It-Tielet Parti DsbA-L Tinteraġixxi Ma' VDAC1 fl-Apoptożi taċ-Ċelluli Tubulari medjata mill-Mitokondriju U tikkontribwixxi għall-Progressjoni tal-Mard Akut tal-Kliewi

7. Il-ġenerazzjoni tal-ġrieden PT-VDAC1-KO

Biex ninvestigaw ir-rwol ta 'VDAC1 fl-AKI, waqqafna mudell tal-ġurdien li juri l-knockout ta' VDAC1 fit-tubuli prossimali tal-kliewi. Figura 7a turi l-protokoll tat-tnissil użat biex jiġġenera PT-VDAC1-KO. RT-PCR intuża għall-ġenotip tal-ġrieden PT-VDAC1-KO; dan sar billi amplifikat 416-bp DNA framment floxed allele u 370-bp DNA framment tal-ġene Cre (Figura 7, b; korsiji 4 u 6). Il-ġrieden tat-tip selvaġġ (PT-VDAC1-WT) ma kellhomx il-ġene Cre (Figura 7, b, korsiji 2 u 3). Analiżi ta 'immunoblot indikat li l-livelli ta' espressjoni ta 'VDAC1 fil-kortiċi tal-kliewi tal-ġrieden PTVDAC1-KO kienu aktar baxxi minn dawk fil-ġrieden PTVDAC1-WT wara trattament iskemiku jew sham (Figura 7 c u d). Dan ġie vverifikat aktar bit-tbajja immunoistokimika ta 'VDAC1 (Figura 7e). Din id-dejta vverifikat li konna waqqafna b'suċċess mudell tal-ġurdien PT-VDAC1-KO.

Figura 7. Ħolqien u karatteristiċi tal-mudell tal-ġurdien PT-VDAC1-KO. (a, b) Il-protokoll tat-tnissil għall-ġenerazzjoni ta 'ġrieden PTVDAC1-KO u s-sejbien tal-PCR tal-ġenotip ta' alleli tat-tip selvaġġ u floxed ta 'VDAC1 u alleli PEPCK-Cre. (c) L-analiżi immunoblot ta' VDAC1 u b-tubulin bl-użu ta' tessuti kortikali tal-kliewi ta' ġrieden PT-VDAC1-KO u PT-VDAC1-WT littermate wara korriment IR. (d) Analiżi tal-immaġni fuq skala griża bejniethom. (e) Tbajja immunoistokimika ta' VDAC1 fit-tessuti kortikali tal-kliewi ta' ġrieden tat-tip selvaġġ u VDAC1 wara korriment IR. Ingrandiment oriġinali x 400. Scar Bar: 100µM. Kull esperiment (ċ & e) ġie ripetut 6 darbiet b'mod indipendenti b'riżultati simili. ANOVA f'direzzjoni waħda ntużat għat-tqabbil tal-grupp Multipli (d). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1-WT with IR group.

Ikklikkja hawn biex tkun taf il-benefiċċji ta' Cistanche

8. Il-korriment tal-kliewi kkaġunat mill-I/R, l-apoptosi taċ-ċelluli tubulari, u l-ħsara mitokondrijali ġew imtejba fil-ġrieden PTVDAC1-KO

Littermates tal-ġrieden PT-VDAC1-WT u PT-VDAC1-KO ġew ittrattati b'iskemija (28 min) segwit minn korriment ta' riperfużjoni (48 siegħa). Imbagħad akkwistajna kampjuni tad-demm u tessuti tal-kliewi għal aktar eżami. Sibna li PT-VDAC1-KO soppressa notevolment l-elevazzjoni indotta mill-I/R fil-livelli ta 'BUN u kreatinina (Figura 8 a u b). It-tieni nett, l-analiżi istoloġika u TUNEL urew aktar li PT-VDAC1-KO attenwat b'mod notevoli l-ħsara fit-tessut indotta minn I/R u l-apoptosi taċ-ċelluli renali (Figura 8 c, d, f, u g). It-tielet, l-analiżi EM sabu li PT-VDAC1-KO attenwat b'mod sinifikanti l-ħsara mitokondrijali indotta minn I/R (Figura 8 e u h). Fl-aħħarnett, immunoblotting ikkonferma li l-ġrieden PT-VDAC1-KO wrew livelli mnaqqsa ta 'caspase cleaved-3, akkumulazzjoni aktar baxxa ta' Bax fil-mitokondrija, u rati aktar baxxi ta 'rilaxx ta' Cyt-c fiċ-ċitosol (Figura 8 I- o). Din id-dejta indikat li VDAC1 medja wkoll l-AKI indotta minn I/R.

