Parti 2: Interazzjonijiet Ta 'Aċidu Ascorbic, 5-Aċidu Kaffeoylquinic, U Quercetin-3-Rutinoside Fil-Preżenza U Assenza Ta' Ħadid Waqt l-Ipproċessar Termali U L-Influwenza fuq l-Attività Antiossidanti

Għal aktar informazzjoni. ikkuntattja:tina.xiang@wecistanche.com

Ikklikkja l-link biex titgħallem id-dettalji tal-parti 1:
https://www.xjcistanche.com/news/part1-interactions-of-ascorbic-acid-5-caffeo-54916714.html

3. Diskussjoni

3.1. Relazzjoni Struttura-Attività tal-Aċidu Ascorbic,5-Caffeoylquinic Acid, u Quercetin-3-Rutinoside

L-ewwel indikatur tal-AOA, imkejjel għal sustanzi differenti skont ir-relazzjoni struttura-attività, irriżulta min-numru ta 'gruppi funzjonali. Meta tqabbel it-tliet sustanzi analizzati, l-aċidu askorbiku kellu l-inqas AOA, segwit minn 5-caffeoylquinic acid, filwaqt liquercetin-3-rutinosidelaħaq l-ogħla AOA. Csepregi et al. [14] sabet l-istess ordni meta tqabbel l-AOA ta 'dawn it-tliet komposti. Din il-klassifikazzjoni tista' tiġi spjegata mill-ammont totali ta' gruppi idrossi: quercetin-3-rutinoside għandu għaxra, 5-caffeoylquinic acid għandu ħamsa, uaċidu askorbikugħandu erbgħa. Għalflavonojdi, l-ammont totali ta 'gruppi idrossi u l-impatt tagħhom fuq il-mekkaniżmi ta' AOA kien muri qabel minn Burda u Oleszek[15]. Gruppi idrossidi huma partikolarment siewja fl-istrutturi enediol, peress li jistgħu faċilment jossidaw għal diketones [8]. Fis-sustanzi analizzati l-istruttura tal-endiol hija importanti wkoll għall-abbiltà li jiffurmaw kumplessi ma' joni tal-metall [16-18]. L-istruttura tal-endiol sseħħ fil-molekuli tal-quercetin-3-rutinoside u 5-caffeoylquinic acid fiċ-ċirku tal-fenil, li jistgħu wkoll jinfluwenzaw l-AOA aktar b'saħħitha ta 'dawn il-komposti. Studji ulterjuri sabu li l-AOA jista 'jkun influwenzat ukoll minn strutturi ta' molekuli oħra. L-aċidi fenoliċi huma possibilment affettwati mill-gruppi tal-aċidu karbossiliku, eż, l-aċidu idrossifenil aċetiku (R-CH=CH-COOH) huwa grupp aktar dgħajjef li jiġbor l-elettroni, meta mqabbel mal-aċidu idrossiċinnamiku (R-CH,-COOH) bħal bħala aċidu kaffejku fl-aċidu 5-caffeoylquinic [19]. Fil-flavonoids, l-aglycones kellhom AOA ogħla mill-glycosides korrispondenti [20,21], fil-każ ta' quercetin-3-rutinoside, glycoside, l-AOA tal-aglyconequercetinhija konsegwentement ogħla [14]. Hemm ħafna gruppi funzjonali differenti li jistgħu jinfluwenzaw l-AOA u, konsegwentement, huwa importanti li jintużaw analiżi tat-test differenti b'mekkaniżmi differenti, bħal trasferiment ta 'elettron wieħed (SET), trasferiment ta' atomu ta 'idroġenu (HAT), u elettroni sekwenzjali ta' telf ta 'protoni. trasferiment (SPLET) għall-iskoperta. Kull mekkaniżmu u anke r-reaġent tal-assaġġ użat jistgħu jiskopru strutturi differenti ta 'komposti bijoattivi [22].

3.2.Influwenza ta 'l-Ipproċessar Termali u l-Interazzjoni ta' Antiossidanti Strutturalment Differenti fuq l-Attività Antiossidanti fl-Assenza tal-Ħadid Minerali

