It-Tieni Parti|Jia-Jian-Di-Huang-Yin-Zi Decoction Jeżerċita Effetti Newroprotettivi fuq Newroni Dopaminerġiċi U l-Mikroambjent Tagħhom

It-Tieni Parti|Kif il-mediċina tal-ħxejjex Ċiniża bħal Cistanche għandha effett newroprotettiv u ttejjeb il-memorja?

AGĦFAS HAWN GĦALL-EWWEL PARTI

Għal aktar informazzjoni jekk jogħġbok ikkuntattja lil ali.ma@wecistanche.com

Ikklikkja għal Cistanche estratt trab u suppliment għall-memorja

Diskussjoni

It-trattamenti attwali tal-PD jimmiraw prinċipalment biex itaffu s-sintomi kliniċi. Bħala wieħed mill-metodi potenzjali li jintervjenu, il-fatturi newrotrofiċi għandhom ir-rwol ta 'newroni nutrittivi, li jħeġġu r-riġenerazzjoni tal-axon18. It-tnaqqis ta'newrotrofikufatturi jistgħu jinduċu d-deġenerazzjoni tan-newroni dopaminerġiċi. Ix-xjentisti immunostew it-tessuti tal-moħħ ta’ pazjenti PD u mhux PD ta’ 72–79 sena biex josservaw l-espressjonijiet ta’ diversinewrotrofikufatturi. Kważi l-fatturi kollha naqsu sa ċertu punt u t-telf tal-GDNF kien l-aktar pendenti19. Barra minn hekk, il-GDNF ttaffi s-sintomi tal-mutur tal-pazjenti permezz ta 'injezzjoni ta' putamen20, kif ukoll ippromwova s-sopravivenza ta 'newroni dopaminerġiċi in vitro21. Fl-istudju preżenti, għażilna BDNF u GDNF biex nevalwaw l-effetti newrotrofiċi tad-decoction JJDHYZ u osservajna li JJDHYZ f'dożaġġ għoli huwa involut fir-regolazzjoni tal-GDNF. Attwalment, il-effetti newroprotettivita 'JJDHYZ fuq ġrieden PD kienu aktar minn hekk. Is-sistema nervuża ċentrali hija partikolarment sensittiva għall-istress ossidattiv għall-konsum għoli ta 'ossiġnu tagħha, produzzjoni għolja ta' ossiġnu reattiv, u depożizzjoni dejjem tiżdied ta 'ħadid tal-metall newrotossiku22. Fiżikament, enżimi antiossidanti bħal superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx), u catalase (CAT) jikkatalizzaw radikali ħielsa. Madankollu, l-awto-ossidazzjoni u l-metaboliżmu enżimatiku tad-dopamina jwasslu għall-produzzjoni ta 'radikali ħielsa newrotossiċi u speċi ta' ossiġnu eċċessiv. Radikali ħielsa akkumulati jikkawżaw stress ossidattiv biex jagħmlu ħsara lill-molekuli bijoloġiċi fiċ-ċelloli u jikkawżaw mewt taċ-ċelluli23. Studji ta 'wara l-mewt wrew it-tnaqqis ta' GSH u inkrement ta 'GSSG fl-SNpc, li jdgħajfu d-difiża antiossidanti naturali u jikkawżaw id-deġenerazzjoni tan-newroni nigrali24. F'mudelli ta 'annimali, newrotossina bħala MPTP jinduċi l-ġenerazzjoni ta' radikali ħielsa u jaggravaw il-piżijiet ta 'enzimi antiossidanti25. Fl-istudju preżenti tagħna, osservajna li MPTP inibixxa l-espressjonijiet ta 'GSH, CAT u tejbet il-konċentrazzjoni ta' MDA. JJDHYZ inibixxi l-ġenerazzjoni ta 'MDA, salva t-telf tal-antiossidant GSH, speċjalment fid-dożaġġ għoli. Bl-istudju fil-fond dwar il-PD,newroinfjammazzjonihuwa wkoll meqjus bħala assoċjat mat-telf selettiv ta 'newroni dopaminerġiċi. Għalhekk, l-intervent terapewtiku fuq l-attivazzjoni tal-mikroglia u l-astroċiti tkun waħda mill-istrateġiji effettivi. Il-mikroglia huma moniters importanti tal-immunità li jiffurmaw l-ewwel linja difensiva kontra l-patoġeni li jinvaduh u jirrispondu malajr għall-korrimenti tas-CNS. Mikroglia u astroċiti eċċessivi ġew osservati fis-substantia nigra u l-istriatum ta’ każijiet ta’ awtopsja26. Il-mikroglia u l-astroċiti attivati ​​jiġġeneraw ROS27 u jirrilaxxaw ċitokini proinfjammatorji, chemokines, u proteinases oħra28. Il-livelli ta' IL-1, IL-2, IL{-6, u TNF- huma miżjuda fil-fluwidu ċerebrospinali ta' pazjenti b'PD29 familjari jew sporadiku. Osservazzjonijiet simili ġew irrappurtati f'mudelli ta' annimali indotti minn MPTP u 6-OHDA. Dawn il-fatturi mnixxija jippromwovu alternazzjonijiet fl-ambjent newronali u jżidu s-suxxettibilità newronali għall-mewt30,31. Aħna doppju immunostained il-GFAP b'TH biex niskopru astroċiti attivati ​​fl-SN. Sadanittant, użajna żewġ bijomarkaturi biex nittikkettjaw il-mikroglia. Minbarra l-bijomarkatur magħruf Iba-1, intuża l-markatur l-ieħor tal-wiċċ taċ-ċelluli, speċifiku għall-mikroglia, imsejjaħ transmembrane protein 119 (Tmem119)32. Ir-riżultati wrew telf sinifikanti ta 'TH-pożittiv.

