Phenylethanol Glycosides Minn Cistanche Tubulosa Jrażżan l-Attivazzjoni taċ-Ċelluli Stellate Epatiċi U Imblokka l-Konduzzjoni Ta' Mogħdijiet ta' Sinjali f'TGF-01/smad Bħala Aġenti Potenzjali ta' Fibrożi Kontra l-Fwied
Mar 05, 2022
Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang u Tao Liu
Astratt: Cistanche tubulosahija mediċina tal-ħxejjex tradizzjonali Ċiniża użata ħafna biex tirregola l-immunità uphenylethanoid glycosides(CPhGs) huma fost il-komponenti primarji responsabbli għal din l-attività. Studji preċedenti indikaw l-effetti preventivi u terapewtiċi ta 'CPhGs fuq fibrożi epatika indotta mill-albumina tas-serum bovin (BSA) fil-firien. L-għan tal-istudju kien li jevalwa l-effett tal-fibrożi kontra l-fwied tas-CPhGs u l-monomeriechinacosideuacteosidebilli jinibixxi l-attivazzjoni taċ-ċelluli stellati tal-fwied (HSC), jimblokka l-konduzzjoni tal-mogħdijiet tas-sinjalar fit-trasformazzjoni tal-fattur tat-tkabbir-p1 (TGF-p1)/smad, u jiddetermina li huma attività epatoprotettiva in vitro. Il-proliferazzjoni ta 'HSC kienet ovvjament inibita wara trattament b'CPhGs (100,50 ^g/mL)/echinacoside (500,250,125 ^g/mL)/acteoside (6, 3 ^g/mL), b'valuri IC50 ta' 119.125,520.345 u g/6. mL, rispettivament, fl-assaġġ MTT. Konċentrazzjonijiet differenti ta' CPhGs/echinacoside/acteosidema affettwax it-tossiċità ċellulari fuq HSC skont il-kejl tal-lactate dehydrogenase (LDH). Konċentrazzjonijiet differenti ta' CPhGs/echinacoside/acteosideżied il-livell ta 'mRNA u l-espressjoni tal-proteini ta' smad7 u naqas il-livelli ta 'mRNA ta' smad2, smad3 u l-espressjoni ta 'proteini ta' smad2, phospho-smad2 (p-smad2), smad3, phospho-smad3 (p-smad3) f'HSC. Fil-qosor, dawn ir-riżultati juru li CPhGs/echinacoside/acteosidejista 'jimblokka l-konduzzjoni tal-mogħdijiet tas-sinjalar f'TGF-p1/smad, u jinibixxi l-attivazzjoni ta' HSC, u jissuġġerixxi liC. tubulosagħalhekk jista' jkun mediċina erbali potenzjali għat-trattament tal-fibrożi tal-fwied.
Kliem ewlieni: Cistanche tubulosa; phenylethanol glycosides minnCistanche(CPHGs);echinacoside; acteoside; ċelluli stellati tal-fwied (HSC); TGF-p1/smad
1. Introduzzjoni
isiru proliferattivi u fibroġeniċi, sussegwentement jakkumulaw ECM, u fl-aħħar mill-aħħar jiddifferenzjaw f'ċelluli fibroġeniċi li jixbħu l-myofibroblast. It-trasformazzjoni tal-fattur tat-tkabbir-.1 (TGF-p 1) huwa meqjus bħala l-medjatur profibroġeniku ewlieni. Il-mogħdija tas-sinjalar relatata ma 'TGF-&1 hija mekkaniżmu importanti ta' fibrożi epatika, u prinċipalment tinkludi sinjalar dipendenti fuq smad u indipendenti minn smad, u l-mogħdija tat-trasduzzjoni tas-sinjalar dipendenti fuq smad hija maħsuba li hija kanal ewlieni tas-sinjalar TGF-p1 . Għalhekk, l-imblokk tal-mogħdija ta 'sinjalazzjoni TGF-p1/smad jista' jrażżan il-produzzjoni tal-kollaġen u eventwalment itaffi l-fibrożi epatika, li għamlet din il-mogħdija mira importanti fir-riċerka tad-droga tal-fibrożi kontra l-fwied f'dawn l-aħħar snin.
Minkejja l-inċidenza għolja madwar id-dinja ta 'fibrożi epatika, l-ebda terapija anti-fibroġenika ġeneralment aċċettata mhi disponibbli [2—4]. Mediċini Veġetali Tradizzjonali Ċiniżi (TCHMs) huma ta 'interess kbir għat-trattament ta' disturbi tal-fwied minħabba li xi wħud jistgħu jintużaw mediċini terapewtiċi fil-ġestjoni u l-prevenzjoni tal-fibrożi tal-fwied. Bħalissa, ħafna studji huma ffukati fuq mediċini anti-fibroġeniċi potenzjali li ilhom jintużaw bħala TCHMs għal eluf ta 'snin [5].
