Proprjetajiet Foto-Protettivi U Anti-Melanoġeniċi Ta' Estratti ta' Kadsura Coccinea differenti

Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ir-radjazzjoni ultravjola solari (UV), ikkaratterizzata minn UVA (320–400 nm), UVB (280–320 nm), u UVC (100–280 nm), hija l-aktar fattur ambjentali kritiku li jikkawża kanċer tal-ġilda u xjuħija fotolika li tirriżulta minn ċitotossiċità, ġenotossiċità , u fototossiċità. Speċifikament, ir-radjazzjoni UVA u UVB jinkludu aktar minn 95 fil-mija u 3 fil-mija tal-irradjazzjoni UV ta 'kuljum, rispettivament [8]. L-irradjazzjoni UVA u UVB tista 'tinduċi speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) indirettament jew direttament billi tippenetra s-saffi epidermali u/jew dermali tal-ġilda, li twassal għal ħsara ossidattiva u mewt taċ-ċelluli. F'dawn l-aħħar deċennji, ir-radjazzjoni UV saret tħassib serju għas-saħħa tal-ġilda u għadha qed tinfirex b'mod perikoluż mad-dinja kollha [9–11]. L-irradjazzjoni UV hija stimulant dirett u konsistenti tal-keratinoċiti, li jammontaw għal madwar 95 fil-mija tal-massa taċ-ċelluli epidermali tal-ġilda. Il-keratinoċiti jaġixxu bħala l-ewwel ostaklu kontra perikli mikrobjali, kimiċi u fiżiċi, u jgħinu fid-difiża kontra r-radjazzjoni UVA u UVB. Meta l-keratinoċiti jkunu esposti għal UVA u UVB, jiġu ġġenerati ROS intraċellulari, u b'hekk tiskatta l-apoptożi [12-14].

Il-melanoċiti huma responsabbli għall-produzzjoni u l-kwantità ta 'pigmenti tal-melanin, li huma atturi importanti fid-difiża bijoloġika tal-epidermide tal-ġilda; id-disregolazzjoni tagħhom tista 'tikkawża disturbi ta' iperpigmentazzjoni jew ipopigmentazzjoni [15,16]. Melanocytes huma mqassma fl-istratum basale tal-epidermide tal-ġilda, li hija affettwata wkoll minn espożizzjoni għad-dawl tax-xemx, speċi reattivi ta 'ossiġnu (ROS), u ormoni li jistimulaw il-melanocyte (-MSH) [17,18]. Tyrosinase, membru tal-familja tal-proteini tar-ram tat-tip-3, hija metalloproteina kkonservata b'mod evoluttiv li għandha rwol kruċjali fil-melanoġenesi u fl-attivitajiet ta' monophenol monooxygenase, catecholase, u diphenols. Ir-regolazzjoni 'l isfel ta' tyrosinase, proteina relatata mat-tyrosinase-1 (TRP-1), u proteina relatata mat-tyrosinase-2 (TRP{-2) għandhom effetti katalitiċi distinti. TRP-1 huwa 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase, u TRP-2 huwa DOPAchrome tautomerase [19,20]. Barra minn hekk, il-fattur tat-traskrizzjoni relatat mal-mioftalmosi (MITF) u l-proteina li tgħaqqad l-element li tirrispondi għall-cAMP (CREB) huma fatturi ta 'traskrizzjoni li primarjament jirregolaw il-melanoġenesi u jikkodifikaw informazzjoni dwar il-mod u l-intensità tal-istimulazzjoni [17,21]. Studji multipli ddikjaraw li l-mogħdijiet MITF u CREB jirregolaw il-melanoġenesi. MITF huwa fattur ewlieni fit-traskrizzjoni ta 'enzimi relatati mal-melanoġenesi u r-regolatur ċentrali tal-melanoġenesi. -MSH twassal għall-espressjoni ta 'MITF permezz ta' mekkaniżmu ta 'sinjalazzjoni li jinvolvi proteina li torbot relatata ma' cAMP (CREB). Imbagħad, MITF jidħol fin-nukleu bis-sekwenza tal-kaxxa M (AGTCATGTGCT) biex jippromwovi t-traskrizzjoni ta 'ġeni u enzimi melanoġeniċi speċifiċi. Huwa magħruf ukoll li CREB fosforilat huwa stimulat minn -MSH, li jingħaqad mal-element ta 'kunsens CRE fil-promotur Mitf biex jirregola t-traskrizzjoni Mitf [21-24].

F'dan l-istudju, estratti ta 'għerq KC (KCR), zokk (KCS), weraq (KCL) u frott (KCF) ġew imqabbla b'mod komprensiv u saru evalwazzjonijiet multipli tal-proprjetajiet fotoprotettivi u anti-melanoġeniċi tagħhom.