ċelluli konkomitanti ma 'numru akbar ta' ċelluli gliali fil-grupp mudell (Fig. 3). It-trattament JJDHYZ-H inibixxi t-telf ta 'DAnewroniu distruttivinewroinfjammazzjoni.

Permezz tar-riżultati msemmija hawn fuq, aħna primarjament niġbdu l-konklużjoni li JJDHYZ kellu effetti newroprotettivi fuq ġrieden PD. Iżda l-mekkaniżmi kienu għadhom inċerti. Peress li s-sopravivenza tan-newroni dopaminerġiċi tiddependi fuq il-mikroambjent, il-konnessjonijiet potenzjali bejniethomnewroniu NVU attirawna l-aktar, għalhekk esplorajna aktar l-effetti regolati ta 'JJDHYZ fuq NVU.

NVU huwa magħmul primarjament minn newroni u ċelluli mhux newronali, inklużi ċelluli endoteljali, periċiti, astroċiti, mikroglia u ċelluli vaskulari tal-muskoli lixxi. BBB huwa l-komponent ewlieni. L-ewwel, osservajna l-bidliet ultrastrutturali fil-BBB minn TEM. Microvessels normali kienu komposti bil-lamina bażali kontinwu, astrocytic tarf-saqajn, u ċelloli endoteljali normali, li jistgħu jiġu osservati b'mod ċar taħt mikroskopju elettroniku ta ' trasmissjoni. Madankollu, fil-mudell MPTP indott, strutturi normali kienu minflok minn ċelluli endoteljali minfuħin u astrocytic tarf-saqajn, lumen kapillari defeated, u edema (Fig. 4B). JJDHYZ-H itaffu n-nefħa tas-saqajn tat-tarf astroċitiċi. Microvessels b'membrana bażali kontinwa u integrità ta 'l-endotelju kienu wkoll osservati (Fig. 4C). L-anġjoġenesi hija mekkaniżmu importanti involut fil-patofiżjoloġija ta 'PD33. Ġew irrappurtati għadd akbar ta’ nuklei ta’ ċelluli endoteljali u vini tad-demm postmortem fl-SNpc ta’ pazjenti b’PD u primati parkinsonjani. Iż-żieda ta 'CD31 tista' tkun relatata mat-tfixkil tal-barriera tad-demm-moħħ unewroinfammazzjoni11,34,35. Pereżempju, ġrieden indotti minn MPTP b'knockout ta 'TNF kienu aktar possibbli biex jiġi evitat it-tfixkil ta' BBB36. Hawnhekk, eżaminajna l-BBB, in-newroni, u ċ-ċelloli glial flimkien biex nesploraw fil-fond dan it-trattament. Microvessels ġew ittikkettati b'antikorp anti-CD31 u nstabu aktar CD31-microvessels pożittivi fil-grupp mudell (Fig. 6, P<0.05), which="" is="" in="" accordance="" with="" the="" reports="" of="" angiogenesis="" in="">