Cistanche tubulosa W (familja Orobanchaceae)fa pjanta parassitika, hija mkabbra ħafna fir-reġjun tan-Nofsinhar ta 'Xinjiang fiċ-Ċina [6]. In-nies jużawha biex isaħħu l-kliewi, irawmu d-demm, jirrilassaw l-imsaren u jdewmu s-senescence mingħajr effetti sekondarji, u huwa elenkat uffiċjalment fil-Farmakopea Ċiniża [7]. C. tubulosa fih varjetà ta 'komponenti attivi, inklużi phenylethanoid glycosides (CPhGs), iridojdi, u polysaccharides. Fost il-ħafna komponenti attivi f'C. tubulous, is-CPhGs, li jippreżentaw numru ta 'bijoattivitajiet (antiossidant, kontra l-għeja, reżistenza għar-radju, eċċ.) Huma Pie komponenti karatteristiċi ewlenin ta' dan l-impjant. F'dawn l-aħħar snin, huwa rrappurtat li CPhGis għandhom effetti epatoprotettivi Hent eċċessivi, u jistgħu jneħħu s-radikali tas-siġar, jipproteġu membrani epatiċi, u juru effetti immunoregolatorji, inibizzjoni ta 'apoptożi, inibizzjoni tal-espressjoni tal-antiġen tal-wiċċ tal-epatite B (HBs Ag) u epatite B Attività ta' replikazzjoni tad-DNA tal-antiġen (HBeAg) u tal-virus tal-epatite B (HBV), eċċ. Il-livell tad-DNA tal-HBV huwa l-aktar indiċi affidabbli li jirrifletti direttament l-attività ta 'replikazzjoni virali, li hija l-fattur ewlieni fid-determinazzjoni tal-istorja naturali ta' infezzjonijiet kroniċi tal-HBV, monitoraġġ tal-effett tat-terapija antivirali oP, u valutazzjoni tal-pronjosi ta 'infezzjonijiet HBV akuti u kroniċi. L-indiċi ta' skoperta seroloġika tal-HBV jinkludu prinċipalment HBsAg, HBeAg, eċċ. [8—11]. Madankollu, hemm ftit rapporti tal-letteratura fl-effetti tal-fibrożi kontra l-fwied tas-CPhGs. Studji preċedenti indikaw l-effetti preventivi u terapewtiċi ta 'CPhGs fuq fibrożi epatika indotta minn albumina tas-serum bovin (BSA) fil-firien, iżda l-attività antifibroġenika ta' CPhGs u l-monomeri ewlenin tagħha (echinacoside u acteoside, Figura 1) qatt ma ġew evalwati in vitro.
organika Cistanche tubulosa
2. Riżultati
2.1. Determinazzjoni kwantitattiva tas-CPhGs
CPhGs fiC. tubulosafihom ITtwo phenylethyl alcohol glycosides: echinacoside u acteo side, u l-kontenut tagħhom fis-CPhGs ġew skoperti mill-analiżi HPLC (Figura 1) li kienu 42.71 fil-mija 土 0.42 fil-mija u 14.27 fil-mija 土 0.18 fil-mija, rispettivament.
2.2. Attivitajiet Inibitorji ta'CPhGs, Echinacoside u Acteoside fuq HSC-T6
CPhGs, echinacoside u acteoside (62.5-500 卩g/mL) inibixxu l-vijabbiltà taċ-ċelluli ta 'HSC b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni. CPhGs u acteoside wrew attività inibitorja notevoli fuq ċelluli HSC, b'inibizzjoni ta '50 fil-mija tal-valuri ta' attività ta 'tkabbir taċ-ċelluli (IC50) kienet 119.125 昭/mL u 6.999 昭/mL rispettivament. Echinacoside wera attività inibitorja moderata (IC50,520.345 昭/mL; Tabella 1 u Figura 2).
2.3. Tossiċità taċ-ċelluli ta 'CPhGs, Echin acoside u Acteorida fuq HSC
Lactate dehydrogenase (LDH), enzima ċitoplasmika stobbli preżenti fiċ-ċelloli kollha, terġa' tinħareġ malajr fis-supernatant tal-kultura taċ-ċelluli wara ħsara fil-membrana tal-plażma. L-attività ta' l-enżimi fis-supernatant tal-kultura tikkorrelata mal-proporzjon taċ-ċelluli lysed [12]. Kif muri fit-Tabella 2, meta ttrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' C PhGs, echinacoside u acteoside, għalkemm l-attività LDH wriet żieda żgħira meta mqabbla mal-grupp taċ-ċelluli coirtrol, id-differenza ma kinitx statistikament sinifikanti (p> 0.05 ), li jindika li ħafna mill-membrani taċ-ċelluli jżommu l-integrità tagħhom, u l-inibizzjoni ta 'CPhGs, echinacoside u acteoside fuq HSC mhix dovuta għal tossiċità ċellulari mhux speċifika.
2.4. Effett ta'CPhGs, Echinacoside u Acteosde fuq il-Proliferazzjoni ta' HSC Indotta minn TGF-^i
Il-proliferazzjoni, l-attivazzjoni u d-divrenzjar ta 'HSC huma regolati minn varjetà ta' fatturi. Fost il-fatturi varji involuti fil-fibrożi tal-fwied, TGF{{0}} huwa meqjus bħala l-aktar importanti, peress li jista’ jattiva l-HSC, jippromwovi d-divrenzjar tal-myofibroblast, iżid is-sintesi tal-ECM, u jinibixxi d-degradazzjoni tal-ECM, u jirrilaxxa kimokini u ċitokini involuti fil-fibrożi tal-fwied [13]. F'dan l-istudju, ħlief għall-grupp ta 'kontroll, HSCs stazzjonarji ġew stimulati b'TGF-P1 in vitro biex jissimulaw il-formazzjoni ta' fibrożi tal-fwied bikrija, u biex jinvestigaw l-effett ta 'CPhGs, echinacoside u acteoside fuq TGF-p1- proliferazzjoni HSC indotta. Kif muri t-Tabella 3, meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll, il-grupp TGF-61 ippromwova b'mod sinifikanti l-proliferazzjoni ta' HSC (p <0.01). meta="" mqabbel="" mal-grupp="" tgf-p1,="" tgf-p1="" flimkien="" ma'="" cphgs="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05),="" tgf{{18}="" }="" flimkien="" ma'="" echinacoside="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05),="" tgf-p1="" flimkien="" ma'="" acteoside="" (ta)="" (3.0,="" 6.0="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05)="" kollha="" inibixxu="" b'mod="" notevoli="" l-proliferazzjoni="" ta'="" hscs="" indotti="" minn="" tgf-|3="" 1="" fi="" gradi="">