AOA stabbli fuq żmien estiż ta '40 min ta' ipproċessar termali jindika li d-degradazzjoni termali hija ta 'inqas importanza milli inizjalment ipotetizzat. Barra minn hekk, id-dejta tal-HPLC wriet li l-5-caffeoylquinic acid pur u l-quercetin-3-rutinoside kienu stabbli, b'degradazzjoni massima ta '20 fil-mija, matul l-ipproċessar termali. Studji preċedenti wrew l-istabbiltà tal-5-caffeoylquinic acid sal-punt normali tat-togħlija tal-ilma [23], filwaqt li Dawidowicz u Typek[24] sabu disa' komposti derivattivi, wara li saħħnu 5-caffeoylquinic acid għal 5 sigħat taħt rifluss. Għall-konċentrazzjoni ta 'aċidu askorbiku, instabet degradazzjoni wara 40 min ta' tisjir. Fatturi li jinfluwenzaw, li jirriżultaw f'degradazzjoni tal-aċidu askorbiku mingħajr ħadid f'soluzzjoni milwiema, jistgħu jkunu valuri tal-pH, espożizzjoni għad-dawl, ossidazzjoni, temperatura, u konċentrazzjonijiet differenti [25,26]. F'dan l-istudju, il-fatturi temperatura u konċentrazzjoni x'aktarx kellhom ir-rwol ewlieni, peress li l-proċessi ossidattivi tnaqqsu għall-minimu minħabba spazju minimu tal-gass fil-mikrotubi. Huwa possibbli li l-fażi tal-gass li fadal għadha biżżejjed għad-degradazzjoni taħt kundizzjonijiet aerobiċi. Il-kundizzjonijiet differenti jirriżultaw fi prodotti differenti [27,28], għalhekk f'dan l-istudju, wara 40 min ta 'tisjir, setgħu jinstabu prodotti taż-żewġ kundizzjonijiet. Yuan u Chen [28] irrappurtaw li furfural, 2-aċidu furojku, 3-hydroxy-2-pyrrone, u sustanza mhux magħrufa huma prodotti ta' degradazzjoni maġġuri ta' aċidu askorbiku f'soluzzjoni milwiema skont il-valur tal-pH . Shinoda et al. [29,30] sabet fil-meraq tal-larinġ il-prodotti tad-degradazzjoni furfural, 2-aċidu furojku, 5-hydroxymaltol, 3-hydroxy-2-pyrrone, u 5-(hydroxymethyl )furfural. Hsu et al. [31] analizzat l-aċidu askorbiku f'soluzzjonijiet etanoliċi u skopra 2-aċidu furojku u 3-hydroxy-2-pyrrone. Skont kundizzjonijiet aerobiċi jew anerobiċi, id-derivattivi tal-aċidu askorbiku misjuba (il-qċaċet 3 u 4) jistgħu jkunu furfural, 2-aċidu furojku, jew 3-hydroxy-2-pyrrone jew intermedji. L-aċidu askorbiku naqas f'relazzjoni doża-rispons, u konċentrazzjonijiet ogħla ta 'aċidu askorbiku wrew proporzjonijiet ta' degradazzjoni aktar baxxi waqt it-tisjir. L-aċidu askorbiku jidher li jistabbilizza ruħu f'konċentrazzjonijiet ogħla, preżumibbilment minħabba r-rabtiet tal-idroġenu u l-enerġija van de Waals [32].

F'taħlitiet binarji u ternarji, instabu prinċipalment effetti addizzjonali fuq AOA. F'taħlitiet binarji, jekk is-sustanza b'AOA ogħla żdiedet fil-konċentrazzjoni tagħha, l-AOA tal-kombinazzjoni tagħhom żdiedet ukoll. Studji oħra sabu wkoll effetti addittivi bejn ( plus )-catechin (200 um) b'aċidu askorbiku (50-200 mg/L)[33], u bejn taħlitiet binarji ta' monoterpeni differenti[34]. Fl-assaġġ DPPH biss, instabu effetti antagonistiċi f'5-caffeoylquinic acid flimkien ma' quercetin-3-rutinoside u f'taħlitiet ternarji b'konċentrazzjonijiet ta' quercetin-3-rutinoside rduppjati. Dan jista' jkun ikkawżat mill-orjentazzjoni tal-molekuli fl-ispazju, speċjalment quercetin-3-rutinoside, bħala molekula pjuttost kbira, u l-aċċessibbiltà sterika tal-molekula radikali DPPH [35]. Fl-assaġġ TPC, il-kombinazzjoni ta 'aċidu askorbiku u 5-caffeoylquinic acid irriżultaw f'effetti antagonistiċi qawwija fi proporzjon 1:2, filwaqt li taħlitiet maqluba bi proporzjon 2:1 irriżultaw f'effetti sinerġistiċi qawwija, li qabżu s-somma tal- AOAs rispettivi. L-aċidu askorbiku ta' konċentrazzjoni doppja jista' jagħti, taħt dawn il-kundizzjonijiet, spinta addizzjonali lill-AOA, minħabba l-awto-stabilizzazzjoni segwita mill-istabbilizzazzjoni ta' molekuli oħra, murija minn 5-caffeoylquinic acid f'dan l-esperiment. Fil-meraq tar-Rummien-nuċiprisk, bejn il-fenoli naturali u l-aċidu askorbiku, instabet l-istess interazzjoni, filwaqt li fil-meraq tal-għeneb ġew osservati effetti antagonistiċi li jżidu billi tiżdied il-konċentrazzjoni tal-aċidu askorbiku [36]. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li taħlitiet ta' aċidu askorbiku, 5-caffeoylquinic, u quercetin-3-rutinoside jiksbu l-ogħla potenzjal AOA meta l-aktar potentiantiossidantihuma disponibbli b'mod abbundanti.

