Attività Estroġenika tal-Glycosides Minn Cistanche Deserticola Bħala Aġġuvant tar-Riċetturi tal-Estroġenu in Vitro
Mar 05, 2022
Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Hui Song, Wen-Lan Li, Xiang-Ming Sun, Yang Hu, Jing-Xin Ding, Yu-Bin Ji, Jing-Ya Wang
INTRODUZZJONI
Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" fiċ-Ċiniż), mediċina tal-ħxejjex tradizzjonali Ċiniża li ġiet irreġistrata għall-ewwel darba f'ShenNongBenCaoJing, intużat għat-trattamenti ta 'defiċjenza tal-kliewi, impotenza, stitikezza senile, u defiċjenza tad-demm għal eluf ta' snin.[1] Huwa mqassam prinċipalment fir-reġjuni tad-deżert tal-Majjistral taċ-Ċina, bħal Gansu u Xinjiang.[2] Ir-riċerka farmakoloġika moderna wriet li C. deserticola jista’ javvanza funzjonijiet mediċinali wesgħin, bħar-regolamentazzjoni tal-ormoni, attività immunomodulatorja, antiossidativa, newroprotettiva, anti-infjammatorja u estroġenika.[3,4] Glycosides of Cistanches (GCs) tqiesu bħala wieħed mill- komponenti attivi ewlenin b'diversi effetti bijoloġiċi.[5,6]
Ir-riċetturi tal-estroġenu- (ERs- ) u ER huma s-sottotipi tal-ERs li jistgħu jirregolaw il-funzjonijiet fiżjoloġiċi.[7] Dawn il-proteini jistgħu jirregolaw it-traskrizzjoni tal-ġeni fil-mira billi jorbtu ma' sekwenzi regolatorji tad-DNA assoċjati fin-nukleu taċ-ċellula. Iż-żewġ sottotipi huma espressi b'mod notevoli fis-sistemi kardjovaskulari u nervużi ċentrali.[8,9] ER teżisti prinċipalment fil-glandola mammarja, l-utru, l-ovarji, l-għadam, l-organu riproduttiv maskili, u l-prostata. ER huwa preżenti prinċipalment fil-prostata, fl-ovarji u fil-bużżieqa tal-awrina.[10,11] Barra minn hekk, hemm xi rwoli fiżjoloġiċi komuni għaż-żewġ sottotipi, bħal fl-iżvilupp u l-funzjoni tal-ovarji u fil-protezzjoni tas-sistema kardjovaskulari. [12,13] Riċerka preċedenti fil-grupp tagħna żvelat il-mekkaniżmu tal-GCs simili estroġeniku bil-metodu ta 'analiżi metabolomika.[14] Fi studju kontinwu, analizzajna l-mekkaniżmu ta 'attività estroġenika ta' GCs fuq linji ta 'ċelluli MCF-7 relatati ma' ERs.
MATERJALI U METODI
Strumenti
L-inkubatur ECO-170P-230 kien minn New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., Bio-Rad 680 microplate reader, u apparat tal-elettroforesi kienu minn Bio-Rad Laboratories, Inc., mikroskopju CX21 kien minn Olympus Co., Ltd. , Is-sistema tal-immaġini tal-ġel GIS-2019 kienet minn Tanon Science and Technology Co., Ltd., il-pjanċa tal-qiegħ ċatt kienet minn Corning Inc., iċ-ċitometrija tal-fluss EPICS-XL kienet minn Beckman-Coulter Inc., u StepOnePlus Real-Time polymerase chain reaction (PCR) kienet minn Thermo Fisher Scientific.
Kimiċi u reaġenti
Il-GCs ġew ippreparati fil-laboratorju tagħna bħala l-metodu rrappurtat qabel,[14] u l-purità tal-GCs ġiet iddeterminata li kienet 52 fil-mija (l-acteoside intuża bħala markatur biex jiddetermina l-GCs) permezz ta 'spettrofotometrija ultravjola. Estradiol (E2) inxtara minn Yuanye Biotechnology Co., Ltd.(Shanghai, China). Serum bovin tal-fetu (FBS) u RPMI-1640 kienu minn Gibco Co., Ltd., pjanċa tal-qiegħ ċatt 96-well kienet minn Corning Inc., u dimethyl sulfoxide (DMSO) u 3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl ]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) inxtraw mingħand Sigma-Aldrich Corporation. Reaġent TRIzol, Reverse Transcription (RT) Kit, u TB Green™ RT-PCR Kit inxtraw minn TaKaRa Co., Ltd., Dalian, iċ-Ċina. Anti-ER Rabbit pAb, anti-ER Rabbit pAb, u antikorpi -actin inxtraw minn Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Il-kimiċi komuni l-oħra kollha nxtraw minn fornituri kummerċjali standard.