Figura 8. Attenwazzjoni ta 'korriment renali ikkawżat mill-IR, apoptożi taċ-ċelluli tubulari, ħsara fil-mitokondriju, u l-espressjoni ta' Bax, Cyt-c, u caspase3 cleaved fil-ġrieden PT-VDAC1-KO. L-arterji renali bilaterali tal-ġrieden PT-VDAC1-KO u PT-VDAC1-WT littermate ġew ikklampjati għal 28 min u mbagħad rilaxxati għal 48 siegħa biex jiġi stabbilit mudell IR. (a) BUN. (b) Krejatinina fis-serum. (c) Tbajja ta' ematossilina u eosina. (d) Sezzjonijiet rappreżentattivi taċ-ċelloli pożittivi għal TUNEL. (e) Sejbien tal-mikroskopju elettroniku tal-morfoloġija tal-mitokondriju. (f) Punteġġ ta' ħsara tubulari. (g) In-numru ta' ċelluli pożittivi għal TUNEL. (h) Punteġġ ta' korriment tal-mitokondrija. (i) L-immunoblots janalizzaw l-espressjoni ta 'caspase3 cleaved, VDAC1, u DsbA-L kif ukoll l-espressjoni ta' BAX u Cyt-c fi frazzjonijiet mitokondrijali u ċitosoliċi. b-tubulin u GAPDH intużaw bħala kontroll sħiħ tat-tagħbija lisat jew ċitosoliku, rispettivament. COX IV intuża bħala kontroll tat-tagħbija tal-mitokondrija. (j- p) Analiżi tal-immaġni fuq skala griża bejniethom. Ingrandiment oriġinali x 400. Scar Bar: 100µM f'c & d 20µM f'e. Kull esperiment (c- e&i) ġie ripetut 6 darbiet b'mod indipendenti b'riżultati simili. ANOVA f'direzzjoni waħda ntużat għat-tqabbil tal-grupp Multipli (a, b, f- h&j- p). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1 WT with IR group.

Cistanche tubulosa

9. L-espressjoni żejda tal-ħsara fil-kliewi indotta minn DsbA-L aggravata kienet attenwata fil-ġrieden PT-VDAC1-KO

ta' DsbA-L waqt korriment iskemiku. Ġimgħa qabel ma ġie stabbilit il-mudell tal-ġurdien tal-IR, injettajna l-vina tad-denb ta 'kull ġurdien bil-plasmid DsbA-L (l-injezzjoni saret darbtejn matul din il-ġimgħa). L-espressjoni żejda ta 'DsbA-L aggravat l-elevazzjoni indotta mill-IR fl-espressjoni tal-BUN u tal-krejatinina, ħsara fil-kliewi u apoptożi renali; dawn l-effetti kienu attenwati fil-ġrieden PTVDAC 1-KO (Figura 9 a- d, e, u f). Ir-riżultati ta 'l-immunoblot indikaw ukoll li l-espressjoni żejda ta' DsbA-L tejbet iż-żieda indotta mill-IR fil-caspase cleaved-3, l-akkumulazzjoni ta 'Bax fil-mitokondrija, u r-rilaxx ta' Cyt-c fiċ-ċitosol; dawn l-effetti tnaqqsu fil-ġrieden PT-VDAC1-KO (Figura 9 g u h- l). B'mod kollettiv, dawn ir-riżultati wrew aktar li VDAC1 medja l-effett ta 'DsbA-L waqt ħsara iskemika.

