PARTI Ⅰ:Il-Proċess Infjammatorju jimmodula l-espressjoni u l-lokalizzazzjoni ta' WT1 fil-podoċiti li jwasslu għal ħsara fil-kliewi
Mar 23, 2022
Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
MARIELA ARELLANO-RODRÍGUEZ, PABLO ZAPATA-BENAVIDES & ET AL.
Introduzzjoni
Tumur ta' Wilm-1 ġene(WTI) huwa wieħed mill-ġeni ewlenin involuti fis-sopravivenza ta 'podocytes u filtrazzjoni renali ineffiċjenti. Proċessi infjammatorji jwasslu għalkliewifallimentu dan jista' possibbilment iseħħ permezz tal-modulazzjoni ta' WT1 (Tumur ta' Wilm-1 ġene). WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) tikkodifika fattur ta’ traskrizzjoni, proteina tas-swaba’ taż-żingu li għandha erba’ iżoformi ewlenin permezz ta’ splicing alternattiv fl-eson 5(17AA±)u l-eson 9(KTS±)(1). L-isoforma KTS għandha affinità ogħla għad-DNA, KTS flimkien ma' ko-lokalizza mal-proteini spliceosome fiċ-ċitoplasma (2, 3).WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) għandu rwol kruċjali fl-embrijoġenesi, primarjament fil-gonadi ukliewiżvilupp; fl-adulti, l-espressjoni tagħha hija limitata għal ċelluli vixxerali speċjalizzati fil-kliewi(podoċiti) u huwa essenzjali għall-manutenzjoni u l-modulazzjoni ta’ diversi ġeni, bħal podocalyxin, nephrin(NPHS1), u fattur ta’ traskrizzjoni ta’ paired-box (4-6). Mutazzjonijiet jew tnaqqis tal-espressjoni WTl jistgħu jwasslu għal espressjoni mnaqqsa ta 'nephrin u podocalyxin u hija assoċjata ma' nefropatiji bħal glomerulosclerosis(5, 7-10).
Is-sindromu nefrotiku huwa s-sindromu renali l-aktar frekwenti fit-tfulija, il-klassifikazzjoni istoloġika tiegħu hija Bidla nefrotika Minima, glomerulosclerosis segmentali fokali, u sklerożi mesanġjali diffusa, u skont il-firxa tar-rispons għal sterojdi hija kklassifikata bħala sindromu nefrotiku sensittiv u reżistenti (11) .
effetti ta 'cistanche: anti-infjammazzjoni
Mutazzjoni ta' WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) huwa rrappurtat b'mod komuni fi tfal b'sindromu nefrotiku reżistenti għall-isterojdi, marda rari li taffettwa 10-15 fil-mija tal-pazjenti bis-sindromu nefrotiku(12,13). Madwar 80 fil-mija tat-tfal kollha b'sindromu nefrotiku sporadiku jirrispondu għal trattament sterojdi, madankollu, ma nstabet l-ebda mutazzjoni f'WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) fi studju ta’ koorti kbir(14).Tnaqqis fl-espressjoni ta’ sindromu nefrotiku reżistenti għall-isterojdi u sa ċertu punt f’pazjenti b’sindromu nefrotiku sensittiv għall-isterojdi(15).F’mudell murini ta’ infjammazzjoni sistemika indotta minn lipopolysaccharide(LPS), 24 siegħa wara l-amministrazzjoni ta' LPS, WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) ġie traslokat għaċ-ċitoplasma u kien assoċjat ma’ tnaqqis fl-espressjoni ta’ nephrin, komponent ewlieni għaż-żamma tad-dijaframma tal-qasma fil-podoċiti u essenzjali għal filtrazzjoni glomerulari korretta, u b’hekk turi WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) jaġixxi bħala fattur traskrizzjoni għall-ġene tan-nephrin li jirregola 'l fuq (16).
F'ċelluli tal-kanċer tal-pulmun A459 ittrattati b'fattur-alfa tan-nekrożi tat-tumur (TNFa), traslokazzjoni ta' WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) proteina għal ċitoplasma ġiet osservata, li tissuġġerixxi li stimolu infjammatorju jista 'jbiddel il-lokalizzazzjoni intraċellulari tiegħu u l-funzjoni tat-traskrizzjoni (17). Il-fosforilazzjoni jista' jkollha rwol fil-modulazzjoni tal-attività regolatorja tat-traskrizzjoni ta' WT1 (Tumur ta' Wilm-1 ġene) permezz ta' interferenza mat-traslokazzjoni nukleari, kif ukoll bl-inibizzjoni ta' WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) L-irbit tad-DNA(18) permezz ta' fosforilazzjoni medjata minn proteina kinase dipendenti fuq cAMP ta' Ser-365 u Ser-393 fid-dominju tas-swaba taż-żingu (19).
