosan, mhux biss għandhom solubilità fl-ilma tajba u gruppi abbundanti eOH oreNH2 li jwasslu għal rispons tajjeb ta' pH iżda għandhom ukoll attivitajiet ta 'benefiċċju kontra t-tumur billi jtejbu l-funzjoni immuni tal-ospitanti permezz tar-regolazzjoni tal-attività. ta 'ċelluli immuni bħal makrofaġi monoċiti u limfoċiti30,31. Dawn jiggarantixxu l-possibbiltà enormi li jinbnew nano immunostimulanti fil-mira li jirrispondu għall-istimoli għal immunoterapija sinerġistika.

Hawnhekk, ibbażat fuq il-kunsiderazzjonijiet ta 'hawn fuq, fid-disinn sperimentali tagħna, NSMs pentacyclic triterpene ta' aċidu betulinic (BA) jintuża bħala aġent kontra l-kanċer qawwi32, COS ġie introdott biex jissintetizza molekula COS-BA amfifilika biex itejjeb l-effett kimoterapewtiku. Chlorin e6 (Ce6), fotosensibilizzatur użat b'mod wiesa 'b'tossiċità baxxa ħafna/mhux skur33, intuża biex jinbena prodrug fotosensittiv COS-BA/Ce6 NPs kompletament solubbli fl-ilma li juża strateġija ta' ko-assemblaġġ dirett. COS-BA/Ce6 NPs ikkombinaw żewġ modalitajiet terapewtiċi, kimoterapija u terapija fotodinamika (PDT), li jistgħu effettivament iżidu l-preżentazzjoni ta 'antiġeni derivati ​​mit-tumur għaċ-ċelluli T, li jiġġeneraw risponsi immunoloġiċi robusti bl-għajnuna ta' adjuvant immuni anti-PD-L1 biex tikkawża kimoterapija/PDT/immunoterapija kontra t-tumur effiċjenti ħafna u sinerġistiku (Skema 1). L-inġinerija COS-BA/Ce6 NPs wrew funzjoni ta 'rqad intelliġenti b'effetti ta' kimoterapija insidjużi, jiġifieri, NPs ko-assemblati mhux irradjati wrew ċitotossiċità in vitro inibita b'mod notevoli meta mqabbla ma 'COS-BA amfifiliku kemm jekk kontra l-kanċer jew ċelluli normali. Attribwita għall-imġiba distintiva li tirrispondi għall-pH, twettaq tossiċità baxxa u bijosigurtà għal tessut normali in vivo iżda hija tossika ħafna għat-tessut tat-tumur minħabba r-rilaxx stimulanti ta 'COS-BA iperattiv fil-mikroambjent tat-tumur dgħajjef aċiduż34. Sa l-aħjar għarfien tagħna, bħalissa, in-nano-drogi ddisinjati li jħaddnu din il-funzjoni ta 'rqad kimoterapewtiku għadhom rarament irrappurtati. Sadanittant, in-nanodroga għandha karatteristiċi terapewtiċi favorevoli multipli bħal ġenerazzjoni mtejba ta '1 O2 billi tnaqqas id-distakk tal-enerġija (DEST) ta' Ce6, metaboliżmu bijoloġiku rapidu, u akkumulazzjoni mtejba tat-tumur, li wassal għal kombinazzjoni effiċjenti u sigura kontra t-tumur ta 'kimoterapija u trattament PDT. Aktar importanti minn hekk, kemm is-sistemi ta 'kimoterapija bbażati fuq NP kif ukoll ta' kimoterapija/PDT jistgħu jattivaw b'mod effettiv l-immunità antitumorali billi jiffaċilitaw il-proliferazzjoni ta 'ċelluli CD8þ T li jipproduċu TNF-a u IFN-g f'tumuri primarji jew imbiegħda. Nano-droga bijodegradabbli, bijokompatibbli, rieqda unikament, bijo-sikura, u effiċjenti ħafna bijodegradabbli, bijokompatibbli, u effiċjenti ħafna tagħna tikseb reazzjonijiet terapewtiċi immuni sistemiċi sinifikanti, li tiftaħ possibbiltajiet attraenti għal applikazzjoni klinika fit-trattament ta 'terapija tal-kanċer mill-bogħod jew metastatika.

L-Iskema 1 PDT u l-kimoterapija ta' COS-BA/Ce6 NPs assemblati flimkien saħħew kontra l-PD-L1 biex jinduċu immunoterapija sistemika kontra t-tumur. L-introduzzjoni ta 'COS li jinħall fl-ilma tista' ttejjeb b'mod effettiv l-attività kimoterapewtika ta 'BA (impinġa bħala nofs xabla), li tirriżulta fi prodrug amfifiliku COS-BA iperattiv (xabla twila). Meta assemblati flimkien ma 'photosensitizer Ce6 (scabbard), in-nano-assemblaġġi strutturati bil-qoxra u sensittivi għall-pH kellhom funzjoni ta' "rqad" intelliġenti u distintiva b'tossiċità kimoterapewtika inibita għal tessuti normali. Iżda, ladarba wasal u ġie stimulat mill-mikroambjent tat-tumur aċiduż (Hþ), il-prodrug amfifiliku attiv ħafna COS-BA se jiġi rilaxxat li jirriżulta f'kimoterapija sinifikanti. Barra minn hekk, il-ko-assemblaġġi mibnija urew attività PDT eċċellenti b'ġenerazzjoni mtejba ta 'ossiġnu singlet (1 O2) indotta mid-distakk ta' enerġija mnaqqsa bejn l-istati eċċitati singlet u triplet (DEST) ta 'Ce6. Flimkien ma 'imblokk tal-punt ta' kontroll anti-PD-L1, ir-rilaxx ta 'antiġeni assoċjati mat-tumur wara trattament ta' kimoterapija/PDT jista 'jattiva b'mod effettiv rispons immuni sistemiku kontra t-tumur għal immunoterapija tal-kanċer mill-bogħod.

2. Materjali u metodi

2.1. Sinteżi ta' COS-BA

Aċidu betuliniku (40 mg, 0.1 mmol), EDC (38 mg, 0.2 mmol), u NHS (17 mg, 0.15 mmol) ) ġew maħlula fi 3 mL ta 'N, N-dimethylformamide (DMF). Wara li tħawwad f'temperatura tal-kamra għal 30 min, 96 mg ta 'soluzzjoni ta' ilma COS (1 mL) ġew miżjuda bil-mod qatra fit-taħlita u mħawwda għal 24 siegħa. Imbagħad it-taħlita ta 'reazzjoni ġiet dilwita b'CH2Cl2, u estratta ripetutament. Is-saff CH2Cl2 ġie evaporat u purifikat fuq kolonna tal-ġel tas-silika. Il-BA mhux reaġit tneħħa inizjalment bl-użu ta' etere tal-pitrolju: aċetun (5:1, v/v) bħala eluwent, u mbagħad inbidel għal 3:1 biex jagħti COS-BA abjad (rendiment: 42%), fejn COS ġie identifikat bħala dimer ( n Z 2). 1 H NMR (40{{70}} MHz, CDCl3) d: 8.98 (1H, s, BA-28 O] CeNH), 4.73 (1H, s, H -29a), 4.60 (1H, s, H-29b), 3.18 (1H, dd, JZ 4.8, 10.8 Hz, H{-3), 2.95e3.93 (8H, m, COS), 2.64 (3H, s, CH3eCOS), 0.76 (3H, s, H-24), 0.83 (3H, s, H-25), 0.90 (3H, s, H{{ {69}}), 0.97 (3H, s, H-26), 0.98 (3H, s, H-27), 1.70 (3H, s, H-30). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) d: 179.18 (CO, COS), 156.43 (C- 28), 150.97 (C{-20), 109.03 (C{-29), 78.74, 77.04 , 69.32, 69.22, 65.25, 58.14, 55.62, 55.21, 53.65, 53.22, 50.52, 45.96, 44.32,44.11, 41.85, 40.85, 40.85, 40.35, 40.52, 40.52, 45.96 04, 36.39, 35.31, 34.21, 31.81, 31.54, 31.17, 30.28 , 29.09, 27.80, 27.22, 25.74, 25.53, 20.91, 19.48, 18.12, 16.02, 15.87, 15.17, 14.65, 14.62. ESIeMS m/z: 814.5871 [M‒6H] (C44H72N2O12).

2.2. Preparazzjoni ta' COS-BA/Ce6 NPs

COS-BA/Ce6 NPs ko-assemblati ġew ippreparati b'metodu ta 'ripreċipitazzjoni ta' pass wieħed. Tipikament, 5 mL ta 'Ce6 (33 mmol/L) u 40 mL ta' COS-BA (33 mmol/L) soluzzjonijiet DMSO tħalltu l-ewwel. Sussegwentement, it-taħlita ġiet injettata malajr f'1 mL ta 'ilma li kien fih 10 mL ta' NaOH (50 mmol/L) taħt ultrasonikazzjoni (KQ-250E, ShuMei, Kunshan, iċ-Ċina). Wara l-ivvibrar għal 10 min, il-COS-BA/Ce6 NPs inkisbu permezz ta 'ċentrifugazzjoni fi 13,000 rpm (TGL-16G, Xiangyi, Changsha, iċ-Ċina) għal 25 min. Formulazzjonijiet oħra bi proporzjonijiet differenti ta 'COS-BA għal Ce6 ġew ippreparati bl-istess proċedura bi proporzjon molari kostanti ta' NaOH għal Ce6 ta '3:1.

2.3. Linji taċ-ċelluli

MCF tal-bniedem-7, HepG2, LO2, u ġrieden 4T1, linji taċ-ċelluli L929 huma pprovduti mill-Istitut tal-Bijokimika u l-Bijoloġija taċ-Ċelloli, SIBS, CAS (Ċina). MCF-7, HepG2, u LO2 ġew ikkultivati ​​f'medja DMEM b'10% serum bovin tal-fetu (FBS, Gibco) u 1% antibijotiku penicillin-streptomycin (Life Technology, USA) f'37 C. 4T1 u L929 ġew ikkultivati ​​f' RMPI-1640 medju bl-istess proporzjon bħal hawn fuq.

2.4. Studji ta 'assorbiment ċellulari u mogħdijiet endoċitiċi

Għall-investigazzjoni tat-teħid ċellulari, ċelluli 4T1 jew LO2 ġew inkubati b'NPs Ce6 jew COS-BA/Ce6 ħielsa (konċentrazzjoni ekwivalenti ta' Ce6: 1.7 mg/mL, COS-BA: 19.5 mg/mL, BA: 10 .8 mg/mL) għal diversi drabi. Wara l-ħasil, it-twaħħil, u t-tbajja’ DIPA (#D9542, Sigma), iċ-ċelluli ngħataw immaġni taħt mikroskopju fluworexxenti invertit (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Changchun, iċ-Ċina). L-intensità tal-fluworexxenza ġiet iddeterminata bl-użu taċ-ċitometrija tal-fluss bl-użu tas-sistema Guava EasyCyte mini (Merck Millipore, il-Ġermanja). Għall-kwantifikazzjoni tal-effiċjenza tal-assorbiment, l-akkumulazzjoni ċellulari ta 'BA u COS-BA ġiet imkejla bl-użu ta' HPLC (Agilent 1200, USA). Tipikament, ċelluli 4T1 ġew ittrattati b'COS-BA jew BA ħielsa (BA ekwivalenti: 25 mg/mL) għal 0.5 u 3 sigħat. Wara l-ħasil bil-PBS, il-gerbub taċ-ċelluli nħasdu u għaddew minn omoġenizzazzjoni ultrasonika (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Ningbo, iċ-Ċina) għal liżi taċ-ċelluli. Imbagħad, COS-BA jew BA ġew estratti bil-kloroform għall-analiżi HPLC wara lijofilizzar tal-kampjuni. Il-fażi mobbli kienet ilma (0.2% aċidu fosforiku) u aċetonitrile b'rata ta 'fluss ta' 1.0 mL/min, u l-proporzjonijiet tal-volum korrispondenti kienu 60:40 u 15:85 (v/v) għall-analiżi ta 'COS-BA u BA, rispettivament . Il-wavelength ta 'skoperta kien 213 nm. Għall-investigazzjoni ta' mogħdijiet endoċitiċi ta' COS-BA/Ce6 NPs, ċelluli 4T1 ġew miżrugħa fi pjanċi 6-bjar u inkubati għal 24 siegħa qabel ma ġew ittrattati minn qabel b'diversi inibitur ta' endoċitosi għal 30 min, inkluż inibitur tal-mikropinoċitosi [50 mmol/L , ethyl isopropyl amiloride (EIPA) (#N132356, Aladdin)], inibitur ta' endocytosis medjat minn clathrin [20 mmol/L, chlorpromazine (#C7010, Solarbio)], inibitur ta' endocytosis medjat minn caveolae [25 mmol/L, nystatin #IN0260, Solarbio)], u inibitur tal-aċidifikazzjoni tal-lysosome [50 mmol/L, chloroquine phosphate (#C9720, Solarbio)]35. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​aktar b'2 ​​mL ta 'COS-BA/Ce6 NPs (Ce6: 1.7 mg/mL, COS-BA: 19.5 mg/mL) għal 2 sigħat u immaġni taħt FIM (UP Optotech). Iċ-ċelloli inkubati mingħajr inibitur endoċitiku f'37 C ġew issettjati bħala kontroll u f'inkubazzjoni f'temperatura baxxa (4 C) għall-evalwazzjoni tal-endoċitożi dipendenti fuq l-enerġija. Sadanittant, l-intensità medja tal-fluworexxenza taċ-ċelloli kienet ukoll iddeterminata permezz taċ-ċitometrija tal-fluss.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Assaġġ taċ-ċitotossiċità

Iċ-ċelloli 4T1 ġew miżrugħa fi pjanċa ta' 96-bir. Imbagħad iċ-ċelloli ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet ta 'COS-BA NPs għal 24 siegħa. Wara, 10 mL ta 'żebgħa MTT (#M158055, Aladdin) (5 mg/mL) ġie miżjud mal-bir u inkubati għal 4 sigħat addizzjonali, u mbagħad ġew miżjuda 150 mL ta' DMSO biex jinħall il-kristalli tal-formazan . L-assorbiment ta 'kull bir f'492 nm ġiet irreġistrata minn microplate reader. Għall-grupp ta 'irradjazzjoni, iċ-ċelluli ġew ittrattati b'mediċini għal 4 sigħat, imbagħad irradjati għal 10 min b'dawl 675  10 nm u inkubati għal 20 siegħa addizzjonali. Iċ-ċitotossiċità ta' COS-BA/Ce6 NPs (1 mg/mL ta' Ce6 jikkorrispondi għal 11.5 mg/mL COS-BA u 6.4 mg/mL BA) kontra ċelloli oħra (MCF-7, HepG2, LO2, u L929) ġew determinati wkoll bl-istess assaġġ MTT biss b'mezz differenti. Sadanittant, l-indiċi tal-kombinazzjoni ġie kkalkulat mis-software CompuSyn 2.0 bl-użu tal-kalkolu tat-teorema Chou Talalay36.

