Phenylethanoid Glycosides Minn Paraboea Martinii Ipproteġi Ċelloli tal-Feochromocytoma tal-Firien (PC12) Minn Korriment taċ-Ċelloli Indotti mill-Perossidu tal-Idroġenu
Mar 04, 2022
Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Xue Gong†a, Yan Xu†b, Kai Renc, Xiaorong Baid
L-istress ossidattiv huwa magħruf li għandu rwol essenzjali fil-patoġenesi ta 'diversi mard. Hija marbuta mal-etjoloġija tal-marda ta 'Alzheimer (AD), il-marda ta' Parkinson (PD), l-epilessija, u mard ieħor [1–3]. Fil-preżent, sar progress kontinwu fl-istudju tal-patoġenesi ta 'AD, PD, u mard ieħor. Madankollu, minħabba l-għarfien limitat tal-mekkaniżmi molekulari sottostanti AD, PD, u mard ieħor, strateġiji preventivi jew kurattivi effettivi għal dan il-mard ma ġewx realizzati [4]. H2O2 huwa komponent importanti ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS). Għaldaqstant, il-ħsara taċ-ċelluli PC12 indotta minn H2O2- hija l-aktar mudell użat komunement ta 'stress ossidattiv u huwa użat ħafna fi studji sperimentali ta' effetti newroprotettivi [5]. Heme oxygenase 1 (HO-1) u glutamate-cysteine ligase-catalytic subunit (GCLC) huma enzimi antiossidanti ċellulari importanti, u ż-żewġ ġeni huma regolati 'l isfel mill-fattur nukleari erythroid 2 (Nrf2), li qed joħroġ bħala terapewtiku promettenti. mira għan-newroprotezzjoni [6,7]. Phenylethanoid glycosides, derivati mill-unità C-6-C{-3, fihom ħafna gruppi idroksil fenoliċi u għandhom attivitajiet antiossidanti u kontra t-tixjiħ sinifikanti. Matul l-aħħar ftit snin, studji indikaw li ħafna pjanti mediċinali fihom phenylethanoid glycosides li juru attività antiossidanti sinifikanti. Per eżempju, phenylethanoid glycosides derivati minnHerba cistanchehuma magħrufa li jeżerċitaw effetti protettivi fuq defiċits konjittivi fl-AD. Dak l-istudju investiga l-mekkaniżmu protettiv assoċjat bl-użu ta 'mudell ta' ġurdien 8 suxxettibbli għas-senescence aċċelerat AD (SAMP8). Ir-riżultati indikaw li l-abbiltà tal-phenylethanoid glycosides li jtejbu d-defiċits konjittivi fil-ġrieden SAMP8 tista 'tkun relatata mal-promozzjoni tal-plastiċità sinaptika li tinvolvi proċessi antiossidanti [8]. F'dan l-istudju, żewġ phenylethanoid glycosides ġew separati u ppurifikati mill-għoqiedi tal-injam Tectona grandis (teak); dawn il-komposti wrew effetti antiossidanti notevoli li ġew determinati bl-użu ta 'metodu amperometriku [9]. Barra minn hekk, il-komposti ta 'caffeoyl phenylethanoid glycoside minn Lindernia ruellioides jeżerċitaw effetti antiossidanti u superoxide anjoni ħielsa li jneħħu r-radikali in vitro [10]. Il-mekkaniżmi ta 'azzjoni ta' phenylethanoid glycosides huma relatati mar-regolamentazzjoni tal-passaġġ ta 'sinjalazzjoni Nrf2/ARE, li jinfluwenza s-sintesi ta' SOD, CAT, GSH-PX, u enzimi antiossidanti oħra [11]. Il-familja Gesneriaceae, li fiha 150 ġeneru u madwar 3700 speċi, hija mqassma primarjament fir-reġjuni tropikali u moderati tal-Lvant u n-Nofsinhar tal-Asja, l-Oċeanja, l-Amerika t'Isfel, l-Afrika, l-Ewropa tan-Nofsinhar, u l-Messiku [12].