Il-mikrobastimenti jirregolaw l-iskambji tas-sustanzi ġewwa u barra l-bastimenti u jiffurmaw ostaklu naturali biex jipproteġu s-CNS. Il-proteini tight junction, li huma konnessi sewwa huma selettività għolja biex jirrestrinġu d-dħul ta 'sustanzi eżoġeni permezz tal-vojt taċ-ċelluli. Aħna misjuba occludin u claudin-5 espressjoni fl-SNpc permezz ta 'immunostaining (Fig. 5). MPTP eżawrit dawn iż-żewġ proteini ta 'junction stretta, filwaqt li l-proteini fil-ġrieden ittrattati b'JJDHYZ-H ma kinux differenti b'mod sinifikanti minn dawk fil-grupp normali. Minbarra junctions stretti, alternazzjonijiet ta 'MMPs jinfluwenzaw ukoll il-funzjoni tal-BBB38. Dawn l-enzimi dipendenti miż-żingu huma medjaturi ewlenin ta 'alterazzjonijiet ta' proteini ta 'junction stretta, u juru attività proteolitika fuq il-matriċi extraċellulari, inkluża l-lamina bażali fl-NVU39. Taħt kundizzjonijiet newroinfjammatorji, l-MMP3 u l-MMP9 huma l-ewwel imnixxija bi tweġiba għal korriment infjammatorju, u MMP2 huwa mnixxi f'forma ta 'zymogen, li hija attivata mal-ħsara tal-ospitanti fis-CNS40. It-tlieta minn dawn l-MMPs jaqtgħu l-proteini tal-junction stretta. Occludin huwa vulnerabbli għal attakk minn MMPs, MMP-2, u MMP-9 jiddegradaw claudin-5 wara insult iskemiku41. L-MMPs jiddegradaw ukoll il-proteini tal-lamina bażali, bħal fibronectin, laminin, u heparan sulfate, wara insult iskemiku, li jikkontribwixxi għat-tqassim tal-BBB42,43. Diversi rapporti sostnew li l-MMPs huma involuti fl-apoptosi. Newroni DA mejta jirrilaxxaw MMP3 in vitro, li jkompli jinduċi attivazzjoni mikrogliali44. Aħna mtebbgħin b'mod fluworexxenti MMP2, MMP3 u MMP9, u ddeterminajna li l-espressjonijiet tat-tlieta minn dawn l-MMPs żdiedu fil-grupp mudell (Fig. 7). JJDHYZ-H żamm l-espressjoni ta 'claudin-5 u occluding, probabbilment billi jinibixxi l-attivazzjoni ta' MMPs.

Biex nistudjaw il-bidliet mikroambjentali tal-fatturi immuni, għażilna 29 fattur minn artikli ppubblikati, li kull wieħed minnhom kien relatat mill-qrib mal-mikroglia u l-astroċiti. Meta mqabbla mal-grupp ta 'kontroll, CCL2, CCL4, u IL-23 kienu regolati 'l isfel fil-grupp mudell. JJDHYZ f'dożaġġ għoli qaleb l-effetti inibitorji ta 'MPTP fuq CCL2, CCL4, u IL -23 (Fig. 8). Żieda fl-espressjoni ta' CCL2-mRNA ġiet irrappurtata f'mudell ta' PD akut indott minn MPTP, u CCL2 jista' jkompli jinduċi l-espressjoni ta' CCL4; madankollu, it-telf newronali SNpc mhuwiex imnaqqas b'mod sinifikanti fil-ġrieden knockout CCL2-45. Ir-rwol ta 'CCL2 fil-PD għadu inċert. IL-23 huwa prodott minn ċelluli majelojdi u ġie kkunsidrat bħala wieħed miċ-ċitokini ewlenin għal terapiji mmirati f'mard medjat mill-immunità46,47. Ibbażat fuq rapporti preċedenti, CCL2 u CCL4 kienu maħsuba li jippromwovu l-infjammazzjoni fil-mudelli ta 'Il-marda ta' Alzheimer, filwaqt li IL23 jinibixxi l-infjammazzjoni. Dan huwa paradossali mal-effetti newroprotettivita' JJDHYZ? Peress li r-rwol ta 'dawn iċ-ċitokini mhuwiex ċar fil-PD, jeħtieġ li jiġu investigati mekkaniżmi sottostanti. Ir-raġuni għaliex JJDHYZ irregolat 'il fuq għal CCL2, CCL4, u IL23 għadha qed tesplora u aħna se naqsmu r-riżultati fil-futur.

