Parti 1:L-Acteoside Jrażżan l-Osteoklastoġenesi Mmedjata minn RANKL Billi Inibixxi l-Induzzjoni C-Fos U l-Pathway NF-KB U Attenwazzjoni tal-Produzzjoni ROS
Mar 05, 2022
Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*
Astratt
Bosta studji rrappurtaw li ċ-ċitokini infjammatorji huma medjaturi importanti għall-osteoklastoġenesi, u b'hekk jikkawżaw riassorbiment eċċessiv tal-għadam u osteoporożi.Acteoside minn cistanche herb, il-kompost attiv ewlieni ta 'Rehmannia glutinosa, li huwa użat ħafna fil-mediċina tradizzjonali Orjentali, għandu potenzjali anti-infjammatorji u antiossidanti. F'dan l-istudju, sibna liacteosideinibit b'mod notevoli d-divrenzjar u l-formazzjoni tal-osteoclast minn makrofaġi tal-mudullun (BMMs) u makrofaġi RAW264.7 stimulati mill-attivatur tar-riċettur tal-ligand tal-fattur nukleari-kappaB (NF-kB) (RANKL).Acteosidetrattament minn qabel ipprevjeni wkoll l-assorbiment mill-ġdid tal-għadam minn osteoklasti maturi b'mod dipendenti fuq id-doża. Acteoside (10 mM) attenwat l-attivazzjoni stimulata minn RANKL ta 'p38 kinase, kinases regolati b'sinjal extraċellulari, u c-Jun N-terminal kinase, u soppressa wkoll l-attivazzjoni ta' NF-kB billi jinibixxi l-fosforilazzjoni tas-subunità p65 u l-inibitur kBa. Barra minn hekk, żidiet medjati minn RANKL fl-espressjoni ta 'c-Fos u fattur nukleari ta' ċelluli T attivati, ċitoplasmika 1 (NFATc1), u fil-produzzjoni ta 'fattur ta' nekrożi tat-tumur-a, interleukin (IL)-1b , u IL-6 kienu apparentement inibiti minn trattament minn qabel ta 'acteoside. Barra minn hekk, oraliacteosidenaqqas it-telf tal-għadam ikkaġunat mill-ovarjiktomija u l-produzzjoni ta 'ċitokini infjammatorji għal livelli ta' kontroll. Id-dejta tagħna tissuġġerixxi li l-acteoside jinibixxi d-divrenzjar u l-maturazzjoni tal-osteoklasti minn prekursuri osteoklastiċi billi jrażżan l-attivazzjoni indotta minn RANKL ta 'proteini kinases attivati minn mitoġenu u fatturi ta' traskrizzjoni bħal NF-kB, c-Fos u NFATc1. B'mod kollettiv, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-acteoside jista' jaġixxi bħala aġent kontra r-risorbiment biex inaqqas it-telf tal-għadam billi jimblokka l-attivazzjoni tal-osteoclast.
Introduzzjoni
L-għadam jiġi mmodifikat b'mod kostanti b'attività bilanċjata ta' osteoklasti u osteoblasti [1]. L-osteoklasti joħorġu minn ċelluli prekursuri ematopojetiċi tan-nisel tal-monoċiti/makrofagi, filwaqt li l-osteoblasti huma tan-nisel mesenkimali [2]. Attivazzjoni anormali tal-osteoclast jew osteoblastogenesis mnaqqsa jistgħu jfixklu l-omeostażi tal-għadam, eventwalment jikkawżaw mard bħall-osteoporożi, artrite u kanċer tal-għadam [3,4]. L-osteoporożi hija marda komuni tal-għadam li twassal għal riskju akbar ta’ ksur. L-aktar forma komuni ta 'osteoporożi hija kkawżata minn defiċjenza ta' estroġenu fin-nisa tal-menopawża. Mediċini bħal kortikosterojdi u anti-epilettiċi jistgħu wkoll jikkawżaw żbilanċ bejn l-assorbiment mill-ġdid u l-formazzjoni tal-għadam, li jista 'jirriżulta f'osteoporożi [5].