Gesneriaceae fiċ-Ċina. Ġie rrappurtat li madwar 100 speċi għandhom effikaċja medika u l-biċċa l-kbira minn dawn huma distribwiti prinċipalment fil-provinċji ta 'Guangxi u Guizhou [13]. F'dawn l-aħħar snin, ir-riċerka dwar il-pjanti Gesneriaceae żdiedet gradwalment f'żoni differenti tad-dinja, u nstabu xi kostitwenti ġodda b'attivitajiet fiżjoloġiċi [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt jappartjeni għal Parabola (Gesneriaceae) u hija pjanta erbaċeja. Ibbażat fuq "Ir-Reġistri tar-Riżorsi tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża", ġie rreġistrat li l-impjant kollu jintuża bħala mediċina. Barra minn hekk, jista 'jeżerċita ħafna attivitajiet farmakoloġiċi fuq kundizzjonijiet bħal ematemesis, edema, disentrija, korriment trawmatiku, u ksur [15]. Bai wera li phenylethanoid glycosides huma wieħed mill-kostitwenti kimiċi ewlenin tal-pjanti Gesneriaceae [16]. Xi riċerkaturi sabu wkoll li phenylethanoid glycosides għandhom attivitajiet antiossidanti sinifikanti [17]. Li wera li phenylethanoid glycosides taCistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 fil-mija) ta 'tmien phenylpropanoid glycosides tkejjel bil-metodu ta' normalizzazzjoni taż-żona tal-quċċata HPLC. Bħala eżempju, il-mapep tal-kromatografija ta 'paraboside B u paraboside II huma murija fil-Figura 1, u l-kontenut relattiv tagħhom instab li kien 98.23 fil-mija u 99.20 fil-mija, rispettivament. Il-linja taċ-ċelluli tal-feokromoċitoma adrenali tal-far li ma tantx differenzjati (PC12) inxtrat mill-Bank taċ-Ċelloli fl-Akkademja tax-Xjenza taċ-Ċina (Shanghai, iċ-Ċina). Dulbecco's modifikat Eagle's medium (DMEM) u serum taż-żiemel inxtraw minn Gibco (Gaithersburg, MD, USA). Serum bovin tal-fetu (FBS) inxtara minn Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, USA). H2O2 inkiseb minn Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (Tianjin, iċ-Ċina). Trizol inxtara minn Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). PrimeScriptTM RT reagent Kit (Perfect Real Time) inkiseb minn TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, iċ-Ċina). Primers għal HO-1, GCLC, u GAPDH ġew sintetizzati minn Sangon Biotech (Shanghai, iċ-Ċina). Il-kit tal-Assaġġ tal-Proliferazzjoni taċ-Ċelluli ta' Soluzzjoni Waħda Aqueous CellTiter 96® (MTS) inkiseb minn Promega Corp. (Madison, USA). Inibituri ta' protoporphyrin taż-żingu HO-1 (ZnPP) inxtraw minn Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Intużaw ukoll Inkubatur tas-CO2 Thermo311 (Thermo, USA), StepOnePlusTM Real-Time PCR Instrument Thermal Cycling Block (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo), u xCELLigence RTCA DPlus Analyzer u E-Plate 16 (ACEA Biosciences, USA) .
Cistanche deserticola
Kultura taċ-ċelluli u trattament
Iċ-ċelloli PC12 tkabbru f'DMEM li fihom 5 fil-mija FBS u 5 fil-mija serum taż-żwiemel f'37 grad f'atmosfera umidifikata ta '5 fil-mija CO2. Iċ-ċelloli PC12 ġew maqsuma fi tliet gruppi kif ġej: grupp ta 'kontroll, grupp mudell, u grupp ta' trattament. Tmien glikożidi phenylpropanoid ġew maħlula f'DMSO (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">
Determinazzjoni ta' H2O2
Aħna ddeterminajna l-konċentrazzjoni xierqa ta 'H2 O2 bl-użu ta' analiżi ċellulari f'ħin reali (RTCA). Iċ-ċelloli PC12 ġew miżrugħa f'mikroplate CIM-plate-16 f'volum ta '100 µL u mbagħad inkubati għal 12-il siegħa f'37 grad f'atmosfera ta' 5 fil-mija CO2. Iċ-ċelloli PC12 ġew maqsuma fi gruppi ta 'kontroll u mudell. Sussegwentement, 10 μL H2O2 (50, 100, 200, u 400 μM) ġew miżjuda mal-gruppi tal-mudell, u l-gruppi ta 'kontroll ġew ittrattati b'10 μL DMEM komplut, imwaqqaf fi tliet bjar kumplessi. L-E-Plate 16 tqiegħdet fl-xCELLigence RTCA, immonitorjata kull 15-il minuta, u r-riżultati ġew irreġistrati għal 32 siegħa. L-effett ta 'H2O2 fuq ċelluli PC12 ġie analizzat bl-użu tas-softwer ta' analiżi tad-dejta xCELLigence RTCA. Il-valur tal-indiċi taċ-ċelluli (CI) intuża biex jiddetermina l-aħjar konċentrazzjoni ta 'H2O2 u t-tul tal-azzjoni.
Estrazzjoni kompost u iżolament
Il-frazzjonijiet ġew separati abbażi tal-polarità tagħhom bl-użu ta 'metodi deskritti qabel. P. martini trab imnixxef bl-arja (4 kg) ġie estratt suċċessivament tliet darbiet b'soluzzjoni ta' etanol milwiema ta' 75 fil-mija [20]. L-estratti miksuba mbagħad ġew ikkonċentrati bl-użu ta 'evaporatur li jdur biex jitneħħa l-etanol, u nkisbu estratti mhux raffinati. Il-kampjuni ġew maħlula f'ilma dejonizzat u mbagħad estratti suċċessivament b'etere tal-pitrolju, aċetat etiliku, n-butanol, u ilma. L-estratt ta' n-butanol (400 g) ġie frazzjonat bl-użu ta' kolonna tar-reżina makroporuża AB{-8 u soluzzjoni ta' etanol-H2O2 (0, 1{{47} }, 30, 50, 70, u 95 fil-mija). Fl-aħħar inkisbu sitt frazzjonijiet (frazzjonijiet 1-6). Il-frazzjonijiet 3 u 4 ġew soġġetti għal separazzjoni bl-użu ta 'kolonna MCI bi gradjent ta' MeOH-H2O2 (10-100 fil-mija). Sussegwentement, il-prodotti ġew iżolati bl-użu ta' Sephadex LH-20 b'50 fil-mija MeOH bħala l-eluwent. Il-komposti 1 (41.0 mg) u 6 (15.6 mg) ġew iżolati mill-frazzjoni 3. Il-komposti 2 (62.0 mg), 3 (34.7 mg), 7 (11.0 mg), u 8 (26.0 mg) inkisbu mill-frazzjoni 4 bl-użu ta' Sephadex LH-20 kromatografija b'50 fil-mija MeOH bħala l-eluwent. L-iżolazzjonijiet finali twettqu b'HPLC semi-prep, b'fażi inversa (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) b'50 fil-mija MeOH u detezzjoni UV f'280 nm biex jipproduċu komposti 4 (39.0 mg) u 5 (9.0 mg) [20].