Ikklikkja biex titgħallem aktar dwar il-prodotti

3.3. Influwenza tal-Ħadid Minerali

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>aċidu askorbiku. Madankollu, iż-żieda tal-ħadid mat-taħlitiet kellha influwenza fuq ir-riżultati tal-analiżi TEAC u DPPH, filwaqt li l-assaġġi TPC ma ġewx affettwati b'mod wiesa '. Għal din ir-raġuni, huwa importanti li tuża testijiet tat-test differenti b'mekkaniżmi ta 'ħidma differenti meta taħdem ma' kampjuni b'ħafna ħadid.

Fl-assaġġ DPPH biss l-AOA ta' quercetin-3-rutinoside pur, u flimkien ma' aċidu askorbiku, ekwimolari jew mhux ekwimolari b'konċentrazzjonijiet doppji ta' quercetin-3-rutinoside, kellhom valuri aktar baxxi fil-preżenza tal-ħadid. Boligon et al. [351 spjega li l-assaġġ DPPH jiskopri aħjar antiossidanti iżgħar, minħabba l-aċċessibilità sterika ta 'dawn ir-radikali. Preżumibbilment, quercetin-3-rutinoside biż-żewġ naħat li jorbtu jista 'jibni kumplessi pjuttost kbar bil-ħadid, u għalhekk ikun inaċċessibbli għall-assaġġ. Kif imsemmi minn Kejic et al. [8], dan jista 'jiġi spjegat mill-formazzjoni ta' kumplessi supramolekulari permezz tal-koordinazzjoni ta 'jonji tal-metall. Flimkien ma 'aċidu askorbiku, li huwa kapaċi jibni kumplessi ta' valenza mħallta fi proporzjon 1:2 [12], preżumibbilment, dawn il-kumplessi mħallta akbar ma jistgħux jinteraġixxu mar-radikali DPPH. Kuntrarju għar-riżultati f'dan l-istudju, studji oħra [18,37,38] sabu, bl-użu tal-assaġġ DPPH, li l-kumplessi quercetin-3-rutinoside huma antiossidanti aktar effettivi minn quercetin-3-rutinoside pur. Huwa magħruf li kumplessi kelati ta 'flavonoids u joni tal-metall jistgħu jiċħdu l-attività radikali ta' joni tal-metall kumplessi [39]. L-unika differenza kienet li f'dan l-istudju intuża s-sulfat tal-ħadid tal-ammonju (II), minflok il-klorur jew is-sulfat tal-ħadid (ⅡI), użat fix-xogħol ta 'Symonowics u Kolandek [39].

Instabu effetti sinerġistiċi bejn l-aċidu askorbiku u 5-caffeoylquinic acid fil-preżenza tal-ħadid fil-proporzjon 2:1, u effetti antagonistiċi fil-proporzjon 1:2. Il-kombinazzjoni ta' 5-caffeoylquinic acid mal-ħadid ma kinitx rakkomandata in vivo [6]. Madankollu, dan l-istudju wera li, in vitro, l-ammont doppju ta' aċidu askorbiku meta mqabbel ma' 5-caffeoylquinic acid jista' saħansitra jkollu effetti sinerġistiċi fuq AOA. Investigazzjonijiet ulterjuri dwar il-proporzjonijiet jistgħu juru jekk l-effetti pożittivi jistgħux jinkisbu wkoll in vivo.