2. Materjali u Metodi

2.1. Preparazzjoni ta' Estratti KC

Pjanta KC 15 ta 'tliet snin tkabbar f'borma tal-plastik ta' 9 L fil-kampus ta 'Miryang tal-Università Nazzjonali ta' Pusan. KC ġie identifikat mill-Professur Young Whan Choi, l-awtur ta 'dan l-istudju. Dawn il-kampjuni ġew depożitati bħala kampjuni ta 'vawċers (numru ta' adeżjoni KC- PDRL-1) fl-erbarju tad-Dipartiment tal-Bijoxjenza Ortikulturali, Kulleġġ tar-Riżorsi Naturali u Xjenza tal-Ħajja, Università Nazzjonali ta 'Pusan. Il-pjanti ġew mogħtija l-ilma biżżejjed bl-użu ta' soluzzjoni nutrittiva kompluta b'livell ta' konduttività ta' 1.0 mS·cm−1 u li kien fih l-elementi li ġejjin (f'me·L−1): LE3-N, 16; NH4-N, 1.34; P, 4; K, 8; Ca, 8; u S, 4. KC gown fil-port inħasad f'Diċembru 2020 billi kklassifika għeruq, zkuk, weraq u frott (Figura 1A). Kampjuni maħsuda ġew immedjatament lajofilizzati fi freeze dryer u maħżuna f'boroż tal-vinil f'20 ◦C sal-analiżi. L-għeruq imnixxfa, zkuk, weraq, u frott ta 'KC (20 g) ġew mitħun fi trab fin u estratti f'temperatura tal-kamra bl-alkoħol etiliku. Fil-qosor, filtrazzjoni u evaporazzjoni ta 'estratti EtOH ta' KC saru taħt pressjoni mnaqqsa f'45 ◦C segwita minn lajofilizzazzjoni. Fl-aħħarnett, l-estratt solidu (50 mg/mL) ġie maħlul f'dimethyl sulfoxide (DMSO) għal aktar esperimenti.

cistancheherba epimedium sagittatumestratt

2.2. Kontenut totali ta 'Polyphenolic u Flavonoid ta' Estratti KC

Kif deskritt qabel [25], il-kontenut totali ta 'polifenoli u flavonoid ta' estratti ta 'għerq, zokk, weraq u frott KC ġew imkejla bl-użu tal-metodi kolorimetriċi Folin-Ciocalteu (polifenol totali) u klorur tal-aluminju (flavonoid). L-assorbiment tkejjel f'700 nm (polifenol totali) bl-użu ta' Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK) u f'510 nm (flavonoid) bl-użu tal-VICTOR Multilabel Plate Reader (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) .

Il-kurvi standard inbnew bl-użu ta' aċidu galliku (polifenol totali) u quercetin (flavonoid) bħala l-istandards, u r-riżultati ġew espressi bħala ekwivalenti ta' aċidu galliku għal kull gramma (GAE/g) ta' estratti ta' għerq, zokk, weraq u frott KC u ekwivalenti ta' quercetin. għal kull gramma (QE/g) ta 'għerq KC, zokk, weraq, u estratti tal-frott, rispettivament.

2.3. Assaġġ DPPH u ABTS

L-attivitajiet ta' tneħħija radikali DPPH u ABTS ta' estratti ta' għerq, zokk, weraq u frott KC ({{0}}.5 mg/mL) ġew imkejla skont metodu deskritt qabel [25] b'modifiki żgħar. Estratti ta' għerq, zokk, weraq u frott KC (0.5 mg/mL) tħalltu ma' soluzzjoni DPPH (60 µM) f'mikroplates. Wara li l-kampjuni tħawwdu b'mod vigoruż, inżammu fid-dlam f'25 ◦C għal 0.5 h. Soluzzjonijiet ta 'ħażna ta' 7 mM ABTS u 2.6 persulfate tal-potassju ġew ippreparati f'ilma distillat f'temperatura tal-kamra fid-dlam għal 18-il siegħa. L-għerq KC, iz-zokk, il-weraq u l-estratti tal-frott (0.5 mg/mL) tħalltu mas-soluzzjoni tax-xogħol u mbagħad tħallew joqgħod għal 0.5 sigħat f'temperatura tal-kamra fid-dlam. L-assorbenza tat-taħlitiet tal-kampjuni ġiet immonitorjata f'510 nm (DPPH) jew 734 nm (ABTS).

2.4. Kultura taċ-Ċelloli

Il-Keratinoċiti aderenti (HaCaT) u l-melanoċiti aderenti (B16F10) ġew imlaqqma f'soluzzjoni tal-kultura DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) li fiha 10 fil-mija FBS (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) u 1 fil-mija penicillin/streptomycin (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) u kkultivati ​​f'37 ◦C b'5 fil-mija CO2. It-tkabbir taċ-ċelluli HaCaT u B16F10 aderenti kien osservat regolarment, u l-medju kien mibdul kull jumejn jew tlett ijiem. Ċelloli mill-fażi tat-tkabbir logaritmiku ntużaw għal esperimenti sussegwenti.

2.5. Irradjazzjoni UVA u UVB

Il-keratinoċiti ġew esposti għall-irradjazzjoni UVA jew UVB (Bio-Link BLX-365, Villber- Lourmat, Eberhardzell, il-Ġermanja) b'tubi 5 8 W li jarmu l-biċċa l-kbira tal-enerġija tagħhom f'ogħla livell ta' emissjoni jew f'365 nm ( UVA) jew 312 nm (UVB). Dożi ta 'irradjazzjoni UVA kienu 20 J/cm2 u dożi ta' irradjazzjoni UVB kienu 50 mJ/cm2.