Is-sepsis huwa riżultat tar-rispons infjammatorju sistemiku u huwa kkaratterizzat mir-rilaxx ta 'ċitokini pro-u anti-infjammatorji indotti minn infezzjoni. Ħsara renali akuta hija komuni f'pazjenti morda b'mod kritiku fil-preżenza ta 'infjammazzjoni akuta u għandha rabta qawwija mal-progressjoni ta' ħsara kronika fil-kliewi (20,21). Hemm evidenza li l-infjammazzjoni għandha rwol importanti fil-ħsara lil diversi organi, inklużkliewi(22).F'dan ix-xogħol, aħna evalwajna l-effett ta 'ċitokini pro-infjammatorji fuq il-modulazzjoni ta' WT1 (Tumur ta' Wilm-1 ġene) espressjoni u t-traslokazzjoni tagħha għaċ-ċitoplasma.
benefiċċju cistanche tubulosa: antit-cncer u anti-tumur
Materjali u metodi
Mudell tal-annimali. Ġrieden BALB/c nisa (8-10 ġimgħat) inkisbu minn Harland Mexico (Belt tal-Messiku, Messiku). Il-ġrieden kienu fil-gaġeġ taħt temperatura tal-kamra kkontrollata, umdità, u dawl (ċiklu dawl-dlam 12/12h) b'ilma u ikel ad libitum.LPS ta 'Escherichia coli O111: B4 (Sigma Aldrich, Toluca, Mexico City, Messiku) u wieħed injezzjoni ta 'LPS ġiet amministrata f'doża ta' 8 mg/kg ġol-peritonew (16); is-soluzzjoni salina ntużat għall-kontroll, ġrieden mhux ittrattati. Il-ġrieden ġew sagrifikati b'injezzjoni intraperitoneali ta' 200 mg/kg ta' soluzzjoni ta' sodium pentobarbital f'12,24,36,48 u 72 siegħa, b'n=5 f'kull punt ta' ħin, u mbagħadkliewiinġabru tessut u demm. L-awrina nġabret qabel is-sagrifiċċju tal-annimali.
Żewġ ġrieden għalkliewiesplants ġew injettati b'1 mg/kg ta 'LPS kull jumejn biex jinduċu kronikukliewi korrimentbħala kontroll pożittiv (21). L-esperimenti kollha twettqu skont l-approvazzjoni minn qabel mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Fakultà tax-Xjenzi Bijoloġiċi (CEIBA-2016-034).
Kilwaesplants. Minnkliewital-ġrieden BALB/c, slices tat-tessut 250-300 um ħoxnin ġew ippreparati b'slicer tat-tessut Krumdieck (Alabama Research and Development, Munford, AL, USA) f'4 gradi bil-fluss kostanti tal-buffer tal-bikarbonat Krebs Henseleit (KB) li kien effermat b'5 fil-mija CO2. Il-flieli ġew maħsuda f'KB buffer f'4 gradi.Kilwal-esplants ġew ibbanjati fi 12-pjanċi tal-bir bil-mezz Eagle's mod/F12 modifikat ta' Dulbecco supplimentat b'10 fil-mija serum bovin tal-fetu u 5 fil-mija aġent antibijotiku-antifungali, u inkubati f'37 grad C, b'5 fil-mija CO, u tħawwad f'25 rpm. L-explants ġew ittrattati b'10 ng/ml ta' TNFa (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 20 ng/ml ta' interleukin 1 (IL1; R & D Systems) u 100 ng/ml ta' LPS u analizzati f'6, 12 u 24 siegħa wara.
Proteina urinarja. Inġabru kampjuni ta' l-awrina f'kull punt ta' żmien hawn fuq. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet imkejla bl-użu tal-kit DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) u albuminurja ġiet evalwata bl-użu ta 'elettroforesi tal-ġel tas-sodju dodecyl sulfate-polyacrylamide u bbażat fuq id-daqs tal-faxxa tal-albumina tas-serum bovin (16).
Ċitokini pro-infjammatorji. Il-livelli ta' IL6, IL1, u TNFa tkejlu bl-użu ta' kits ta' analiżi immunosorbenti marbuta ma' enzimi sandwich (PeproTech, Mexico City, Messiku).