Materjali u metodi

Dikjarazzjoni etika.

L-istudju preżenti sar skond il-Linji Gwida għall-Kura u l-Użu ta 'Annimali tal-Laboratorju mill-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa. Il-Kumitat għar-Riċerka tal-Annimali tal-Università Fudan approva l-proċeduri kollha.

Annimali. Ġrieden maskili c57BL/6 li jiżnu 22–25 g (tixjiħ 8–10 ġimgħat) kienu miżmuma f’ambjent ikkontrollat ​​b’temperatura (temperatura kostanti ta’ 22±3 grad) b’60 fil-mija ta’ umdità u ċiklu ta’ 12-siegħa dawl/dlam . L-ikel u l-ilma kienu disponibbli ad libitum.

Preparazzjoni ta 'JJDHYZ.

Te JJDHYZ decoction huwa magħmul minn seba 'ħwawar mhux raffinati: Radix Rehmanniae, Fructus Corni, Radix Morinda Officinalis, Herba Cistanches, Radix Angelicae Sinensis, Radix Asparagi, u Radix Paeoniae Alba fi proporzjon ta' 1:0.6:1: 1:1:1:1 (dettalji dwar il-ħxejjex jistgħu jidhru fit-Tabella 2). Il-komponenti erbali kollha nxtraw mill-Isptar ta 'Zhongshan, l-Università ta' Fudan. Il-ħwawar mhux raffinati kollha ġew l-ewwel mgħaddsa f'ilma distillat għal 30min u mgħollija għal siegħa u ġabru s-sospensjoni. Imbagħad ġie miżjud ilma distillat mar-residwi tal-ħxejjex u l-proċess ġie ripetut darbtejn. Alkoħol deidrat ġie miżjud mas-sospensjoni miġbura għal konċentrazzjoni finali ta 'alkoħol ta' 75 fil-mija (v/v). Ir-residwi kienu mxarrba f'alkoħol etiliku 75 fil-mija għal 24 siegħa biex tinġabar is-sospensjoni. Is-sospensjoni u l-likwidu miksuba mir-residwi tħalltu u ċentrifugati f'2,000 g għal 20 min. L-alkoħol ġie volatilizzat kompletament b'evaporatur li jdur. Il-konċentrazzjoni finali tad-decoction JJDHYZ kienet 1 g/ml (w/v).

Komposti kimiċi ta 'JJDHYZ.

Te JJDHYZ fih rubiadin (PubChem CID: 124062), paeoniforin (PubChem CID: 442534), albiforin (Pubchem CID: 24868421), ferulic acid (Pubchem CID: 445858), catalpol (PubChem CID: 445858), catalpol (Pubchem CID: Pubchem CID: 445858), catalpol (Pubchem CID: 445858) ), cistanoside D (PubChem CID: 5315930), echinaco side (PubChem CID: 5281771), rehmannioside A (PubChem CID: 6325881), rehmannioside D (PubChem CID: 92044472), u ursolic aċidu 92044472), u ursolic5.

Disinn ta' studju.