Ħafna inibituri anti-resorbive inklużi bisfosfonati, calcitonin, estroġenu, u modulaturi selettivi tar-riċetturi tal-estroġenu ntużaw biex jittrattaw l-osteoporożi. Dawn l-inibituri jżommu l-massa tal-għadam billi jinibixxu l-funzjoni tal-osteoklasti [6]. It-terapija ta 'sostituzzjoni tal-estroġenu hija l-aktar trattament popolari biex tipprevjeni u tikkura l-osteoporożi ta' wara l-menopawża. Madankollu, it-terapija ta' sostituzzjoni tal-estroġenu fit-tul tista' żżid ir-riskju ta' kanċer tal-endometriju u tas-sider. Għalhekk, ħafna investigaturi ffukaw l-isforzi tagħhom fuq l-iżvilupp ta 'aġent ġdid kontra l-assorbiment li ma jkollux effetti sekondarji [7-10]. Minħabba li l-osteoklasti jiffunzjonaw fir-riassorbiment tal-għadam, l-osteoklasti li jinibixxu speċifikament tqiesu l-mira ewlenija f'bosta studji.
L-osteoklasti huma ċelluli ġganti multinukleati ffurmati minn proġenituri mononukleari tal-familja monoċiti/makrofagi permezz tal-proliferazzjoni sekwenzjali, id-divrenzjar u l-fużjoni ta 'ċelluli prekursuri ematopojetiċi [11]. Fattur li jistimula l-kolonja tal-makrofagi (M-CSF) u attivatur tar-riċettur tal-ligand tal-fattur nukleari (NF)-kB (RANK) (RANKL) huma fatturi essenzjali għad-differenzjazzjoni tal-osteoklasti [12]. Barra minn hekk, diversi ċitokini infjammatorji, bħall-fattur tan-nekrożi tat-tumur (TNF) u l-interleukin (IL)-1b, jikkontribwixxu għall-osteoklastoġenesi billi jimmodulaw l-induzzjoni ta 'RANKL, osteoprotegerin, u M-CSF [7,13]. L-irbit ta' RANKL mar-riċettur RANK tal-wiċċ taċ-ċellula jirriżulta f'kumplessi ta' fatturi assoċjati RANKL/RANK/TNFR (TRAF) li jattivaw b'mod sekwenzjali NF-kB u protein kinases attivati minn mitoġenu (MAPKs), inkluż c- Jun N-terminal kinase (JNK), p38 kinase, u kinażi extraċellulari relatati mas-sinjali (ERK) [14]. Din l-attivazzjoni għandha rwol ewlieni fil-medjazzjoni tad-divrenzjar, l-attivazzjoni u s-sopravivenza tal-osteoklasti. RANKL jattiva wkoll l-espressjoni ta 'fatturi ta' traskrizzjoni bħal fattur nukleari ta 'ċelluli T attivati, ċitoplasmika 1 (NFATc1), u c-Fos, li huma essenzjali għall-iżvilupp tal-osteoklasti [7,9]. Għalhekk, is-sinjalar RANKL huwa meqjus bħala l-mira ewlenija ta 'aġenti anti-resorbive li jrażżnu l-attivazzjoni tal-osteoclast u t-telf tal-għadam.
Acteosidehuwa l-kompost attiv ewlieni ta 'Rehmannia glutinosa, li huwa użat ħafna fil-mediċina Orjentali tradizzjonali [15,16]. Acteoside huwa antiossidant qawwi u għandu attivitajiet anti-epatotossiċi, anti-infjammatorji u anti-noċiċettivi [17-20]. Preċedentement sibna li l-acteoside inaqqas l-attività tat-tyrosinase u l-bijosintesi tal-melanin billi jirregola s-sinjalar ERK [21], jipproteġi kontra ħsara ġinġivali medjata minn speċi ta 'ossiġnu reattiv (ROS) [22], u irażżan il-ħsara taċ-ċelluli medjata minn mikotossini [23]. Dawn l-effetti huma relatati mill-qrib mal-kapaċità tan-nukleosidi li jneħħu ROS u jirregolaw is-sinjalar medjat minn MAPK. B'mod partikolari, ROS huma ssuġġeriti biex jimmedjaw mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni indotti minn RANKL u avvenimenti ċellulari fl-osteoklasti. It-trattament minn qabel b'antiossidanti inibixxi l-attivazzjoni indotta minn RANKL ta 'NF-kB, ERK, u IkBa, u b'hekk irażżan l-osteoklastoġenesi [24]. Dawn is-sejbiet issuġġerew bil-qawwa li, minbarra l-attività anti-infjammatorja, l-attività anti-ossidanti hija kruċjali għal aġent kontra r-riassorbiment, u b'hekk l-acteoside jista 'jrażżan l-osteoklastoġenesi indotta minn RANKL.