2.6. Kejl tal-Vijabilità taċ-Ċelloli u Ċitotossiċità permezz ta' Analiżi CCK-8 u LDH

Għall-analiżi tal-vijabbiltà taċ-ċelluli, soluzzjoni tal-Kit tal-Għoti taċ-Ċelloli-8 (CCK{-8) mill-Kit tal-Assaġġi CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ġiet miżjuda mal-keratinoċiti HaCaT u sospensjonijiet taċ-ċelluli tal-melanoma B16F10 skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur u inkubati f'37 ◦C għal 4 sigħat. Fil-qosor, 2 104 ċelluli ġew miżrugħa f'kull bir ta 'pjanċa ta' 24-bir u inkubati b'5 fil-mija CO f'37 ◦C għal 24 siegħa. Fil-qosor, 2 104 ċelluli ġew miżrugħa f'kull bir ta 'pjanċa ta' 24-bir u inkubati b'5 fil-mija CO f'37 ◦C għal 24 siegħa. Wara 24 siegħa ta 'inkubazzjoni, reaġent CCK-8 ġie miżjud ma' kull bir, u ċ-ċelloli ġew inkubati aktar għal 4 sigħat. Intuża kit ta 'skoperta ta' ċitotossiċità (Roche Applied Science, l-Isvizzera) biex jiddetermina r-rilaxx ta 'lactate dehydrogenase extraċellulari (LDH) fil-medju tal-kultura tal-keratinoċiti HaCaT. L-assorbenza ġiet analizzata f'450 nm (CCK-8) u 490 nm (LDH) bl-użu ta' VICTOR Multilabel Plate Reader.

2.7. Evalwazzjoni tal-Produzzjoni Intraċellulari ta' ROS f'Keratinoċiti

Il-livelli ta' ROS intraċellulari ġew analizzati bl-użu ta' {{0}}(u-6)-chloromethyl-2′,7′-dichloride-hydrofluorescein diacetate acetyl ester (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, l-Istati Uniti). Il-proċeduri kollha twettqu skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Fil-qosor, wara trattament ta' estratti parzjali oħra ta' KC (0.5 mg/mL), Keratinocytes (HaCaT) ġew maħsula b'salina buffered bil-fosfat (PBS) u inkubati b'CM-H2DCFDA (5 µM) għal 0.5 h f' id-dlam. Minn hemm 'il quddiem, il-ġenerazzjoni ta' ROS intraċellulari ġiet viżwalizzata bl-użu ta 'mikroskopju fluworexxenti Carl Zeiss; L-intensità tal-fluworexxenza tkejjel ibbażata fuq żebgħa fluworexxenti (CM-H2DCFDA) bl-użu ta 'ċitometru tal-fluss (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, USA).

2.8. Analiżi ta 'Apoptosis

Wara l-espożizzjoni u t-trattament, il-keratinoċiti HaCaT ġew trypsinizzati u ċentrifugati. Sussegwentement, l-apoptosi taċ-ċelluli miksuba ġiet evalwata bl-użu tal-fluorescein isothiocyanate (FITC) Annexin V/Dead CellApoptosis Kit (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, USA) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Fil-qosor, il-keratinoċiti tlaħlaħ darbtejn b'PBS, u nkisbu l-keratinoċiti fil-buffer tal-irbit tal-annexin u tħalltu ma 'soluzzjoni tax-xogħol FITC/Annexin V (komponent A) u propidium iodide (PI). Wara l-inkubazzjoni f'temperatura tal-kamra għal 15-il minuta fid-dlam, ġiet imkejla l-apoptosi tal-keratinoċiti u l-perċentwal ta 'ċelluli apoptotiċi ġie kkalkulat permezz ta' ċitometru tal-fluss (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, USA). Instabu sinjali għall-kanali FL1 (FITC/Nexin V) u FL3 (PI), u ġew stabbiliti tbajja tal-markatur tal-kwadrant u plots b'tikek taċ-ċelloli mtebbgħin.

2.9. Analiżi tal-Kontenut Intraċellulari ta' Melanin u Attività Tyrosinase

Il-kontenut intraċellulari tal-melanin u l-analiżi tal-attività tat-tyrosinase ġew imkejla billi spjegaw fejn kienet differenti l-proċedura kemmxejn modifikata [24]. Melanoċiti ġew ittrattati b'konċentrazzjoni finali ta '0.5 µM -MSH u l-0.5 mg/mL KC estratti parzjali oħra għal 48 siegħa. Pellets tal-melanocyte ġew lysed b'1 N NaOH f'10 fil-mija DMSO f'80 ◦C għal siegħa. Il-kontenut relattiv ta' melanin ġie ddeterminat billi titkejjel l-assorbenza f'475 nm bl-użu ta' VICTORMultilabel Plate Reader. L-attività intraċellulari tat-tyrosinase ġiet iddeterminata billi titkejjel ir-rata ta 'produzzjoni ta' dopachrome bl-użu ta 'L-DOPA. Melanoċiti ġew maħsula b'PBS kiesaħ bis-silġ u lysed f'PBS li kien fih 1 fil-mija (w/v) Triton X-100. Is-sottostrat tat-tyrosinase L-DOPA (2 mg/mL) kien ippreparat fl-istess buffer tal-liżi tal-fosfat. Kull estratt tpoġġa fi 96-pjanċa tal-bir, u nbdiet analiżi tal-enżimi billi żżid soluzzjoni L-DOPA. Wara l-inkubazzjoni għal siegħa, l-assorbiment tkejjel f'475 nm bl-użu ta 'VICTOR Multilabel Plate Reader biex tanalizza l-produzzjoni ta' dopachrome. Il-valur ta' kull kejl kien espress bħala perċentwal tal-kontroll. Arbutin(A, 0.5 mg/mL) intuża bħala kontroll pożittiv.