2.6. Mudelli tal-annimali

Il-proċeduri sperimentali kollha ġew esegwiti skont il-protokolli approvati mill-Kumitat għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Università Medika ta 'Harbin. Ċelloli 4T1 ġew sospiżi f'medja RMPI-1640 u injettati taħt il-ġilda fuq in-naħa tal-lemin ta' kull ġurdien BALB/c femminili (18e22 g, 6e7 ġimgħat).

2.7. Immaġini ta' fluworexxenza in/ex vivo

200 mL ta 'soluzzjoni ta' glucose 5% COS-BA/Ce6 NPs (ekwivalenti Ce6: 0.35 mg/mL, COS-BA: 4.02 mg/mL) ġiet injettata mill-vina tad-denb fil-ġrieden li jġorru t-tumur. Wara dan, l-immaġini tal-fluworexxenza ta 'siti tat-tumur f'ħin predeterminat twettqet bl-użu ta' sistema ta 'immaġni ta' annimali in vivo multi-mudell AniView 100/600 (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China) bl-eċitazzjoni f'630 nm. Wara 24 siegħa wara l-injezzjoni, l-organi ewlenin (qalb, fwied, milsa, pulmun u kliewi) u tumur inġabru għal immaġini ta 'fluworexxenza ex vivo. Barra minn hekk, l-immaġini tal-fluworexxenza ex vivo ta 'tumuri u organi maġġuri f'ħinijiet differenti wara injezzjonijiet iv ta' Ce6 jew COS-BA/Ce6 NPs ġew evalwati wkoll.

2.8. Kimoterapija/PDT in vivo

4T1-ġrieden li jġorru (75e100 mm3 ) huma maqsuma b'mod każwali f'sitt gruppi (n Z 5): 1) 5% soluzzjoni tal-glukożju; 2) Ce6; 3) Ce6 bl-irradjazzjoni; 4) COS-BA (40.2 mg/kg, fejn BA: 22.3 mg/kg); 5) COS-BA/Ce6 NPs; 6) COS-BA/Ce6 NPs b'irradjazzjoni. Għal kull grupp, il-ġrieden jiġu injettati b'200 mL ta' COS-BA/Ce6 NPs (ekwivalenti Ce6: 3.5 mg/kg tal-ġisem) mill-vina tad-denb fil-Jiem 0, 2, u 4. Għall-gruppi ta' irradjazzjoni, f'4 sigħat. wara l-injezzjoni wara kull amministrazzjoni, il-ġrieden kollha ġew anestetizzati b'isoflurane, u s-siti tat-tumur ġew irradjati b'675  10 nm (150 mW/cm2) dawl għal 15-il minuta. Il-volumi tat-tumur u l-piżijiet tal-ġisem tal-ġrieden jiġu rreġistrati kull jum ieħor ukoll. Il-volumi tat-tumur huma kkalkulati bil-formula: VZ wisa'2 tul/2. Wara 14-il jum ta 'trattament, it-tumuri tneħħew u peżati biex jiġi kkalkulat il-proporzjon ta' inibizzjoni tat-tumur (TIR) ​​bl-ekwazzjoni użata b'mod komuni: TIRZ (kampjun 1/kontroll) 100%. Fejn il-kampjun u l-kontroll kienu l-piż medju tat-tumur ta 'kull grupp ittrattat u grupp ta' soluzzjoni akwea ta 'glukożju ta' 5%, rispettivament.

2.9. Kimoterapija/PDT/immunoterapija in vivo

Biex jintwera l-potenzjal ta 'COS-BA/Ce6 NPs flimkien ma' immunoterapija, il-mudell tat-tumur bilaterali kien iddisinjat permezz ta 'injezzjoni taħt il-ġilda ta' ċelluli 4T1 fil-ġnub tax-xellug u tal-lemin. Meta t-tumuri resqu lejn 75e100 mm3, il-ġrieden ġew maqsuma f'ħames gruppi. (1) Kontroll; (2) COS-BA/ Ce6 NPs (COS-BA Z 40.2 mg/kg, fejn BA Z 22.3 mg/kg); (3) COS-BA/Ce6 NPs þ dawl; (4) COS-BA/Ce6 NPs þ anti-PDL1; (5) COS-BA/Ce6 NPs þ anti-PD-L1 þ dawl. F'Jum 0, 200 mL ta 'soluzzjoni ta' 5% glukożju (Grupp 1) jew COS-BA/Ce6 NPs (Ce6 Z 3.5 mg/kg) (Grupp 2, 3, 4, 5) ġew injettati iv fil-ġrieden. Wara 4 sigħat wara l-injezzjoni, it-tumuri tal-lemin tal-Gruppi 3 u 4 ġew irradjati għal 15-il minuta. Il-ġrieden ġew anestetizzati bl-isoflurane u rrumblati fuq naħa waħda biex jevitaw li jesponu t-tumuri tax-xellug. Imbagħad antikorp anti-PD-L1 (BioXcell, numru tal-prodott: BE0101, numru tal-klonu: 10F.9G2) ġie injettat iv fil-ġrieden għall-Gruppi 4 u 5 fil-Jiem 2, 4, u 6 (15 mg għal kull ġurdien għal kull injezzjoni). It-tul u l-wisa 'ta' kull tumur ġew immonitorjati kull jum ieħor. Wara 14-il jum ta' kura, is-serum tad-demm tal-ġrieden inġabar biex jevalwa l-interferon-gamma (IFN-g) (#KMC4021) u l-fattur tan-nekrożi tat-tumur (TNF-a) (#BMS607-3) bl-użu ta' analiżi ELISA (eBioscience ). It-tumuri ġew miġbura, dissoċjati, ittrattati b'buffer tal-liżi taċ-ċelluli ħomor tad-demm, u maħsula b'PBS permezz ta 'ċentrifugazzjoni. Imbagħad, is-sospensjoni taċ-ċelluli kienet imtebba’ b’anti-CD3-FITC (#MA{1-10187, klonu 145-2C11, eBioscience) u anti-CD8a-PE (#{12-0081-85, klonu 53-6.7, eBioscience). Wara, l-infiltrazzjoni tal-limfoċiti T ċitotossiċi (CTL) fit-tumuri tal-lemin u tax-xellug wara trattamenti differenti ġew evalwati permezz ta 'ċitometrija tal-fluss.

3. Riżultati u diskussjoni

3.1. Sinteżi, fabbrikazzjoni, u karatterizzazzjoni ta 'COS-BA/ Ce6 NPs

F'dan l-istudju, aħna nfasslu molekula żgħira ġdida ta 'prodrug COS-BA ibbażata fuq oligosaccharide ta' chitosan solubbli fl-ilma (COS), li tista 'tgħolli l-attività kimoterapewtika ta' pentacyclic triterpene betulinic acid (BA) billi ttejjeb l-assorbiment taċ-ċelluli billi tiżdied l-idrofiliċità. Il-COS (grad ta' polimerizzazzjoni, DP: 2e6) użat hawn ġie ppreparat bil-metodu deskritt qabel tagħna30. Imbagħad, il-COS-BA ġie sintetizzat permezz ta 'reazzjoni ta' kondensazzjoni ta 'deidrazzjoni. Flimkien ma 'l-analiżi tal-komponenti prinċipali ta' COS, l-istruttura kimika ta 'COS-BA kienet maħsuba li hija disaccharide (DP: 2) modifikat BA (Tagħrif ta' Appoġġ Fig. S1), li kien ikkonfermat minn 1 H NMR, 13C NMR, u ESIeMS (Tagħrif ta' Appoġġ Fig. S2eS4). Analiżi tar-rappreżentant 1 H NMR wriet is-sinjal distint tal-proton ta 'COS madwar 2.64e3.93 ppm u C] CH2 peaks (4.60, 4.73 ppm) ta' BA, li juri s-sinteżi ta 'suċċess ta' COS-BA (Fig. 1A). Għall-preparazzjoni tar-reaġent antitumorali sinerġistiku koassemblat COS-BA/Ce6 NPs, intuża approċċ versatili ta 'preċipitazzjoni mill-ġdid billi kkoopera ma' fotosensitizer Ce6 effiċjenti ħafna. Billi tbiddel il-proporzjonijiet molari inizjali, iż-żewġ formulazzjonijiet ta 'ko-assemblaġġ COS-BA/Ce6 jistgħu jiffurmaw nanostrutturi sferiċi b'daqsijiet modulati (Fig. 1B u Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S5). Madwar proporzjonijiet ta 'input differenti ta' COS-BA/Ce6, id-dijametri idrofiliċi ta 'COS-BA/Ce6 NPs kienu qrib 200e300 nm b'potenzjal z negattiv. Meta wieħed iqis li NPs ippreparati f'formulazzjoni ta '8: 1 wrew indiċi ta' polidispersità aktar baxx (PDI, 0.143) b'daqs relattivament iżgħar (249 nm), kien meħtieġ ukoll ammont suffiċjenti ta 'aġent kimoterapewtiku COS-BA għat-trattament kombinatorju. Għalhekk, għażilna l-formulazzjonijiet ta 'COS-BA/Ce6 (8:1) għall-istudju li ġej. Taħt din l-ottimizzazzjoni, COS-BA/Ce6 NPs esibiti distribuzzjonijiet ta 'daqs dojoq (Fig. 1C) u solubilità tajba fl-ilma, li jindika n-natura kollojdali tiegħu (Fig. 1D). Biex tesplora r-raġunijiet wara dan il-ko-assemblaġġ ta 'suċċess, l-imġieba primarja ta' awto-assemblaġġ ta 'COS-BA ħielsa ġiet investigata bl-użu tal-mikroskopija elettronika tal-iskannjar (SEM) (Fig. 1E), li ssuġġeriet li COS-BA jista' jifforma nano- uniformi ħafna. sfera ta 'w168 nm, li timplika li l-modifika kimika ta' COS ma tbiddilx l-abbiltà ta 'awto-assemblaġġ ta' BA innifsu (Informazzjoni ta 'Appoġġ Fig. S6). Hija dik il-proprjetà li eventwalment tinduċi l-kostruzzjoni b'suċċess tal-ko-assemblaġġi. Notevolment, apparti min-nanostruttura solida kkonfermata mill-mikroskopija elettronika tat-trażmissjoni (TEM), COS-BA/ Ce6 NPs wrew struttura distinta tal-qoxra ħielsa COS-BA NPs, u l-ħxuna medja tal-qoxra kienet ta 'madwar 2.35 nm. Il-karatterizzazzjoni fiżjokimika l-oħra hija miġbura fil-qosor fil-Fig. 1F. Barra minn hekk, COS-BA/Ce6 NPs wrew z-potenzjal negattiv ta '5.38 mV u daqs idrodinamiku ta' w249 nm, ogħla minn dak miksub minn SEM (w182 nm). Fl-istess ħin, l-effiċjenzi tat-tagħbija u l-inkapsulament Ce6 kienu ta '8.1 u 96%, rispettivament, kif determinat minn kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja (HPLC). Ukoll, id-dejta FT-IR (Fig. 1G) ikkonfermat aktar dan il-ko-assemblaġġ minħabba li COS-BA/Ce6 NPs urew il-karatteristiċi C] N, CeN, u C] CH peaks ta 'Ce6 li jidhru f'1633, 1078, u 633 cm 1 , rispettivament.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