Fl-istudju preżenti, esplorajna jekk l-acteoside għandux effett terapewtiku fuq it-telf tal-għadam. Aħna eżaminajna l-effetti tal-acteoside fuq id-divrenzjar tal-osteoklasti u r-riassorbiment tal-għadam u l-mekkaniżmi ċellulari relatati bl-użu ta 'sistemi sperimentali in vitro u in vivo.
Cistanche acteoside irażżan l-osteoklastoġenesi indotta minn RANKL
Materjali u metodi
Dikjarazzjoni ta' Etika
Il-prattiċi tal-kura u l-użu tal-annimali ġew approvati mill-Kumitat tal-Università Nazzjonali ta' Chonbuk dwar l-Etika fil-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Laboratorju (Permess Nru CBU 2010-0007). L-esperimenti kollha f'dan l-istudju saru skont il-linji gwida tal-Kumitat għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Università.
Ġrieden, Kimiċi, u Oġġetti tal-Laboratorju
Ġrieden ICR femminili ta 'erba' ġimgħat inxtraw minn Orient Bio Inc. (Seoul, Korea) u miżmuma f'2261uC u 5565 fil-mija umdità fuq ċiklu ta 'dawl/dlam ta' 12-il siegħa b'aċċess ħieles għall-ikel u l-ilma. Acteoside (3,4-dihydroxy-bphenethyl-Oa-rhamnopyranosyl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopyranoside; C29H36O15) (Fig. S1) kien iżolat mill-weraq ta 'Rehmannia glutinosa. Acteoside ġie maħlul f'salina buffered phosphate (PBS) qabel l-użu. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6, u M-CSF inxtraw minn R & D Systems (Minneapolis, MN, USA). Antikorpi speċifiċi għal c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa, u b-actin inkisbu minn Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Antikorpi għal p-p38 u p38 inxtraw minn Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Calcium Assay u Osteocalcin (OC) EIA Kits inxtraw minn BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) u Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA), rispettivament, biex jiddeterminaw il-parametri bijokimiċi tas-serum. Il-kit tal-Assaġġi tal-fosfat tal-aċidu tal-ġurdien reżistenti għat-tartrat (TRAP) (Sistemi Immunodijanjostiċi, Scottsdale, AZ, USA) intuża wkoll biex ikejjel il-livell tas-serum TRAP5b. Sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor, kimiċi addizzjonali nkisbu minn Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), u oġġetti tal-laboratorju kienu minn SPL Life Sciences (Pochun, Korea t'Isfel).
Kulturi taċ-Ċelloli
Iċ-ċelluli tal-mudullun inkisbu mit-tibja u l-femora ta 'ġrieden ICR nisa ta' 6 ġimgħat skond il-metodi deskritti qabel [25]. Is-sospensjoni tal-mudullun ġiet inkubata f'dixx tal-kultura ta' 100-mm fil-preżenza ta' 50 ng/ml M-CSF. Wara 3 ijiem, ċelluli aderenti ntużaw bħala makrofaġi tal-mudullun (BMMs) biex jinduċu differenzjazzjoni osteoklastika. Xi ċelluli tal-mudullun ġew inkubati wkoll għal 48 siegħa mingħajr M-CSF, u ċelloli aderenti ġew ikkultivati f'mezz ta 'differenzjazzjoni tal-osteoblast, kif deskritt x'imkien ieħor [25]. Ċelloli makrofagi RAW264.7 ġew ikkultivati fil-mezz Eagle modifikat ta 'Dulbecco (DMEM) supplimentat b'10 fil-mija serum bovin tal-fetu (FBS), 2 mM L-glutamina, u antibijotiċi. Dawn iċ-ċelloli ntużaw bħala linja taċ-ċelluli kontroparti għal BMMs biex jesploraw l-effett ta 'acteoside fuq l-osteoklastoġenesi.