Preparazzjoni tal-kampjun
Preparazzjoni ta' glycosides ta' soluzzjoni ta' stokk ta' Cistanches
L-estratt tal-GCs ġie maħlul f'DMSO biex jagħmel soluzzjoni stokk bil-konċentrazzjoni ta' 0.1051 g/ml u maħżun f'4 gradi. RPMI-1640 ħieles mill-fenol aħmar intuża biex iddilwixxi s-soluzzjoni tal-istokk għal diversi konċentrazzjonijiet qabel l-użu.
Preparazzjoni ta' soluzzjoni stokk ta' estradiol
L-estratt E2 ġie maħlul f'DMSO biex jagħmel soluzzjoni stokk bil-konċentrazzjoni ta' 0.27 mg/ml u maħżun f'4 gradi. RPMI-1640 ħieles mill-fenol aħmar intuża biex iddilwixxi s-soluzzjoni tal-istokk għal diversi konċentrazzjonijiet qabel l-użu.
Preparazzjoni ta' serum bovin tal-fetu trattat bid-dextran bil-faħam
Mijiet ta 'millilitri ta' FBS tħalltu ma '250 mg ta' trab tal-faħam attivat u 25 mg ta 'dextran. Wara l-inkubazzjoni għal 45 min f'55 grad, it-taħlita ġiet ċentrifugata f'4 gradi, 1000 rpm għal 15 min. Is-supernatant ġie ffiltrat bl-użu tal-membrana Millipore Express PES biex jikseb il-faħam tal-kannol trattat b'dextran (CDT)-FBS u maħżun f'-20 grad.
Kultura taċ-ċelluli
Il-linji taċ-ċelluli tal-kanċer tas-sider uman MCF-7 inkisbu mill-ġbir tal-kultura tat-tip Amerikan (ATCC). Barra minn hekk, iċ-ċelloli ġew ikkultivati b'medja RPMI-1640 li fiha 10 fil-mija FBS u 1 fil-mija penicillin-streptomycin f'37 grad taħt atmosfera umidifikata ta '5 fil-mija CO2. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati fil-medju RPMI-1640 ħieles mill-fenol aħmar li kien fih 5 fil-mija CDT-FBS 4 ijiem qabel l-assaġġ MTT sabiex l-estroġenu fiċ-ċelloli għandu jitneħħa.
Analiżi tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli ta' estradiol fuq linji taċ-ċelluli MCF-7
Il-proliferazzjoni taċ-ċelluli kienet imkejla bl-użu tal-assaġġ MTT għaċ-ċelloli MCF-7.[15,16] E2 ġie maħlul f'midja tal-kultura RPMI-1640 li kien fiha 0.1 fil-mija DMSO f'konċentrazzjonijiet finali ta' {{27 }}.1, 1, 10, 100, u 1000 nM. Il-linji taċ-ċelluli MCF-7 ġew ikkultivati f'medja RPMI-1640 ħielsa mill-fenol aħmar għal 4 ijiem. Wara l-ħasil b'salina buffered bil-fosfat (PBS) tliet darbiet, ġew miżjuda 100 µL ta' medium RPMI-1640 ħieles mill-FBS fi pjanċi ta' 96-bir f'1.5 × 104 għal kull bir u inkubati f'37 grad għal 24 siegħa. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet tas-soluzzjoni E2 għal 72 siegħa. Imbagħad, 100 µL ta’ soluzzjoni MTT (0.5 mg/mL) ġew miżjuda ma’ kull bir. Iċ-ċelloli ġew inkubati għal 4 sigħat. Fl-aħħarnett, ġew miżjuda 150 µL ta 'DMSO biex jinħall il-kristalli ta' formazan. L-assorbiment tkejjel f'570 nm minn qarrej tal-mikroplate, u r-rata ta 'proliferazzjoni (PR) ġiet ikkalkulata.