3.2. Mekkaniżmu ko-immuntat u l-formazzjoni tal-istruttura tal-qoxra

Sussegwentement, biex nifhmu aħjar il-mekkaniżmu ta 'ko-assemblaġġ, l-ewwel investigajna l-proċess ta' formazzjoni primarja ta 'NPs. Sibna li l-ko-assemblaġġ ta 'COS-BA ma' Ce6 jista 'jkun spontanju minħabba li dawn iż-żewġ speċi jistgħu wkoll jiffurmaw nanostruttura sferika anki jekk mingħajr ivvibrar (Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S7), li jista 'jkun minħabba l-bidla negattiva ta' enerġija ħielsa Gibbs (DG ) f’ko-assemblaġġi37. Din l-assemblaġġ spontanju ssuġġeriet ukoll interazzjoni intermolekulari aktar b'saħħitha bejn COS-BA u Ce6. Ġeneralment, l-interazzjonijiet intermolekulari f'assemblaġġi supramolekulari awto (jew ko-) huma p‒p-stacking mhux kovalenti, rbit ta 'l-idroġenu, u forzi ta' van der Waals 38,39. Għal din l-analiżi, aħna mbagħad investigajna l-assorbiment tal-UV ta 'COS-BA/Ce6 NPs (Fig. 1H u F), li ssuġġerixxa meded ta' Soret (41 0 nm) u Qy (667 nm) imqassma fl-aħmar meta mqabbla ma ' Ce6 ħieles (405 u 665 nm, rispettivament). Sadanittant, jista 'jinstab ukoll l-assorbiment karatteristika sinifikanti ta' COS-BA, li jindika pp intermolekulari possibbli stivar bejn COS-BA u Ce640. Barra minn hekk, wara l-inkubazzjoni bis-surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS, 0.2% w/v) (Informazzjoni ta 'Appoġġ Fig. S8), COS-BA/Ce6 NPs wrew faxxa Qy li għadha kif ġiet blu-shifted f'641 nm u rkuprat b'mod drammatiku fluworexxenza, li juri li l-interazzjonijiet idrofobiċi kkontribwew ukoll għall-ko-assemblaġġ28. Peress li dawn l-interazzjonijiet assoċjati mhux kovalenti, ko-assemblaġġi wrew fluworexxenza notevoli quenching (98.2%) fl-ilma (Fig. 1I). B'mod kollettiv, huwa raġonevoli li wieħed jemmen li p‒p stivar u interazzjonijiet idrofobiċi jistgħu jkunu l-forzi ewlenin li jmexxu għall-kostruzzjoni ta 'ko-assemblaġġi. Wara, biex ikomplu Ħares il-proċess ta 'assemblaġġ b'mod aktar intuwittiv u jiżvelaw ir-raġunijiet sottostanti għaliex NPs strutturati bil-qoxra jistgħu jiffurmaw, wettaqna mudell ta' simulazzjoni ta 'dinamika molekulari simplifikata (MD) li fih 16-il molekula COS-BA ottimizzata u żewġ Ce6 addizzjonali f'kaxxa ta' l-ilma. . Inizjalment, aħna evalwaw l-interazzjoni / rbit possibbli ta 'l-awto-assemblaġġi COS-BA fi żmien 5 ns ta' ħin ta 'simulazzjoni (Fig. 2A u Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S9). Sibna li, ħlief għal bosta bonds ta 'idroġenu intramolekulari fil-frazzjoni COS, setgħu wkoll jiġu osservati diversi pari ta' H-bonds intermolekulari bejn COS-BA (Fig. 2B u Informazzjoni ta 'Appoġġ Fig. S10), li indika li t-twaħħil ta' l-idroġenu jista 'jkun wieħed. tal-forzi ewlenin li jmexxu għall-formazzjoni ta’ NPs COS-BA. Partikolarment interessanti, fl-awto-assemblaġġi COS-BA, il-molekuli kollha COS-BA jiffurmaw struttura apparentement simmetrika (Fig. 2C). Dan il-fenomenu affaxxinanti mmotivana biex nesploraw ir-relazzjoni possibbli bejn din il-proprjetà u l-formazzjoni ta 'NPs COSBA strutturati bil-qoxra. Imbagħad, ippruvajna nespandu l-unitajiet tal-kaxxa. B'mod sorprendenti, il-kaxxi konnessi li jikkonsistu minn molekuli COS-BA kienu rranġati b'mod regolari li jirriżulta fi strutturi ta 'netwerk vojta "ortogonali" (Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S11). Aktar importanti minn hekk, aħna ikkalkula b'mod każwali l-ħxuna tal-molekuli tal-qoxra u sibna li kienu konsistenti mat-TEM (w2.35 nm) (Fig. 2D). Din it-tendenza li jiffurmaw strutturi tan-netwerk vojta tista 'tkun responsabbli għall-formazzjoni ta' NPs strutturati bil-qoxra. Biex tiġi ttestjata din l-idea, l-istruttura MD tal-ko-assemblaġġi COS-BA / Ce6 ġiet simulata (Fig. 2E u Informazzjoni ta 'Appoġġ Fig. S12). Simili għal awto-assemblaġġi COS-BA, numru kbir ta 'bonds H intramolekulari u intermolekulari nstabu wkoll fil-ko-assemblaġġi (Fig. 2F u Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S13). Barra minn hekk, il-pp stacking possibbli bejn C] C ta 'COS-BA u ċ-ċirku aromatiku ta' Ce6 ġie osservat fil-ko-assemblaġġi (Fig. 2G), li huwa konsistenti mad-dejta minn investigazzjonijiet UV preċedenti. Wara li testendi n-numru ta 'kaxxi, xorta jistgħu jinstabu strutturi simili ta' netwerk vojta, biss b'regolarità u ortogonalità mnaqqsa (Informazzjoni ta 'Appoġġ Fig. S14). Din tista' tkun ir-raġuni possibbli għall-morfoloġija mhux uniformi ta' COS-BA/Ce6 NPs meta mqabbla ma' COSBA NPs. Barra minn hekk, id-distanza molekulari tas-saff tal-qoxra hija wkoll qrib il-ħxuna tal-qoxra (w2.35 nm) ta 'NPs kif jidher bl-użu tat-TEM (Fig. 2H). B'mod kollettiv, spekulajna li l-formazzjoni ta ' COS-BA/Ce6 NPs jew COS-BA NPs strutturati bil-qoxra jistgħu fil-biċċa l-kbira jkunu attribwibbli għal din it-tendenza tal-molekuli li jinġabru fi strutturi tan-netwerk tal-qoxra vojta.

Figura 1 Fabbrikazzjoni u karatterizzazzjoni ta 'chitosan oligosaccharides modifikat aċidu betuliniku (COS-BA) nano-assemblaġġi medjati mill-prodrug COS-BA/Ce6 NPs. (A) Il-pożizzjonijiet ewlenin amplifikati ta '1 H NMR ta' COS-BA. (B) Preparazzjoni ta 'ko-assemblati COS-BA/Ce6 NPs b'diversi proporzjonijiet COS-BA/Ce6. (C) Distribuzzjoni tad-daqs ta 'COS-BA/Ce6 NPs bl-użu ta' COS-BA u Ce6 (proporzjon molari, 8:1) bħala blokki tal-bini. (D) Is-solubilità fl-ilma u l-effett Tyndall tal-ko-assemblaġġi, jindikaw natura kollojdali. (E) Immaġini SEM u TEM ta 'awto-assemblaġġi COS-BA ħielsa u COS-BA/Ce6 NPs ko-assemblati. (F) Sommarju tal-proprjetajiet fiżjokimiċi ta 'COS-BA/Ce6 NPs. (G) spettri FT-IR, (H) spettri UV Vis, u (I) spettri ta 'emissjoni fluworexxenti ta' Ce6 ħielsa, COS-BA, u COS-BA/Ce6 NPs ko-assemblati fl-ilma.

Figura 2 Strutturi ta ' (A) COS-BA awto-assemblaġġi u (E) ko-assemblati COS-BA/Ce6 NPs wara simulazzjoni ta' dinamika molekulari (MD) għal 5 ns bi proporzjon molari ta 'unità strutturali ta' 8:1 (COS-BA) /Ce6, ikkalkulat ibbażat fuq l-effiċjenza tat-tagħbija Ce6). Il-mudell tal-linja intuża għall-H2O u l-mudelli tal-stick jirrappreżentaw molekuli COS-BA jew Ce6, fejn l-atomi C ta 'Ce6 huma ttikkettjati bil-vjola. L-informazzjoni dwar ir-rabta tal-idroġenu bejn il-molekuli COS-BA f'(B) l-awto-assemblaġġi tagħha u (F) il-ko-assemblaġġi COS-BA/Ce6 NPs. (C) L-istruttura apparentement simmetrika tal-arranġament molekulari COS-BA wara simulazzjoni MD. (G) Interazzjonijiet molekulari possibbli bejn COS-BA u Ce6 juru stivar ta 'pp potenzjali. Il-ħxuna indikata tal-molekuli tal-qoxra fi struttura ta 'netwerk vojta "ortogonali" wara li testendi kaxxi MD korrispondenti ta' (D) awto-assemblaġġi COSBA ħielsa u (H) ko-assemblaġġi COS-BA/Ce6 NPs.

3.3. Mekkaniżmu ta 'enerġija ta' ġenerazzjoni mtejba ta '1 O2

Sussegwentement, eżaminajna aktar il-ġenerazzjoni tal-ossiġnu singlet (1 O2), waħda mill-ispeċijiet kritiċi tal-ossiġnu reattiv (ROS) tal-prestazzjoni tal-PDT billi tuża DPBF (1,3-diphenylisobenzofuran) bħala sonda. Wara irradjazzjoni sostnuta tas-soluzzjonijiet ta 'taħlita ta' COS-BA / Ce6 NPs b'DPBF, l-assorbiment UV ta 'DPBF naqas fl-intensità, li jindika ġenerazzjoni 1 O2 (Fig. 3A). Wara t-tqabbil mar-referenza tal-methylene blue (MB), l-F ( 1 O2) ta 'COS-BA/ Ce6 NPs ġie kkalkulat bħala 0.26, kemmxejn ogħla minn Ce6 ħieles (FZ0.19) (Fig. 3B). Ġeneralment, l-enerġija assorbita minn fotosensittivi se tgħaddi minn tliet mogħdijiet ta 'rilassament li jinvolvu fluworexxenza, effett ta' tisħin permezz ta 'rilassament vibrazzjonali, u ġenerazzjoni ta' ROS permezz ta 'qsim intersistema (ISC)41. B'mod konsistenti mal-emissjoni tal-fluworexxenza mkessħa b'mod sinifikanti, COS-BA/ Ce6 NPs ukoll ma ppromwoviet l-ebda effett ta 'tisħin fl-ilma (Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S15), li implika proċess ISC imtejjeb wara ko-assemblaġġ ta 'Ce6 ma' COS-BA, u b'hekk iwassal. għall-ġenerazzjoni mtejba 1 O2. Biex niċċaraw aktar il-mekkaniżmu molekulari ta 'tali effett, ippruvajna nottimizzaw u nikkalkulaw il-mudell ta' molekula waħda possibbli ta 'COS-BA/Ce6 li jikkonsisti f'stivar ta' pp potenzjali miksub minn simulazzjoni MD permezz tat-teorija funzjonali tad-densità (DFT) (Fig. 3C) . B'mod tal-għaġeb, COS-BA/Ce6 wera assorbiment ta 'UV ta' 581.24 nm osservabbli b'ċaqliq aħmar minn dak ta 'Ce6 ħieles (579.30 nm), li jindika l-okkorrenza ta' pp stacking (Fig. 3D). Għalkemm il-ġeometrija minimizzata ta 'enerġija ta' COS-BA/Ce6 wriet differenzi strutturali ħfief b'konfigurazzjoni MD imdaħħla, il-pstacking distintiv bejn bonds C] C jew C] O ta 'COS-BA maċ-ċirku porphine ta' Ce6 kien għadu osservabbli, u vvalida aktar li l- hawn fuq p‒p stivar huwa possibbli. Sadanittant, reċentement intwera li ż-żieda fl-effiċjenza tad-donazzjoni tal-elettroni permezz ta 'stacking p‒p tista' tiffaċilita l-proċess ISC42, filwaqt li r-rata ISC (KISC) hija proporzjonali għal (1/DEST) 2,43. Jiġifieri, id-distakk ta 'enerġija aktar baxx (DEST) ta' fotosensibilizzatur se jsaħħaħ il-proċess ISC li jippromwovi ġenerazzjoni effiċjenti ta 'ROS. Aħna sussegwentement nikkalkulaw l-istat singlet aktar baxx eċċitati (S1) u l-istat triplet (T1) ta 'Ce6 u COS-BA/Ce6 (Fig. 3E), rispettivament. Ir-riżultati indikaw li COS-BA/Ce6 wera DEST imnaqqas ta '1.1892 eV meta mqabbel ma' Ce6 ħieles (1.2001 eV), li jikkonferma l-proċess ISC imtejjeb. It-tnaqqis ta' DEST huwa ta' għajnuna għall-produzzjoni ta' 1 O2, li ġiet ivverifikata wkoll f'nanofotosensibilizzaturi oħra44. Meħuda flimkien, il-p-stacking jidher li jnaqqas id-DEST ta 'Ce6 wara l-ko-assemblaġġ ma' COS-BA, u b'hekk iwassal għal ġenerazzjoni mtejba ta '1 O2.

Figura 3 Mekkaniżmu ta' enerġija ta' ġenerazzjoni mtejba ta' 1 O2 indotta minn NPs COS-BA/Ce6. (A) Spettri UV Vis ta 'fotodekompożizzjoni ta' 1,3-diphenylisobenzofuran (DPBF) wara irradjazzjoni fit-tul ta 'COS-BA/Ce6 NPs. (B) Fil-plots ta 'l-ewwel ordni ta' bidliet ta 'assorbiment UV DPBF (DOD), ir-rendiment ta' 1 O2 ġie evalwat bl-użu ta 'methylene blue (MB) (FZ 0.52) f'DMSO bħala l-kompost ta' referenza. (C) Strutturi mnaqqsa bl-enerġija ta 'mudell COS-BA/Ce6 ta' molekula waħda possibbli meqjusa mill-ġenb u minn quddiem, li nkiseb skont il-konfigurazzjoni molekulari inizjali bejn Ce6 b'COS-BA wara simulazzjoni MD u wara kalkoli DFT. (D) Transizzjonijiet ta' spettri ta' assorbiment UV Vis imbassra (vireg vertikali) ta 'Ce6 ħieles u mudell COS-BA/Ce6 ottimizzat. (E) Il-livelli tal-enerġija kkalkulati tal-istat singlet eċċitat l-aktar baxx tagħhom (S1) u l-istat triplet l-aktar baxx (T1), rispettivament, [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Fejn DEST ġie kkalkulat bħala ES1 ET1.