Differenzjazzjoni Osteoklastika u Tbajja’ TA’ TRAP
BMMs ġew ittrattati minn qabel b'diversi konċentrazzjonijiet (0-50 mM) ta'acteosidegħal 2 sigħat qabel ma tistimula b'100 ng/ml RANKL. Il-midja tal-kultura ġiet sostitwita b'midja friska fil-jiem 2 u 5. Wara 7 ijiem ta 'inkubazzjoni, il-kulturi ġew iffissati f'4 fil-mija paraformaldehyde buffered PBS u mtebbgħin bi TRAP bl-użu ta' kit Sigma Aldrich skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Iċ-ċelloli pożittivi għal TRAP ġew magħduda bl-użu ta 'mikroskopija ottika, u ċelloli li fihom 3 nuklei jew aktar kienu kkunsidrati bħala osteoklasti. Ċelloli RAW 264.7 ġew esposti wkoll għal 100 ng/ml RANKL wara trattament minn qabel b'acteoside għal 2 h, u wara 7 ijiem ta 'inkubazzjoni, iċ-ċelloli ġew ipproċessati għat-tbajja' ta' TRAP.
Kejl tal-Vijabilità taċ-Ċelloli
Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet iddeterminata bl-użu ta' reaġent-8 tal-melħ tat-tetrazolium solubbli fl-ilma (WST). Fil-qosor, BMMs jew ċelluli RAW264.7 ikkultivati f'mezz ta 'tkabbir li fih 10 fil-mija FBS u antibijotiċi ġew ittrattati b'10 mM acteoside jew kompost fenoliku bħal quercetin, luteolin, apigenin, jew epigallocatechin -3-gallate (EGCG). Reaġent WST-8 ġie miżjud fil-kulturi wara 48 siegħa ta' inkubazzjoni. Wara l-inkubazzjoni għal 4 sigħat addizzjonali, l-assorbenza speċifika tal-WST-8- ġiet imkejla f'450 nm bl-użu ta' microplate reader (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).
Assaġġ tar-Riassorbiment tal-għadam
BMMs (16105 ċelluli/ml) ġew sospiżi f'a-MEM li kien fih 50 ng/ml M-CSF u 100 ng/ml RANKL, imbagħad maqsuma fuq 24-pjanċa sew miksija b'nanokristalli tal-fosfat tal-kalċju (OAAS{{6} }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Korea t'Isfel) f'densità ta' 26104 ċelluli/ċm2 bi u mingħajr acteoside. Wara l-inkubazzjoni għal 7 ijiem, iċ-ċelloli tneħħew mill-pjanċi b'5 fil-mija ipoklorit tas-sodju, u l-formazzjoni tal-ħofra ġiet osservata taħt mikroskopju ottiku. L-erja risorbita ġiet imkejla wkoll b'analizzatur tal-immaġni u espressa bħala perċentwal tal-valur tal-kontroll.
Analiżi Western Blot
Lisati tal-proteini sħaħ ġew ippreparati f'liżi buffer kif deskritt band'oħra [26]. Proteini ċitosoliċi u nukleari ġew ippreparati kif deskritt qabel [25]. Ammonti ugwali ta 'estratt ta' proteina ġew isseparati minn 12-15 fil-mija SDS-PAGE u blotted fuq membrani ta 'polyvinyl difluoride. Il-blots ġew ittestjati b'antikorpi primarji matul il-lejl f'4uC qabel l-inkubazzjoni b'antikorp sekondarju f'buffer imblukkar għal siegħa. Il-blots kienu
żviluppat b'kimiluminixxenza msaħħa (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) u espost għal film tar-raġġi-X (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).
Assaġġ tal-Attività MAPK
Iċ-ċelloli ġew ittrattati minn qabelacteosidegħal 2 sigħat u mbagħad stimulati b'RANKL għal -30 min addizzjonali. L-attivitajiet tal-MAPK ġew determinati bl-użu ta' kits ta' analiżi immunometrika, bħall-kit ta' analiżi ta' p-p38 kinase (Assay Designs, Inc., MI, USA), kit ta' analiżi tal-enżimi p-ERK (Disinni tal-Assaġġi), u kit ELISA sandwich p-SAPK/JNK (Teknoloġija tas-Sinjali taċ-Ċelloli, MA, l-Istati Uniti). Il-proċeduri kollha segwew l-istruzzjonijiet tal-manifattur, u l-assorbiment kien imkejjel minn microplate reader.