Cistancheechinacosidehuwa inibitur tat-tyrosinase.

2.10. PCR kwantitattiv f'ħin reali

L-RNA totali ġie iżolat minn kull grupp ta 'melanoċiti bl-użu tal-RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, il-Ġermanja). It-traskrizzjoni inversa twettqet bl-użu tal-kit ta 'traskrizzjoni inversa ta' cDNA ta 'kapaċità għolja (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA), skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur, biex tinkiseb l-ewwel linja ta' cDNA. Il-fergħat imbagħad intużaw bħala mudelli għal PCR kwantitattiv f'ħin reali (qRT-PCR) bl-użu ta 'strument Bio-Rad Chromo4TM u taħlita prinċipali SYBR Green qPCR (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA). PCR twettqet taħt denaturazzjoni minn qabel f'95 ◦C għal 5 min, denaturazzjoni f'95 ◦C għal 15 s, u ittemprar f'55-58 ◦C għal 30 s. GAPDH mRNA intuża bħala referenza interna għal tyrosinase, TRP-1, u TRP-2 mRNA. Il-valur relattiv tal-espressjoni tal-ġene fil-mira=2-∆∆CT. Is-sekwenzi tal-primer kienu kif ġej: Tyrosinase-sens (5′-ggccagctttcaggcagaggt-3′), Tyrosinase-anti-sens (5′-tggtgcttcatgggc aaaatc-3′), TRP-1-sens (5 ′-agccccaactctgtcttttc-3′), TRP-1-anti-sens (5′-ggtctccctacatttccagc-3′), TRP-2-sens (5′- tccagaagtttgacagccc-3 ′), TRP-2-anti-sens (5′-ggaaggagtgagccaagttatg-3′), GAPDH-sens (5′-aggtggtctcctctgacttc{-3′), u GAPDH-antisens (5′-taccaggaaatgagcttgac -3′).

2.11. Western Blotting

Melanoċiti ġew maħsuda u lysed bl-użu ta 'reaġent ta' estrazzjoni ta 'proteini mammiferi (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Il-proċeduri kollha twettqu skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-konċentrazzjonijiet kollha tal-proteini ġew determinati bl-użu ta 'kit ta' analiżi tal-proteini Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Imbagħad, il-buffer tat-tagħbija ġie miżjud mas-supernatant tal-proteina u mħallat. It-taħlita kienet mgħollija għal 10 min, u l-proteini ġew separati bl-użu ta 'Mini-PROTEAN Precast Gels (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) u trasferiti fuq membrana Hybond polyvinylidene difluoride (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). L-immunodetezzjoni saret bl-użu ta' tyrosinase (1:1000), TRP-1 (1:1000), TRP-2 (1:1000), MITF (1:1000), CREB fosforilat (p-CREB 1: 1000), CREB (1:1000), u -tubulin (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) bl-użu ta 'SignalBoost Immunoreaction Enhancer Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Il-membrana ġiet inkubata matul il-lejl bl-antikorpi primarji f'4 ◦C. L-antikorp sekondarju tal-mogħoż kontra l-fenek (IgG) (1:5000, Cell Signaling Technology) ġie miżjud mal-membrana u inkubat f'temperatura tal-kamra għal siegħa. Il-meded tal-proteini ġew osservati bl-użu ta 'sottostrat imtejjeb ta' Pierce ECL western blotting (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) u kkwantifikati bħala l-proporzjon tal-intensità tal-medda tal-proteina fil-mira mal-intensità tal-medda -tubulin.

2.12. Analiżi Statistika

L-assaġġi kollha ġew ripetuti b'mod indipendenti mill-inqas tliet darbiet. Il-parametri statistiċi kollha huma ppreżentati bħala l-iżball standard medju tal-medja (SEM). Analiżi statistiċi saru bl-użu ta 'analiżi ta' varjanza f'direzzjoni waħda (ANOVA), segwit mit-test post-hoc ta 'Dunn. Valur ta' p < 0.01="" jew="" p="">< 0.05="" tqieset="">

test għall-flavonoids

3. Riżultati

3.1. Tqabbil ta 'Proprjetajiet Antiossidanti ta' Diversi Estratti Parzjali ta 'KC

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25.7 ± 2.1 fil-mija) > KCF (8.7 ± 1.1 fil-mija) (Figura 1E).