3.4. Karatteristiċi ta' rqad tal-kimoterapija

Wara, biex jiġi vvalidat il-kunċett tad-disinn fl-istudju preżenti li l-iżvilupp tal-molekula COS-BA anfifilika jista 'jżid b'mod effettiv l-effett terapewtiku ta' BA billi jtejjeb l-assorbiment taċ-ċelluli permezz ta 'żieda fl-idrofiliċità, u sadanittant ikompli jibni COS-BA/Ce6 li jirrispondu għall-istimoli u kompletament idrofiliku. L-NPs iffaċilitaw ir-rqad tiegħu fit-tessuti normali u l-attivazzjoni fis-siti tat-tumur. Biex tittestja din l-ipoteżi, l-ewwel investigajna l-imġieba tar-rilaxx tad-droga ta 'COS-BA/Ce6 NPs f'diversi soluzzjonijiet buffer (Fig. 4A). Ir-riżultati indikaw li COS-BA/Ce6 NPs wrew imġieba li tirrispondi għall-pH b'rilaxx ta 'Ce6 kumulattiv ta' 88% f'pH 5.6 u 57% f'pH 7.4 wara 24 siegħa, rispettivament. Din il-karatteristika x'aktarx qamet mill-qerda ta 'bonds ta' idroġenu numerużi li kienu jeżistu f'COS-BA/Ce6 NPs wara l-introduzzjoni ta 'Hþ45 aċiduż, u b'hekk wassal għal żieda fir-rilaxx ta' Ce6 (Fig. 4B). Dan kien ikkonfermat aktar biż-żarmar ta 'COS-BA/Ce6 NPs wara inkubazzjoni f'ambjenti aċidużi direttament (Fig. 4C). Din il-karatteristika li tirrispondi għall-pH tista 'tkun ta' benefiċċju għal terapija effettiva kontra t-tumur minħabba l-mikroambjent tat-tumur dgħajjef aċiduż34. Sadanittant, COS-BA/Ce6 NPs kellhom stabbiltà aħjar minħabba li l-ebda tibdil sinifikanti fid-daqs jew fil-PDI ma setgħu jiġu osservati wara l-inkubazzjoni fil-PBS u 1640-RMPI medju tal-kultura taċ-ċelluli għal 10 ijiem (Tagħrif ta’ Appoġġ Fig. S16), li jkun importanti għall-użu potenzjali tagħhom għal aktar applikazzjonijiet bijomediċi. Sussegwentement, twettqu aktar investigazzjonijiet billi evalwaw iċ-ċitotossiċità ta 'BA lipofiliku ħieles (angolu ta' kuntatt q: 133.3) u COS-BA amfifiliku (q: 52) (Fig. 4D) b'assaġġi standard ta 'methyl thiazolyl-diphenyl tetrazolium bromide (MTT). Kif imbassar, jew għal ċelluli tal-kanċer 4T1 jew epatoċiti LO2 normali, COS individwali essenzjalment m'għandu l-ebda attività kontra l-kanċer f'dożi relattivament baxxi. Dan jista' jkun minħabba l-effetti ta' kontra l-proliferazzjoni ta' COS li jiġu attivati ​​permezz ta' mogħdija ta' sinjalazzjoni NF-kB li tinduċi biss f'konċentrazzjonijiet għoljin (bejn wieħed u ieħor f'livell ta' milligramma)30. Billi, COS-BA twettaq ċitotossiċità mtejba b'mod notevoli b'valuri IC50 estremament baxxi (6.03 mg/mL għal 4T1 u 9.92 mg/mL għal LO2) meta mqabbla ma' dawk ta' BA (17.63 mg/mL għal 4T1 u 20.53 mg/mL għal LO2) anki fl-istess konċentrazzjonijiet tal-massa (Fig. 4E u J). Ir-riżultati suscitati implikaw li l-modifika ta 'COS solubbli fl-ilma ttejjeb ħafna l-effiċjenza ta' teħid ċellulari ta 'BA lipofiliku, u b'hekk iwassal għall-attività qawwija kontra l-kanċer ta' COS-BA. Biex tikkwantifika l-effiċjenza tat-teħid, l-akkumulazzjoni ta 'BA jew COS-BA fi ħdan ċelluli 4T1 kienet iddeterminata direttament mill-HPLC (Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S17). Ir-riżultati appoġġaw b'mod ċar li COS-BA amfifiliku juri assorbiment sinifikament ogħla minn BA ħieles (madwar 3.6-darbiet wara 3 sigħat ta 'inkubazzjoni), li juri l-attività kimoterapewtika msaħħa ta' COS-BA. Il-konklużjoni ta 'hawn fuq kienet appoġġjata aktar miċ-ċitotossiċità mtejba b'mod sinifikanti ta' COSBA amfifiliċi kontra ċelluli tal-kanċer HepG2 u MCF-7 (Informazzjoni ta 'Appoġġ Fig. S18), li huma konsistenti sew mal-kunċett tad-disinn. Wara l-ko-assemblaġġ ma 'Ce6, sibna li COS-BA/Ce6 NPs mingħajr irradjazzjoni juru ċitotossiċità inibita b'mod notevoli kontra ċelluli tal-kanċer 4T1 meta mqabbla mal-COS-BA ekwivalenti, speċjalment f'11.5 mg/mL, iżda l-attività bażika tal-PDT ma kinitx affettwata ( Fig. 4F). Biex nivvalidaw dan il-fenomenu b'mod aktar sħiħ, investigajna aktar iċ-ċitotossiċità in vitro ta' COS-BA/Ce6 NPs kontra ċelloli oħra tal-kanċer inklużi MCF-7 u HepG2. Interessanti, amphiphilic COS-BA wera ċitotossiċità aktar b'saħħitha ħafna kontra ċelluli MCF -7 (Fig. 4G), iżda l-attività kimoterapewtika naqset b'mod sinifikanti wara ko-assemblaġġ ma 'Ce6, jiġifieri, nonirradiated COS-BA/Ce6 NPs. Riżultati simili ġew osservati wkoll fiċ-ċelloli HepG2 biss bi tnaqqis żgħir (Fig. 4H). Biex tkompli tappoġġja l-konklużjonijiet ta 'hawn fuq, aħna evalwaw ukoll l-effetti kimoterapewtiċi ta' nano-assemblaġġi u COS-BA kontra ċelluli normali tal-fibroblast tal-ġrieden L929 u epatoċiti LO2 umani (Fig. 4I). Ir-riżultati indikaw li l-COS-BA/Ce6 NPs immuntati naqqsu b'mod sinifikanti l-mediċina anfifilika oriġinali tossika ħafna COS-BA, u wrew bijokompatibilità eċċellenti. Billi janalizzaw iċ-ċitotossiċità, il-valuri IC50 tal-COS-BA amphiphilic kienu sinifikament aktar baxxi minn dak tal-COS-BA/Ce6 NPs ko-assemblati irrispettivament mill-kanċer jew ċelluli normali (Fig. 4J). Jiġifieri, il-bini ta 'nano coasemblies kompletament idrofiliċi u li jirrispondu għall-istimoli jista' effettivament jrażżan iċ-ċitotossiċità għolja tad-droga amfifilika COS-BA minn qabel. Meta wieħed iqis il-karatteristika distintiva li tirrispondi għall-pH, jidher li COS-BA/Ce6 NPs se jkunu rieqda f'tessuti normali b'tossiċità baxxa mixtieqa tal-kimoterapija, iżda attivi fit-tessuti tat-tumur minħabba r-rilaxx stimulanti tagħhom ta 'COS-BA tossiku ħafna fit-tumur aċiduż dgħajjef. mikroambjent. Meħuda flimkien, kuntrarjament għan-neofunzjonalizzazzjoni irrappurtata b'mod wiesa 'ta' reaġenti kimoterapewtiċi li tejbu l-attività kontra l-kanċer22,23, nano-assemblaġġi medjati minn COS-BA amfifiliċi mhux biss juru karatteristika ta '"rqad" intelliġenti b'effetti ta' kimoterapija insidjużi iżda jżommu wkoll attività PDT speċjalizzata, li juru potenzjal enormi. għal terapija intelliġenti kontra t-tumur.

Figura 4 (A) Profili ta' rilaxx ta' Ce6 in vitro minn NPs COS-BA/Ce6 f'PBS (pH 7.4, 6.5 jew 5.6) li fihom Tween 80 (0.5%, v/v) fi 37 C. (B) Il-mekkaniżmu possibbli li jirrispondu għall-pH li Hþ iqanqal iż-żarmar ta 'NPs. (C) Iż-żarmar ta 'COS-BA/Ce6 NPs wara inkubazzjoni diretta f'madwar pH 4.0 ilma. (D) L-angolu ta 'kuntatt ta' BA ħielsa, Ce6, COS-BA, u COS-BA/Ce6 NPs, rispettivament. (E) Ċitotossiċità taċ-ċelluli ta 'BA ħielsa, COS, u COS-BA amfifiliċi kontra kanċer rappreżentattiv 4T1 u ċelluli LO2 normali. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ta' (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) ċelluli tal-kanċer HepG2 wara li ġew inkubati b'COS-BA ħielsa, COS-BA/Ce6 NPs bi/mingħajr irradjazzjoni f'konċentrazzjoni ekwivalenti indikata ta' COS-BA għal 24 siegħa. (I) Ċitotossiċità taċ-ċelluli ta 'COS-BA ħielsa, NPs COS-BA/Ce6 mhux irradjati kontra ċelluli LO2 u L929 normali. (J) L-analiżi IC50 tal-COS-BA kontra l-kanċer u ċ-ċelloli normali. Id-dejta hija espressa bħala mezz SD (n Z 6). *P ˂ 0.05, **P ˂ 0.01, u ***P ˂ 0.001 juru d-differenzi sinifikanti.

Biex tesplora r-raġunijiet possibbli wara din il-karatteristika ta 'rqad tal-kimoterapija, l-imġieba ta' assorbiment ċellulari dipendenti fuq il-ħin ta 'COS-BA/Ce6 NPs ġiet evalwata suċċessivament permezz ta' inkubazzjoni b'ċelluli tal-kanċer 4T1. Ir-riżultati indikaw li, għalkemm COS-BA/Ce6 NPs wrew it-tifi tal-fluworexxenza notevoli, xorta wrew effiċjenza fagoċitika mtejba meta mqabbla ma 'Ce6 ħielsa minħabba l-fluworexxenza ħamra ċitoplasmika aktar b'saħħitha, kif determinat mill-analiżi kwantitattiva taċ-ċitometrija tal-fluss (Fig. 5A). Din l-internalizzazzjoni ċellulari mtejba ta 'NPs tista' tiġi attribwita għall-endoċitożi21. Meħuda flimkien, aħna spekulajna li, għalkemm ko-assemblaġġi solubbli ħafna fl-ilma COS-BA/Ce6 NPs (angolu ta 'kuntatt q: 36.7) urew endoċitożi ċellulari mtejba minn Ce6 lipofiliku (q: 132.6, qrib BA), l-effiċjenza mnaqqsa ta' fagoċitosi ta ' L-NPs jistgħu jidhru meta mqabbla mal-molekula COS-BA anfifilika, u b'hekk jidhru mrażżna ċ-ċitotossiċità kimoterapewtika ta 'COS-BA/Ce6 NPs. Jiġifieri, l-effiċjenza tat-teħid taċ-ċelluli minn għoli għal baxx bħala tali sekwenza: COS-BA amfifiliku, COS-BA/Ce6 NPs idrofiliċi, BA lipofiliċi jew Ce6. Aktar importanti minn hekk, iż-żarmar inadegwat ta 'NPs ċellulari jista' jkun raġuni importanti oħra għall-effett kimoterapewtiku mdgħajjef, li kollha jistgħu jkunu relatati mar-rqad intelliġenti tal-kimoterapija ta 'COS-BA/Ce6 NPs. Barra minn hekk, minħabba li ż-żarmar ta 'NPs sar speċifikament fl-ambjent aċiduż taċ-ċelluli tat-tumur, biex turi l-karatteristika li tirrispondi għall-pH, ippruvajna nkomplu nqabblu l-effetti ta' assorbiment ta 'COS-BA/Ce6 NPs f'ċelluli LO2 normali (Fig. 5B) . Madankollu, COS-BA/Ce6 NPs ma wrewx fluworexxenza ħamra Ce6 inibita b'mod sinifikanti fiċ-ċelloli LO2. B'kuntrast, l-imġieba ta 'assorbiment minn LO2 kienet simili għal dik taċ-ċelloli tal-kanċer 4T1, li tissuġġerixxi li COS-BA/Ce6 NPs jistgħu wkoll jiżarmaw anke f'ċelloli normali, li jistgħu jirriżultaw mill-kompartimenti intraċellulari tal-pH dgħajjef aċidużi (endosomi/liżosomi) eżistenti ġewwa. kemm kanċer kif ukoll ċelluli normali46. Peress li l-assorbiment ċellulari ta 'NPs jiddependi fuq il-proċess ta' endoċitosi, l-inkubazzjoni diretta tad-droga tista 'ma tenfasizzax ir-rispons għall-pH ta' COS-BA/Ce6 NPs fil-livell ċellulari. Madankollu, il-mikroambjent tat-tumur (TME) huwa aċiduż ħafna meta mqabbel mat-tessuti normali47. Irrispettivament mill-kanċer intraċellulari jew TME, COS-BA/Ce6 NPs jistgħu jirrispondu għall-pH u żarmati biex jiskattaw ir-rilaxx ta 'COS-BA tossiku ħafna. Billi, fit-tessuti normali, COS-BA/Ce6 NPs setgħu jiġu żarmati biss wara li jidħlu f'ambjent ċellulari normali, u jnaqqas il-probabbiltà tar-rilaxx ta 'COSBA. Għalhekk, aħna niddeduċu li l-karatteristika ta 'rqad tal-kimoterapija ta' COS-BA/Ce6 NPs għall-mikroambjent tat-tumur hija valida u affidabbli, u l-idea tad-disinn fl-istudju preżenti hija fattibbli.