2.5. Espressjonijiet ta' mRNA smad2)smad3 u smad7 wara intervent ta' CPhGs, ochmacoside u acteaside fuq HSCs
Smad3 u smad2 huma effetturi downstream ewlenin tal-passaġġ tas-sinjalar TTGF-p [14,15], u smad7 huwa inibitur tas-sinjalar smad. Teoretikament, l-espressjoni miżjuda ta 'smad7 jew espressjoni mnaqqsa ta' smad2/smad3 tista 'timblokka l-konduzzjoni ta' mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni f'TGF-p 1/smad. Kif muri fil-Figura 3, analiżi PCR quantitafive f'ħin reali wriet li l-espressjoni tal-mRNA ta 'smad2 u smad3 indikat livell aktar baxx, filwaqt li smad7 indikat livelli ogħla fil-grupp ta' kontroll, meta mqabbel mal-grupp TGF-|31. Fil-grupp TC (25, 50, 75,100 |dg/mL), il-livell ta' mRNA ta' smad2 (p < 0.{{37)="" }}5)="" u="" smad3="" (p=""><0.01) naqsu="" b'mod="" sinifikanti="" meta="" mqabbla,="" mal-grupp="" tgf-pf,="" u="" kienet="" saħansitra="" simili="" għall-grupp="" ta="" 'kontroll;="" me="" sadanittant,="" il-livell="" ta="" 'mrna="" ta'="" smad7="" żdied="" b'mod="" sinifikanti="" fil-grupp="" tc="" (50,="" 75,100="" 卩g/ml)="" (p="">< 0.05,="" p="">< 0.05,="" p="">< 0.01,="" rispettivament).="" madankollu;="" l-espressjoni="" smad7="" indikat="" xejra="" axxendenti="" fil-grupp="" thetc="" 25="" 卩g/ml="" meta="" mqabbla="" mal-grupp="" tgf-p1="" (figura="">
Sadanittant, meta mqabbla mal-grupp TGF-p1, l-espressjoni tal-mRNA smad2 u smad3 naqset b'mod sinifikanti fit-TE (62.5, 125, 250, 500 卩g /mL) grupp (p <0.01), u="" l-espressjonijiet="" ta="" 'smad7="" mrna="" żdiedu="" b'mod="" sinifikanti="" fil-grupp="" te="" (125,="" 250,500="" 昭/ml)="" (p="">< 0.01)="" (figura="" 4)="" .="" bl-istess="" mod,="" il-grupp="" ta="" (0.75,1.5,="" 3.0,="" 6.0="" ^g/ml)="" wera="" wkoll="" l-istess="" tendenza="" (figura="">
2.6. Influwenza ta'CPhGs, Echinacoside, u Ac)eosids fuq T GF-^i/smad Signaling Pathway f'HSC
Il-mogħdija tas-sinjalar TGF-p 1/smad tiddependi fuq smad2, smad3, phospho-smad2 (p-smad2), phospho-smad3 (p-smad3) u smad7, fejn p-smad2, p-smad3 huma l-forom attivati ta' smad2 u smad3. F'dan l-istudju, il-livelli ta 'proteina ta' omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 u smad7 ġew analizzati. Analiżi Western blot misjuba żidiet fil-livelli smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 minn TGF-p1, u l-inibizzjoni ta 'dawn iż-żidiet minn CPhGs, ec hinacoside u acteoside; sadanittant, wesiern blot analiżi żvelat up-regolati smad7 livelli minn CPhGs, echinacoside u acteoside. (Figuri 6—8).
Kif muri fil-Figura 6, meta mqabbel mal-grupp c on2rol (l-espressjonijiet tal-proteini ta 'smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 żdiedu b'mod sinifikanti, u l-espressjoni tal-proteina smad7 naqset fil-grupp TGF-p1. Fil-TC (25) , 50, 75, 100 昭/mL) gruppi tad-droga, l-smad/ (Figura 6A), p-smad2 (Figura 6B), smad 3 (Figura 6C), p -smad3 (Figura 6D) espressjonijiet kienu sinifikament aktar baxxi minn dik fil-grupp TGF-p1 (卩 <0.01), u l-espressjoni tal-proteina smad7 (Figura 6E) kienet ogħla minn dik tal-grupp TGF-S1 (p <0.01) (Figura 6).
Fl-istess ħin, l-espressjonijiet ot smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 u smad7 proteina ġew imkejla wara intervent ta 'echinacoside u acteoside fuq HSC. Kif muri fil-Figuri 7 u 8 il-livelli ta' espressjoni tal-proteini smad2, smad3, p-smad2 u p-smad3 ġew inibiti b'mod sinifikanti (p < 0.05="" jew="" p="">< 0.01="" ),="" il-livell="" ta="" 'espressjoni="" tal-proteina="" smad7="" kien="" elevat="" (p=""><0.01), meta="" mqabbel="" mal-grupp="" tgf-p="" 1="" (figuri="" 7="" u="">
3. Diskussjoni
Il-fibrożi tal-fwied hija waħda mill-kawżi ewlenin ta 'morbożità u mortalità madwar id-dinja, iżda għażliet terapewtiċi limitati ħafna huma disponibbli bħalissa għal din il-kundizzjoni, għalhekk, huwa importanti ħafna għalina li nfittxu miri potenzjali għal intervent terapewtiku biex jipprevjenu l-iżvilupp tal-fibrożi tal-fwied. 16]. Riċentement, ir-riċerkaturi sabu li diversi mediċini erbali għandhom effetti epatoprotettivi ta 'anti-fibrotic. Ħafna TCHMs bħal pilloli Fufang Biejia Ruangan [17] u decoction Xiao-chai-hu (shosaiko to fil-Ġappun) [18,19] intużaw ħafna biex jittrattaw fibrożi epatika fiċ-Ċina, il-Korea, u l-Ġappun għal eluf ta 'snin. C. tubulosa fih varjetà ta 'komponenti attivi inklużi CPhGs, iridojdi, u polysaccharides. Bħala waħda mill-bażijiet materjali effikaċi ta 'C. tubulosa, CPhGs jippossjedu attività epatoprotettiva eċċellenti, iżda hemm informazzjoni limitata dwar l-effetti anti-fibrotiċi ta' GPhCs u l-komposti relatati tiegħu. F'dan l-istudju, investigajna kif is-CPhGs, l-echinacoside u l-acteoside jrażżnu l-attivazzjoni tal-HSC u jimblokkaw il-kond uzzjoni tal-passa tas-sinjalar f'TGF-p1/snaad bħala aġenti potenzjali tal-fibrożi anti-hep a tic in vitro.