Figura 9. L-espressjoni żejda ta 'DsbA-L aggravat ħsara fil-kliewi I/R indotta kienet attenwata fil-ġrieden PT-VDAC 1-KO. Il-ġrieden PT-VDAC1-KO u PT-DsbA-L-WT ġew ittrattati bi jew mingħajr plasmid DsbA-L u mbagħad stabbilixxew mudell IR. (a)BUN. (b) Krejatinina fis-serum. (c) Tbajja ta' ematossilina u eosina. (d) Sezzjonijiet rappreżentattivi taċ-ċelloli pożittivi għal TUNEL. (e) Punteġġ ta' ħsara tubulari. (f) In-numru ta' ċelluli pożittivi għal TUNEL. (g) L-immunoblots analizzaw l-espressjoni ta 'caspase3 cleaved, VDAC1, u DsbA-L kif ukoll l-espressjoni ta' BAX u Cyt-c fi frazzjonijiet mitokondrijali u ċitosoliċi. b-tubulin u GAPDH intużaw bħala kontroll sħiħ tat-tagħbija lisat jew ċitosoliku, rispettivament. COX IV intuża bħala kontroll tat-tagħbija tal-mitokondrija. (h- n) Analiżi tal-immaġni fuq skala griża bejniethom. Ingrandiment oriġinali x 400. Scar Bar: 100mM. Kull esperiment (c- e) ġie ripetut 6 darbiet b'mod indipendenti b'riżultati simili. ANOVA f'direzzjoni waħda ntużat għat-tqabbil tal-grupp Multipli (a, b, u f- n). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. ^ P<0.05 versus IR group.* P<0.05 versus IR group.

Suppliment Cistanche

10. L-attenwazzjoni tal-ħsara renali indotta minn I/R fil-ġrieden PTDsbA-L-KO tnaqqset bl-espressjoni żejda ta 'VDAC1

Biex tikkonferma aktar jekk il-ħsara tubulari medjata minn DsbA-L kinitx dipendenti fuq VDAC1, il-ġrieden littermate tal-ġrieden PTDsbA-L -WT u PT- DsbA-L -KO ġew l-ewwel esposti għal trattament I/R, u mbagħad injettati permezz tal-vina tad-denb bil-plasmid ta' espressjoni żejda VDAC1. Iż-żieda indotta mill-I/R fil-livelli tal-BUN u tal-krejatinina tjiebet fil-ġrieden PT- DsbA-L -KO; madankollu, dan l-effett ġie evitat mill-espressjoni żejda ta 'VDAC1 (Figura 10 a u b). It-tbajja 'HE u TUNEL wrew li l-estensjonijiet relattivi ta' ħsara fit-tessut renali indotti mill-IR u apoptosi taċ-ċelluli renali tnaqqsu fil-ġrieden PT- DsbAL -KO u li dawn l-effetti ġew imblukkati mill-espressjoni żejda ta 'VDAC1 (Figura 10 c-f). Immunoblotting wera li l-ġrieden PT- DsbA-L -KO kellhom livelli aktar baxxi ta 'caspase cleaved-3, livelli aktar baxxi ta' akkumulazzjoni ta 'Bax fil-mitokondrija, u rati aktar baxxi ta' rilaxx ta 'Cyt-c fiċ-ċitosol; madankollu, dawn l-effetti ġew eliminati mill-espressjoni żejda ta 'VDAC1 (Figura 10 g- m). Din id-dejta appoġġat il-fatt li DsbA-L ippromwova l-ħsara iskemika b'mod li kien dipendenti fuq VDAC1.