Skont id-dejta tal-HPLC, iż-żieda tal-ħadid mal-kampjun se jkollha effett minimu fuq l-attività katalitika tiegħu, peress li naqset biss il-konċentrazzjoni tal-aċidu askorbiku f'0 min kampjuni msajra. Fil-kampjuni tal-aċidu askorbiku imsajjar, kuntrarjament għal kampjuni mingħajr ħadid, konċentrazzjonijiet ogħla ta 'aċidu askorbiku wasslu għal proporzjon ta' degradazzjoni ogħla.5-Aċidu caffeovlquinic u quercetin-3-rutinoside jeħtieġu l-fatturi addizzjonali temperatura u ħin, kif ukoll interazzjonijiet f'taħlitiet, għall-attività katalitika tal-ħadid biex taħdem. Quercetin-3-rutinoside, fil-preżenza tal-ħadid, naqas biss f'taħlitiet binarji ma 'aċidu askorbiku wara l-ipproċessar termali. Dan jista 'jkun minħabba l-fatt li l-flavonoid jaġixxi bħala antiossidant primarju u mbagħad ir-radikali kompost li jirriżulta jirreaġixxi ma' l-aċidu askorbiku, u jirriġenera l-kompost oriġinali [18]. 5-L-aċidu caffeoylquinic jidher li huwa speċjali, minħabba li jipproteġi quercetin-3-rutinoside, filwaqt li l-aċidu askorbiku mhux kapaċi jipproteġi quercetin-3-rutinoside. Għalhekk, l-aċidu 5-caffeoylquinic jista' jkun il-molekula ewlenija għall-istabbilizzazzjoni tas-sistema flimkien mal-ħadid u l-ipproċessar termali. Din l-ipoteżi ta' 5-caffeoylquinic acid bħala molekula stabilizzanti ġiet ikkonfermata aktar fit-taħlitiet ternarji. Hawnhekk, quercetin-3-rutinoside kien dejjem stabbilizzat b'5-caffeoylquinic acid, sabiex anke fil-preżenza ta 'aċidu askorbiku ma kien osservat l-ebda tnaqqis fil-konċentrazzjoni ta' quercetin-3-rutinoside. Fi studju ieħor, 5-caffeoylquinic acid wera proprjetajiet protettivi kontra d-degradazzjoni tal-anthocyanins permezz ta' mekkaniżmu ta' ko-pigmentazzjoni [40]. Prodotti ġodda ta' degradazzjoni, b'AOA possibbilment ogħla, dehru mit-tliet sustanzi kollha fil-preżenza tal-ħadid. L-aċidu kaffejku (il-quċċata 6) ġie identifikat bħala prodott ta' tqassim ta' 5-caffeoylquinic acid (dejta mhux murija). Dan wassal għas-suppożizzjoni li s-sustanza l-oħra tista' tkun l-aċidu quinic jew wieħed mid-disa' derivattivi possibbli deskritti minn Dawidowicz u Typek [24]: quinic acid;(1S,3R,4R,5R)-5-[{{24] }}(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoyl]-1,4,5-trihydroxy-cyclohexane carboxylic acid;(1S3R,4R,5R)-5- [3-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-hydroxypropanoyl]-1,4,5 trihydroxycyclohex-anecarboxylic acid; trans 3-aċidu O-kaffeoylquinic; trans 5-aċidu O-kaffeoylquinic; trans 4-aċidu O-kaffeoylquinic; aċidu kafejku; aċidu cis-5-O-kaffeoylquinic;4,5-aċidu dikaffeoylquinic. Għal quercetin-3-rutinoside, jidher prodott ta' degradazzjoni fil-kromatogramma, li ma setax jiġi identifikat.

3.4. Kapaċità li tifforma Chelates b'Ferriku (Fe3 plus) u Ħadid tal-ħadid (Fe2 plus)

Fil-kampjuni kollha li fihom l-aċidu askorbiku, il-ħadid ferriku tnaqqas għal ħadid tal-ħadid. F'dan il-proċess,aċidu askorbikujieħu elettron mill-ħadid ferriku u jnaqqasha għal ħadid tal-ħadid, u jsir radikali nnifsu. Ir-radikali instabbli jikkonverti malajr f'aċidu dehydroascorbic u aktar prodotti ta' degradazzjoni [12]. Minħabba l-hydroxy peroxide nieqes, reazzjoni lura għall-ħadid ferriku permezz taċ-ċiklu Fenton mhix possibbli. F' 0 min imsajjar taħlitiet binarji, aktar minn 20 fil-mija tal-ħadid kien marbut fil-preżenza ta 'aċidu askorbiku. Huwa magħruf li l-aċidu askorbiku jifforma kumplessi ma' speċi tal-ħadid u jonji oħra tal-metall permezz ta' kelazzjoni permezz tan-nuklei 3-O u 2-O wara l-ispostament tal-idroġenu mill-3-OH u 2- Gruppi OH [16,17,41. Jista' wkoll jifforma kumplessi ta' ħadid-ascorbate ta' valenza mħallta [42]. Madankollu, l-aċidu askorbiku huwa aġent kelanti dgħajjef u, wara t-tisjir, ġew skoperti biss traċċi ta 'ħadid marbut f'kampjuni puri u mħallta meta l-aċidu askorbiku kien preżenti. Barra minn hekk, minħabba l-proċess tat-tisjir, l-aċidu askorbiku jkisser għal prodotti ta 'degradazzjoni, li jidhru li ma jistgħux jikkelaw bil-ħadid.