Analiżi tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli ta' glycosides ta' Cistanches fuq linji taċ-ċelluli MCF-7
Il-proliferazzjoni taċ-ċelluli kienet imkejla bl-użu tal-assaġġ MTT għaċ-ċelloli MCF-7. GCs ġew maħlula f'midja tal-kultura RPMI-1640 li kien fiha 0.1 fil-mija DMSO f'konċentrazzjonijiet finali ta' 0.0175, 0.175, 1.75, 17.5, u 175 µg /ml. Linji taċ-ċelluli MCF-7 ġew ikkultivati f'medja RPMI-1640 mingħajr fenol aħmar li fih 5 fil-mija CDT-FBS għal 4 ijiem. Wara l-ħasil mill-PBS tliet darbiet, 100 µL ta 'medja RPMI-1640 ħielsa mill-FBS ġew miżjuda fi pjanċi ta' 96-bir f'1.5 × 104 għal kull bir u inkubati f'37 grad għal 24 siegħa. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet tas-soluzzjoni GCs għal 24, 48, u 72 siegħa, rispettivament. Imbagħad, 100 µL ta’ soluzzjoni MTT (0.5 mg/mL) ġew miżjuda ma’ kull bir. Iċ-ċelloli ġew inkubati għal 4 sigħat. Fl-aħħarnett, ġew miżjuda 150 µL ta 'DMSO biex jinħall il-kristalli ta' formazan. L-assorbiment tkejjel f'570 nm minn qarrej tal-mikroplate, u l-PR ġie kkalkulat. RPMI-1640 mingħajr fenol aħmar u medju li fih E2 (2.725 × 10−3 µg/ml) kienu l-gruppi negattivi u pożittivi, rispettivament.
Analiżi tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli ta' glikożidi ta' Cistanches b'fulvestrant fuq linji taċ-ċelluli MCF-7
Il-proliferazzjoni taċ-ċelluli kienet imkejla bl-użu tal-assaġġ MTT għaċ-ċelloli MCF-7. Il-GCs ġew maħlula f'midja tal-kultura RPMI-1640 li fiha 0.1 fil-mija DMSO f'konċentrazzjonijiet finali ta '1.75, 17.5, u 175 µg/ml. Linji taċ-ċelluli MCF-7 ġew ikkultivati f'medja RPMI-1640 mingħajr fenol aħmar li fih 5 fil-mija CDT-FBS għal 4 ijiem. Wara l-ħasil mill-PBS tliet darbiet, 100 µL ta 'medja RPMI-1640 ħielsa mill-FBS ġew miżjuda fi pjanċi ta' 96-bir f'1.5 × 104 għal kull bir u inkubati f'37 grad għal 24 siegħa. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet tas-soluzzjoni GCs u inkubati b'fulvestrant (6.06 × 10-5 µg/ml) għal 48 siegħa. Imbagħad, 100 µL ta’ soluzzjoni MTT (0.5 mg/mL) ġew miżjuda ma’ kull bir. Iċ-ċelloli ġew inkubati għal 4 sigħat. Fl-aħħarnett, ġew miżjuda 150 µL ta 'DMSO biex jinħall il-kristalli ta' formazan. L-assorbiment tkejjel f'570 nm minn qarrej tal-mikroplate, u l-PR ġie kkalkulat. RPMI-1640 mingħajr fenol aħmar u medju li fih E2 (2.725 × 10−3 µg/ml) kienu l-gruppi negattivi u pożittivi rispettivament.