3.5. Kimoterapija in vitro/PDT kontra l-kanċer effikaċja ta’ COS-BA/Ce6 NPs

Barra minn hekk, qabel il-kimoterapija/PDT dettaljata kontra l-kanċer in vitro ta’ COS-BA/Ce6 NPs u biex niskopru aktar il-mekkaniżmu ta’ endoċitosi, nistudjaw l-erba’ mogħdijiet ewlenin ta’ endoċitosi billi nżidu inibituri endoċitiċi korrispondenti inkluż chlorpromazine (medjat minn clathrin), chloroquine phosphate ( inibitur tal-aċidifikazzjoni tal-lysosome), nystatin (medjat minn caveolae), u inibitur tal-makropinocytosis EIPA (ethylisopropyl amiloride) (Fig. 5C u D). Aħna nosservaw li l-introduzzjoni ta 'nystatin u chlorpromazine jistgħu jinibixxu b'mod aktar effiċjenti l-effiċjenza fagoċitika minn EIPA u chloroquine phosphate, li juru fluworexxenza ċellulari mnaqqsa b'mod sinifikanti meta mqabbla ma' normali 37 C. Dawn ir-riżultati indikaw li COS-BA / Ce6 NPs ġew internalizzati b'mekkaniżmi multipli, prinċipalment permezz il-mogħdijiet ta' endoċitosi medjata minn clathrin u caveolae. Peress li l-ġenerazzjoni 1 O2 miżjuda permezz ta 'interazzjonijiet intermolekulari, COS-BA/Ce6 NPs juru rendiment ROS interċellulari mtejba b'mod sinifikanti minn dak ta' Ce6 kif indikat mill-fluworexxenza ħadra aktar b'saħħitha tas-sonda DCFH (Fig. 5E), li timplika l-effiċjenza fotodinamika ogħla. Assays MTT juru li COS-BA/Ce6 NPs taħt irradjazzjoni jwettqu effett ta 'inibizzjoni msaħħa b'mod notevoli fuq ċelluli 4T1 minn dak ta' Ce6 ekwivalenti, filwaqt li b'ċitotossiċità relattivament moderata mingħajr irradjazzjoni (Fig. 5F). B'mod sinifikanti, l-IC5 0 ta 'Ce6 (0.53 mg/mL) f'COS-BA/Ce6 NPs kien ħafna inqas minn Ce6 ħieles (1.39 mg/mL) (Fig. 5G), li jissuġġerixxi effikaċja PDT mtejba b'mod notevoli, li kien aktar perfettament muri miċ-ċitotossiċità ta 'COSBA/Ce6 NPs kontra ċelluli tal-kanċer tal-bniedem MCF-7 u HepG2 (Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S19). Bl-istess mod, b'paragun ma 'Ce6 ħieles, il-valuri relattivament aktar baxxi IC25, IC50, u IC75 kienu osservati wkoll f'ko-assemblaġġi (Fig. 5G). Sadanittant, meta mqabbla ma 'Ce6 PDT waħdu u kimoterapija waħda ta' NPs fid-dlam, COS-BA/Ce6 NPs taħt irradjazzjoni kisbu kimoterapija/PDT kombinata aktar effettiva kontra t-tliet ċelluli tal-kanċer ta 'hawn fuq, li juru sinerġiżmu (indiċi ta' kombinazzjoni: CI ˂ 1) ( Fig. 5I). Barra minn hekk, it-tbajja’ doppja ta’ fluworexxenza taċ-ċelluli ħajjin/mejta bl-użu ta’ calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) u propidium iodide (PI) ikkonfermat aktar li COS-BA/Ce6 NPs setgħu b’mod effiċjenti jinduċu apoptosi u nekrożi taċ-ċelluli, peress li ċ-ċelloli trattati kienu kważi mtebbgħin b'sinjal ta 'fluworexxenza PI aħmar meta kkultivat għal 10 sigħat addizzjonali wara l-irradjazzjoni (Fig. 5H). Sadanittant, COS-BA/Ce6 NPs mhux irradjati (doża ogħla Ce6: 3.2 mg/mL) kellhom ukoll ċerta attività kimoterapewtika kif jidher mis-sinjali AM u PI simultanjament. Din l-attività PDT mtejba b'mod notevoli ta 'COS-BA/Ce6 NPs ġiet ivvalidata aktar mit-tbajja' AM/PI wara t-trattament għal 20 siegħa addizzjonali (Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S20). Barra minn hekk, meta żżid sodium azide (SA) u D-mannitol (DM), quencher speċjali separatament ta '1 O2 u $OH48, maċ-ċelloli 4T1 trattati b'COS-BA/Ce6 NPs-PDT, il-vijabbiltà taċ-ċelluli ovvjament miżjuda implikat li Fotoreazzjonijiet tat-Tip I ($OH) u tat-Tip II (1 O2) seħħew fl-istess ħin fil-proċess PDT medjat minn COSBA/Ce6 NPs (Fig. 5J). Barra minn hekk, COS-BA/Ce6 NPs partikolarment jippossjedu kompatibilità aħjar tad-demm kif indikat mill-emolisi negliġibbli taċ-ċelluli ħomor tad-demm (Fig. 5K), li jissuġġerixxi l-potenzjal għal applikazzjonijiet bijomediċi permezz ta 'amministrazzjoni ġol-vini.

3.6. Bijodistribuzzjoni in vivo ta 'COS-BA/Ce6 NPs

Sussegwentement, qabel l-investigazzjoni tad-distribuzzjoni in vivo, aħna mbagħad ivvalutajna l-farmakokinetika ta 'COS-BA/Ce6 NPs billi nimmonitorjaw il-konċentrazzjoni ta' Ce6 fid-demm wara injezzjoni ġol-vina b'Ce6 jew COS-BA/Ce6 NPs ekwivalenti. Il-profili tal-konċentrazzjoni-ħin ta 'Ce6 fid-demm (Fig. 6A) u l-parametri farmakokinetiċi komparattivi (Tabella ta' Informazzjoni ta 'Appoġġ S1) jappoġġjaw b'mod ċar li COS-BA/Ce6 NPs għandhom ċirkolazzjoni fit-tul fid-demm, li tista' tippermetti akkumulazzjoni akbar fit-tumur. siti. B'mod partikolari, COS-BA/Ce6 NPs wrew eliminazzjoni rapida tad-demm fi żmien sagħtejn, li timplika bijodegradabilità favorevoli. Għaldaqstant, aħna mbagħad investigajna l-bijodistribuzzjoni in vivo u l-abbiltà tal-akkumulazzjoni tat-tumur ta 'COS-BA/Ce6 NPs (Fig. 6B u C). Simili għal nanokomposti Ce6 irrappurtati universalment33, COS-BA/Ce6 NPs jistgħu jitqassmu malajr mal-ġisem kollu. Speċjalment matul l-ewwel 4 sigħat, l-assemblaġġi wrew emissjoni ta 'fluworexxenza ovvjament aktar b'saħħitha f'siti tat-tumur minn Ce6 ħieles, li jissuġġerixxi ż-żamma mtejba u l-kapaċità ta' akkumulazzjoni mmirata lejn it-tumur ta 'COS-BA/Ce6 NPs, probabbilment attribwiti għall-effett passiv ta' żamma tal-permeabilità msaħħa (EPR) mogħtija min-nanopartiċelli14. Wara 6 sigħat wara l-injezzjoni, l-intensità tal-fluworexxenza fis-siti tat-tumur naqset gradwalment malajr. Notevolment, b'differenza mill-nanokomposti rrappurtati b'mod komuni b'akkumulazzjoni mtejba b'mod sinifikanti tat-tumur meta mqabbla ma 'droga pożittiva b'xejn29, COS-BA/Ce6 NPs ma wrewx akkumulazzjoni prominenti ħafna fit-tumur joqgħod f'24 siegħa wara l-injezzjoni minn Ce6 ħieles (Fig. 6C), li kien appoġġjat aktar mill-immaġini tat-tumur imneħħija (Fig. 6D u E). Il-bijodegradabilità eċċellenti ta 'NPs tista' tkun responsabbli għall-introduzzjoni ta 'molekuli organiċi żgħar naturali. Dan kien osservat ukoll ma' nano-assemblaġġi medjati minn molekuli żgħar ta' terpenojdi oħra49. Barra minn hekk, COS-BA/Ce6 NPs wrew ukoll distribuzzjoni tat-tessut simili bħala Ce6 ħielsa (Fig. 6E), u l-intensità medja tal-fluworexxenza ex vivo kienet ġeneralment aktar baxxa minn dik ippreżentata in vivo, li timplika aktar bijodegradabilità tajba. Barra minn hekk, meta wieħed iqis id-differenza fil-livell ta 'fluworexxenza mill-qrib bejn 2 u 4 sigħat wara l-injezzjoni ta' NPs u Ce6, kif ukoll operabbiltà sperimentali li tippermetti intervalli suffiċjenti għall-irradjazzjoni, 4 sigħat wara l-amministrazzjoni ntgħażlet bħala l-punt tal-ħin tad-dawl għal terapija PDT sussegwenti.

Meta wieħed iqis l-akkumulazzjoni tat-tumur mhux prominenti ħafna f'24 siegħa minn Ce6 ħieles, biex nivvalidaw aktar l-effett EPR miżjud li għandhom COS-BA/Ce6 NPs, aħna mmonitorjajna immedjatament l-immaġini ta 'fluworexxenza ex vivo ta' tumuri f'ħinijiet differenti wara injezzjoni ġol-vini b'nanodrogi ( Fig. 6F u G). B'mod notevoli, jew f'20 min jew fi 12-il siegħa wara l-injezzjoni, COS-BA/Ce6 NPs tabilħaqq wrew emissjoni ta 'fluworexxenza aktar b'saħħitha f'siti tat-tumur minn Ce6 ħieles, li juri kapaċità eċċellenti u mtejba ta' akkumulazzjoni tat-tumur. Sadanittant, hekk kif għadda ż-żmien, l-intensitajiet tal-fluworexxenza miżmuma fit-tessut tat-tumur iddgħajfu gradwalment (Fig. 6G), li hija kompletament konsistenti mar-riżultati tal-immaġini tal-fluworexxenza in vivo tal-annimali. B'mod ċar, dan il-metaboliżmu bijoloġiku rapidu u l-akkumulazzjoni msaħħa tat-tumur evitaw it-tossiċità potenzjali ta 'akkumulazzjoni fit-tul, li jiggarantixxu terapija antitumorali effiċjenti ħafna b'bijosigurtà aħjar.

Figura 5 Effikaċja kontra l-kanċer in vitro ta' COS-BA/Ce6 NPs. Internalizzazzjoni ċellulari ta 'ċelluli tal-kanċer (A) 4T1 u (B) ċelluli normali LO2 inkubati f'NPs ħielsa Ce6 jew COS-BA/Ce6 għal 0.5 u 3 sigħat, u analiżi ċitometrika tal-fluss korrispondenti tal-intensità tal-fluworexxenza. (C) Inibizzjoni tat-teħid ta 'studji speċifiċi ta' passaġġ endoċitiku u (D) intensità ta 'fluworexxenza korrispondenti ta' ċelluli mkejla b'ċitometrija tal-fluss wara inkubazzjoni b'COSBA/Ce6 NPs bi/mingħajr inibituri endoċitiċi inklużi chlorpromazine, chloroquine, nystatin, u ethylisopropyl amiloride (EIPA). Vireg tal-iskala Z 20 mm. (E) Ġenerazzjoni ROS ċellulari indotta minn Ce6 ħielsa jew COS-BA/Ce6 NPs (ekwivalenti Ce6: 1.6 mg/mL). Vireg tal-iskala Z 20 mm. (F) Vijabilità taċ-ċelluli taċ-ċelloli 4T1 wara diversi trattamenti għal 24 siegħa. (G) L-analiżi IC25, IC50, IC75 ta' NPs ħielsa Ce6 u COS-BA/Ce6 kontra ċelluli 4T1, MCF-7, u HepG2, rispettivament. (H) Calcein-AM/jodur tal-propidju (PI) tbajja ħaj/mejjet ta 'ċelluli 4T1 ittrattati COS-BA/Ce6 NPs (Ce6: 1.6 mg/mL) wara inkubazzjoni għal 10 sigħat addizzjonali, kif ukoll COS- mhux irradjati BA/Ce6 NPs (Ce6: 3.2 mg/mL). Skala bars Z 50 mm. (I) Indiċi ta 'kombinazzjoni (CI) ta' NPs COS-BA/Ce6 fuq ċelluli 4T1, MCF-7, u HepG2, kif determinat mill-kalkolu tat-teorema Chou Talalay. (J) Mekkaniżmi PDT (Tip I u Tip II) indotti bl-irradjazzjoni ta 'COS-BA/Ce6 NPs u evalwati b'1 O2 u $OH quencher sodium azide speċifiċi (SA) u D-mannitol (DM), rispettivament. (K) Perċentwali ta 'emolisi taċ-ċelluli ħomor tad-demm wara inkubazzjoni b'COS-BA/Ce6 NPs għal 4 sigħat. Id-dejta hija espressa bħala mezz SD (n Z 3). *P ˂ 0.05, **P ˂ 0.01, u ***P ˂ 0.001 juru d-differenzi sinifikanti.

Figura 6 Ċirkolazzjoni tad-demm in vivo u bijodistribuzzjoni ta 'COS-BA/Ce6 NPs. (A) Profili tal-konċentrazzjoni tal-ħin ta 'Ce6 fid-demm wara injezzjonijiet iv ta' Ce6 ekwivalenti jew COS-BA/Ce6 NPs assemblati flimkien (n Z 3). (B) Immaġini ta 'fluworexxenza tal-ġisem kollu ta' ġrieden li jġorru tumuri 4T1 wara injezzjonijiet iv ta 'mediċini indikati f'diversi punti ta' ħin. (C) Intensità medja tal-fluworexxenza miksuba mis-siti tat-tumur f'(B). (D) Immaġini ta 'florexxenza ex vivo ta' tumuri u organi ewlenin imneħħija mill-ġrieden ta 'hawn fuq f'24 siegħa, u riżultat kwantitattiv tal-intensità tal-fluworexxenza korrispondenti (E) (n Z 3). (F) Immaġini ta 'florexxenza ex vivo ta' tumuri u organi ewlenin f'ħinijiet differenti wara injezzjonijiet iv ta 'Ce6 jew COS-BA/Ce6 NPs, u (G) analiżi tal-intensità tal-fluworexxenza korrispondenti ta' tumuri. Id-dejta hija espressa bħala mezz SD (n Z 3).