Assaġġ tal-vijabbiltà taċ-ċelluli
Iċ-ċelluli PC12 ġew miżrugħa fi 96-pjanċi bir-bir f'densità ta' 2 × 1{{10}}4 ċelluli/bir f'volum finali ta' 100 µL . Iċ-ċelloli PC12 ġew inkubati f'37 grad b'5 fil-mija CO2 għal 12-il siegħa. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet ta' estratti mhux raffinati (0.025, 0.05, 0.1, 0.2, u 0.4 mg/mL) u komposti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 f'ħames konċentrazzjonijiet (3.125, 6.25, 12.5, 25, u 50 μM). Wara trattament minn qabel għal 24 siegħa, il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet iddeterminata b'assaġġi MTS. Iċ-ċelloli PC12 ġew inkubati minn qabel bi jew mingħajr l-inibitur HO-1 mingħajr ZnPP (15 μM) għal 30 min, imbagħad inkubati bi jew mingħajr caleolarioside B, paraboside B, u paraboside II (3.125 μM) għal 12-il siegħa, u finalment inkubati b'400 μM H2O2 għal 6 sigħat oħra. Wara t-trattament, in-numru ta 'ċelloli superstiti kien iddeterminat b'assaġġ MTS [6].
Effetti protettivi ta' estratti mhux raffinati u komposti monomeriċi fuq ċelluli PC12 ittrattati H2O2-
Iċ-ċelloli ġew ikkultivati fi pjanċa ta' {{0}}bir b'volum finali ta' 100 µL. Dilwizzjonijiet serjali ta 'estratti mhux raffinati (0.025, 0.05, 0.1, 0.2, u 0.4 mg/mL) ġew miżjuda mal-grupp ittrattat. Wara trattament minn qabel għal 12-il siegħa, 400 μM ta 'soluzzjoni H2O2 (konċentrazzjoni ottimali) ġew miżjuda mal-grupp ittrattat u l-grupp H2O2 ta' kull bir għal 6 sigħat. Soluzzjoni MTS imbagħad ġiet miżjuda ma 'kull bir, u l-pjanċi ġew inkubati għal 3 sigħat f'temperatura ta' 37 grad C. Il-pjanċi ġew oxxillati b'veloċità baxxa għal 5 min f'temperatura tal-kamra sakemm il-kristalli kollha ġew maħlula għal kollox. Il-protezzjoni taċ-ċelluli ġiet iddeterminata abbażi tar-riżultati tal-assaġġ MTS skont 2204 X. GONG ET AL tal-manifattur. Niżżel minn https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 mill-mistieden fis-27 ta' Awwissu 2021 istruzzjonijiet. Id-densità ottika ġiet iddeterminata f'wavelength ta 'assorbiment ta' 490 nm. Aħna ssegwi aktar l-attività tal-komposti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 iżolati mill-frazzjonijiet 3 u 4. Dilwizzjonijiet serjali tal-komposti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 (3.125, 6.25, 12.5, 25, u 50 μM) ġew miżjuda mal-grupp ittrattat biex jiddeterminaw l-effetti protettivi rispettivi tagħhom fuq ċelluli PC12 indotti H2O2-.
phenylethanoid glycosides minn Cistanche deserticola: Jipproteġi n-newroni u kontra t-tixjiħ
PCR kwantitattiv f'ħin reali (qRT-PCR)
Iċ-ċelloli PC12 inħasdu fi 12-il siegħa wara t-trattament b'3.125 μM caleolarioside B, paraboside B u paraboside II. RNA totali ġie estratt bl-użu ta 'trizol-reaġent, u alikwoti ta' RNA totali ġew traskritti b'lura bl-użu ta 'Primescript RT Master Kit skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-primers li ġejjin ġew impjegati għall-esperimenti skont rapport preċedenti [21]. HO-1: Quddiem 5′ -GC CTGCTAGCCTGTGTCAAG-3′, Reverse 5′ -AGC GGGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: Quddiem 5′ - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3′, Reverse 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: Quddiem 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, Reverse 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3′. Alikwoti tas-cDNAs miksuba mbagħad ġew amplifikati permezz tal-PCR. Il-kundizzjonijiet ta 'reazzjoni kienu kif ġej: denaturazzjoni inizjali f'95 grad (30 s), segwit minn 40 ċiklu ta' f'95 grad (5 s), 60 grad (34 s), u 72 grad (35 s). Il-primers kollha ġew ittestjati u s-sinjal fluworexxenti FL ġie skopert; imbagħad, il-valur △Ct ġie kkalkulat u l-valuri relattivi tqabblu ma’ dawk tal-grupp ta’ kontroll bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja: △Ct=Ct (kampjun) − Ct (kontroll endoġenu), △△Ct {{36} } △Ct (kampjun) −△Ct (mhux ittrattat), u tinja bidla=2−△△Ct. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) intuża bħala kontroll intern.