5-L-aċidu caffeoylquinic huwa redunt relattivament fqir. Il-ħadid ferriku tnaqqas b'5-aċidu caffeoylquinic, u bi tisjir fit-tul, it-tnaqqis żdied.5-Aċidu caffeoylquinic jikelati b'ħadid ferriku fi trasferiment ta' tagħbija ligand għal metall [17].5-Aċidu caffeoylquinic iġorr naħa waħda li torbot possibbli fl-istruttura endiol 3,4 tal-aċidu caffeic. Dan jista' jkun indikatur għaliex l-aċidu caffeic huwa l-parti bijoattiva ta' 5-caffeoylquinic acid, filwaqt li l-aċidu quinic kważi m'għandu l-ebda AOA [43]. Endiols inibixxu l-formazzjoni ta 'OH minħabba l-formazzjoni ta' kumpless tal-ħadid[41]fi proporzjon wieħed għal wieħed [44,45]. Lamy et al.[46] jikkonkludu li 5-caffeoylquinic acid jifforma kumplessi monomeriċi, filwaqt li Kiss et al. [47] sabu speċi oligomeriċi. Kuntrarjament għal studji preċedenti [17,48], instabu biss traċċi ta 'ħadid marbut fil-preżenza ta' 5-caffeoylquinic acid qabel u wara l-ipproċessar termali. Dan jista' jiġi spjegat mill-kundizzjonijiet newtrali tal-pH f'dan l-istudju, filwaqt li studji oħra ħadmu f'medju aċiduż, ibbażat fuq valur tal-pH minn 1-2.5 fl-istonku tal-bniedem [48]. Instab preċipitat iswed f'kampjuni maħżuna wara diversi sigħat, li huwa indikatur ta' kumplessi 5-caffeoylicquinic acid-ħadid ferriku. Kampjuni mħallta reċentement intużaw għall-analiżi, għalhekk il-formazzjoni ta 'dawn il-kumplessi f'pH newtrali teħtieġ perjodu itwal ta' żmien. Il-kumplessi tal-ħadid b'aċidu kaffejku wrew ftit attività ta' tkessiħ [49]. Barra minn hekk, m'hemm l-ebda evidenza spettrofotometrika għal reazzjoni bejn l-aċidu quinic u l-ħadid ferriku [48]. Kuntrarjament għal 5-caffeoylquinic acid, fil-kampjun quercetin-3-rutinoside, instab ħadid marbut, anke wara l-ipproċessar termali.

Quercetin-3-rutinoside naqqas ħadid ferriku għal ħadid ferruż b'żieda minima b'ħin fit-tul tat-tisjir. Din l-attività moderata ta' tnaqqis ta' quercetin-3-rutinoside kienet deskritta qabel minn Mira et al. [50]. L-attività li tnaqqas ferrika ta' quercetin-3-rutinoside ġiet skoperta f'3-rutinoside, 5,7,3',4'-OH [50]. L-interazzjoni moderata mal-ħadid ferriku tista 'tiġi spjegata b'numru aktar baxx ta' gruppi -OH, li rriżulta f'densità ta 'ċarġ negattiv aktar baxx fin-naħa ta' kelazzjoni [50]. Flavonoids jistgħu jikkelaw ma' jonji tal-metall fi tliet naħat ta' koordinazzjoni potenzjali:(i)bejn gruppi 5-idrossi u 4-carbonyl, (ii) bejn gruppi 3-idrossi u 4-carbonyl, u (ii) bejn gruppi 3', A'-hydroxy f'Bring [39]. Quercetin-3-rutinoside juża l-ġnub li jorbtu (i) u (i)[9], u fil-grupp 3-hydroxy, ir-rutinoside huwa mwaħħal. Id-dejta spettrali saħansitra wriet li l-joni tal-metall huma marbuta biss mal-grupp 3', A'-hydroxy [18]. Il-kelati huma aktar effettivi bil-ħadid fil-forma bivalenti tiegħu [50]. F'taħlitiet binarji, quercetin-3-rutinoside ma jkunx kapaċi jifforma kumplessi meta jkun preżenti l-aċidu askorbiku, għall-kuntrarju f'taħlitiet ternarji. Jekk l-aċidu 5-caffeoylquinic ikun preżenti, jinstabu ammonti żgħar ta' ħadid marbut. Dan jindika li 5-caffeoylquinic jipproteġi quercetin-3-molekuli ta' rutinoside fil-preżenza ta' aċidu askorbiku, għalhekk quercetin-3-rutinoside jista' jifforma kumplessi mal-ħadid.