Assaġġ taċ-ċiklu taċ-ċelluli
Il-GCs ġew maħlula f'midja tal-kultura RPMI-1640 li fiha 0.1 fil-mija DMSO f'konċentrazzjonijiet finali ta '1.75, 17.5, u 175 µg/ml. Linji MCF-7-ċelluli ġew ikkultivati f'medja RPMI-1640 ħielsa mill-fenol aħmar li kien fih 5 fil-mija CDT-FBS għal 4 ijiem. Wara l-ħasil mill-PBS tliet darbiet, 1 mL ta 'medja RPMI-1640 ħielsa mill-FBS ġie miżjud fi pjanċi ta' 6-well f'2.5 × 105 għal kull bir u inkubati f'37 grad għal 24 siegħa. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet tas-soluzzjoni GCs u inkubati b'fulvestrant (6.06 × 10-5 µg/ml) għal 48 siegħa. Sussegwentement, iċ-ċelluli nġabru u maħsula b'PBS tliet darbiet, ċentrifugati f'4 gradi, 1000 rpm għal 10 min, u ffissati b'70 fil-mija etanol f'-20 grad, matul il-lejl. Wara l-ħasil b'PBS darbtejn, iċ-ċelloli kienu mtebbgħin b'soluzzjoni PI (50 mg/mL) li kien fiha 1 mg/mL ta 'RNase A u 0.1 fil-mija Triton X-100 għal 30 min fid-dlam f'4 gradi. Iċ-ċiklu taċ-ċelluli ġie skopert bl-użu taċ-ċitometrija tal-fluss, u l-indiċi ta 'proliferazzjoni (PI) ġie kkalkulat kif ġej. RPMI-1640 mingħajr fenol aħmar u medju li fih E2 (2.725 × 10−3 µg/ml) kienu l-gruppi negattivi u pożittivi, rispettivament. PI=(S flimkien ma' G2 M)/(G0 /G1 flimkien ma' S flimkien ma' G2 M) × 100 fil-mija
Iżolament ta 'RNA u analiżi kwantitattiva ta' reazzjoni tal-katina tal-polimerażi f'ħin reali
Biex jitkejjel il-livell ta' mRNA, intuża assaġġ RT-quantitative PCR (qPCR). L-RNA ċellulari totali ġie estratt b'reaġent TRIzol. Għal qPCR, RNA ġie traskritt b'lura għal cDNA minn 4 µg ta' RNA totali bl-użu ta' kit RT. L-analiżi RT-PCR twettqu bl-użu ta' TB Green™ RT-PCR Kit. Il-protokolli kollha twettqu skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-par primer użat għall-amplifikazzjoni ta' ER kien 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' ('il quddiem) u 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (reverse); il-par primer użat għall-amplifikazzjoni ta' ER kien 5'-AGTGCCGCTCTTGGGAGAGCTG-3' ('il quddiem) u 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (reverse). Il-kundizzjonijiet tal-PCR għal ER u ER kienu 94 grad għal 3 min segwiti minn 37 u 40 ċiklu, rispettivament, ta '94 grad għal 30 s, 58 grad għal 2 min, u 72 grad għal 2 min. Il-par tal-primer użat għall-amplifikazzjoni ta' GAPDH kien 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' ('il quddiem) u 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (wara). Il-kundizzjonijiet tal-PCR għal GAPDH kienu 94 grad għal 3 min segwiti minn 30 ċiklu ta '94 grad għal 30 s, 58 grad għal 2 min, u 72 grad għal 2 min. Kull darba li l-esperiment RT-qPCR ġie ripetut aktar minn darbtejn. Għal dan, GAPDH intuża bħala kontroll intern. L-espressjoni tal-ġeni relattiva ta 'ER / ER ta' transfettanti fir-rigward taċ-ċelloli ta 'kontroll ġiet ikkalkulata: 2-(∆∆Ct).
Western blotting
L-espressjoni tal-proteini ER u ER ġiet skoperta mill-analiżi tal-western blot bħala l-metodu rrappurtat b'modifiki minuri. Fil-qosor, iċ-ċelluli MCF-7 tkabbru fi pjanċi ta '6-well f'2.5 × 105 ċelluli kull bir u ttrattati b'GCs fil-konċentrazzjoni finali ta' 1.75, 17.5, u 175 µg/ml għal 48 siegħa, rispettivament. Wara l-inkubazzjoni, l-estratti taċ-ċelluli sħaħ ġew ippreparati bl-użu ta' buffer RIPA li kien fih 1 mM PMSF. Proteini fl-estratti taċ-ċelluli sħaħ ġew separati minn 12 fil-mija sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis u mbagħad trasferiti għal membrani polyvinylidene difluoride. Il-membrana ġiet imblukkata b'5 fil-mija (w/v) ħalib xkumat maħlul fil-buffer TBST u inkubata b'antikorpi primarji u sekondarji min-naħa tagħhom. Antikorpi marbuta kienu osservati.
Analiżi statistika
Ir-riżultati ġew espressi bħala mezzi u devjazzjonijiet standard, u s-sinifikat statistiku twettqet bl-użu tat-test t ta' Student b'softwer SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was="" considered="" statistically="">
RIŻULTATI
Wara 24 siegħa ta 'trattament E2, il-proliferazzjoni taċ-ċelloli MCF-7 ovvjament tjiebet [Figura 1a]. 10nM ta 'soluzzjoni E2 jistgħu jistimulaw it-tkabbir taċ-ċelloli ovvjament (123.89 fil-mija). Madankollu, biż-żieda tal-konċentrazzjoni E2, il-kapaċità tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli ddgħajjef. Għalhekk, 10nM kienet l-aħjar konċentrazzjoni ta 'E2 f'dan l-esperiment.