Estrazzjoni tal-proteini
Iċ-ċelloli PC12 ġew miżrugħa fuq dixxijiet ta' 100-mm f'1 × 107 ċelluli/dixx. Wara t-twaħħil, iċ-ċelloli ġew ittrattati rispettivament b'caleolarioside B, paraboside B, u paraboside II (3.125 µM) għal 12-il siegħa. Il-glikosidi mbagħad tneħħew, u ċ-ċelloli ġew inkubati b'H2O2 għal 6 sigħat oħra. Wara l-inkubazzjoni, iċ-ċelloli ġew maħsula darbtejn b'PBS kiesaħ u mibruxa mid-dixxijiet b'1 mL ta 'PBS. L-omoġenati taċ-ċelluli ġew ċentrifugati f'1500 rpm għal 10 min. Wara t-trattament, il-proteini ċellulari ġew estratti bl-użu ta 'beyotime RIPA cell lysis buffer b'1 mM PMSF skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Barra minn hekk, proteini ċitoplasmiċi u nukleari ġew iżolati kif deskritt fil-protokoll tal-kit ta 'estrazzjoni nukleari u ċitoplasmika ta' Beyotime. Il-konċentrazzjonijiet tal-proteini tal-kampjuni ġew skoperti bl-użu ta 'kit ta' analiżi tal-proteini Beyotime BCA, u l-kampjuni kollha ġew maħżuna f'-80 grad għall-analiżi tal-western blot [6].
Analiżi Western blot
L-elettroforeżi SDS-PAGE saret wara l-estrazzjoni u d-denaturazzjoni sussegwenti tal-proteina totali minn gruppi differenti. Wara l-elettroforeżi, il-proteina ġiet trasferita għal membrani PVDF, li mbagħad ġew imblukkati b'5 fil-mija trab tal-ħalib xkumat għal 4 sigħat. Wara l-ħasil, antikorp primarju (antikorp poliklonali tal-fenek GAPDH (1:10,000 dilwizzjoni), antikorp poliklonali tal-fenek HO-1 (dilwizzjoni 1:1000), jew antikorp poliklonali tal-fenek GCLC (dilwizzjoni 1:1000) ġie miżjud mal-membrani, li ġew inkubati matul il-lejl fi gradi 4. L-għada, il-membrani PVDF ġew maħsula tliet darbiet f'TTBS. Sussegwentement, antikorp sekondarju (konjugat affinity pur mogħoż anti-fenek IgG (1:1000 dilwizzjoni) ittikkettat b' peroxidase horseradish ġie miżjud mal-membrani, li mbagħad ġew inkubati f'temperatura tal-kamra għal siegħa 2. Il-membrani PVDF ġew maħsula u soġġetti għal reaġent ta 'skoperta ta' kimiluminixxenza ECL għal espożizzjoni ta 'sinjalazzjoni fuq film tar-raġġi X, li mbagħad ġie ffissat u skannjat [22].
Analiżi statistika
Id-dejta ġiet analizzata bl-użu ta' SPSS 19.0, u r-riżultati huma ppreżentati bħala l-mezzi b'devjazzjoni standard (SD) ta' tliet esperimenti indipendenti. Valuri ta' p < 0.05="" tqiesu="" li="" jindikaw="" differenzi="" statistikament="">
Riżultati Stabbiliment tal-mudell H2O2
Kif muri fil-Figura 2, H2O2 f'50, 100, u 200 μM ma kkawżax il-livell xieraq ta 'mewt taċ-ċelluli. Madankollu, 400 μM H2O2 aġixxa fuq iċ-ċelloli PC12 fi żmien 2-6 sigħat, u l-ħsara ossidattiva liċ-ċelloli kellha t-tendenza li tkun stabbli. Għalhekk, ikkunsidrajna li l-induzzjoni b'H2O2 f'konċentrazzjoni ta '400 μM għal 6 sigħat kienet xierqa biex timita l-ħsara kkawżata mill-istress ossidattiv għaċ-ċelloli PC12.
Effetti protettivi ta 'estratti mhux raffinati fuq ċelluli PC12 ittrattati b'H2O2
Meta mqabbel ma' dak fil-grupp tal-mudell H2O2 (Figura 3), estratt ta' n-butanol f'konċentrazzjonijiet ta' 0.05, 0.1, {{10} }.2, u 0.4 mg/mL tejbu b'mod sinifikanti l-ħsara ossidattiva liċ-ċelluli PC12 indotta minn H2O2 (p < 0.05)="" b'mod="" dipendenti="" fuq="" il-konċentrazzjoni.="" din="" id-dejta="" ssuġġeriet="" li="" l-frazzjoni="" n-butanol="" kien="" fiha="" attività="" protettiva="" aktar="" qawwija.="" madankollu,="" estratti="" tal-etere="" tal-petroleum="" u="" tal-aċetat="" tal-etil="" urew="" attività="" protettiva="" biss="" f'konċentrazzjonijiet="" għoljin="" (etere="" tal-petroleum:="" 0.1="" u="" 0.2="" mg/="" ml,="" p="">< 0.{{31}="" }5;aċetat="" etiliku:="" 0.2="" u="" 0.4="" mg/ml,="" p="">< 0.05).="" barra="" minn="" hekk,="" konċentrazzjonijiet="" differenti="" ta="" 'estratti="" tal-fażi="" milwiema="" ma="" wrew="" l-ebda="" effett="" protettiv="" (p=""> 0.05). Barra minn hekk, żidna dejta minn studju ta 'validazzjoni bl-użu ta' linji ta 'ċelluli tan-newroblastoma umana SH-SY5Y (SH-SY5Y) fil-Fajl Supplimentari. Trattament b'250 μM H2O2 irriżulta fi tnaqqis fil-vijabbiltà taċ-ċelluli; madankollu, caleolarioside B, paraboside B, u paraboside II (3.125, 6.25, 12.5, 25, u 50 μM) trattament attenwat b'mod sinifikanti l-mewt taċ-ċelluli SH-SY5Y. Ir-riżultati tal-esperimenti wrew li caleolarioside B, paraboside B, u paraboside II ipproteġu ċ-ċelloli SHSY5Y mill-ħsara taċ-ċelluli indotta minn H2O2-.