Figura 10. Il-korriment tal-kliewi tal-ġrieden indotti mill-IR tjiebu PT-DsbA-L-KO naqas bl-espressjoni żejda ta 'VDAC1. Il-ġrieden PT-DsbA-L-KO u PT-DsbA-L-WT ġew ittrattati bi jew mingħajr plasmid VDAC1 u mbagħad stabbilixxew mudell IR. (a) BUN. (b) Krejatinina fis-serum. (c) Tbajja ta' ematossilina u eosina. (d) Sezzjonijiet rappreżentattivi taċ-ċelloli pożittivi għal TUNEL. (e) Punteġġ ta' ħsara tubulari. (f) In-numru ta' ċelluli pożittivi għal TUNEL. (g) L-immunoblots analizzaw l-espressjoni ta 'caspase3 cleaved, VDAC1, u DsbA-L kif ukoll l-espressjoni ta' BAX u Cyt-c fi frazzjonijiet mitokondrijali u ċitosoliċi. b-tubulin u GAPDH intużaw bħala kontroll sħiħ tat-tagħbija lisat jew ċitosoliku, rispettivament. COX IV intuża bħala kontroll tat-tagħbija tal-mitokondrija. (hm) Analiżi tal-immaġni fuq skala griża bejniethom. Ingrandiment oriġinali x 400. Scar Bar: 100mM. Kull esperiment (ċ, d, u g) ġie ripetut 6 darbiet b'mod indipendenti b'riżultati simili. ANOVA f'direzzjoni waħda ntużat għat-tqabbil tal-grupp Multipli (a, b, e, f, u h- m). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus IR group.

Herba Cistanche

11. Il-ħsara renali kkaġunata minn CLP kienet attenwata fil-ġrieden PT-DsbA-LKO jew PT-VDAC1-KO

AKI indotta minn sepsis hija kawża komuni oħra ta 'AKI fil-prattika klinika. Littermates tal-PT-DsbA-L jew VDAC-WT u PT-DsbA-L jew VDAC1-KO kienu suġġetti għall-mudell CLP u mbagħad ewtanizzat 18-il siegħa wara l-kirurġija. Ir-riżultati indikaw li l-ġrieden PT-DsbA-L jew VDAC1- KO naqqsu b'mod notevoli l-elevazzjonijiet indotti minn CLP fil-livelli tal-BUN u tal-krejatinina, u l-livelli miżjuda ta 'ħsara fit-tessut renali u apoptosi taċ-ċelluli renali (Figuri S1 u S2 a-f ). L-immunoblotting ikkonferma li l-ġrieden PTDsbA-L jew VDAC1-KO wrew ukoll livelli mnaqqsa ta’ caspase cleaved-3, livelli aktar baxxi ta’ akkumulazzjoni ta’ Bax fil-mitokondrija, u rati aktar baxxi ta’ rilaxx ta’ Cyt-c fiċ-ċitosol (Figuri S1 u S2 g- n). B'mod kollettiv, din id-dejta wriet li kemm DsbA-L kif ukoll VDAC1 medjaw il-progressjoni tal-AKI settika.

12. Il-ħsara renali kkaġunata minn VAN kienet attenwata fil-ġrieden PT-DsbAL-KO jew PT-VDAC1-KO

AKI indott minn Vancomycin (VAN) huwa wkoll mudell importanti għall-AKI. Il-mifrex ta' PT-DsbA-L jew VDAC1-WT u PT-DsbA-L jew VDAC1-KO ġew injettati intraperitonealment b'VAN (600mg/kg) għal 7 ijiem konsekuttivi. Ir-riżultati indikaw li l-ġrieden PT-DsbA-L jew VDAC1-KO naqqsu b'mod notevoli l-elevazzjoni indotta minn VAN tal-livelli ta' BUN u kreatinina, ħsara fit-tessut renali, u apoptosi taċ-ċelluli renali (Figuri S3 u S4 an-f). Analiżi ta' immunoblot ikkonfermaw ukoll li l-ġrieden PTDsbA-L jew VDAC1-KO urew ukoll livelli mnaqqsa ta' caspase cleaved-3, livell aktar baxx ta' akkumulazzjoni ta' Bax fil-mitokondrija, u rati aktar baxxi ta' rilaxx ta' Cyt-c fil- cytosol (Figuri S3 u S4 g- m). Fil-qosor, din id-dejta wriet li kemm DsbA-L kif ukoll VDAC1 medjaw AKI indotta minn VAN.