4. Materjali u Metodi

4.1.Kimiċi

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99 fil-mija), dodecahydrate tas-sulfat tal-ammonju ferriku, u hexahydrate tas-sulfat tal-ammonju tal-ħadid inxtraw minn Carl Roth (Karlsruhe, il-Ġermanja).

4.2.Kampjuni

Soluzzjonijiet milwiema u taħlitiet ta' standards awtentiċi ta' aċidu askorbiku, {{0}}caffeoylquinic acid, u quercetin-3-rutinoside ġew ippreparati bħala soluzzjonijiet puri u taħlitiet fi proporzjonijiet differenti. It-taħlitiet binarji kollha possibbli saru fi proporzjonijiet ekwimolari, u proporzjonijiet mhux ekwimolari b'kompost wieħed irduppjati. It-taħlitiet ternarji ġew ippreparati wkoll fi proporzjonijiet ekwimolari, kif ukoll fi proporzjonijiet mhux ekwimolari b'kompost wieħed jew tnejn irduppjati, rispettivament. Il-konċentrazzjonijiet finali tal-antiossidanti kienu 0.3 mM għal kull soluzzjoni tat-test. Barra minn hekk, l-esperimenti kollha ġew ripetuti wara ż-żieda ta '0.3 mM ħadid ({{10}}.15 mM ħadid tal-ħadid u 0.15 mM ħadid ferriku) b'kollox għal kull taħlita. L-ammonti magħżula ta 'antiossidanti u ħadid mhumiex ibbażati fuq livelli fiżjoloġiċi jew tal-ikel, huma bbażati fuq mases molari biex jistudjaw l-effett tal-interazzjoni molekulari. Konsegwentement, ġie stabbilit proporzjon ekwimolari bejn l-antiossidanti totali u l-ħadid. It-taħlitiet kollha ġew imsajjar għal 0, 10, 20, u 40 min f'ilma jagħli, u wara mkessħa fuq is-silġ biex iwaqqaf il-proċess tat-tisħin. Dan sar għal tliet repliki indipendenti.

4.3.Kejl fotometriku

Antiossidanti(pura jew imħallat) fin-nuqqas u l-preżenza tal-ħadid ġew imkejla għall-attività ta’ tnaqqis totali tagħhom u l-attività antiossidanti fi tliet repliki tekniċi indipendenti bl-użu ta’ metodu ta’ produzzjoni għolja fi 96-pjanċi ta’ sew (SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Intużaw analiżi tat-test differenti, minħabba l-mekkaniżmi ta 'reazzjoni differenti: trasferiment ta' elettron wieħed (SET) u trasferiment ta 'atomu ta' idroġenu (HAT). Filwaqt li l-assaġġ TEAC u TPC huwa bbażat fuq SET [17,18], għall-assaġġ tat-test DPPH, il-letteratura mhix ċara pjuttost jekk hijiex ibbażata fuq SET, HAT, jew saħansitra taħlita ta’ dawn iż-żewġ mekkaniżmi [{{6} }]. Studju reċenti minn Foti[51] skopra li l-fenoli jistgħu jirreaġixxu ma 'DPPH permezz ta' trasferiment sekwenzjali ta 'elettroni b'telf ta' protoni (SPLET), taħlita taż-żewġ mekkaniżmi. Fatturi, bħall-polarità medja u l-potenzjal ta 'jonizzazzjoni, jinfluwenzaw il-mekkaniżmu predominanti.

4.3.1. Kontenut Fenoliku Totali (TPC)

Il-kontenut totali ta' fenol (TPC) ġie ddeterminat bl-użu tal-metodu Folin-Ciocalteu fi 96-platt tal-bir, li kien deskritt qabel minn Bobo-Garcia et al.[52] b'xi modifiki.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99). L-isem komuni ta 'dan it-test huwa qarrieqi minħabba li r-reaġent Folin-Ciocalteu jirreaġixxi wkoll fuq sustanzi mhux fenoliċi, bħal vitamini u minerali [22]. Jiddeskrivi aħjar l-"attività ta 'tnaqqis totali" ta' komposti bijoattivi.