Assaġġ ta' Bidla ta' Mobbiltà Elettroforetika (EMSA)
Reazzjonijiet ta' rbit tad-DNA-proteini saru għal 30 min f'temperatura tal-kamra, b'10–15 mg proteina f'20 ml buffer li fih 1 mg/ml BSA, 0.5 mg/ml poly (dI-dC), 5 fil-mija gliċerol , 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 30,000 cpm ta' [a-32P] oligonukleotidi ttikkettjati b'dCTP, u l-framment Klenow tad-DNA polimerażi. Il-kampjuni ġew separati fuq 6 fil-mija ġellijiet tal-polyacrylamide, li ġew imnixxfa u esposti għal film tar-raġġi X (Eastman Kodak Co.) għal 12-24 siegħa f'270uC. Is-sekwenzi tal-primer tal-oligonukleotidi speċifiċi għal NF-kB kienu 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 u 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A -59.
Assaġġ Luciferase NF-kB
RAW264.7 makrofaġi fi 24-pjanċi ta 'bir ġew trasfettati bi 0.8 mg kB-luciferase reporter vector bl-użu ta' 2 ml ta 'Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. F'24 siegħa wara t-trasfezzjoni, iċ-ċelloli ġew stimulati b'RANKL fil-preżenza u n-nuqqas ta 'acteoside għal 24 siegħa. Iċ-ċelloli ġew sospiżi mill-ġdid f'100 ml reporter lysis buffer
(Promega, Madison, WI, USA). Ammonti ugwali ta' kampjuni ta' proteini tpoġġew ġo 96-mikroplates sew u mħallta ma' substrat luciferase. Il-luminexxenza tkejjel bl-użu ta 'luminometru tal-mikroplate (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, il-Ġermanja). F'dan l-esperiment, peptide inibitur NF-kB permeabbli (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) intuża bħala inibitur kB pożittiv.
Kejl taċ-Ċitokini
BMMs jew ċelluli RAW264.7 ġew stimulati b'RANKL fil-preżenza ta 'acteoside fi 24-pjanċi ta' kultura sew. Wara 48 siegħa ta' inkubazzjoni, inġabru s-supernatanti tal-kultura u ġew evalwati b'ELISA bl-użu ta' kits OptEIATM speċifiċi ta' TNF-a-, IL-1b- u IL-6-Specifiċi OptEIATM skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.
Reazzjoni tal-Katina tal-Polimerażi ta' Traskrizzjoni inversa f'Ħin Real (RT-PCR)
L-espressjoni tal-mRNA ta 'markaturi osteoklastiċi, bħal c-Fos, NFATc1, u TNF-a, kienet determinata b'RT-PCR f'ħin reali. Fil-qosor, l-RNA totali ġie estratt mill-makrofaġi b'reaġent Trizol skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur (Invitrogen). cDNA ġie sintetizzat b'1 mg ta 'RNA totali bl-użu ta' SuperScript Reverse Transcriptase II u primers (Invitrogen). Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA,USA) intużat biex tiskopri l-akkumulazzjoni tal-prodott PCR waqt iċ-ċikliżmu bis-sistema ta 'detezzjoni ta' sekwenza ABI 7500 (Applied Biosystems). Wara denaturazzjoni f'95uC għal 10 min, PCR kien
imwettaq bl-użu ta' erbgħin 3-ċiklu ta' pass ta' denaturazzjoni f'95uC għal 15 sek, ittemprar f'60uC għal 1 sek, u estensjoni f'72uC għal 30 sek. Ir-reazzjonijiet kollha tal-PCR saru mill-inqas fi tliet kopji, u l-livelli tal-espressjoni ġew normalizzati għall-ġene HPRT tal-manutenzjoni fl-istess reazzjoni. Dan l-istudju uża l-istess sekwenzi primer deskritti band'oħra [7].
Kejl ta 'ROS Intraċellulari
Soluzzjoni stokk ta' 29,79-dichlorodihydrofluorescein-diacetate (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, il-Ġermanja) ġiet ippreparata f'DMSO u maħżuna f'220uC fid-dlam. Fil-qosor, il-BMMs (106 ċelluli/ml fi 6-pjanċi tal-bir) ġew ikkultivati b'50 ng/ml M-CSF għal 24 siegħa u mbagħad ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet (0– 10 mM) ta'acteoside2 sigħat qabel stimulazzjoni b'100 ng/ml RANKL. Wara siegħa ta 'ko-inkubazzjoni, dawn iċ-ċelloli ġew sussegwentement inkubati b'25 mM DCFH-DA għal 30 min. Il-fluworexxenza ħadra ta' 29,79-dichlorofluorescein (DCF) ġiet irreġistrata f'515 nm (FL 1) bl-użu ta' sistema FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), u 10,000 avvenimenti ġew magħduda għal kull kampjun.