Ħsara fil-fwied ta 'kwalunkwe etjoloġija fl-aħħar mill-aħħar twassal għall-attivazzjoni ta' HSCs, li jgħaddu minn transdifferenzjazzjoni għal ċelluli fibroġeniċi bħal myofibroblast [20]. Jiġifieri li myofibroblasts
huma derivati mill-attivazzjoni u l-proliferazzjoni ta 'HSCss [21], u huwa meqjus bħala l-medjatur tal-formazzjoni tal-fibrożi epatika. Għal din ir-raġuni, għamilna studji in vitro biex inqabblu r-rati ta 'vijabbiltà taċ-ċelluli ta' HSCs esposti għal CPhGs, echinacoside u acteoside. Ir-riżultati wrew li l-effett inibitorju ta 'acteoside fuq HSC kien l-aktar b'saħħtu, u l-effett ta' CPhGs kien aħjar minn dak ta 'echinacoside. CPhGs, echinacoside u serum medikati b'acteoside kollha inibixxu l-proliferazzjoni tal-HSC b'mod dipendenti fuq id-doża.
LDH hija enzima ċitoplasmika fiċ-ċelloli ħajjin, u ma tistax tippenetra l-membrana taċ-ċellula f'ċirkostanzi normali. Meta ċ-ċelloli jiġu mħassra, il-permeabilità tal-membrana tiżdied u LDH jiġi rilaxxat għal barra taċ-ċellula. Normalment, LDH jista' jiskopri l-grad ta' ħsara taċ-ċelluli [{{0}}]. L-investigazzjoni wriet li l-attività LDH ta 'CPhGs, echinacoside u serum medikat acteoside wriet biss żieda żgħira meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll taċ-ċelluli, u d-differenza ma kinitx statistikament sinifikanti (p> 0.05), li tindika li ħafna mill-membrana taċ-ċellula żammet l-integrità tagħhom. , u l-inibizzjoni ta 'HSCs minn CPhGs, echinacoside u acteoside mhijiex dovuta għal tossiċità ċellulari mhux speċifika.
Meta sseħħ ħsara fil-fwied, epatoċiti attivati jistgħu jirrilaxxaw TGF-pi li mbagħad jattiva HSC-T6, għalhekk, TGF-pi għandu relazzjoni mill-qrib mal-fibrożi [25-27]. F'dan l-istudju, CPhGs, echinacoside u acteoside jistgħu jitqiesu bħala strateġija terapewtika attraenti għall-inibizzjoni tal-proliferazzjoni tal-HSC wara li l-HSCs ġew stimulati b'wTGF-pi in vitro. Aħna nispekulaw li CPhGs, echinacoside u acteoside jistgħu jintużaw bħala tip ta 'trattament u/jew prevenzjoni ta' fibrożi tal-fwied, u jinibixxu l-formazzjoni ta 'fibrożi tal-fwied bikrija. Il-formazzjoni ta 'fibrożi epatika hija proċess kumpless ta' involviment multifattur u multiċellulari. F'dan il-proċess patoloġiku, l-interazzjonijiet ċelluli-ċelluli, ċelluli-ċitokini u ċelluli-matriċi jikkostitwixxu netwerk ingombranti. F'dan in-netwerk, l-iżvilupp tal-fibrożi epatika jista 'jiġi rregolat b'mogħdijiet u mezzi ta' sinjalar differenti. TGF-pi huwa attivatur klassiku ta 'HSC u medjatur ewlieni fil-patoġenesi tal-fibrożi tal-fwied [28]. CPhGs, echinacoside u acteoside jistgħu jinibixxu l-espressjonijiet ta 'mRNA u proteini relatati mal-mogħdija TGF-pi/smad f'HSCs.
TGF-pi jeżerċita l-effetti ċellulari tiegħu permezz tal-mogħdija tas-sinjalar smad, u ġie kkunsidrat bħala medjatur ewlieni fl-iżvilupp tal-fibrożi u l-infjammazzjoni tal-fwied. Malli jorbot TGF-pi mar-riċettur TGF-p-tip II, ir-riċettur tat-tip II kinase fosforila d-dominju GS tar-riċettur tat-tip I TGF-p, li jwassal għall-attivazzjoni tar-riċettur tat-tip I [29]. Permezz tal-azzjoni ta 'p-smad2 u p-smad3 f'żewġ residwi ta' serine fil-motif SSXS tat-terminal C tagħhom, reazzjonijiet 'l isfel mill-mogħdija tas-sinjalar smad huma attivati bl-attivazzjoni tar-riċettur tat-tip I [30]. P-smad2 u p-smad3 jiffurmaw kumplessi oligomeriċi ma 'smad4, imbagħad jidħlu fin-nukleu u jeżerċitaw l-attività ta' traskrizzjoni bijoloġika tagħhom. Għalhekk, il-proteini smad jittrasmettu sinjali direttament mir-riċettur kinase għan-nukleu [3i]. Min-naħa l-oħra, smad7 huwa kkombinat sew mar-riċettur TGF-pi, li jwassal għall-inkapaċità ta 'smad 2/3 li jiġi attivat kif ukoll l-inibizzjoni tal-mogħdijiet tat-trasduzzjoni tas-sinjali [32]. Smad7 jista 'jaġixxi biex jinibixxi l-p-smad2 u p-smad3, traslokazzjoni nukleari ta' kumplessi smad attivati, u attivazzjoni ta '(CAGA) (9)-MLP-Luc, li tirriżulta fi tnaqqis fl-espressjoni tal-collagen I u inibizzjoni sħiħa tat-trasduzzjoni tas-sinjali TGF-p [33,34]. Ir-riżultati tagħna wrew li CPhGs, echinacoside u acteoside jistgħu jnaqqsu l-espressjonijiet tal-mRNA smad2 u smad3, u jżidu l-espressjoni tal-mRNA smad7; jinibixxu l-espressjonijiet tal-proteini smad2, p-smad2, smad3 u p-smad3, u jirregolaw l-espressjoni tal-proteini smad7, li jissuġġerixxu li CPhGs, echinacoside u acteoside għandhom ukoll rwol fl-inibizzjoni tal-attivazzjoni tal-HSC u b'hekk jinibixxu l-fibrożi epatika, li jenfasizzaw potenzjal anti-fibrotiku mekkaniżmu.