3.7. In vivo kimoterapija/PDT trattament kombinatorju kontra t-tumur 

Motivata mill-karatteristika unika ta 'rqad, bijodegradabilità tajba, u attività PDT, ġiet investigata l-kimoterapija in vivo/terapija kombinata kontra t-tumur PDT. Ġrieden li jġorru tumur 4T1 ġew maqsuma b'mod każwali f'6 gruppi u injettati ġol-vini b'Ce6 ekwivalenti (3.5 mg/kg ta 'ġisem) kull jumejn għal total ta' tliet dożi. 4 h wara l-injezzjoni, is-siti tat-tumur tal-ġrieden fil-gruppi ħfief ġew irradjati għal 15-il minuta (Fig. 7A). Sadanittant, il-volumi korrispondenti tat-tumur jew il-piżijiet tal-ġisem ġew irreġistrati kull jum ieħor. Wara 14-il jum ta 'trattament (Fig. 7B), Ce6 ħielsa b'irradjazzjoni u COS-BA ħielsa kienu ineffettivi fit-trażżin tat-tumur, x'aktarx minħabba l-akkumulazzjoni limitata tal-mediċina fit-tessut tat-tumur. B'kuntrast, wara l-irradjazzjoni ta 'COS-BA/Ce6 NPs, ġiet osservata l-inibizzjoni tat-tumur l-aktar sinifikanti, li vvalida l-effiċjenza tal-kombinazzjoni eċċellenti tal-kimoterapija/PDT. Il-piżijiet medji tat-tumur (Fig. 7D) u ritratti korrispondenti ta 'tumuri dissected (Fig. 7E) it-tnejn urew l-aħjar effikaċja kontra t-tumur ta' COS-BA/Ce6 NPs taħt irradjazzjoni, peress li ġrieden ittrattati wrew l-iżgħar daqsijiet tat-tumur minn dawk ta 'gruppi oħra. Il-proporzjon medju ta 'inibizzjoni tat-tumur ta' COS-BA/Ce6 NPs ittrattati b'PDT laħaq 80.3%, ogħla minn dawk ta 'Ce6 PDT b'xejn (42.4%), u COS-BA ħieles (38.5%). Notevolment, għalkemm studji in vitro preċedenti wrew li COS-BA / Ce6 NPs mingħajr dawl wrew funzjoni rieqda ta 'attività kimoterapewtika, xorta jwettqu effiċjenza mtejba kontra t-tumur (49.5%) meta mqabbla ma' COS-BA ħielsa (Fig. 7D). Aħna spekulajna li żewġ raġunijiet possibbli jikkontribwixxu għal dan ir-riżultat, waħda hija l-akkumulazzjoni ogħla tat-tumur ta 'COS-BA/Ce6 NPs minħabba l-effett EPR irrappurtat b'mod wiesa'. Fattur ieħor huwa l-mikroambjent tat-tumur dgħajjef aċiduż li stimula r-rilaxx ta 'COS-BA tossiku ħafna. Minħabba l-konċentrazzjoni kritika ogħla tal-miċelli (CMC, 187 mg/mL) ta 'COS-BA (Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S21), tista 'teżisti fl-istat tal-monomeru fl-ambjent tat-tumur, u b'hekk tiffavorixxi l-kimoterapija mtejba ta' COS- mhux irradjati. BA/Ce6 NPs. Barra minn hekk, biex tivverifika aktar l-effikaċja superjuri kontra l-kanċer ta 'COS-BA/Ce6 NPs, tbajja ta' ematoxylin u eosin (H & E) ta 'tumuri saret (Fig. 7G).

Figura 7 Studju tal-effikaċja b'mudell ta' xenograft 4T1 taħt il-ġilda. (A) Illustrazzjoni skematika ta 'trattament PDT in vivo. (B) Profili tat-tkabbir tat-tumur, (C) bidliet fil-piż tal-ġisem, u (D) piżijiet tat-tumur imneħħija li fihom proporzjonijiet ta 'inibizzjoni tat-tumur ta' ġrieden li jġorru 4T 1- wara diversi trattamenti fil-gruppi indikati (n Z 5 għal kull grupp). (E) Immaġini ta 'tumuri imneħħija minn ġrieden rappreżentattivi wara t-trattament. (F) Analiżi tal-bijokimika tas-serum wara trattament b'COS-BA/Ce6 NPs għal 14-il jum. (G) Tbajja rappreżentattiva ta 'H & E ta' sezzjonijiet ta 'tumur imneħħija wara trattamenti differenti. Vireg tal-iskala Z 50 mm. (H) Tbajja ta 'TUNEL ta' sezzjonijiet tat-tumur ikkurati bi PDT Ce6 u COS-BA/Ce6 NPs ħielsa. Skala bars Z 20 mm **P < 0.01 jindika d-differenzi sinifikanti.

Ir-riżultati indikaw li s-sezzjonijiet tat-tumur ittrattati b'COS-BA/Ce6 NPs-PDT wrew deterjorament serju tat-tessut u defiċjenza tan-nuklei, filwaqt li n-nekrożi moderata tat-tessut kienet osservata fil-gruppi l-oħra. Fl-istess ħin, meta mqabbel ma 'dawl Ce6 ħieles, COS-BA/Ce6 NPs taħt irradjazzjoni żiedu b'mod notevoli n-numru ta' ċelluli pożittivi għal TUNEL li juru tbajja nukleari kannella aktar b'saħħitha (Fig. 7H), tikkonferma aktar it-terapija kombinata ta 'kimoterapija/PDT eċċellenti. Barra minn hekk, l-ebda varjazzjonijiet ovvji tal-piżijiet tal-ġisem ma ġew osservati fil-gruppi kollha (Fig. 7C). Anke jekk il-gruppi ħfief COSBA/Ce6 NPs jew Ce6 kellhom telf modest fil-piż tal-ġisem waqt l-amministrazzjoni, il-piżijiet tal-ġisem reġgħu lura għan-normal wara ftit jiem. L-ebda ħsara evidenti jew leżjoni infjammatorja ma setgħet tinstab fl-organi maġġuri maħsuda fl-aħħar tat-trattamenti (Informazzjoni ta 'Appoġġ Fig. S22), it-tnejn li huma jindikaw it-tossiċità sistemika baxxa/l-ebda u l-bijosigurtà tajba ta' COS-BA/Ce6 NPs. Barra minn hekk, għalkemm COS-BA/Ce6 NPs huma prinċipalment akkumulati fit-tessut tal-fwied, il-markaturi korrispondenti tal-funzjoni tal-fwied (ALT, AST, u ALP) ma wrewx bidliet sinifikanti meta mqabbla ma 'ġrieden b'saħħithom normali (Fig. 7F), li jissuġġerixxu bijokompatibilità aħjar. Barra minn hekk, il-markaturi tal-funzjoni renali (BUN, CRE, u UA) u l-parametri bijokimiċi (ALB, u TBIL) dehru wkoll li huma simili għal ġrieden normali, u aktar jimplikaw bijosigurtà aħjar. B'mod ċar, dan il-prodrug molekula żgħira organika COS-BA medjata minn ko-assemblaġġi COS-BA/Ce6 NPs għandhom karatteristiċi terapewtiċi favorevoli multipli li jiftħu possibbiltajiet attraenti għal applikazzjonijiet fil-mediċina klinika.

3.8. Immunità kontra t-tumur ta' kimoterapija/PDT kombinata u imblokk kontra l-PD-L1

Riċentement, bosta studji innovattivi wrew li l-kombinazzjoni ta 'immunoterapija tal-kanċer ma' modalitajiet oħra ta 'trattament tista' effettivament tqajjem risponsi immuni speċifiċi għat-tumur għall-eliminazzjoni ta 'tumuri primarji jew imbiegħda1. Imħeġġa mill-funzjoni unika ta' rqad tal-kimoterapija u l-effikaċja eċċellenti ta' kimoterapija/PDT kontra t-tumur ta' COS-BA/Ce6 NPs, aħna għalhekk nistaqsu jekk jistax ukoll jikkawża risponsi immunoloġiċi bl-għajnuna ta' adjuvant immuni anti-PD-L1 biex jikkawża terapija antitumorali effiċjenti ħafna. . Jista 'jikkura tumuri 'l bogħod li ma jistgħux jiġu ttrattati direttament bl-użu ta' trattament PDT, u b'hekk jipprovdi strateġija alternattiva għal applikazzjonijiet kliniċi kontra l-kanċer? Biex tittestja din l-ipoteżi, f'dan l-istudju, ġie stabbilit mudell ta '"żewġ tumuri" u proċeduri ta' esperiment dettaljati ġew murija fil-Fig. 8A. Tipikament, żewġ tumuri 4T1 ġew imlaqqma kemm fil-ġenb tax-xellug kif ukoll tal-lemin ta 'kull ġurdien. Meta wieħed iqis li l-anti-PD-L1 waħdu m'għandux effett immunoterapewtiku li jidher50, l-esperimenti ġew maqsuma f'5 gruppi inkluż grupp mhux trattat, COS-BA/Ce6 NPs, COS-BA/Ce6 NPs b'anti-PD-L1, COS- BA/Ce6 NPs bid-dawl, COS-BA/Ce6 NPs bid-dawl u anti-PD-L1. Wara injezzjoni waħda iv ta 'NPs (Ce6: 3.5 mg/kg), it-tumuri tal-lemin (tumur primarju) fil-gruppi ħfief ġew irradjati għal 15-il minuta biex jevalwaw l-effetti immunoloġiċi tal-PDT/kimoterapija, filwaqt li t-tumuri tax-xellug (tumuri mill-bogħod) fil-gruppi kollha mingħajr ebda trattament intgħażlu għal kimoterapija individwali. Sussegwentement, fil-Jiem 2, 4, u 6, ġrieden fil-gruppi immuni ġew injettati iv b'antikorp anti-PD-L1 (15 mg għal kull ġurdien għal kull injezzjoni) għal total ta 'tliet dożi. B'mod sinifikanti, irrispettivament mit-trattament PDT jew le, COS-BA/Ce6 NPs flimkien ma 'anti-PD-L1 jistgħu jinibixxu b'mod effiċjenti l-progressjoni tat-tumur primarju (Fig. 8B). U l-proporzjonijiet medji korrispondenti ta 'inibizzjoni tat-tumur laħqu separatament 86.7% (irradjazzjoni) u 76.5% (l-ebda irradjazzjoni), ferm ogħla minn kimoterapija individwali (5.7%) jew kimoterapija/PDT (27.4%) trattament (Fig. 8C) . Ir-ritratti ta 'tumuri dissected (Fig. 8D) u ġrieden li jġorru 4T 1- (Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S23) wara 14-il jum ta 'trattament appoġġaw ukoll viżwalment il-konklużjoni ta' hawn fuq. Dawn ir-riżultati ssuġġerew li kemm il-kimoterapija bbażata fuq NPs kif ukoll il-kimoterapija/PDT jistgħu jattivaw b'mod effettiv l-immunità kontra t-tumur. Sadanittant, l-aktar impressjonanti, l-imblokk anti-PD-L1 flimkien ma 'NPs offra wkoll effett notevoli ta' inibizzjoni tat-tumur għal tumuri imbiegħda (xellug) mhux irradjati (Fig. 8E u F), ġeneralment aktar b'saħħithom minn COS-BA/Ce6 NPs waħedhom, li kien ikkonfermat ukoll mill-immaġini korrispondenti dissected tumuri u ġrieden wara t-trattament (Fig. 8D u Fig. S23), li juri aktar ir-rispons immuni effiċjenti kontra t-tumur indott minn COS-BA/Ce6 NPs.