Il-ġrieden C57BL/6 ingħataw mill-ħalq salina, JJDHYZ, jew selegiline għal 14-il jum segwit minn injezzjoni intraperitoneali ta 'salina jew MPTP (30mg/kg/jum għal 5 ijiem). Il-ġrieden kienu maqsuma b'mod każwali fis-sitt gruppi li ġejjin: (1) grupp ta 'kontroll: injezzjoni salina flimkien ma' amministrazzjoni gastrointestinali salina; (2) Grupp MPTP: injezzjoni MPTP flimkien ma 'salina; (3) JJDHYZ-grupp ta 'dożaġġ baxx (JJDHYZ-L): injezzjoni MPTP flimkien ma' JJDHYZ 8.5 g / kg / jum; (4) JJDHYZ-grupp ta 'dożaġġ medju (JJDHYZ-M): injezzjoni MPTP flimkien ma' JJDHYZ 17 g / kg / jum; (5) JJDHYZ-grupp ta 'dożaġġ għoli (JJDHYZ-H): injezzjoni MPTP flimkien ma' JJDHYZ 34 g / kg / jum; u (6) selegiline grupp: injezzjoni MPTP flimkien ma selegiline 1.0mg/kg/jum48. Trab MPTP u selegiline ġew solubilizzati fis-salina.

Immunoistokimika.

Sezzjonijiet tal-SNpc (-3.64mm ~ -2.92mm minn Bregma) inkisbu minn kull ġurdien. Is-sezzjonijiet ġew dewaxed, idratati, u maħsula b'salina buffered b'fosfat (PBS) (5min × 3), u mbagħad sar irkupru tal-antiġen f'buffer tal-aċidu ċitriku (pH 6. 0). L-attività tal-perossidasi endoġena ġiet imblukkata bi buffer ta 'perossidu tal-idroġenu-metanol ta' 3 fil-mija. Wara l-inkubazzjoni b'10 fil-mija serum tal-mogħoż f'temperatura tal-kamra għal siegħa, is-sezzjonijiet ġew inkubati b'antikorp anti-occludin (ab168986, Abcam) f'4 gradi matul il-lejl. Sussegwentement, l-immunotikkettjar kompla bl-użu ta' antikorp sekondarju ta' perossidu tar-ravanell (HRP) (mogħoż kontra l-fenek, A0208, Beyotime). Iċ-ċelloli immunopożittivi ġew magħduda minn 5 slides tar-reġjun SN għal kull ġurdien u ttieħdet il-medja. Intużaw 3 annimali għal kull grupp. In-numri taċ-ċelluli pożittivi kollha ġew magħduda f'SNpc taħt 40 ingrandiment bl-użu tas-softwer Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA).

Immunofluworexxenza.

Sezzjonijiet iffriżati tal-SNpc ġew iffissati fl-aċetun għal 20min, ittrattati bi 3 fil-mija perossidu tal-idroġenu fil-metanol, u mbagħad inkubati b'soluzzjoni ta 'imblukkar tas-serum tal-mogħoż ta' 10 fil-mija. Sussegwentement, is-sezzjonijiet ġew inkubati f'4 gradi matul il-lejl b'antikorpi kontra l-proteini fil-mira li ġejjin: BDNF (ab108319, Abcam), GDNF (ab18956, Abcam), Iba-1 (#019–19741, woke, Ġappun), Tmem119 (ab209064, Abcam), claudin-5 (ab15106, Abcam), MMP2 (ab92536, Abcam), MMP3 (ab53015, Abcam), u MMP9 (ab76003, Abcam). Antikorp Cy3-konjugat tal-mogħoż kontra l-fenek (A0516, Beyotime) intuża bħala l-antikorp sekondarju. In-nuklei ġew counterstained b'DAPI (C1005, Beyotime). Immaġini taċ-ċelloli mtebbgħin b'mod pożittiv inqabdu permezz ta 'mikroskopju fluworexxenti (Olympus BX51, Ġappun). Il-metodu ta 'kwantifikazzjoni kien l-istess bħall-immunoistokimika.

Analiżi kwantitattiva RT-PCR.

L-RNA totali mit-tessuti SNpc ġie estratt bl-użu tar-reaġent TRIzol (T9424, Sigma) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-konċentrazzjoni u l-kwalità tal-mRNA ġew determinati spettrofotometrikament. Reazzjonijiet ta’ traskrizzjoni inversa twettqu bl-użu tal-kit tar-reaġent PrimeScript RT (RR047, Takara) fuq Applied Biosystems 7500 Real-time PCR Detection System bl-użu ta’ SYBR Premix Ex Taq II Kit (RR820, Takara). Intużaw il-primers li ġejjin għal GAPDH, GDNF, u BDNF: GAPDH: 5′-GGT TGT CTC CTG CGA CTT CA-3′ u 3′-CCT CAT TCT TTG GGA CCT GGT-5′; BDNF: 5′-GAG GTC TGA CGA CGA CAT CA-3′ u 3′-GTC AGT TCA CGG AA A CCT CG-5′; u GDNF:5′-CAA TGG ATT CAT ACC CTG-3′ u 3′-TCC AGA TAA TGT AGG TCG T-5′. Il-kampjuni kollha ġew evalwati fi tliet kopji, u ntużaw valuri medji għall-kwantifikazzjoni relattiva 2−ΔΔCT.