Is-sekwenza tal-effetti epatoprotettivi tat-tliet aġenti tal-ittestjar intweriet li kienet acteoside > CPhGs > echinacoside. Sabiex jiġu eluċidati aktar ir-raġunijiet għad-differenzi fil-mekkaniżmu li bih is-CPhGs, l-echinacoside u l-acteoside jipproteġu kontra l-fibrożi tal-fwied, ġew analizzati l-istrutturi kimiċi tagħhom. Il-frak tal-glycoside tal-alkoħol fenetil jidher li huwa struttura essenzjali għall-effett epatoprotettiv [35]. Acteoside (C29H36Oi5) huwa glycoside doppju, u echinacoside (C35H46O20) huwa triglycoside, jiġifieri, echinacoside għandu glycoside żejjed fl-istruttura tiegħu meta mqabbel ma 'acteoside, li jwassal għal żieda fid-daqs spazjali tiegħu. L-attività epatoprotettiva jew inibizzjoni tal-HSC tal-acteoside hija aħjar minn dik tal-echinacoside, li jista 'jkun minħabba l-eżistenza ta' xkiel steriku.
jipproteġi l-fwied: estratt ta 'cistanche
4. Taqsima Sperimentali
4.1. Kimiċi u Reaġenti
TGF-pi inxtara minn Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA). Il-linja taċ-ċelluli HSC-T6 inxtrat minn Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Wuhan, iċ-Ċina). Dimethyl sulfoxide (DMSO) inxtara minn Sigma Inc. (St. Louis, MO, USA). Smad2, smad3 u smad7 primers ġew prodotti minn Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Shanghai, iċ-Ċina). Il-kit tas-sinteżi tal-cDNA tal-ewwel linja Revert Aid inxtara minn Thermo Scientific (Shanghai, iċ-Ċina). Il-kit PCR aħdar Quantifast SYBR inxtara minn QIAGEN GmbH (Hilden, il-Ġermanja). p-smad2 (ser465/467) antikorp, Smad3 (C67H9) fenek mAb u p-smad3 (ser423/425) fenek mAb inxtraw minn Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA). L-antikorp Smad7 inxtara minn Boster (Wuhan, iċ-Ċina). L-antikorp poliklonali Smad2 u l-antikorp monoklonali p-actin inxtraw minn Proteintech (Wuhan, iċ-Ċina). Is-sejbien ta 'antikorp primarju sar bl-użu ta' soluzzjoni ta 'Antikorp ta' 2 grad (Alk-Phos. Konjugat, Anti-fenek) u soluzzjoni ta 'Antikorp ta' 2 grad (Alk-Phos. Konjugat, Anti-ġurdien) mixtrija minn Invitrogen™ (Carlsbad, CA, USA). Lactate dehydrogenase assay kit kien minn Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, iċ-Ċina).
4.2. Materjal tal-Pjanti
C. tubulosa inġabret minn Tulufan, fir-reġjun awtonomu ta 'Xinjiang Uirghur taċ-Ċina, f'Mejju 2006. Il-materjali tal-pjanti ġew identifikati bħala C. tubulosa minn Jiang He, Istitut tal-Materia Medica ta' Xinjiang. Ġie depożitat kampjun ta 'vawċer fl-Istitut tal-Materia Medica ta' Xinjiang fiċ-Ċina.
4.3. Iżolament u Purifikazzjoni ta 'CPhGs u l-Komposti tiegħu
Ir-riżomi imnixxfin u mqatta' ta' C. tubulosa (6.0 kg) ġew estratti b'mod konsekuttiv tliet darbiet taħt rifluss b'70 fil-mija etanol (4.8 L), u s-solvent imbagħad tneħħa mill-estratti kkombinati għal biex jagħti l-estratt ta' l-etanol (1.146 kg). L-estratti tal-etanol ġew ippurifikati bir-reżina AB-8 biex jinkiseb l-estratt mhux raffinat tal-phenyl ethanol glycos ides (CPhG s). Wara d-solvenza fl-ilma, l-att extret ġie ppurifikat permezz ta' kromatografija ta' reżina makroporuża ta' assorbiment AB-8 biex tikseb in-naħat totali ta 'phenyl ethanol glyco minn C. tubulosa (CPhGs, 210 g). CPhGs ġew applikati fuq kolonna ODS OP{{10}} u elużi suċċessivament b'taħlitiet ta' MeOH—H?.(0:1 -^1:0). Elua tes ġew magħquda f'ħames subfrazzjonijiet skond l-imġieba TLC bl-użu tas-sistema tas-solvent CHCh-MeOH-H?. (6:4:0.5). Spots ġew viżwalizzati wara l-bexx b'1 fil-mija FeCih. Diversi frazzjonijiet ġew ippurifikati ripetutament permezz tal-kromatografija tal-kolonna Sephadex LH-20 b'metanol bħala eluwent, u żewġ phenyl ethanol glycosides ġew iżolati mill-CPhGs. L-istrutturi tagħhom ġew ikkonfermati bħala echinacoside (C35H46O20) u acteoside (C29H36O15) bl-użu ta 'MS, 1H-, u MC-NMR [35], liema puritajiet ġew determinati li huma 99.17 fil-mija u 98.92 fil-mija, rispettivament, mill-UV-HPLC. L-istrutturi ta 'echinacoside u acteoside huma murija fil-Figura 9.
4.5. Determinazzjoni kwantitattiva ta'CPhGs
Kromatografija likwida (HPLC) (LC{{0}}Strument HPLC, Shimadzu Co., Kyoto, Ġappun) ġiet impjegata biex tanalizza l-kontenut ta 'echina coside u cteoside fis-CPhGs. Kolonna Phenomenex Gemini ODS (250 x 4.6 mm, 5 |^m) intużat fi 30 grad. Fażi mobbli iżokratika li tikkonsisti f'metanol-acetonitrile-1 fil-mija ta' aċidu aċetiku (15:10:75, v/v/v) intużat għal ġirja ta' 40 minuta, b'rata ta' fluss ta' 0.6 mL/min, b'UV skoperta fi 334 nm.