3.2. Tqabbil ta' Keratinoċiti Vijabbli u Ħsara Ttrattati b'Diversi Estratti Parzjali ta' KC fil-Preżenza ta' UVA, UVB, jew Non-Irradjazzjoni

Aħna wettaq l-esperimenti li ġejjin biex nesploraw l-effetti ta 'onkeratinocytes KCR, KCS, KCL, u KCF. L-ewwel, l-estratti kollha ġew applikati għal keratinoċiti HaCaT fil-preżenza ta 'UVA, UVB, jew non-irradjazzjoni. L-analiżi CCK-8 wriet li l-estratti ma bidlux b'mod sinifikanti l-vijabbiltà tal-keratinoċiti f'konċentrazzjonijiet ta' 0.5 mg/mL. Aktar tard, keratinocytes ġew ittrattati b'KCR, KCS, KCL, u KCF fil-preżenza ta 'irradjazzjoni UVA jew UVB. L-irradjazzjoni UVA u UVB inibbet b'mod sinifikanti l-vijabbiltà tal-keratinoċiti, kif muri mill-analiżi CCK-8 fil-Figura 2A. Madankollu, sibna li l-vijabbiltà ta 'keratinoċiti irradjati UVA u UVB żdiedet fl-ordni li ġejja: KCL, KCR, KCS, u KCF (Figura 2A). Aħna mmonitorjajna wkoll il-keratinoċiti bil-ħsara billi kejlu r-rilaxx ta 'LDH extraċellulari. Ir-riżultati wrew li l-irradjazzjoni UVA jew UVB iffaċilitat b'mod sinifikanti r-rilaxx ta 'LDH; madankollu, KCL, KCR, KCS, u KCF attenwaw b'mod sinifikanti r-rilaxx ta 'LDH b'espożizzjoni UVA jew UVB f'dik l-ordni (Figura 2B). Ir-riżultati sperimentali ta 'hawn fuq urew li l-effetti anti-proliferattivi u ċitotossiċi ta' l-irradjazzjoni UVA jew UVB fuq keratinocytes ġew imtaffija fl-ordni ta 'KCL, KCR, KCS, u KCF. Notevolment, KCL jista 'jrestawra l-vijabbiltà taċ-ċelluli għal livelli ta' kontroll.

Figura 2. Il-vijabbiltà tal-keratinoċiti u l-effetti taċ-ċitotossiċità tal-estratt ta 'KCR, KCS, KCL, u KCF fil-preżenza ta' UVA, UVB jew non-irradjazzjoni.

3.3. Tqabbil tal-Produzzjoni Intraċellulari ta' ROS f'Keratinoċiti Ittrattati b'Diversi Estratti Parzjali ta' KC fil-Preżenza jew Assenza ta' Irradjazzjoni UVA u UVB

Peress li l-produzzjoni intraċellulari ta 'ROS tikkawża ħsara severa lill-keratinoċiti, huma kkunsidrati medjaturi potenzjali ta' ħsara kkawżata mir-radjazzjoni UVA jew UVB. Diversi studji ssuġġerew li l-irradjazzjoni UVA jew UVB tinduċi produzzjoni endoġena ta 'ROS [12,14]. Immirajna li niddeterminaw jekk kienx hemm żieda fil-livelli endoġeni ta' ROS f'keratinoċiti irradjati bl-UVA jew bl-UVB. Għaldaqstant, analiznajna l-intensità intraċellulari tal-fluworexxenza tas-sonda CM-H2DCFDA billi tuża mikroskopija tal-fluworexxenza u ċitometrija tal-fluss. Bħala riżultat ta 'mikroskopija fluworexxenti, immaġini tat-tbajja' CM-H2DCFDA wrew tbajja ħafifa fil-kontroll, keratinoċiti kkurati KCR, KCS, KCL u KCF u tbajja sinifikanti f'keratinoċiti irradjati bl-UVA jew UVB (Figura 3A). Skont ir-riżultati kwantifikati taċ-ċitometrija tal-fluss, l-irradjazzjoni UVA u UVB żiedet il-livelli ta’ ROS intraċellulari fil-keratinoċiti b’27.2 ± 4.5 fil-mija u 34.1 ± 4.2 fil-mija, rispettivament, meta mqabbla ma’ dik fil-kontroll (5.7). ±0.2 fil-mija). Barra minn hekk, simili għar-riżultati tal-mikroskopija tal-fluworexxenza, ġie kkonfermat li l-livell ROS intraċellulari ġie mrażżan minn estratti KC fl-ordni ta 'KCL> KCR> KCS> KCF fil-preżenza ta' irradjazzjoni UVA jew UVB (Figura 3B). Dawn ir-riżultati jindikaw li diversi estratti parzjali ta 'KC inibixxu b'mod sinifikanti l-ħsara tal-keratinoċiti billi naqqsu l-livelli ta' ROS endoġeni.