Induzzjoni ta' Osteoporożi Indotta mill-Ovariectomy
Ġrieden ICR femminili (6 ġimgħat) intużaw għal dan l-istudju. Ġrieden irċevew operazzjoni finta (Sham, n =10) jew ovariectomized kirurġiku (OVX, n=20) taħt anestesija. Ġimgħa wara l-operazzjoni, il-ġrieden OVX ġew maqsuma b’mod każwali f’2 gruppi ta’ 10 ġrieden kull wieħed: OVX bilaterali u OVX bilaterali supplimentati b’200 ml
PBS li fih 1 mM acteoside oralment (grupp AC). Acteoside orali ġie amministrat darba kull 3 ijiem għal 8 ġimgħat wara l-kirurġija, u
l-istess ammont ta 'PBS ġie amministrat lill-gruppi Sham u OVX. Wara ġurnata mill-aħħar amministrazzjoni, il-ġrieden ġew sagrifikati u mbagħad ġew analizzati parametri bijokimiċi fis-serum u l-istruttura tal-għadam 3-dimensjonali.
Determinazzjoni tal-Parametri Bijokimiċi tas-Serum
Inġabru kampjuni tad-demm permezz tat-titqib tal-qalb u s-serum inġabar permezz ta’ ċentrifugazzjoni. Kampjuni tas-serum ġew maħżuna f'280uC għal analiżi tal-parametri bijokimiċi. Il-livelli tas-serum ta’ IL-1b u IL-6 ġew stmati bl-użu tal-kit ELISA kif deskritt hawn fuq, filwaqt li l-attività tal-fosfatażi alkalina (ALP) ġiet iddeterminata bl-użu ta’ assaġġ kolorimetriku bijokimiku li jkejjel l-ammont ta’ p -nitrofenol prodott minn sottostrat tal-fosfat p-nitrofenol, kif deskritt band'oħra [27]. Biex jiġu stmati l-bijomarkaturi tal-formazzjoni u l-assorbiment mill-ġdid tal-għadam, il-livelli tas-serum OC, tal-kalċju u TRAP5b ġew ukoll determinati skont l-istruzzjonijiet tal-manifatturi.
Analiżi tal-Istruttura tal-għadam u l-Parametri Morfometriċi
Il-femora tal-ġrieden (gruppi Sham, OVX, u AC) ġew dissected u mimlija b'salina fiżjoloġika għall-ittestjar mekkaniku. Is-saħħa mekkanika tal-wirk kienet imkejla kif deskritt x'imkien ieħor [28]. It-tagħbija tal-ksur ġiet irreġistrata bħala l-ogħla forza f'newtons fil-punt li x-xaft tan-nofs tal-ksur tal-wirk tal-lemin. Barra minn hekk, il-wirk ħafif ta 'kull annimal ġie analizzat b'mod isto-morfometriku bl-użu ta' sistema ta 'tomografija tal-mikrokompjuter (mikro-CT) (sistema tar-raġġi X microfocus SkyScan 1076, Kontich, il-Belġju). Fil-qosor, l-għadam f'ħażna ta 'formaldehyde ta' 4 fil-mija kienu mnixxfa superfiċjalment fuq tessut tal-karta qabel ma ġew imgeżwer f'''cling-film'' tal-plastik jew f'parafilm, biex jipprevjenu t-tnixxif waqt l-iskannjar. Kull għadam imgeżwer bil-plastik tpoġġa f'tubi tal-fowm tal-plastik/polistirene li kienu mmuntati vertikalment orizzontalment fil-kamra tal-kampjun tal-iskaner 1076 għal
immaġini mikro-CT. L-iskannjar sar bl-użu ta 'vultaġġ tas-sors ta' 100 kV u kurrent tas-sors ta '140 mA b'riżoluzzjoni ta' 35 mm.
Mudelli tridimensjonali tal-għadam trabekulari tal-wirk ġew rikostruwiti bl-użu ta 'SkyScan CT Analyzer verżjoni 1.11. Il-parametri strutturali bħad-densità minerali tal-għadam trabekulari (BMD, g/cm3), il-volum tal-għadam fil-mija (volum tal-għadam (BV)/volum tat-tessut (TV), fil-mija), ħxuna (Tb.Th, mm), separazzjoni (Tb.Sp). , mm), u n-numru (Tb.N, 1/mm) imbagħad ġew imkejla.