Biex tesplora bis-sħiħ dan ir-rispons immuni effiċjenti kontra t-tumur, CD8þ limfoċiti T ċitotossiċi (CTLs), immunocyte kritiku għall-immunoterapija tal-kanċer4, ġew evalwati aktar billi ġew analizzati ċ-ċelloli immuni fit-tumuri tal-lemin jew tax-xellug wara 14-il jum ta 'trattament. Instab li COS-BA/Ce6 NPs flimkien ma 'anti-PD-L1 bi jew mingħajr trattament PDT indotta CD8þ CTL robusta infiltrazzjoni fit-tumuri primarji (Fig. 8H u J). L-infiltrazzjoni CD8þ CTL kienet sa 11.3% wara kimoterapija/PDT ibbażata fuq COS-BA/Ce6 NPs flimkien ma’ trattament anti-PD-L1, kemmxejn ogħla minn COS-BA/Ce6 NPs flimkien ma’ anti-PD-L1 (9.63%), u ferm ogħla minn dak fi gruppi oħra mingħajr anti-PD-L1, inkluż trattament b'kimoterapija bbażata fuq COS-BA/Ce6 NPs (5.12%) jew kimoterapija/PDT waħedha (4.07%). Bl-istess mod, meta mqabbla ma 'gruppi mhux immuni, infiltrazzjoni CTL miżjuda b'mod sinifikanti kienet osservata wkoll fit-tumuri tax-xellug (distanza) għall-ġrieden wara COS-BA/Ce6 NPs flimkien ma' antiPD-L1 bi jew mingħajr trattament PDT (Fig. 8I u K), aktar li jimplika risponsi immuni effettivi ħafna indotti minn kimoterapija jew terapija kombinata kimoterapija/PDT. Sadanittant, wara l-introduzzjoni ta 'anti-PD-L1, kemm kimoterapija bbażata fuq COS-BA/Ce6-kimoterapija/PDT wasslu għal produzzjoni robusta ta' ċitokini multipli li għandhom rwoli ċentrali fir-regolazzjoni tal-funzjonijiet ċitotossiċi ta 'CTLs8, inkluż tumur. necrosis factor-alpha (TNF-a) (Fig. 8L) u interferon-gamma (IFN-g) (Fig. 8M) fil-kampjuni tas-serum tal-ġrieden wara 14-il jum ta 'trattament, aktar appoġġ li kien hemm risponsi immuni antitumorali effiċjenti. Barra minn hekk, ma ġew osservati l-ebda bidliet apparenti fil-piżijiet tal-ġisem fi gruppi ta 'trattament differenti (Fig. 8N), li jindika l-bijosigurtà favorevoli ta' din il-kimoterapija/PDT/immunoterapija kkombinata. Meħuda flimkien, sibna li għalkemm anti-PD-L1 flimkien ma' COSBA/Ce6 NPs bid-dawl wrew proporzjon ta' inibizzjoni tat-tumur kemmxejn ogħla (86.7%) mill-grupp mhux irradjat (76.5%) kontra t-tumuri t-tajba minħabba l-influwenza ta 'PDT (Fig. 8B‒D), ma ġiet osservata l-ebda differenzi sinifikanti fl-effetti terapewtiċi fuq it-tumuri tax-xellug fil-preżenza (77.8%) jew assenza (78.4%) ta' PDT (Fig. 8E‒G). Aħna nispekulaw li r-raġunijiet possibbli li ġejjin iwasslu għal dan il-fenomenu. L-ewwelnett, għall-mekkaniżmu ta 'kimoterapija jew PDT li jsaħħaħ l-effetti immunoloġiċi tal-imblokk tal-punt ta' kontroll anti-PD-L1, studji li jakkumulaw wrew li dawn il-modalitajiet ta 'trattament jistgħu jikkawżaw infjammazzjoni akuta fiż-żona tat-tumur, u b'hekk tiżdied il-preżentazzjoni ta' antiġeni assoċjati mat-tumur għal T ċelluli, u b'hekk jinduċu liċ-ċelloli tal-kanċer jgħaddu minn ICD8,9. Iċ-ċelloli tat-tumur li jgħaddu minn ICD jirregolaw ’il fuq is-sinjali ta’ “eat me” billi jesponu l-calreticulin (CRT) fuq l-uċuħ taċ-ċelluli tat-tumur li jmutu immunoġenikament u sinjali ta’ “periklu” billi jirrilaxxaw il-kaxxa tal-grupp 1 ta’ mobilità għolja (HMGB1), li jippromwovu l-attivazzjoni taċ-ċelluli dendritiċi. biex jattiva CTLs, li l-attività tagħhom tista 'titjieb b'anti-PD-L1, u b'hekk tirriżulta f'immunoterapija kontra l-kanċer imtejba b'mod sinifikanti51.

Figura 8 Effett kontra t-tumur ta 'kimoterapija/PDT ibbażata fuq COS-BA/Ce6 NPs flimkien ma' immunoterapija ta 'imblokk ta' checkpoint anti-PD-L1. (A) Illustrazzjoni skematika ta 'kimoterapija/PDT ibbażata fuq CNPs b'terapija anti-PD-L1. (BeD) (B) Il-profili tat-tkabbir tat-tumur, (C) piżijiet medji tat-tumur, u (D) immaġini ta 'tumuri imneħħija minn ġrieden rappreżentattivi għal tumuri primarji (lemin) wara diversi trattamenti għal 14-il jum kif indikat. (EeG) (E) Il-kurvi tat-tkabbir tat-tumur, (F) piżijiet medji tat-tumur, u (G) immaġini ta 'tumuri imneħħija għal tumuri bogħod (xellug) mhux irradjati wara trattamenti differenti kif indikat. (H) Popolazzjonijiet ta 'ċelluli CD8þ T f'tumuri tal-lemin u (J) perċentwali ta' infiltrazzjoni CTL ġew skoperti kwantitattivament permezz ta 'ċitometrija tal-fluss wara 14-il jum ta' trattament. (I, K) Popolazzjonijiet ta 'ċelluli CD8þ T f'tumuri tax-xellug f'Jum 14 ġew skoperti kwantitattivament permezz ta' ċitometrija tal-fluss (n Z 3). Sekrezzjoni ta' ċitokini fis-serum wara 14-il jum ta' trattament inkluż (L) IFN-g u (M) TNF-a mkejla b'assaġġ ELISA (n Z 3). (N) Bidliet fil-piż tal-ġisem tal-ġrieden waqt diversi trattamenti. *P < 0.05, **P < 0.01, u ***P < 0.001 juru d-differenzi sinifikanti.

It-tieni nett, f'dan ix-xogħol, COS-BA/Ce6 NPs jistgħu jitqassmu fuq it-tumuri tax-xellug u tal-lemin simultanjament, kemm il-kimoterapija tax-xellug kif ukoll il-kimoterapija/PDT tal-lemin għandhom potenzjal enormi li jinduċu ċelluli tat-tumur li jgħaddu minn ICD. Sadanittant, COS-BA/Ce6 NPs huma amministrati f'doża waħda biss, l-immunoterapija tiddependi prinċipalment fuq tliet dożi ta 'anti-PD-L1, kemm jekk kimoterapija jew kimoterapija/PDT, huma biss primers. Id-differenzi terapewtiċi fl-induzzjoni taċ-ċelluli tat-tumur ICD bejn il-kimoterapija individwali u t-trattamenti kkombinati tal-kimoterapija/PDT jistgħu ma jkunux prominenti ħafna. Il-perċentwal ta 'CD8þ CTLs fuq ix-xellug (Fig. 8I u K) u tumuri tal-lemin (Fig. 8H u J) appoġġja wkoll l-ispekulazzjoni ta' hawn fuq, ma ġiet osservata l-ebda differenza sinifikanti f'CD8þ CTLs fil-preżenza jew in-nuqqas ta 'PDT. Għalhekk, COS-BA/Ce6 NPs flimkien ma 'anti-PD-L1 bi jew mingħajr irradjazzjoni kisbu effiċjenza simili kontra l-kanċer kontra t-tumuri tax-xellug. Barra minn hekk, minħabba li ċ-ċelloli 4T1 jesprimu livelli baxxi ta 'PD-L152, anti-PD-L1 waħdu ġie ppruvat b'mod wiesa' li għandu xi effett immunoterapewtiku li jidher fuq il-kanċer tas-sider 4T153,54. Minkejja l-effetti ICD medjati minn COS-BA/Ce6 NPs jiġġustifikaw aktar investigazzjoni, ir-riżultati ppreżentati wrew li COS-BA/Ce6 NPs jiksbu risponsi immuni mtejba b'mod notevoli bl-għajnuna ta 'anti-PD-L1. B'mod kollettiv, jidher li COS-BA/Ce6 NPs tabilħaqq saħħew l-immunoterapija tal-kanċer ta 'anti-PD-L1, mhux biss terapija kombinata. Għalkemm anti-PD-L1 flimkien ma 'COS-BA/Ce6 NPs bi jew mingħajr trattament PDT ma wrewx differenzi sinifikanti fl-effetti terapewtiċi, it-tnejn li huma wrew ovvjament effikaċja mtejba kontra t-tumur meta mqabbla ma' doża waħda ta 'COS-BA/Ce6 NPs. Jiġifieri, anki jekk mingħajr trattament ħafif, ladarba ġie introdott l-immunoġeniċità antiPD-L1, l-immunoġeniċità tar-residwi tat-tumur wara l-kimoterapija COS-BA/Ce6 NPs tista’ tingħata spinta li tirriżulta f’risponsi immuni sistemiċi antitumorali notevoli, u b’hekk iwassal għal soppressjoni effettiva. ta’ tumuri primarji jew imbiegħda. Għalhekk, għandu jkun possibbli li jiġu eliminati tumuri primarji u metastatiċi waqt immunoterapija klinika kontra l-kanċer bi trattamenti ripetuti b'NPs. B'mod ċar, dawn ir-riżultati kollettivament jipprovdu evidenza ta 'risponsi immuni kontra t-tumur effettivi ħafna u sinerġistiċi indotti minn COS-BA/Ce6 NPs flimkien ma' imblokk anti-PD-L1, jew b'kimoterapija waħedha jew flimkien ma 'kimoterapija/PDT.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

4. Konklużjonijiet

Fil-qosor, iddisinjajna, sintetizzajna u żviluppajna apposta, bijokompatibbli, bijodegradabbli, tossiku baxx iżda effiċjenti ħafna u klinikament disponibbli nano-prodrug foto-kemoterapewtiku trasformat COS-BA/Ce6 NPs billi ngħaqqad tliet komponenti multifunzjonali aċidu betuliniku ta’ molekula żgħira naturali assemblata waħedha. (BA), COS li jinħall fl-ilma, u Ce6 fotosensibilizzatur tossiku baxx għal kimoterapija/PDT magħquda. Sussegwentement iqajjem risponsi immuni kontra t-tumur effettivi ħafna u sinerġistiċi flimkien ma' imblokk kontra l-PD-L1, jew bil-kimoterapija waħedha jew flimkien ma' kimoterapija/PDT. Speċifikament, nuru li l-arranġament molekulari ta 'netwerk vojt jista' jiffaċilita l-formazzjoni ta 'nanopartiċelli strutturati bil-qoxra. Modifiki ta 'COS solubbli fl-ilma jistgħu jtejbu ħafna l-attività kontra l-kanċer ta' molekuli żgħar naturali lipofiliċi billi jibnu prodrug amfifiliku. Aħna nuru wkoll li n-nanodrogi li rriżultaw wrew karatteristiċi terapewtiċi favorevoli multipli, speċjalment funzjoni ta '"rqad" intelliġenti b'effetti ta' kimoterapija insidjużi. Flimkien mar-rispons distintiv tal-pH, dawn il-ko-assemblaġġi jwettqu tossiċità baxxa u bijosigurtà ma 'tessut normali iżda huma tossiċi ħafna għat-tessuti tat-tumur. Flimkien mal-ġenerazzjoni mtejba 1 O2, bijodegradabilità tajba, u bijokompatibilità, li kollha kkontribwew għall-kimoterapija / PDT / immunoterapija kontra l-kanċer effiċjenti ħafna, sinerġistiku u sigur. B'mod partikolari, kimoterapija individwali mingħajr trattament PDT tista' tattiva risponsi immuni sistemiċi kontra t-tumur, u tiftaħ possibbiltajiet attraenti għal immunoterapija klinikament sinerġistika kontra l-kanċer. B'mod ġenerali, dan ix-xogħol jipprovdi ħarsa promettenti għall-iżvilupp ta 'nano-immunostimulanti multifunzjonali naturali ħafna bijoattivi, u tossiċi baxxi għall-immunoterapija klinika.

Referenzi

1. Sang W, Zhang Z, Dai YL, Chen XY. Avvanzi riċenti fl-immunoterapija tal-kanċer tal-kombinazzjoni sinerġistika bbażata fuq nanomaterjali. Chem Soc Rev 2019;48:3771e810.

2. Li XY, Guo XM, Ling JB, Tang Z, Huang GN, He LZ, et al. Immunoterapiji tal-kanċer ibbażati fuq in-nanomediċina żviluppati billi jiġu pprogrammati mill-ġdid makrofaġi assoċjati mat-tumur. Nanoskala 2021;13:4705e27.

3. Chao Y, Xu LG, Liang C, Feng LZ, Xu J, Dong ZL, et al. Terapija ta’ radjuisotopi immunostimulatorji lokali magħquda u imblokk tal-punti ta’ kontroll immuni sistemiku jagħtu risponsi qawwija kontra t-tumur. Nat Biomed Eng 2018;2:611e21.

4. Wen YY, Chen X, Zhu XF, Gong YC, Yuan GL, Qin XY, et al. Nanopartiċelli integrati fototermali-kimoterapija b'rispons tal-mikroambjent tat-tumur tejbu l-induzzjoni tal-mewt taċ-ċelluli immunoġeniċi għal trattament effiċjenti tal-kanċer tal-kolorektum. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11:43393e408.

5. Peng JR, Xiao Y, Yang Q, Liu QY, Chen Y, Shi K, et al. L-aggregazzjoni intraċellulari ta 'nanoassemblaġġi ta' molekuli żgħar ipprogrammati mill-ġdid b'peptidi ttejjeb il-kimoterapija tal-kanċer u l-immunoterapija kombinatorja. Acta Pharm Sin B 2021;11:1069e82.

6. Kanzunetta W, Kuang J, Li CX, Zhang MK, Zheng DW, Zeng X, et al. Immunoterapija mtejba bbażata fuq terapija fotodinamika kemm għall-eradikazzjoni tat-tumur tal-metastasi primarja kif ukoll tal-pulmun. ACS Nano 2018;12: 1978e89.

7. Wang C, Xu LG, Liang C, Xiang J, Peng R, Liu Z. Risposti immunoloġiċi attivati ​​minn terapija fototermali b'nanotubi tal-karbonju flimkien ma 'terapija anti-CTLA-4 biex tinibixxi l-metastasi tal-kanċer. Adv Mater 2014;26:8154e62.

8. Huwa CB, Duan XP, Guo NN, Chan C, Poon C, Weichselbaum RR, et al. Il-polimeri ta 'koordinazzjoni nanoskala tal-qalba jgħaqqdu l-kimoterapija u t-terapija fotodinamika biex isaħħu l-immunoterapija tal-kanċer tal-imblokk tal-punt ta' kontroll. Nat Commun 2016;7:12499.

9. Galluzzi L, Buque A, Kepp O, Zitvogel L, Kroemer G. Mewt taċ-ċelluli immunoġeniċi fil-kanċer u mard infettiv. Nat Rev Immunol 2017;17: 97e111.

10. Chiang CS, Lin YJ, Lee R, Lai YH, Cheng HW, Hsieh CH, et al. Taħlita ta 'nanopartiċelli manjetiċi bbażati fuq fucoidan u immunomodulaturi ttejjeb l-immunoterapija lokalizzata fit-tumur. Nat Nanotechnol 2018;13:746e54.