Strutturi ta' komposti iżolati mill-frazzjoni n-butanol
Biex tikkonferma li l-estratt ta 'n-butanol kien fih komponenti attivi, aħna aktar frazzjonati tmien komposti mill-estrazzjoni. L-istrutturi tal-komposti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 ġew identifikati b'dejta spettrali differenti (1 H-NMR, 13C-NMR, u ESI-MS) ibbażati fuq paraguni ma' dejta ppubblikata għal paraboside A , paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, u isonuomioside A, rispettivament [20]. Pereżempju, id-dejta għal paraboside B kienet kif ġej: gomma kannella; ½ 20 D −55.7 (c 0.05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (logε): 220 (3.61), 291 (3.54), 330 (3.66) [20]; IRKBr max cm−1 : 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm−1 [20]; għal dejta spettroskopika dettaljata 1 H u 13C NMR murija fir-referenza 20; HR-ESI-MS (negattiv) m/z 741.2231 [MH]- (kalkoli għal C33H41O19, 741.2242) [20]. Id-dejta għall-paraboside II kienet kif ġej: trab amor phous abjad; ½ 20 D −80.5 (c 0.05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (logε): 229 (3.74), 322 (3.73) [20]; IRKBr max cm−1 : 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm−1 [20]; għal dejta spettroskopika dettaljata 1 H u 13C NMR murija fir-referenza 20; ESI-MS (negattiv) m/z 637
Effetti protettivi ta' komposti iżolati kontra t-tossiċità indotta minn H2 O2-fiċ-ċelloli PC12
Assays MTS intużaw biex jinvestigaw l-effett ta' komposti iżolati fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli PC12 esposti għat-tossiċità indotta minn H2O2-. Kif muri fil-Figura 5, meta mqabbla ma 'dak fil-grupp ta' kontroll, ċelluli PC12 ittrattati minn qabel b'ħames konċentrazzjonijiet differenti ta 'caleolarioside B, paraboside B, paraboside II, jew paraboside A (3.125, 6.25, 12.5, 25, u 50 μM) għal 24 siegħa ma wrew l-ebda differenzi sinifikanti fil-vijabbiltà taċ-ċelluli (p> 0.05). Għalhekk, trattament minn qabel taċ-ċelloli PC12 b'caleolarioside B, paraboside B u paraboside II ma rriżulta fl-ebda ċitotossiċità. Kif muri fil-Figura 6, 400 µM H2O2 naqas b'mod sinifikanti l-vijabbiltà taċ-ċelluli meta mqabbla ma 'dik fil-grupp ta' kontroll. Barra minn hekk, il-vijabbiltà taċ-ċelluli taċ-ċelloli PC12 ittrattati H2O2- żdiedet b'mod notevoli wara trattament minn qabel taċ-ċelloli PC12 b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'caleolarioside B, paraboside B, u paraboside II; barra minn hekk, il-vijabbiltà taċ-ċelluli kienet l-ogħla wara t-trattament b'50 µM caleolarioside B, 50 µM paraboside B, u 12.5 µM paraboside II. Il-ħames komposti l-oħra ma wrew l-ebda effett protettiv sinifikanti fuq ċelluli PC12 ittrattati H2O2-. Biex nispjegaw din is-sejba, niddiskutu waħda minn dawn bħala eżempju, filwaqt li l-oħrajn mhumiex deskritti fil-manuskritt.
Livelli ta' traskrizzjoni ta' HO-1 u GCLC
Wara ttestjajna l-livelli ta’ traskrizzjoni ta’ HO{{0}} u GCLC f’ċelluli PC12 ittrattati b’caleolarioside B, paraboside B, u paraboside II. L-mRNA totali nġabar minn ċelluli PC12 ittrattati u mhux ittrattati għal 12-il siegħa u mbagħad ġie soġġett għal analiżi tal-espressjoni b'qRT-PCR. Kif muri fil-Figura 7(a,c,e), il-livelli ta’ traskrizzjoni ta’ HO-1 żdiedu b’mod sinifikanti wara li ċ-ċelloli PC12 ġew ittrattati minn qabel bil-konċentrazzjonijiet indikati ta’ caleolarioside B, paraboside B u paraboside II għal 12-il siegħa (p < 0.05).="" kif="" muri="" fil-figura="" 7(b),="" il-livelli="" ta="" 'traskrizzjoni="" ta'="" gclc="" żdiedu="" wkoll="" b'mod="" sinifikanti="" fiċ-ċelloli="" pc12="" ittrattati="" minn="" qabel="" bil-konċentrazzjonijiet="" indikati="" ta="" 'caleolarioside="" b="" għal="" 12-il="" siegħa.="" madankollu,="" il-livelli="" ta="" 'gclc="" fiċ-ċelloli="" pc12="" ittrattati="" minn="" qabel="" b'paraboside="" b="" għal="" 12-il="" siegħa="" naqsu="" b'mod="" sinifikanti="" meta="" mqabbla="" ma'="" dawk="" fil-grupp="" mudell="" (p=""><0.05; figura="" 7(d)).="" barra="" minn="" hekk,="" bit-trattament="" ta="" 'paraboside="" ii,="" il-livelli="" ta'="" gclc="" fiċ-ċelloli="" pc12="" ma="" kinux="" differenti="" b'mod="" sinifikanti="" meta="" mqabbla="" ma="" 'dawk="" fil-grupp="" tal-mudell="" (p=""> 0.05; Figura 7(f)).