4.6. Kultura taċ-Ċelloli
Iċ-ċelloli HSC ġew ikkultivati fil-mezz ta' Eagle modifikat ta' Dulbecco (Glukożju Għoli) (DMEM, Beijing, iċ-Ċina) supplimentat b'10 fil-mija serum bovin tal-fetu (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), 10 0 IU/mL peniċillina u 100 ^g/mL streptomycin (HyClone, Logan, UT, USA) f'inkubatur umidifikat f'37 grad b'5 fil-mija CO2. Dawn iċ-ċelluli ġew subkultivati regolarment b'soluzzjoni ta 'trypsin 0.25 fil-mija (1x) (HyClone, Logan, UT, USA) u l-medju kien mibdul kull jumejn. Inizjalment, iċ-ċelloli ġew ikkultivati b'DMEM li kien fih 10 fil-mija FBS għal 48 siegħa. Il-medju mbagħad ġie sostitwit b'DMEM mingħajr FBS biex iċ-ċelluli jitneħħew bil-ġuħ għal 12-il siegħa. Dawn iċ-ċelloli ġew propagati għal 48 siegħa u Wara 48 siegħa, is-serum kien ġuħ b'0.5 fil-mija FBS għal 12-il siegħa qabel ma żżid 5 ng/mL TGF-&1,
4.7. Determinazzjoni tal-Valuri IC50
Wara inkubazzjoni matul il-lejl f'mezz ta 'ġuħ li fih {{0}}.5 fil-mija FBS, ċelluli HSC ġew miżrugħa fi pjanċa 96-bir b'densità ta' 5 x 104 ċelluli/mL għal 24 siegħa. Iċ-ċelloli HSC ġew ittrattati b'CPhGs, echinacoside u acteoside f'konċentrazzjonijiet differenti (0, 3.90625, 7.8125, 15.625,31.25, 62.5, 125, 250, u 500 ^g / mL) għal 48h. Kull konċentrazzjoni kellha erba 'bjar. Fl-aħħar tat-trattament, 20 卩L MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (Sigma; 5 mg/mL) ġie miżjud u ċ-ċelloli ġew inkubati għal 4 sigħat oħra. DMSO (200 rL) ġie miżjud ma 'kull bir wara li tneħħi s-supernatant. Wara li tħawwad il-pjanċa għal 10 min fuq shaker, il-valuri IC50 inkisbu billi tkejjel l-assorbenza f'wavelength ta '490 nm bl-użu ta' strument ta 'tikkettar ta' enżimi (Benchmark PLUS, Hercules, CA, USA), dan l-assaġġ sar triplikat. Il-valuri IC50 ta 'CPhGs, echinacoside u acteoside kienu 119.125, 520.345 u 6.999 Rg/mL, rispettivament.
4.8. L-Effetti ta 'Inibizzjoni Proliferattiva taċ-Ċelloli u l-Vijabilità taċ-Ċelloli
Iċ-ċelloli HSC kienu esposti għal konċentrazzjonijiet differenti ta 'CPhGs (25,50,100 Rg/mL), echinacoside (125,250,500 Rg/mL) u acteoside (1.5,3, 6 Rg/mL). Konċentrazzjonijiet differenti ta 'CPhGs, echinacoside u acteoside ġew applikati fuq il-pjanċa f'erba' bjar konsekuttivi u inkubati għal 48 siegħa. L-effetti ta 'inibizzjoni tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli u l-livell ta' vijabbiltà taċ-ċelluli (ibbażat fuq il-kejl tal-attività LDH rilaxxata minn ċelluli bil-ħsara fis-supernatant [36]) ġew determinati b'assaġġ MTT. Ir-rata ta' inibizzjoni ġiet ikkalkulata bl-użu tal-formula li ġejja [37]:
Rata ta' inibizzjoni ( fil-mija ) " [1 — (assorbenza medja tal-grupp sperimentali/assorbenza medja tal-grupp ta' kontroll vojt)] x 100 fil-mija
Skont l-istruzzjoni tal-kit,
LDH (U/L) {{0}} (OD imkejla — kontroll OD)/(standard OD — blankOD) x 0.2 mmol/L x 1000
L-istudju preliminari tagħna wera li CPhGs, echinacoside u acteoside ma affettwawx il-vijabbiltà taċ-ċelluli.
4.9. Attivitajiet Anti-Proliferattivi minn TGF-^1
HSC attivat minn TGF-p1 ilu jitqies bħala assoċjat mal-fibrożi tal-fwied, u l-inibizzjoni għat-tkabbir tal-HSC ġiet proposta bħala metodu għat-trattament tal-fibrożi tal-fwied [36,38]. L-effetti anti-proliferattivi ta 'CPhGs, echinacoside u acteoside fuq HSCs attivati minn TGF-p1 ġew determinati b'assaġġ MTT [39]. Bl-użu tal-proċeduri u l-konċentrazzjonijiet tad-droga kif deskritt, il
gruppi sperimentali inkludew il-grupp ta 'kontroll, grupp TGF-pi, TGF-pi flimkien ma' gruppi ta 'drogi ta' konċentrazzjoni differenti. Il-gruppi taċ-ċelluli kollha ħlief il-grupp ta 'kontroll ġew ikkultivati b'DMEM li kien fih 5.0 ng/mL TGF-p1 (mingħajr FBS) għal 24 siegħa. L-attività inibitorja fuq il-proliferazzjoni taċ-ċelluli ġiet ikkalkulata bħala 100 x (assorbenza tal-kompost ittrattat - assorbiment tad-dawl fl-isfond)/(assorbiment tal-mudell - assorbiment tad-dawl fl-isfond).