Figura 3. Effett tal-estratt ta' KCR, KCS, KCL, u KCF fuq il-produzzjoni intraċellulari ta' ROS f'keratinoċiti UVA, UVB jew mhux irradjati

3.4. Tqabbil ta 'Apoptosis ta' Keratinocytes Ittrattati b'Diversi Estratti Parzjali ta 'KC fil-Preżenza jew Assenza ta' Irradjazzjoni UVA u UVB

Biex tiskopri l-apoptożi, li hija indikatur affidabbli tal-ħsara lill-keratinoċiti, il-keratinoċiti ġew imtebba 'b'Annexin V flimkien ma' propidium iodide. Il-Kit tal-Apoptożi taċ-Ċellula Mejta Annexin V/Dead Isothiocyanate (FITC) intuża biex jittestja r-rata ta 'apoptożi fil-keratinoċiti. L-irradjazzjoni UVA u UVB iffaċilitat l-attività tat-tbajja' ta' Annexin V, filwaqt li KCR, KCS, KCL, u KCF naqqsu r-rata ta' attività tat-tbajja' ta' Annexin V fil-preżenza ta' irradjazzjoni UVA u UVB. KCR, KCS, KCL, u KCF waħedhom (0.5 mg/mL) ma kkaġunawx attività ta' tbajja' ta' Annexin V. Dejta kkwantifikata miċ-ċitometrija tal-fluss uriet li l-irradjazzjoni UVA u UVB żiedet il-livelli ta’ apoptosi ta’ keratinoċiti b’46.3± 1.5 fil-mija u 48.7 ± 1.0 fil-mija , rispettivament, meta mqabbel ma' dak tal-kontroll (5.0 fil-mija ± 0.7 fil-mija). Importanti, ġie kkonfermat li l-livell ta 'apoptożi ġie mrażżan minn estratti KC fl-ordni ta' KCL> KCR> KCS> KCF fil-preżenza ta 'irradjazzjoni UVA jew UVB (Figura 4A, B). B'mod ġenerali, l-irradjazzjoni UVA u UVB ikkawżat ħsara lill-keratinoċiti u bosta estratti parzjali ta 'KC attenwaw il-ħsara lill-keratinoċiti indotta mill-irradjazzjoni UV.

Figura 4. Effett ta' estratti ta' KCR, KCS, KCL, u KCF fuq l-apoptożi f'keratinoċiti UVA, UVB jew mhux irradjati.

3.5. Tqabbil tal-Kontenut Intraċellulari ta' Melanin u l-Attività Tyrosinase ta' Melanoċiti Ittrattati b'diversi Estratti Parzjali ta' KC fil-Preżenza jew Assenza ta' Trattament -MSH

Qabel l-investigazzjoni tal-potenzjal bijoloġiku ta' KCR, KCS, KCL, u KCF fuq - melanoġenesi indotta mill-MSH, il-vijabbiltà taċ-ċelluli wara t-trattament ta' KCR, KCS, KCL, u KCF (0.5 mg/mL) ġiet evalwata bl-użu l-assaġġ CCK-8 fil-melanoċiti B16F10 bi jew mingħajr -MSH. KCR, KCS, KCL, u KCF (0.5 mg/mL) ma bidlu l-vijabbiltà taċ-ċelluli fil-preżenza jew in-nuqqas ta '-MSH (Figura 5A). -MSH huwa aġent melanoġeniku importanti li jista 'jżid il-kontenut ta' melanin intraċellulari billi jorbot mar-riċettur tal-melanocortin 1 u jattiva adenylate cyclase. Biex tinvestiga l-effett ta 'KCR, KCS, KCL, u KCF fuq il-melanoġenesi fil-melanoċiti, il-kontenut ta' melanin intraċellulari kien iddeterminat b'osservazzjoni viżwali u kejl bijokimiku. Kif muri fil-Figura 5B, il-kontenut ta 'melanin intraċellulari żdied b'mod sinifikanti b'-MSH. Madankollu, il-ko-trattament ma 'KCR, KCS, KCL, u KCF wera tnaqqis notevoli fil-kontenut ta' melanin intraċellulari meta mqabbel mat-trattament -MSH. Is-sekwenza ta 'kejl bijokimiku li tindika l-inibizzjoni tal-kontenut ta' melanin intraċellulari kienet kif ġej: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 5B). Assaġġ ta 'attività ta' tyrosinase intraċellulari sar skond l-assaġġ tal-kontenut ta 'melanin intraċellulari. L-attività intraċellulari tat-tirosinażi ta 'melanoċiti stimulati minn -MSH żdiedet, filwaqt li dik ta' melanoċiti stimulati minn -MSH ittrattati b'KCR, KCS, KCL, u KCF naqset. Is-sekwenza tal-kejl bijokimiku li tindika l-inibizzjoni tal-attività tat-tyrosinase intraċellulari kienet kif ġej: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 5C). Dawn ir-riżultati jindikaw li bosta estratti parzjali ta 'KC naqqsu b'mod sinifikanti l-kontenut ta' melanin intraċellulari u inibixxu l-attività ta 'tyrosinase mingħajr ma biddlu l-vijabbiltà taċ-ċelluli.