Grupp GCs fil-konċentrazzjonijiet ta '1.75, 17.5, u 175 µg/mg jista' jtejjeb il-proliferazzjoni tal-linji taċ-ċelluli MCF-7 b'mod dipendenti fuq il-ħin u d-dożaġġ u wera differenza sinifikanti mal-grupp negattiv [Figura 1b]. Meta mqabbel ma 'grupp negattiv, il-grupp E2 wera proliferazzjoni ovvja (120.06 fil-mija).
Grupp ta 'medikazzjoni kombinata (CMG) (fulvestrant ma' E2 jew GCs) fil-mezz CDT-FBS ġew inkubati b'ċelluli MCF-4. Wara 72 siegħa ta 'inkubazzjoni, CMG jista' jwassal għall-inklinazzjoni ta 'PR meta mqabbel mal-grupp ta' medikazzjoni individwali (IMG) (P <0.01) [figura="">
L-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss uriet li l-GCs jistgħu jżidu kemmxejn il-valur PI li jissuġġerixxi li l-GCs jistgħu javvanzaw iċ-ċelloli tal-fażi G{{0}}/G1 għal fażijiet S u G2/M [Figura 2 u Tabella 1] u jippromwovu d-DNA taċ-ċelluli sintesi. Ir-riżultat li jindika li l-mekkaniżmu tal-GCs fuq MCF-7 kien simili għal dak tal-E2. F'CMG (fulvestrant b'GCs), il-valur PI taċ-ċellula PI kien tnaqqis għal dak ta 'IMG ftit (P <>
L-analiżi RT-PCR indikat li l-espressjonijiet ta 'ER u ER mRNA żdiedu meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll (P <{0}}.01) b'mod dipendenti mid-doża wara li ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'GCs għal 48 siegħa [Figura 3a u b].
Riżultat Western blot li jindika li wara t-trattament b'diversi konċentrazzjonijiet ta' GCs għal 48 siegħa, il-kontenuti ta' proteini ER u ER f'MCF-7 jiżdiedu bil-GCs żdiedu b'mod dipendenti mid-dożaġġ [Figura 3c-e]
KONKLUŻJONI
F'din ir-riċerka, l-effett tal-GCs fuq il-proliferazzjoni u ċ-ċiklu taċ-ċelluli ta 'MCF-7 ġie ttestjat bil-metodu ta' MTT u ċitometrija tal-fluss, rispettivament. Il-GCs jistgħu jżidu l-proliferazzjoni taċ-ċelluli MCF-7 fil-konċentrazzjoni ta '1.75, 17.5, u 175 µg/ml wara inkubati għal 72 siegħa. Madankollu, iż-żieda għandha tendenza li tonqos meta CCs u fulvestrant intużaw flimkien. Il-GCs jistgħu jżidu l-valur PI taċ-ċelloli MCF-7, inaqqsu ċ-ċellula tal-fażi G1, u jżidu ċ-ċellula tal-fażijiet S u G2.
Fulvestrant huwa antagonist speċifiku għall-ER, li jimblokka l-lokalizzazzjoni nukleari tal-ER billi jfixkel id-dimerizzazzjoni tar-riċetturi u t-trasport nukleari dipendenti fuq l-enerġija.[17] F'din ir-riċerka, konklużjoni kkonfermat li fulvestrant jista' jdgħajjef il-proliferazzjoni ta' GCs fuq ċelloli MCF-7, u jista' jaffettwa t-trasformazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli. Għalhekk, dan l-istudju indika l-attività estroġenika tal-GCs, u wkoll, ER hija l-mira tal-GCs. Fl-esperiment RT-PCR u western blot, mRNA u espressjonijiet ta 'proteini ta' ER u ER fiċ-ċelloli MCF-7 żdiedu biż-żieda tal-konċentrazzjoni ta 'GCs. Għalhekk, GCs jista 'jkollhom rwol fl-attività estroġenika skond mRNA upregulated u proteini ta' ER u ER.