4.10. Reazzjoni tal-Katina tal-Polymerase-Traskrizzjoni inversa (RT-PCR)
Il-livell ta 'espressjoni ta' mRNA ta 'smad2, smad3 u smad7 ġew determinati minn PCR f'ħin reali. Biex tiġi ddeterminata l-espressjoni tal-mRNA fiċ-ċelloli HSC, iċ-ċelloli (5 x 104 ċelluli) ġew miżrugħa fi pjanċi b'sitt reċipjenti bi 3.0 mL DMEM b'10 fil-mija FBS u inkubati matul il-lejl f'37 grad u 5 fil-mija CO2. Wara li l-midja tal-kultura nbidlet għal DMEM mingħajr serum, CPhGs (100,50,25 卩g/mL), echinacoside (500,250,125 昭/mL) u acteoside (6, 3,1.5 ^g/mL) ġew miżjuda mal-bjar. Wara inkubazzjoni għal 48 siegħa b'CPhGs u kompożizzjonijiet ta 'monomeru, RNA totali ġie estratt bl-użu ta' reaġent TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) u aġitat b'mod vigoruż bil-kloroform għal 15 s. Wara li ħalla joqgħod f'temperatura tal-kamra għal 3 min, il-lisat ġie ċentrifugat fi 12,000 xg għal 15 min f'4 gradi. L-RNA fil-fażi milwiema ġie preċipitat bl-isopropanol, u l-fażi milwiema ta 'fuq ġiet trasferita għal tubu mikroċentrifugu ġdid. RNA kien preċipitat billi żżid 0.75 fil-mija etanol, wara li t-tubu mikroċentrifuga u ċentrifugati fi 12,000 xg f'4 gradi għal mhux aktar minn 5 min. Is-supernatant tneħħa u l-RNA tnixxef f'temperatura tal-kamra għal 5-10 min. Il-primers (Sangon) ġew iddisinjati bl-użu tal-Lott Primer 3, u huma elenkati fit-Tabella 4. Ir-riżultati ġew normalizzati għall-mRNA tal-ġene housekeeping p-actin bħala kontroll intern u huma ppreżentati bħala livelli relattivi mRNA. Ir-reazzjonijiet saru bi 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 pM primer par, 8.5 ilma distillat, u 2.5 rL cDNA.
Kull reazzjoni katina tal-polimerażi twettqet taħt il-kundizzjonijiet li ġejjin: 95 grad għal 3 min, imbagħad 40 ċiklu ta' 10 s f'95 grad, 30 s f'55 grad, u 10 s f'55 grad -95 grad għall-estensjoni, segwiti minn kejl wieħed ta' fluworexxenza. Ir-riżultati finali ġew deskritti bil-valuri relattivi (2_AACt). Il-kalkolu u l-analiżi saru permezz tas-Sistema ta 'Detezzjoni tal-PCR f'ħin reali iQ5.
4.11. Analiżi Western Blot
Estratti ta 'ċelluli sħaħ ġew ippreparati bl-użu ta' buffer Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) b'1 fil-mija Halt protease inhibitor u 1 fil-mija Halt phosphatase inhibitor cocktails (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Il-proteina totali ntużat għall-iskoperta ta 'smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 u smad7. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet imkejla u kkwantifikata bil-metodu Bradford. Proteina (10-30 Rg) ġiet isseparata fuq ġel SDS-PAGE ta' 10 fil-mija u ttrasferita għal membrani tal-polyvinylidene fluoride (PVDF) (Millipore, Boston, MA, USA). Il-membrani ġew imblukkati għal siegħa f'temperatura tal-kamra b'5 fil-mija albumina tas-serum bovin, u l-antikorpi primarji (antikorp poliklonali smad2, antikorp p-smad2, mAb tal-fenek smad3 u mAb tal-fenek p-smad3, dilwizzjoni 1:1000; mAb tal-fenek ta' smad7, 1). :200 dilwizzjoni, antikorp monoklonali p-actin, dilwizzjoni 1:5000) ġew inkubati f'4 gradi matul il-lejl. L-Alk-Phos korrispondenti. antikorpi sekondarji konjugati ġew inkubati f'temperatura tal-kamra. Fl-aħħarnett, il-membrani ġew maħsula tliet darbiet b'1 x Tris-HCl salina b'0.1 fil-mija Tween 20, u s-sinjali ġew skennjati u viżwalizzati minn GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Twettqet analiżi densitometrika fuq il-proteini ta 'interess u normalizzata għal p-actin bis-softwer GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). p-actin intuża bħala l-kontroll intern.
4.12. Analiżi Statistika
Id-dejta ġiet espressa bħala mezz 土 devjazzjoni standard (SD). Analiżi statistiċi saru bl-użu tas-softwer SPSS 16.0 (Xinjiang Medical University). Analiżi Probit intużat biex tanalizza l-valuri IC50. Is-sinifikat tad-differenza ġiet ikkalkulata b'test ANOVA one-way, u valuri b'p < 0.05="" tqiesu="" bħala="" statistikament="">
5. Konklużjonijiet
Bħala konklużjoni, CPhGs minn C. tubulosa u l-komponenti tiegħu echinacoside u acteoside juru effetti anti-fibrotiċi sinifikanti. Fost dawn, l-attività ta 'acteoside hija l-aktar qawwija, filwaqt li l-attività tas-CPhGs hija bejn iż-żewġ komposti. L-inibizzjoni tal-attivazzjoni tas-sinjalar TGF-p1/Smad tista 'tkun il-mekkaniżmu sottostanti li bih is-CPhGs jipproteġu kontra mard kroniku tal-fwied assoċjat ma' fibrożi, u echinacoside u acteoside huma l-bażi effettiva ta 'materjal anti-fibrotiku ta' C. tubulosa.
Rikonoxximenti:Din ir-riċerka kienet appoġġata mill-Fondazzjoni Nazzjonali tax-Xjenza Naturali taċ-Ċina (81260624). L-awturi jixtiequ jesprimu r-ringrazzjament sinċier tagħhom lill-Professur Tao Liu għat-titjib tiegħu tal-kitba f'dan id-dokument.
Kontribuzzjonijiet tal-Awtur:TL, JZ, S.-PY, LM u S.-LZ ikkonċepiw u ddisinjaw l-esperimenti. S.-PY, TL u JZ analizzaw id-dejta. S.-PY u JZ kitbu l-manuskritt. TL, LM u JZ irrevedew il-manuskritt. L-awturi kollha qraw u approvaw il-manuskritt finali.