3.6. Tqabbil tal-Livelli ta' Traskrizzjoni u Traduzzjoni ta' Tyrosinase, TRP-1, u TRP-2 f'Melanoċiti Ittrattati b'Diversi Estratti Parzjali ta' KC fil-Preżenza jew Assenza ta'-Trattament MSH

Biex tesplora l-effett ta’ KCR, KCS, KCL, u KCF fuq ir-regolazzjoni baxxa tal-livelli ta’ espressjoni tal-proteina u mRNA tal-markaturi tal-melanoġenesi (tyrosinase, TRP-1, u TRP-2), il-melanoċiti ġew ittrattati b’KCR , KCS, KCL, u KCF fil-preżenza jew in-nuqqas ta' -MSH. Kif muri fil-Figura 6A–C, il-livelli ta 'mRNA ta' tyrosinase, TRP-1, u TRP-2 żdiedu b'mod sinifikanti bit-trattament -MSH. B'kuntrast, meta mqabbla mat-trattament -MSH, KCR, KCS, KCL, u KCF irregolaw l-espressjoni tal-mRNA ta 'tyrosinase, TRP-1, u TRP-2. Barra minn hekk, KCR, KCS, KCL, u KCF waħedhom ma kellhom l-ebda effett sinifikanti fuq il-livelli tal-mRNA ta' tyrosinase, TRP-1, u TRP-2. Analiżi Western blot twettqet b'kooperazzjoni mal-PCR f'ħin reali. Ir-riżultati wrew li t-trattament -MSH żied il-livelli tal-espressjoni tal-proteini ta 'tyrosinase, TRP-1, u TRP-2 u dawn il-livelli tnaqqsu permezz ta' ko-trattament b'KCR, KCS, KCL, u KCF (Figura 6D ). Is-sekwenza ta' PCR kwantitattiva f'ħin reali u inibizzjoni li tindika western blot ta' tyrosinase, TRP-1, u TRP-2 mRNA u espressjoni ta' proteini kienet kif ġej: KCL > KCR=KCS > KCF (Figura 6). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li diversi estratti parzjali ta 'KC għandhom il-potenzjal li jippromwovu l-anti-melanogenesis, li ntwera permezz ta' downregulation tal-markaturi tal-melanogenesis.

3.7. Tqabbil ta' Espressjoni MITF u Fosforilazzjoni CREB ta' Melanoċiti Ittrattati b'Diversi Estratti Parzjali ta' KC fil-Preżenza jew Assenza ta' Trattament -MSH

Tyrosinase, TRP-1, u TRP-2 huma essenzjali fil-melanoġenesi. L-espressjoni tagħhom hija regolata minn MITFexpression u CREB fosforilazzjoni [17,21]. Analiżi Western blot indikat li KCR, KCS, KCL, u KCFeffectively inibit iż-żieda fil-livell ta 'proteina ta' MITF ikkawżat minn trattament -MSH. Barra minn hekk, KCR, KCS, KCL, u KCF waħedhom bilkemm skoprew l-espressjoni tal-proteina MITF. Is-sekwenza ta 'riżultati kwantifikati tal-western blot li jindikaw l-inibizzjoni tal-livelli ta' espressjoni tal-proteini MITF kienet kif ġej: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 7A). Barra minn hekk, KCR, KCS, KCL, u KCF qalbu l-effetti tat-trattament -MSH fuq il-fosforilazzjoni CREB. KCR, KCS, KCL, u KCF waħedhom kellhom ftit effett fuq il-fosforilazzjoni CREB. Is-sekwenza ta 'riżultati kwantifikati tal-western blot li jindikaw inibizzjoni tal-livelli ta' fosforilazzjoni CREB kienet kif ġej: KCL> KCR> KCS> KCF (Figura 7B). Dawn ir-riżultati indikaw li diversi estratti parzjali ta 'KC irażżnu l-inmelanocytes tal-melanoġenesi, għall-inqas parzjalment, permezz ta' espressjoni MITF u fosforilazzjoni CREB.