Espressjoni ta' HO-1 u GCLC
HO{{0}} u GCLC huma enzimi antiossidanti ċellulari importanti, u t-tnejn huma ġeni downstream regolati Nrf2-. L-espressjoni tal-proteina ta' HO-1 u GCLC kienet osservata wkoll wara t-trattament [6]. Il-Figura 8 turi l-livelli ta 'proteini ta' HO -1 u GCLC fiċ-ċelloli PC12 wara trattament b'400 μM H2O2; ir-riżultati indikaw l-intensitajiet fluworexxenti FL ta 'HO-1 fil-gruppi ta' caleolarioside B u paraboside B kienu akbar minn dawk fil-gruppi ttrattati H2O2- (Figura 8(a,c)). Madankollu, l-espressjoni ta 'GCLC ma nbidlitx b'mod sinifikanti mill-komposti, ħlief għal caleolarioside B (Figura 8(b)). Sussegwentement, inibituri kimiċi ta' HO-1 intużaw biex jevalwaw aktar ir-rwoli tal-enzimi antiossidanti fir-regolazzjoni tal-effetti protettivi eżerċitati minn caleolarioside B, paraboside B, jew paraboside II kontra ċ-ċitotossiċità indotta minn H2O2-. Caleolarioside B, paraboside B, u paraboside II (3.125 µM) evitaw iċ-ċitotossiċità indotta minn H2O2-, iżda effetti protettivi bħal dawn ġew maqluba mill-inibitur HO -1 ZnPP (p < 0.01)="" fi="" 15="" µm="" (figura="" 8)="">
Il-benefiċċju ta 'Cistanche: Żid ir-riproduzzjoni maskili
Diskussjoni
It-tixjiħ tal-popolazzjoni hija problema globali serja. Ħafna mard huwa relatat mas-senilità, bħall-AD u l-PD, li huma theddid serju għas-saħħa pubblika. AD u PD ħarġu bħala t-tielet l-aktar mard letali globalment, wara l-mard kardjovaskulari u l-kanċer. Għalhekk, in-newrodeġenerazzjoni saret suġġett ta 'riċerka urġenti madwar id-dinja. Madankollu, il-patoġenesi ta 'AD u PD, mard newrodeġenerattiv tas-sistema nervuża ċentrali, baqgħet mhux ċara sal-lum. Barra minn hekk, hemm biss ftit mediċini li jistgħu jittrattaw b'mod effettiv l-AD jew il-PD minħabba l-mekkaniżmi patoġeniċi kumplessi tagħhom [23]. Studji preċedenti wrew li ROS, bħal anjoni superossidu (O2−) u H2O2, huma l-fatturi ewlenin li jikkontribwixxu għal mard newrodeġenerattiv. Bidliet patoloġiċi matul il-PD jinkludu deġenerazzjoni newronali u mewt tas-substantia nigra u dopamine striatal [24,25]. Għaldaqstant, huwa importanti li jiġu żviluppati mediċini antiossidanti effettivi biex jittrattaw il-PD, u skoperta ta 'mediċina bħal din saret direzzjoni ta' riċerka importanti [26]. Bħalissa, il-mogħdija tas-sinjalar Nrf2/ARE tidher li hija l-aktar passaġġ importanti tal-istress antiossidant endoġenu [27]. Ares jinsab fir-reġjuni ta' klassifikazzjoni 5′-fulfill tal-ġeni, bħal HO-1 u GCLC [28,29]. HO-1 u GCLC huma ġeni relatati Nrf2-li huma regolati 'l isfel minn din il-proteina [6]. L-AREs jistgħu sussegwentement jaffettwaw il-livelli ta 'antiossidanti u jattivaw l-espressjoni downstream ta' HO-1 u ġeni protettivi oħra, li jistgħu jtejbu l-attivitajiet ta 'protezzjoni taċ-ċelluli [30,31]. Barra minn hekk, is-sejbiet issuġġerew li l-effetti protettivi tar-resveratrol kontra t-tossiċità indotta A {{2{{50}}}} fiċ-ċelloli PC12 iseħħu permezz tar-regolazzjoni 'l fuq tal-espressjoni HO-1 permezz tal-attivazzjoni tal-Nrf2 intraċellulari. passaġġ ta 'sinjalazzjoni [32]. Iċ-ċelloli PC12 huma mudell aċċettat ta' ċelloli newrali u jintużaw b'mod estensiv fi studji dwar l-effett newroprotettiv [33]. L-H2O2 jista 'faċilment jgħaddi mill-membrana taċ-ċellula u jikkombina mal-ħadid biex jifforma radikali ħielsa attivi ħafna, li jinduċu stress ossidattiv u ħsara fiċ-ċelluli [34]. H2O2 huwa ROS importanti, u radikali ħielsa huma ġġenerati faċilment u relattivament stabbli, għalhekk, ġeneralment jintużaw biex jistabbilixxu mudell ta 'stress ossidattiv bl-użu ta' ċelloli PC12 [5]. F'dan l-istudju, trattament minn qabel taċ-ċelluli PC12 b'konċentrazzjonijiet mhux tossiċi ta 'l-estratt tal-pjanti pproteġi ċelluli minn H2O2-ċitotossiċità indotta billi naqqas il-ġenerazzjoni ta' ROS. Phenylethanoid glycosides fihom ħafna gruppi hydroxyl fenoliċi li għandhom attivitajiet antiossidanti u kontra t-tixjiħ. F'dan l-istudju, sibna li l-estrazzjoni ta 'n-butanol ipproduċiet protezzjoni aħjar minn frazzjonijiet oħra ta' polarità (Figura 3). Għalhekk, aħna aktar skrinjati l-attivitajiet protettivi ta 'tmien komposti iżolati mill-frazzjoni