Kunflitti ta' Interess:L-awturi ma jiddikjaraw l-ebda kunflitt ta' interess.
Referenzi
1. Subramoniam, A.; Pushpangadan, P. Żvilupp ta 'phytomedicine għal mard tal-fwied. Ind J. Pharmacol. 1999, 31,166-175.
2. Friedman, SL Mekkaniżmi ta 'mard: Mekkaniżmi ta' fibrożi epatika u implikazzjonijiet terapewtiċi. Nat. Clin. Prattika. Gastroenterol Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Roll, FJ; Boyles, J.; Bissell, DM Lipoċiti epatiċi: Iċ-ċelloli prinċipali li jipproduċu l-kollaġen tal-fwied normali tal-firien. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Treġġigħ lura tal-fibrożi epatika一Fatt jew fantasija? H叩atology 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmad, A.; Ahmad, R. Fehim tal-mekkaniżmu tal-fibrożi epatika u approċċi terapewtiċi potenzjali. Għarabja J. Gastroenterol. 2012,18,155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Pietru, H.; Raven; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. In Flora of China, 23 ed.; Kumitat Editorjali tal-Flora taċ-Ċina: Akkademja tax-Xjenzi Ċiniża, Beijing, iċ-Ċina, 2013; pp. 1-16.
7. Kummissjoni tal-Farmakopea Ċiniża tal-Ministeru Sanitarju tar-Repubblika Popolari taċ-Ċina. Farmakopea Ċiniża; Parti 1; Dar tal-Pubblikazzjoni tal-Industrija Kimika: Beijing, iċ-Ċina, 2010; p. 126.
8. Li, J.; Huang, D.; Hu, L. Effett ta 'roucongrong (Herba Cistanches Deserticolae) fuq it-tossiċità riproduttiva fil-ġrieden indotta minn glycoside ta' Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J. Tradit. Chin. Med. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y.; Liao, J.; Tang, Y.; Zhang, P.; Tan, C.; Ni, H.; Wu, X.; Li, N.; Jia, X. ACE u inibituri tal-aggregazzjoni tal-plejtlits minn Tamarix hohenackeri Bunge (impjant ospitanti ta 'Herba Cistanches) li qed jikber f'Xinjiang. Pharmacogn. Mag. 2014,10,111-118. [PubMed]
10. Jia, Y; Guan, Q.; Jiang, Y.; Salh, B.; Guo, Y.; Tu, P.; Du, C. Titjib ta 'kolite indotta mis-sodju ta' dextran sulphate fil-ġrieden minn estratt arrikkit b'echinacoside ta 'Cistanche tubulosa. Phytother. Riż. 2014, 28, 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches jistimula ċ-ċikliżmu redox tal-glutathione ċellulari minn speċi reattivi ta 'ossiġnu ġġenerati minn respirazzjoni mitokondrijali f'kardjomijoċiti H9c2. Pharm. Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Martin, A.; Clynes, M. Acid phosphatase: Endpoint għal testijiet ta' tossiċità in vitro. Vitro Cell. Dev. Biol. 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. Lechuga, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincon, AR; Rivas-Estilla, AM; Esteban-Gamboa, A.; Rojkind, M. TGF-01 jimmodula l-espressjoni tal-matriċi metalloproteinase-13 f'ċelloli stellati epatiċi b'mekkaniżmi kumplessi li jinvolvu p38MAPK, PI3-kinase, AKT, u p70S6k. Em. J. Physiol. Gastrointest Fwied Physiol. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J.; Tang, SY; Nguyen, D.; Alliston, T. It-tagħbija tirregola l-formazzjoni tal-għadam u l-espressjoni ta 'Sclerostin permezz ta' mekkaniżmu dipendenti fuq TGFp. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pessah, M.; Marais, J.; Prunier, C.; Ferrand, N.; Lallemand, F.; Mauviel, A.; Atfi, A. C-Jun jassoċja mal-oncoprotein Ski u jrażżan l-attività ta 'traskrizzjoni Smad2. J. Biol. Chem. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N.; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R.; Leblanc, M.; Coulter, S.; Hu, M.; Scott, C.; et al. A riċettur tal-Vitamina D/ċirkwit ġenomic SMAD jikkaġuna rispons fibrotiku epatiku. Ċellula 2013,153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Yang, FR; Fang, BW; Lou, JS Effetti tal-pilloli Fufang Biejia Ruangan fuq fibrożi epatika in vivo u in vitro. Dinja J. Gastroenterol. 2013,19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, I.; Hironaka, K.; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T.; Okita, K. Il-mediċina tal-ħxejjex Sho-saiko-to (TJ-9) iżid il-metalloproteinases tal-matriċi tal-espressjoni (MMPs) b'espressjoni mnaqqsa ta 'inibitur tat-tessut ta' metalloproteinases (TIMPs) f'ċelluli stellate tal-firien. Ħajja Sci. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M.; Chen, J.; Tsai, C.; Wang, W.; Chang, D.; Tu, DĠ; Hsieh, HY Ir-rwol ta 'TGF-01 u ċitokini fil-modulazzjoni tal-fibrożi tal-fwied minn Sho-saiko-to fil-mudell ligated tal-kanali tal-bili tal-far/s. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Azinge, markaturi bijokimiċi EC, komponenti extraċellulari fil-fibrożi tal-fwied u ċirrożi. Nig. QJ Hosp. Med. 2007,17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Kong, D.; Zheng, S.; Lu, Y. Sors u rwol ta 'myofibroblasts fil-fibrożi tal-fwied. Chin. Pharmacol. Bull. 2011, 27, 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukushima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, CMO; de Oliveira, KM; Martins Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; et al. Mudell ta 'iskemija-riperfużjoni fil-korda spinali tal-firien: Studju ta' sinjalazzjoni ta 'vijabbiltà taċ-ċelluli u apoptożi. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H.; Maqbool, F.; Niaz, K.; Abdollahi, M. Tossiċità ta 'nanopartiċelli u ħarsa ġenerali tal-mudelli sperimentali attwali. Iran Biomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]