Assaġġ Osteoġeniku ta' Differenzjar u Mineralizzazzjoni Ċelloli tal-mudullun tal-għadam kkultivati fi pjanċi ta' kultura ta' {{{{10}}}}tajjeb ġew ittrattati b'DAG (10 nM dexamethasone, 50 mM aċidu askorbiku, u 20 mM b-glycerophosphate) fil- preżenza ta '10 mM acteoside. Wara ġimgħatejn ta 'divrenzjar, iċ-ċelloli ġew iffissati b'etanol 70 fil-mija (vol/vol) kiesaħ bis-silġ għal siegħa u mtebbgħin b'0.2 fil-mija alizarin aħmar S f'ilma distillat għal 30 min f'temperatura tal-kamra. Wara li ċ-ċelloli ġew imneħħija u mnixxfa bl-arja, il-pjanċi tal-kultura taċ-ċelluli ġew evalwati permezz ta 'mikroskopija tad-dawl bl-użu ta' mikroskopju maqlub (Nikon TS100, Ġappun). Biex tikkwantifika l-ammont ta 'żebgħa ħamra, it-tebgħa ġiet elużita b'10 fil-mija acetyl pyridinium chloride billi tħawwad għal 20 min u l-assorbenza ġiet imkejla f'560 nm. L-ammont ta 'kalċju depożitat fis-saffi taċ-ċelluli tkejjel ukoll bl-użu ta' kit Calcium C (Wako Chemical Inc. Osaka, Ġappun) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Barra minn hekk, l-espressjoni ta 'markaturi tal-mRNA speċifiċi għall-għadam, bħal fattur ta' traskrizzjoni relatat mal-runt-2 (Runx2), osterix, sialoprotein tal-għadam (BSP), u OC kienet determinata b'RT-PCR f'ħin reali. Primers oligonucleotide ta 'dawn il-markaturi ġew iddisinjati b'daqsijiet tal-prodott inqas minn 200 bp bl-użu ta' Primer Express Software 3.0 (Applied Biosystems) kif deskritt band'oħra [27].
cistanche acteoside isaħħaħ il-formazzjoni tal-għadam
Riżultati
Acteoside jinibixxi l-formazzjoni ta' osteoklasti mill-makrofaġi b'mod li jiddependi mid-doża
Biex jiġi vverifikat l-effett tal-acteoside fuq id-divrenzjar tal-BMM f'osteoklasti, iċ-ċelloli ġew ikkultivati b'diversi konċentrazzjonijiet (0-20 mM) ta' acteoside għal 7 ijiem fil-preżenza ta' 50 ng/ml M-CSF u 100 ng/ml RANKL. Acteoside naqqas in-numru ta' osteoklasti b'mod dipendenti fuq id-doża. Meta ċ-ċelloli ġew ittrattati minn qabel b'10 mM acteoside għal 2 h, in-numru ta 'osteoclast naqas bi 43 fil-mija meta mqabbel ma' ċelloli supplimentati b'M-CSF u RANKL (Fig. 1A). Fig. 1B turi d-differenzazzjoni osteoclast medjata minn RANKL u l-inibizzjoni tagħha permezz ta 'trattament kombinat b'acteoside. B'mod konsistenti ma 'dan ir-riżultat, it-trattament minn qabel ta' acteoside naqqas id-divrenzjar stimulat minn RANKL taċ-ċelloli RAW264.7 u l-formazzjoni tal-osteoklasti (Figuri 1C u D). Meta l-potenzjal anti-osteoclastic ta 'acteoside fuq BMMs kien imqabbel mal-potenzjal antiosteoclast ta' diversi komposti fenoliċi fl-istess konċentrazzjoni (10 mM), luteolin wera l-ogħla attività (Fig. 2A). Madankollu, luteolin, quercetin, jew apigenin innifsu naqqsu l-vijabbiltà taċ-ċelloli (Fig. 2B). Il-komposti kollha inibixxu d-divrenzjar osteoklastiku minn makrofaġi RAW264.7 bl-attivitajiet relattivi li ġejjin: luteolin. quercetin=apigenin .
Cistanche acteoside Jinibixxi Osteoclast