n-butanol. Ir-riżultati wrew għall-ewwel darba li Figura 8. Analiżi tal-livelli tal-proteina HO-1 u GCLC fuq ċelluli PC12. (a) Analiżi Western blotting tal-espressjoni ta 'HO-1 u GCLC u GAPDH intużat bħala kontroll tat-tagħbija. (b) Analiżi Western blot Espressjoni tal-proteina GCLC. (c) Analiżi Western blot HO-1 espressjoni tal-proteina. (d) L-inibitur HO-1 ZnPP naqqas l-effett newroprotettiv. Id-dejta hija ppreżentata bħala mezz ± SD, n=3. ***p < 0.0{01="" kontra="" grupp="" ta'="" kontroll;="" #p="">< 0.05="" kontra="" grupp="" h2o2="" (mingħajr="" znpp="" trattat),="" ##p="">< 0.01="" kontra="" grupp="" h2o2="" (mingħajr="" znpp="" trattat),="" ###p="">< 0.001="" kontra="" grupp="" h2o2="" (mingħajr="" znpp="" trattat);="" u="" p="">< 0.01,="" kontra="" l-grupp="" h2o2="" (b'znpp="" trattat),="" u="" &p="">< 0.001,="" kontra="" l-grupp="" h2o2="" (b'znpp="" trattat).="" (grupp="" ta="" 'kontroll;="" grupp="" mudell:="" h2o2;="" grupp="" negattiv="" znpp:="" caleolarioside="" b="" flimkien="" ma'="" h2o2,="" paraboside="" b="" flimkien="" h2o2,="" paraboside="" ii="" plus="" h2o2;="" znpp="" grupp="" pożittiv:="" znpp="" flimkien="" ma="" caleolarioside="" b="" flimkien="" h2o2,="" znpp="" plus="" paraboside="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" paraboside="" ii="" flimkien="" ma'="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" et="" al.="" niżżel="" minn="" https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145="" mill-mistieden="" fis-27="" ta'="" awwissu="" 2021="" il-caleolarioside="" b,="" il-paraboside="" b,="" u="" l-paraboside="" ii="" għandhom="" effetti="" protettivi="" sinifikanti="" kontra="" l-ossidattiv="" indott="" minn="" h2o2-="" ħsara="" fiċ-ċelloli="" pc12.="" ir-riżultati="" indikaw="" ukoll="" li="" t-trattament="" h2o2="" wassal="" għal="" ħsara="" sinifikanti="" taċ-ċelluli="" pc12="" u="" naqas="" il-vijabbiltà="" taċ-ċelluli,="" filwaqt="" li="" t-trattament="" ta="" 'caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" u="" paraboside="" ii="" itaffu="" dawn="" l-effetti="" b'mod="" sinifikanti="" (figura="" 6).="" studju="" preċedenti="" rrapporta="" li="" l-passaġġ="" nrf2/are="" huwa="" wieħed="" mill-mogħdijiet="" antiossidanti="" endoġeni="" l-aktar="" importanti,="" u="" jista="" 'jirregola="" l-espressjoni="" ta'="" markaturi="" downstream,="" bħal="" ho-1,="" biex="" jipproteġu="" ċ-ċelloli="" [7].="" ir-riżultati="" tal-qrt-pcr="" u="" l-analiżi="" tal-western="" blotting="" wrew="" li="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b,="" u="" paraboside="" ii="" irregolaw="" b'mod="" sinifikanti="" l-livelli="" ta="" 'ho-1.="" madankollu,="" il-livelli="" ta="" 'traskrizzjoni="" ta'="" gclc="" żdiedu="" b'mod="" sinifikanti="" fiċ-ċelloli="" pc12="" ittrattati="" minn="" qabel="" b'caleolarioside="" b="" iżda="" naqsu="" f'dawk="" ittrattati="" minn="" qabel="" b'paraboside="" b="" meta="" mqabbla="" ma="" 'dawk="" fil-grupp="" mudell.="" barra="" minn="" hekk,="" paraboside="" ii="" ma="" biddilx="" l-espressjoni="" ta="" 'dan="" il-markatur,="" meta="" mqabbel="" ma'="" dak="" fil-grupp="" mudell="" (figuri="" 7="" u="" 8="" (a-c)).="" barra="" minn="" hekk,="" l-effetti="" protettivi="" ta="" 'caleolarioside="" b,="" paraboside="" b,="" u="" paraboside="" ii="" kontra="" l-ħsara="" taċ-ċelluli="" pc12="" indotta="" minn="" h2o2-inqalbu="" mill-inibitur="" ho-1="" znpp="" (figura="" 8(d)).="" bħala="" konklużjoni,="" il-phenylethanoid="" glycosides="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b,="" u="" paraboside="" ii="" ipproteġu="" b'mod="" effettiv="" iċ-ċelluli="" pc12="" minn="" h2o2-indotta="" ħsara="" ossidattiva.="" għaldaqstant,="" dawn="" il-komposti,="" iżolati="" minn="" p.="" martini,="" jistgħu="" jirrappreżentaw="" kandidati="" potenzjali="" tad-droga="" għat-trattament="" ta="" 'mard="">
Il-benefiċċju ta 'Cistanche:trattament ta' mard newrodeġenerattiv
Referenzi
[1] Butterfield DA. Perspettivi dwar stress ossidattiv fil-marda ta 'Alzheimer u tbassir ta' enfasi ta 'riċerka futura. J Alzheimers Dis. 2018;64:1–11.