4.3.2. Kapaċità Antiossidanti Ekwivalenti Trolox (TEAC)

L-attività anti-ossidanti ġiet iddeterminata bl-użu tal-assaġġ TEAC fi 96-pjanċa tal-bir b'xi modifiki. Soluzzjoni stokk b'9.6 mg ABTS u 1.66 mg persulfat tal-potassju mimlija b'H2O sa 25 mL ġiet ippreparata u inkubata fid-dlam f'temperatura tal-kamra għal 12-16 siegħa. Minn din is-soluzzjoni tal-istokk, ġiet ippreparata soluzzjoni ta 'ħidma TEAC, li fiha soluzzjoni tal-istokk ta' 5mL mimlija sa 25 mL b'100 fil-mija MeOH.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH*Scanning Radikali

Il-antiossidantactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Sinerġiżmu u Antagoniżmu

Għall-analiżi tal-effetti sinerġistiċi u antagonistiċi tal-attività antiossidanti, sar paragun tar-riżultati miksuba b'mod sperimentali mal-valuri teoretiċi kkalkulati bis-somma tal-effetti tal-komponenti individwali fil-konċentrazzjoni korrispondenti [53]. Is-sinerġismu jiddeskrivi interazzjoni ta' żewġ sustanzi jew aktar sabiex l-azzjoni magħquda tkun akbar mis-somma ta' kull waħda li taġixxi separatament. Kuntrarjament għal dan, l-antagoniżmu huwa fenomenu fejn l-interazzjoni ta 'żewġ sustanzi jew aktar f'kombinazzjoni għandha effett ġenerali li huwa inqas mis-somma tal-effetti individwali tagħhom.

4.5.Determinazzjoni tal-Ħadid Ijoniku

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99). Id-differenza bejn il-ħadid totali u l-ħadid joniku, is-somma tal-ħadid tal-ħadid u tal-ħadid, hija l-ħadid marbut.

4.6.HPLC-DAD

Biex tikkwantifika l-antiossidanti aċidu askorbiku, 5-caffeoylquinic acid, u quercetin-3-rutinoside u prodotti ta' degradazzjoni tagħhom fl-istess estratti użati għall-fotometrika

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99） ġew ippreparati. Komposti derivati ​​ġew identifikati b'mod tentattiv billi ġew analizzati l-istandards puri fil-preżenza u fin-nuqqas ta 'proċessar ta' qabel u ta 'wara termali tal-ħadid. Għalhekk, il-quċċata l-ġdida għandha toħroġ mill-istandard tal-inserzjoni. Barra minn hekk, it-taħlitiet magħżula tkejlu permezz tal-HPLC-MS biex tiġi vverifikata l-istruttura proposta.

4.7. Analiżi Statistika

Microsoft Excel 2016(Microsoft, Redmond, USA) u R Statistics (verżjoni 3.6.3, Hold-ing the Windsock, 2020) intużaw għal testijiet tal-bijostatistika u għall-preżentazzjoni u t-tpinġija tar-riżultati tad-dejta. L-istatistika inferenzjali għall-valutazzjoni u l-irbit ta 'trattamenti twettqu bl-użu ta' analiżi ta 'varjanza bi tliet direzzjonijiet (ANOVA), test HSD ta' Tukey post hoc, u korrelazzjoni Pearson. Il-pakketti R użati kienu ggplot2 [55], mezzi [56], u multcomp [57].

5. Konklużjonijiet

Ibbażat fuq is-sejbiet deskritti hawn fuq, l-AOA tal-aċidu askorbiku, 5-caffeoylquinic acid, u quercetin-3-rutinoside kien influwenzat mill-istruttura tal-molekula tagħhom, konċentrazzjoni, proporzjon, u interazzjonijiet ma 'antiossidanti u ħadid oħra. L-interazzjoni speċjalment tidher li għandha rwol fl-AOA meta tgħaqqad l-aċidu askorbiku u l-aċidu 5-caffeoylquinic. Hawnhekk, ġew skoperti effetti sinerġistiċi u antagonistiċi. It-temperatura kellha influwenza minima fuq AOA, filwaqt li fl-istess ħin it-temperatura influwenzat l-istabbiltà tal-antiossidanti kollha f'ċerti taħlitiet, speċjalment fil-preżenza tal-ħadid. Il-konċentrazzjoni ta' aċidu askorbiku biss naqset fin-nuqqas ta' ħadid b'ħin fit-tul tat-tisjir u l-konċentrazzjoni ta' 5-caffeoylquinic acid naqset biss fil-preżenza tal-ħadid, filwaqt li l-konċentrazzjoni ta' quercetin-3-rutinoside naqset biss flimkien ma' aċidu askorbiku fil- preżenza ta 'ħadid. Flimkien mal-ħadid, 5-caffeoylquinic acid kien kapaċi jipproteġi molekuli oħra milli jitnaqqsu fil-konċentrazzjoni tagħhom permezz ta 'proċessar termiku.