11. Zheng XL, Ge JC, Wu JS, Liu WM, Guo L, Jia QY, et al. Nanovesicle derivattiv ta' hypocretin bijodegradabbli bħala teranostiku mmexxi mid-dawl qrib l-infra-aħmar għal immaġini u terapija tal-kanċer fotoattiva doppja. Bijomaterjali 2018;185:133e41.

12. Spicer CD, Jumeaux C, Gupta B, Stevens MM. Nanoparticle tal-peptidi u tal-proteini jikkonjuga pjattaformi versatili għal applikazzjonijiet bijomediċi. Chem Soc Rev 2018;47:3574e620.

13. Mei YL, Wang RB, Jiang W, Bo Y, Zhang TF, Yu JL, et al. Progress reċenti fin-nanomaterjali għall-kunsinna ta 'aċidu nuklejku fl-immunoterapija tal-kanċer. Biomater Sci 2019;7:2640e51.

14. Zheng YL, Ye JX, Li ZY, Chen HJ, Gao Y. Progress reċenti fit-terapija tal-kanċer fotodinamika sono: minn sensitizzaturi ġodda żviluppati għal strateġiji li jtejbu l-effikaċja bbażati fuq in-nanoteknoloġija. Acta Pharm Sin B 2021;11:2197e219.

15. Li SK, Zou QL, Li YX, Yuan CQ, Xing RR, Yan XH. Drogi metalli-nano fotodinamiċi supramolekulari bbażati fuq peptidi intelliġenti ddisinjati minn awto-assemblaġġ ta 'koordinazzjoni ta' komponenti. J Am Chem Soc 2018; 140:10794e802.

16. Zhi KK, Wang JC, Zhao HT, Yang X. Ġell tal-prodott naturali ta 'molekula żgħira awto-immuntat għall-kunsinna tad-droga: avvanz f'applikazzjoni ġdida ta' prodotti naturali ta 'molekula żgħira. Acta Pharm Sin B 2020;10: 913e27.

17. Yang X, Ma C, Chen ZM, Liu J, Liu FY, Xie RB, et al. Nanopartiċelli immuntati b'molekula żgħira waħda jimmedjaw kunsinna effiċjenti tad-droga orali. Nano Res 2019;12:2468e76.

18. Zhi KK, Zhao HT, Yang X, Zhang H, Wang JC, Wang J, et al. Ġelators ta' prodotti naturali u metodu ġenerali biex jinkisbu minn organiżmi. Nanoskala 2018;10:3639e43.

19. Cheng JJ, Fu SY, Qin Z, Han Y, Yang X. Aċidi diterpene ta 'molekula żgħira naturali immuntati waħedhom b'attività favorevoli kontra l-kanċer u bijosigurtà għal kimoterapija antitumorali msaħħa b'mod sinerġiku. J Mater Chem B 2021;9:2674e87.

20. Wang JC, Zhao HT, Zhi KK, Yang X. Esplorazzjoni tal-proċess ta 'tagħbija ta' droga ta 'molekula żgħira attiva naturali u effikaċja sinerġistika kontra t-tumur effiċjenti ħafna. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:6827e39.

21. Cheng JJ, Zhao HT, Yao L, Li Y, Qi BK, Wang J, et al. Steroli naturali sempliċi u multifunzjonali awto-immuntati b'fotosensibilizzanti supramolekulari medjati mill-attività kontra l-kanċer għal terapija fotodinamika msaħħa kontra t-tumur. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11: 29498e511.

22. Cheng JJ, Zhao HT, Wang JC, Han Y, Yang X. Coasembly naturali bijoattiv ta 'molekula żgħira sintonizzata ta' drogi fotosensittivi għal fotokimoterapija sinerġistika u msaħħa Tip I effiċjenti ħafna. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:43488e500.

23. Wang JC, Zhao HT, Qiao WS, Cheng JJ, Han Y, Yang X. Nanomedicine-cum-carrier permezz ta 'ko-assemblaġġ ta' prodotti żgħar naturali għal antitumor imsaħħaħ sinerġistiku b'azzjonijiet protettivi tat-tessuti. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:42537e50.

24. Xi JC, Liu HP. Avvanzi riċenti fid-disinn ta 'mediċini u vaċċini anfifiliċi li jitwasslu lilhom infushom. Adv Ther 2019;3:1900107.

25. Zhang RS, Qin XF, Kong FD, Chen PW, Pan GJ. It-titjib tal-assorbiment ċellulari ta 'entitajiet terapewtiċi permezz ta' interazzjoni ma 'komponenti tal-membrana taċ-ċelluli. Drug Deliv 2019;26:328e42.

26. Pujals S, Giralt E. Peptidi li jippenetraw iċ-ċelluli amphipathic b'ħafna Proline. Adv Drug Deliv Rev 2008;60:473e84.

27. Karimi M, Ghasemi A, Sahandi Zangabad P, Rahighi R, Moosavi Basri SM, Mirshekari H, et al. Mikro/nanopartiċelli intelliġenti f'sistemi ta' twassil ta' drogi/ġeni li jirrispondu għall-istimolu. Chem Soc Rev 2016;45: 1457e501.

28. Cheng JJ, Li XY, Wang S, Han Y, Zhao HT, Yang X. Prodrugs triterpene mingħajr trasportatur b'rispons ta 'glutathione u bijosigurtà għal fotokimoterapija msaħħa b'mod sinerġiku. ACS Appl Mater Interfaces 2021;13:245e56.

29. Li XS, Lee SY, Yoon J. Photosensitizers supramolekulari nifs ġdid it-terapija fotodinamika. Chem Soc Rev 2018;47:1174e88.

30. Zou P, Yuan SJ, Yang X, Guo YZ, Li LN, Xu CW, et al. Karatterizzazzjoni strutturali u effetti antitumorali ta 'chitosan oligosaccharides kontra tumur tal-fwied ortotopiku permezz ta' mogħdija ta 'sinjalazzjoni NF-kB. J Funct Foods 2019;57:157e65.

31. Zhai XC, Yuan SJ, Yang X, Zou P, Li NL, Li GY, et al. Chitosan oligosaccharides jinduċu apoptożi fil-karċinoma tal-kliewi tal-bniedem permezz ta 'stress tar-retikulu endoplasmiku dipendenti mill-ispeċi reattivi-ossiġenu. J Agric Food Chem 2019;67:1691e701.

32. Deng G, Ma C, Zhao HT, Zhang SQ, Liu J, Liu FY, et al. Terapija kombinata kontra l-edema u l-antiossidanti għal puplesija iskemika permezz ta 'nanopartiċelli tal-aċidu betuliniku mgħobbija bil-glyburide. Theranostics 2019;9: 6991e7002.

33. Liu K, Xing RR, Zou QL, Ma GH, Mo¨hwald H, Yan XH. Awto-assemblaġġ sempliċi ta' fotosensitizers sintonizzat b'peptide lejn terapija fotodinamika kontra l-kanċer. Angew Chem Int Ed Engl 2016;55:3036e9.

34. Li Y, Lin JY, Wang PY, Luo Q, Lin HR, Zhang Y, et al. Nanodrug ispirat mill-virus tal-virus li jimmira lilhom infushom li jirrispondu għall-mikroambjent tat-tumur għall-kimoterapija fototermali qrib infrared-II ggwidata mill-immaġini. ACS Nano 2019;13:12912e28.

35. Sawada SI, Sato YT, Kawasaki R, Yasuoka JI, Mizuta R, Sasaki Y, et al. Assemblaġġ ibridu ta 'Nanogel għall-kunsinna intraċellulari ta' exosome: effetti fuq endoċitosi u fużjoni mill-inġinerija tal-polimeru tal-wiċċ ta 'exosome. Biomater Sci 2020;8:619e30.

36. Chou TC. Bażi teoretika, disinn sperimentali, u simulazzjoni kompjuterizzata ta 'sinerġismu u antagoniżmu fi studji ta' kombinazzjoni ta 'drogi.... Pharmacol Rev 2006;58:621e81.

37. Zhao YP, Zhao YN, Ma QS, Sun B, Wang QP, Ding Z, et al. Nanorods mingħajr trasportatur, doppju funzjonanti permezz ta 'awto-assemblaġġ ta' molekuli ta 'mediċina pura għal terapija kimo-fotodinamika sinerġistika. Int J Nanomed 2019;14:8665e83.

38. Ma X, Zhao YL. Applikazzjonijiet bijomediċi ta 'sistemi supramolekulari bbażati fuq interazzjonijiet host-mistieden.... Chem Rev 2015;115:7794e839.

39. Qin XH, Zhang MZ, Hu X, Du Q, Zhao ZP, Jiang Y, et al. Nanoinġinerija ta 'derivattiv e6 tal-klorin iddisinjat ġdid għal terapija fotodinamika amplifikata permezz tar-regolazzjoni tal-metaboliżmu tal-lactate. Nanoskala 2021;13:11953e62.

40. Du Q, Qin XH, Zhang MZ, Zhao ZP, Li Q, Ren XM, et al. Nanodrug mingħajr trasportatur regolabbli mill-metaboliżmu mitokondrijali biex tkabbar is-sensittività tat-terapija fototermali. Chem Commun (Camb) 2021;57:8993e6.

41. Li XS, Yu S, Lee D, Kim G, Lee B, Cho Y, et al. Approċċ supramolekulari faċli għal nanoteranostiċi attivabbli mmexxija mill-aċidu nuklejku li jegħlbu l-iżvantaġġi tat-terapija fotodinamika. ACS Nano 2018; 12:681e8.

2. Gilson RC, Black KC, Lane DD, Achilefu S. Hybrid TiO2-nano-photosensitizer rutenju jipproduċi b'mod sinerġiku speċi ta 'ossiġnu reattivi kemm f'kundizzjonijiet iposiċi kif ukoll normosiċi. Angew Chem Int Ed Engl 2017;56:10717e20.

43. Xu SD, Yuan YY, Cai XL, Zhang CJ, Hu F, Liang J, et al. Irfinar tad-distakk tal-enerġija singlet-triplet: approċċ uniku għal fotosensitizers effiċjenti b'karatteristiċi ta 'emissjoni indotta mill-aggregazzjoni (AIE). Chem Sci 2015;6:5824e30.

44. Wu WB, Mao D, Xu SD, Kenry, Hu F, Li XQ, et al. Fotosensibilizzazzjoni mtejba polimerizzazzjoni. Chem 2018;4:1937e51.

45. Kundu PK, Samanta D, Leizrowice R, Margulis B, Zhao H, Bo¨rner M, et al. Awto-assemblaġġ ikkontrollat ​​mid-dawl ta 'nanopartiċelli mhux fotoresponsivi. Nat Chem 2015;7:646e52.

46. ​​Miyazaki M, Yuba E, Hayashi H, Harada A, Kono K. Liposomi modifikati mill-polimeru sensittivi għall-pH ibbażati fuq l-aċidu hyaluronic għal sistemi ta 'kunsinna ta' drogi intraċellulari speċifiċi għaċ-ċelluli. Bioconjug Chem 2018;29:44e55.

47. Zhang JY, Liu ZN, Lian P, Qian J, Li XW, Wang L, et al. Immaġini selettivi u mewt taċ-ċelluli tal-kanċer permezz ta 'fluworexxenza qrib infra-aħmar li tista' tinbidel bil-pH u effetti fototermali. Chem Sci 2016;7:5995e6005.

48. Cheng JJ, Tan GH, Li WT, Zhang HY, Wu XD, Wang ZQ, et al. Sinteżi faċli ta 'Fe3O4@SiO2@CS@pyropheophorbide-a nanopartiċelli fluworexxenti multifunzjonali assistita minn chitosan għal terapija fotodinamika. New J Chem 2016;40:8522e34.

49. Cheng JJ, Wang S, Zhao HT, Liu Y, Yang X. Esplorazzjoni tal-mekkaniżmu ta 'awtoassemblaġġ u kimofototerapija sinerġistika effettiva kontra t-tumur ta' nanodrug fotosensittiv medjat mill-prodrug ta 'l-aċidu ursoliku bijodegradabbli u li jirrispondi għall-glutathione. Biomater Sci 2021;9: 3762e75.

50. Yang Y, Xu J, Sun Y, Mo LT, Liu B, Pan XS, et al. Reazzjoni tal-kompjuters loġika bbażata fuq Aptamer fuq ċelluli ħajjin biex tippermetti terapija ta 'imblokk tal-punti ta' kontroll immuni mhux antikorpi. J Am Chem Soc 2021;143: 8391e401.

51. Kuai R, Yuan WM, Son SJ, Nam J, Xu Y, Fan YC, et al. Eliminazzjoni ta 'tumuri stabbiliti b'kimoimmunoterapija kombinata bbażata fuq nanodisc. Sci Adv 2018;4:eaao1736.

52. Lesniak WG, Chatterjee S, Gabrielson M, Lisok A, Wharram B, Pomper MG, et al. Sejbien ta' PD-L1 f'tumuri bl-użu ta' [(64)Cu]atezolizumab ma' PET. Bioconjug Chem 2016;27:2103e10.

53. Sagiv-Barfi I, Kohrt HEK, Czerwinski DK, Ng PP, Chang BY, Levy R. L-immunità terapewtika kontra t-tumur permezz ta 'blokk tal-punt ta' kontroll hija msaħħa b'ibrutinib, inibitur kemm ta 'BTK kif ukoll ta' ITK. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:E966e72.

54. Liang C, Chao Y, Yi X, Xu J, Feng LZ, Zhao Q, et al. Terapija radjuisotopika interna medjata minn nanopartiċelli biex iżżid lokalment il-permeabilità tal-vaskulatura tat-tumur għal terapiji tal-kanċer imtejba b'mod sinerġiku. Bijomaterjali 2019;197:368e79.