Analiżi Western blot.

Analiżi Western blot saret kif irrappurtat qabel49. It-tessuti SNpc tneħħew fuq pjanċa kiesħa bis-silġ, lisati b'taħlita li fiha RIPA u PMSF assoċjati ma 'inibituri tal-fosfatażi, u mbagħad ċentrifugati f'13,500 rpm għal 20 min f'4 gradi. Ammont ekwivalenti ta 'proteini ġie separat bl-użu ta' ġellijiet SDS-PAGE u membrani PVDF. Il-membrani ġew imblukkati b'5 fil-mija ħalib mingħajr xaħam f'temperatura tal-kamra għal siegħa u mbagħad inkubati matul il-lejl b'antikorpi primarji kontra GDNF (1:1,000) u BDNF (1:1,000) . Sussegwentement, il-membrani ġew inkubati b'antikorp konjugat bl-HRP kontra fniek (dilwizzjoni 1:1, 000). Il-meded immunoreattivi ġew skoperti bl-użu ta 'kimiluminixxenza msaħħa (P0018, Beyotime) u kkwantifikati bl-użu ta' softwer Image J.

Kejl tal-assaġġ tal-immunosorbenti marbut mal-enżimi.

Il-prodott finali tal-perossidazzjoni tal-lipidi MDA (Katalog #K739, BioVision, USA) u l-enżimi antiossidanti SOD (Katalog#K335, BioVison), CAT (Katalog #K773, BioVision), u GSH (Katalog #K261, BioVision) ġew skoperti bl-użu Kitts ELISA skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur.

Alterazzjonijiet ultrastrutturali tal-BBB.

Ġrieden kienu anestetizzati profondament u mbagħad imxerrda transkardjali b'PBS kiesaħ. It-tessuti SNpc tneħħew u nqasmu f'segmenti 1-mm3. Il-kampjuni ġew imwaħħla wara b'2.5 fil-mija glutaraldehyde u 1 fil-mija osmju għal 2h, segwit minn deidrazzjoni f'serje ta 'etanol gradat u reżina inkorporata. Sezzjonijiet ultrarqaq ġew imqatta 'bl-użu ta' mikrotomu, imtebba 'bi 3 fil-mija uranyl acetate-ċomb citrate, u mbagħad osservati b'TEM (PHILIPS CM-120).

Evalwazzjoni tal-permeabilità BBB. BBB

il-permeabilità ġiet evalwata bit-tnixxija ta 'Evans Blue (E2129, Sigma) fil-moħħ wara injezzjoni tal-vina tad-denb kif deskritt qabel50. Fil-qosor, 2 fil-mija Evans Blue f'salina normali ġie injettat 1h qabel l-annimali ġew ewtanizzati. Il-ġrieden kienu anestetizzati profondament u mxerrda transkardjali b'salina normali. It-tessuti SNpc ġew dissekjati u inkubati f'formamide (100mg/ml) f'60 grad għal 24 siegħa, segwiti minn ċentrifugazzjoni f'1, 000 rpm għal 5 min. Inġabru t-supernatanti, u l-assorbiment tat-tessuti ġie skopert bl-użu ta 'spettrometru tal-luminixxenza f'wavelength ta' 620nm ibbażat fuq il-kurva standard ta 'Evans Blue.

Analiżi statistika.

Id-dejta ġiet analizzata bl-użu tas-softwer SPSS 22.0 li juża analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda (ANOVA) u bl-użu tat-test tad-differenza sinifikanti post hocleast (LSD). Ir-riżultati ġew espressi bħala l-medja ± żball standard għal paraguni ta 'gruppi multipli. Id-differenzi tqiesu statistikament sinifikanti biss meta l-valur P kien inqas minn 0.05 (P<>