Fil-pjanti, kombinazzjonijiet ta' aċidu askorbiku, 5-caffeoylquinic acid, u quercetin-3-rutinoside mhumiex biss possibbli iżda komuni. Għalhekk, dawn ir-riżultati jagħtu għarfien bażiku dwar il-proċessi li jseħħu waqt it-tisjir tal-ħxejjex. Il-matriċi tal-ikel huma aktar kumplessi u fihom għadd ta' komposti bijoattivi, inklużi enzimi, minerali oħra, jew aċidi, li jibdlu l-kundizzjonijiet tar-reazzjoni jew huma reattivi nfushom. Dawk l-interazzjonijiet kumplessi huma ferm lil hinn mill-ambitu ta 'dan l-istudju u konċentrazzjonijiet u interazzjonijiet ta' benefiċċjuantiossidantifil-ħaxix imsajjar iridu jiġu indirizzati fil-futur.

Referenzi

1. Mellor, DD; Naumovski, N. Effett tal-kawkaw fid-dijabete: il-potenzjal tal-frixa u l-fwied bħala organi ewlenin fil-mira, aktar minn effett antiossidant? Int. J. Ikel Sci. Technol. 2016, 51, 829–841. [CrossRef]

2. Crozier, A.; Jaganath, IB; Clifford, MN Fenoli, Polifenoli u Tannini: Ħarsa ġenerali. Metaboliti Sekondarji fil-Pjanti: Okkorrenza, Struttura, u Rwol fid-Dieta tal-Bniedem; Crozier, A., Clifford, MN, Ashihara, H., Eds.; Pubblikazzjoni Blackwell: Hoboken, NJ, USA, 2006; pp. 1–24. ISBN 1-4051-2509-8.

3. Miller, D. Metalli ta 'Transizzjoni bħala Katalisti ta' Reazzjonijiet ta '"Awtossidazzjoni". Free Radic. Biol. Med. 1990, 8, 95–108. [CrossRef]

4. Buchner, N.; Krumbein, A.; Rohn, S.; Kroh, LW Effett ta 'l-Ipproċessar Termali fuq il-Flavonols Rutin u Quercetin. Komun Rapida. Spettro tal-Massa. 2006, 20, 3229–3235. [CrossRef]

5. Layrisse, M.; García-Casal, MN; Solano, L.; Barón, MA; Arguello, F.; Llovera, D.; Ramírez, J.; Leets, I.; Tropper, E. Bijodisponibbiltà tal-Ħadid fil-Bnedmin minn Kolazzjon Arrikkit bil-Ħadid Bis-Glycine Chelate, Phytates u Polyphenols. J. Nutr. 2000, 130, 2195–2199. [CrossRef] [PubMed]

6. Hurrell, RF; Reddy, M.; Cook, JD Inibizzjoni ta 'Assorbiment ta' Ħadid Mhux Haem fil-Bniedem minn Xorb li Fih Polifenoliku. Br. J. Nutr. 1999, 81, 289–295. [CrossRef] [PubMed]

7. Kostyuk, VA; Potapovich, AI Antiradical and Chelating Effects in Flavonoid Protection against Silica-Induced Cell Injury. Arch. Biochem. Biophys. 1998, 355, 43–48. [CrossRef] [PubMed]

8. Kejík, Z.; Kaplánek, R.; Masaˇrík, M.; Babula, P.; Matkowski, A.; Filipenský, P.; Veselá, K.; Gburek, J.; Sýkora, D.; Martásek, P.; et al. Kumplessi tal-Ħadid tal-Kapaċità Flavonoids-Antiossidanti u Lil hinn. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 646. [CrossRef]

9. Latos-Brozio, M.; Masek, A. Analiżi tar-Relazzjonijiet Struttura-Attività ta 'Polifenoli Monomeriċi u Polimeriċi (Quercetin, Rutin u Catechin) Miksuba b'Metodi Diversi ta' Polimerizzazzjoni. Chem. Bijodiversi. 2019, 16, e1900426. [CrossRef] [PubMed]

10. Gullón, B.; Lú-Chau, TA; Moreira, MT; Lema, JM; Eibes, G. Rutin: Reviżjoni dwar Metodi ta' Estrazzjoni, Identifikazzjoni u Purifikazzjoni, Attivitajiet Bijoloġiċi u Approċċi biex Titjieb il-Bijodisponibbiltà tagħha. Xejriet Ikel Sci. Technol. 2017, 67, 220–235. [CrossRef]