4. Diskussjoni

Il-popolarità tat-tibjid tal-ġilda qed tiżdied madwar id-dinja minħabba ż-żieda fl-irradjazzjoni UV, u x'aktarx li tilħaq proporzjonijiet għoljin fid-deċennji li ġejjin għal skopijiet estetiċi [8]. It-tipi numerużi ta 'bliċ, bħall-aċidu kojic u l-arbutin, intużaw fis-swieq kosmetiċi u farmaċewtiċi. Barra minn hekk, l-estratti naturali qed jirċievu attenzjoni dejjem akbar minħabba attivitajiet antiossidanti, anti-infjammatorji, anti-tumur, antibatteriċi u oħrajn potenzjali tagħhom [26,27]. Ibbażat fuq il-karatteristiċi ta 'antiossidanti u fotoprotettivi u anti-melanogenesis, ġew żviluppati bosta kandidati kosmetiċi u farmaċewtiċi. Huwa magħruf sew li dawn il-proprjetajiet tal-kandidati li jbajdu huma kontributuri indispensabbli għar-riċerka u l-iżvilupp kożmetiċi u farmaċewtiċi [28]. It-TDM għandu proprjetajiet multi-komponenti u multi-mira u jtejjeb ħafna l-effettività bijoloġika tal-bniedem u l-kwalità tal-ħajja [29]. Ir-riċerka fitokimika moderna turi li l-KC fih varjetà ta’ ingredjenti, b’lignans u terpenojdi huma l-ingredjenti ewlenin [30]. Ġew identifikati aktar minn 202 kompost, inklużi lignans dibenzocyclooctadiene, Spirobenzofuranoid dibenzocyclooctadiene lignans, Arylnaphthalene lignans, Kadlongilactone triterpenoids, u sesquiterpenoids [31,32]. Id-driedroots, iz-zkuk, u l-weraq ta 'KC għandhom tradizzjoni wiesgħa ta' użu fit-TDM biex jittrattaw artrite rewmatojde, ulċeri duwodenali, disturbi gastrointestinali, u problemi ġinekoloġiċi. L-għeruq imnixxfa ta 'KC, b'azzjonijiet ta' tindif tas-sħana u li jeliminaw it-tossini, jinduċu dijureżi għat-tneħħija tal-edema. Frott ta 'KC huwa kkunsmat l-aktar fil-forma ta' frott frisk, meraq, u inbid tal-frott, li jindika li huma ta 'benefiċċju għas-saħħa tal-bniedem [7,33,34]. Studji preċedenti wrew ukoll li hija rikka f'ingredjenti bijoattivi bħal lignans, triterpenoids, flavonoids, aċidi fenoliċi, sterojdi u aċidi amminiċi, li għandhom valur nutrittiv u mediċinali għoli [3,35]. F'dan l-istudju, ġew estratti partijiet differenti ta 'KC. Notevolment, il-kontenut totali ta 'polifenoli u flavonojdi tal-weraq u l-għeruq KC kienu ħafna ogħla minn dawk ta' zkuk u frott. Il-weraq u l-għeruq fihom aktar mid-doppju ta' polifenoli u flavonoids minn zkuk u frott. Bħala riżultat, aħna nikkunsidraw li l-polifenoli u l-flavonoids totali jagħtu kontribut sinifikanti għall-effetti fotoprotettivi u anti-melanoġeniċi tal-KC.

Fototossiċità tal-ġilda kkawżata mir-radjazzjoni UV hija primarjament dovuta għal ċitotossiċità taċ-ċelluli, akkumulazzjoni ta 'ROS intraċellulari, u apoptożi fil-keratinoċiti. Għalhekk, huwa aktar raġonevoli li tiffoka fuq l-inibizzjoni taċ-ċitotossiċità taċ-ċelluli, l-akkumulazzjoni intraċellulari ta 'ROS, u l-apoptożi f'keratinoċiti irradjati bl-UVA u UVB [36,37]. Kif deskritt f'dan l-istudju [10,38], l-intervent b'estratti KC fuq foto-ċitotossiċità (UVA: 20 J/cm2, UVB: 50 mJ/cm2) riżultati wrew li estratti KC naqqsu b'mod sinifikanti ċ-ċitotossiċità taċ-ċelluli, l-akkumulazzjoni intraċellulari ta 'ROS u apoptożi. B'mod konsistenti mar-riżultati preċedenti, l-effetti fotoprotettivi tal-weraq u l-għeruq tal-KC kienu ħafna ogħla minn dawk taż-zokk u tal-frott. Barra minn hekk, ir-riżultati tagħna indikaw li l-estratti KC juru l-effetti msemmija hawn fuq billi jippromwovu attività antiossidanti. Il-melanogenesis spiss tiġi osservata wara l-irradjazzjoni UV u hija primarjament assoċjata ma 'pigmentazzjoni jew iperpigmentazzjoni [39]. Skont studji preċedenti, il-metodu ta 'induzzjoni tal-melanoġenesi bl-użu ta' -MSH ġie rikonoxxut u applikat b'mod wiesa '. Għalhekk, dan l-istudju kien ibbażat fuq il-kostruzzjoni ta 'mudell ta' melanocyte stimulat b'-MSH [24,39]. Sibna li l-estratti KC irażżnu l-kontenut intraċellulari tal-melanincontent u l-attività tyrosinase stimulati minn -MSH. Barra minn hekk, estratti KC irregolaw b'mod baxx it-traskrizzjoni u t-traduzzjoni ta' markaturi tal-melanoġenesi bħal tyrosinase, TRP-1, u TRP-2 f'melanoċiti stimulati minn -MSH. Barra minn hekk, investigajna l-espressjoni tal-proteini MITF u l-fosforilazzjoni CREB f'melanoċiti stimulati minn -MSH. Bl-istess mod, f'dan l-istudju, sibna li l-estratti KC irażżnu l-espressjoni tal-proteina MITF medjata minn -MSH u l-fosforilazzjoni CREB fil-melanoċiti. B'mod konsistenti mar-riżultati fotoprotettivi, l-effetti anti-melanoġeniċi tal-weraq u l-għeruq KC kienu ħafna ogħla minn dawk taż-zkuk u l-frott.

slices cistanche

Għal aktar informazzjoni, jekk jogħġbok ikklikkja hawn.

5. Konklużjonijiet

B'mod ġenerali, l-effetti fotoprotettivi u anti-melanoġeniċi potenzjali tal-estratt KC instabu f'dan l-istudju. L-estratt KC b'kontenut għoli ta 'polifenol u flavonoid jista' jeżerċita effetti foto-protettivi u anti-melanoġeniċi fuq keratinocytes u melanocytes.This studju jipprovdi raġuni u strateġija ta 'riċerka għal interventi kosmetiċi u farmaċewtiċi għal aġenti li jbajdu u fotoprotettivi naturali.