Estratt ta' Cistanche

13. L-apoptosi taċ-ċelluli HK-2 medjata minn DsbA-L kienet assoċjata ma' VDAC1

Ir-riżultat ta 'hawn fuq sab li DsbA-L kien involut fl-apoptosi taċ-ċelloli BUMPT, madankollu, il-funzjoni ta' DsbA fiċ-ċelloli tubulari tal-kliewi tal-bniedem għadha mhux ċara. DsbA-L siRNA ġie trasfettat f'ċelloli HK2 u mbagħad espost għal tnaqqis ta 'ATP għal 2 sigħat u rkupru għal 2 sigħat. Ir-riżultati tal-immunoblot wrew li DsbA-L siRNA tejjeb notevolment iż-żieda indotta minn I/R fl-espressjoni ta' caspase cleaved-3 u VDAC1, iż-żieda fl-akkumulazzjoni ta' Bax fil-mitokondrija, u ż-żieda fil-produzzjoni ta' Cyt-c fiċ-ċitosol ( Figura S5 an- h). Id-dejta ssuġġeriet ukoll li r-rwol ta 'DsbA-L fl-apoptosi taċ-ċelluli HK2 kien relatat mal-VDAC1 waqt it-trattament I/R.

14. L-apoptosi taċ-ċelloli HK-2 medjata minn DsbA-L hija dipendenti fuq il-VDAC1

Biex tivverifika aktar jekk ir-rwol ta 'DsbA-L fl-apoptosi taċ-ċelluli HK2 huwiex dipendenti fuq VDAC1. L-ewwel, iċ-ċelloli HK2 ġew ko-trasfettati b'DsbA-L siRNA plus bi jew mingħajr plasmid VDAC1 u mbagħad esposti għal tnaqqis ta 'ATP għal 2 sigħat u rkupru għal 2 sigħat. Ir-riżultati tal-immunoblot indikaw li DsbA-L siRNA attenwat b'mod sinifikanti ż-żieda indotta minn I/R fl-espressjoni ta' caspase cleaved-3 u VDAC1, iż-żieda fl-akkumulazzjoni ta' Bax fil-mitokondrija, u ż-żieda fil-produzzjoni ta' Cyt-c fiċ-ċitosol, dan l-effett kien imreġġa 'lura bl-espressjoni żejda ta' plasmid VDAC1 (Figura S6a-h). It-tieni, iċ-ċelluli HK2 ġew ko-trasfettati bis-siRNA VDAC1 plus bi jew mingħajr plasmid DsbA-L u mbagħad esposti għal I (2 h) / R (2 h). Ir-riżultati tal-immunoblot wrew li VDAC1 siRNA notevolment tjiebet iż-żieda indotta minn I/R fl-espressjoni tal-caspase cleaved-3 u VDAC1, l-akkumulazzjoni akbar ta 'Bax fil-mitokondrija, u ż-żieda fil-produzzjoni ta' Cyt-c fiċ-ċitosol, dan l-effett ma kienx imsaħħaħ mill-espressjoni żejda tal-plasmid DsbA-L (Figura S7a-h). Id-dejta vverifikat b'mod ċar li VDAC1 medja r-rwol pro-apoptosi ta' DsbA-L fiċ-ċelloli HK-2 waqt it-trattament I/R.

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h u Dongshan Zhang a,b *

Dipartiment tal-Mediċina ta 'Emerġenza, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina

b Mediċina ta 'Emerġenza u Mard Diffiċli Istitut, It-Tieni Isptar Xiangya, Università Ċentrali tan-Nofsinhar, Changsha, Hunan 410011, Repubblika Popolari taċ-Ċina

c Dipartiment tal-Oftalmoloġija, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina

d Dipartiment tal-Kirurġija Urinarja, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina

e Dipartiment tal-Kirurġija tas-Sider, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina

f Dipartiment tal-Kirurġija Ġenerali, It-Tieni Isptar Xiangya, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina

g Dipartiment tas-Saħħa Pubblika, Università tan-Nofsinhar Ċentrali, Changsha, Hunan, Repubblika Popolari taċ-Ċina

h Dipartiment tal-Endokrinoloġija, l-Isptar Popolari ta 'Shenzhen, it-Tieni Kulleġġ Mediku Kliniku tal-Università ta' Jinan, L-Ewwel Sptar Affiljat tal-Università tan-Nofsinhar tax-Xjenza u t-Teknoloġija, Shenzhen, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina

1 Xiaozhou Li u Jian Pan kkontribwew b'mod ugwali għal dan l-istudju