[2] Chignon C, Tomas M, Bonnefontrousselot D, et al. Stress ossidattiv u l-amyloid-beta peptide fil-marda ta 'Alzheimer. Redox Biol. 2018;14:450–464.
[3] Guo JD, Zhao X, Li Y, et al. Ħsara lin-newroni dopaminerġiċi minn stress ossidattiv fil-marda ta 'Parkinson (reviżjoni). Int J Mol Med. 2018;41:1817–1825.
[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH, et al. Assoċjazzjoni ta 'polimorfiżmi rs823128, rs1572931, u rs823156 b'riskji mnaqqsa tal-marda ta' Parkinson. Neurorapport. 2017;27:936–941.
[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX, et al. Azzjoni antiossidanti ta' 7,8-dihydroxyflflavone tipproteġi ċ-ċelluli PC12 kontra ċitotossiċità indotta minn 6-hydroxydopamine. Neurochem Int. 2014;64:18–23.
[6] Li MQ, Xu T, Zhou F, et al. Effetti newroprotettivi ta' erba' phenylethanoid glycosides fuq H2O2-apoptosi indotta fuq ċelluli PC12 permezz tal-passaġġ Nrf2/ARE. Int J Mol Sci. 2018;19:1135.
[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E, et al. Mogħdija Nrf2-ARE: mira emerġenti kontra stress ossidattiv u newroinfjammazzjoni f'mard newrodeġenerattiv. Pharmacol Therapeut. 2016;157:84–104.
[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP, et al. L-effetti tal-phenylethanoid glycosides, derivati minnHerba cistanche, dwar defiċits konjittivi u attivitajiet antiossidanti fil-ġrieden SAMP8 irġiel. J Toxicol Env Heal A. 2017;80:1180–1186.
[9] Tsvetkov DE, Dmitrenok AS, Tsvetkov YE, et al. Phenylethanoid glycosides minn għoqod ta 'l-injam tat-teak u l-attività antiossidanti tagħhom. J Biol Active Prod Nat. 2016;6:272–281.
[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ, et al. Attività antiossidanti ta 'komposti ta' caffeoyl phenylethanoid glycoside minn Lindernia ruellioides in vitro. Cent South Pharm. 2017;15:1687–1690.
[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L, et al. Rwol tal-mogħdija Nrf2-ARE fil-ħsara mill-istress ossidattiv u r-relazzjoni tagħha ma' mogħdijiet oħra ta' sinjalazzjoni. Anim Trobbija Għalf Sci. 2016;37:42–48.
[12] Zheng XK, Li J, Feng WS, et al. Avvanzi fl-istudju ta 'Gesneriaceae. Chin J Droga Ġdida. 2003;12:261–263.
[13] Wen F, Li ZD. Avvanzat tar-riċerka fuq il-pjanta Gesneriaceae. Riżors tal-Pjanti Selvaġġi Chin. 2006;25:1–6.
[14] Yan WY, Chen L, Wang JM, et al. Progress tar-riċerka ta 'triterpenoids ta' pjanti Gesneriaceae. Nat Prod Res Dev. 2012;24:698–701.
[15] Kumpanija Ċiniża tal-mediċina tal-ħxejjex. Ir-rekords tar-riżorsi tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża. Ċina: Science Press; 1994.
[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG, et al. Distribuzzjoni ta 'glycosides Phenylethanoid f'pjanti mediċinali ta' Gesneriaceae. Chin J Chin Mater Med. 2013;38:4267–4270.
[17] He ZD, Lau KM, Xu HX, et al. Attività antiossidanti ta 'phenylethanoid glycosides minn Brandisia hancei. J Ethnopharmacol. 2000;71:483–486.
[18] Li L, Shi DF, Gui YG, et al. Studju dwar l-attivitajiet antiossidanti taphenylethanoid glycosides minn Cistanche deserticola. J Anhui Agri Sci. 2009;32:15835–15836.
[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y, et al. Effetti protettivi taglikosidi ta' cistanchedwar il-ħsara taċ-ċelluli PC12 PARABOLA MARTINI IPROTEĠJA IĊ-ĊELLI PC12 MINN H2O2-ĦSARA INDOTTA 2211