Reazzjoni kwantitattiva tal-katina tal-polimerażi (qPCR). L-RNA totali ġie iżolat mit-tessuti tal-kliewi bl-użu ta' Trizolw Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Single-stranded cDNA ġie sintetizzat permezz ta 'traskrizzjoni inversa bl-użu ta' High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. PCR f'ħin reali twettqet bl-użu tas-Sistema 7500 Real-Time PCR (Bijosistemi Applikati) b'assaġġi ta 'espressjoni tal-ġeni TaqMan. Twettqu assaġġi komparattivi tal-PCR f'ħin reali għal kull kampjun fi tliet kopji. Il-primers għal WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) kienu quddiem:5-TCTGCGG AGCCCAATACAG-3'; invers:5-CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA-3';u sonda FAM:5-CACCGTGCGTGTGTATT-3'NFQ;il-protokoll sar għal 95 grad għal 10 min u 40 ċiklu f'94 grad għal 30 s u 64 grad C għat-30s. L-espressjoni relattiva tal-WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) ġie kkalkulat bl-użu tal-ekwazzjoni 2-AACT(23) bil-ġene tal-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Applied Biosystems) li qed tintuża għan-normalizzazzjoni.
kura tal-marda tal-kliewi cistanche estratt
L-espressjoni ta' mRNA ta' nephrin ġiet determinata bi 3 ug ta' cDNA u l-primers li ġejjin: 'l quddiem: 5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT-3'u reverse:5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG-3'f'94 grad għal 30 s,60 grad grad għal 30 s u 72 grad għal 30s għal 30 ċiklu (372 bp) (16). Għall-espressjoni ta 'GAPDH, primers użati kienu: Quddiem:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',reverse:5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA-3', bil-kundizzjonijiet ta' reazzjoni li ġejjin:94 grad għal 40s, 60 grad għal 30s u 72 grad għal 40s għal 35 ċiklu (452 bp). Espressjoni ta' WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene):Quddiem 5'-CACATGAGAGAAACGCCCCTTCATGTG-3', reverse 5'-TTTGAGCTGGGTCTGAACGAGAAA-3'f'94 grad għal 40 s, 64 grad għal 30s u 72 grad għal 30s għal 35 ċiklu bp).(160 bp). L-espressjoni ta' WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) isoforms KTS± u 17 AA±(F2-R2 primers biex jinstabu 17 AA plus /-u F3-R3 biex jindividwaw KTS plus /-splicing isoforms)twettqu minn PCR konvenzjonali skond Oji et .al.(24). Id-determinazzjoni tal-espressjoni ta '-actin saret skond Lauxet al. (25). Il-prodotti ġew osservati bl-użu ta 'elettroforesi tal-ġel tal-polyacrylamide 10 fil-mija għall-KTS±isoform u ġel agarose ta' 2 fil-mija għall-17AA±isoform.
Immunofluworexxenza. Il-kliewiminn ġrieden u kontrolli ttrattati bl-LPS ġew iffissati f'10 fil-mija formalin u pproċessati għal tbajja ta 'ematoxylin u eosin, immunohistochemistry, u immunofluworexxenza.
Biex tiddetermina l-post ta' WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) fil-ġrieden ittrattati bl-LPS, intużaw sezzjonijiet ta' {{0}}um ħxuna ta' tessut renali mmuntati fuq slides tal-mikroskopju. Il-kampjuni ġew dewaxed, permeabilizzati b'Triton X-100 [0.1 fil-mija Triton b'1 fil-mija ċitrat tas-sodju f'salina phosphate-buffered (PBS)], u maħsula tliet darbiet b'PBS. It-tessuti ġew imblukkati b'20 fil-mija serum bovin tal-fetu f'PBS għal 30 minuta u inkubati f'4 gradi matul il-lejl b'antikorp monoklonali għal WT1 (Tumur ta' Wilm-1 ġene) sc{{0}}(F{-6)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)dilwit 1:100 f'10 fil-mija serum bovin tal-fetu f'PBS. Wara ħasliet bil-PBS, il-preżenza ta 'antikorp marbut ġiet identifikata permezz ta' tbajja' bil-mogħoż kontra l-ġurdien IgG Texas Red sc-2979(Santa Cruz Biotechnology). Is-slajds kienu counterstained b'4',6-diamidino-2-phenylindole. Fl-aħħarnett, il-pjastri ġew immuntati u eżaminati kwalitattivament bl-użu ta 'mikroskopju konfokali Olympus BX61W1 b'objettiv ta' immersjoni fl-ilma ta '40 × u softwer Fluoview 4.0a (Olympus, Tokyo, Ġappun).
Immunoistokimika. Biex tiddetermina fosforilati (p)-WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) f'podoċiti minn ġrieden ittrattati bl-LPS, antikorpi poliklonali għal p-WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) intużaw serine 393,sc-12933 u 363,sc-12934-R(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA）. Slajds li kien fihom sezzjonijiet 4-μm ta' tessut renali ġew dewaxed u permeabilizzati . L-immunoistokimika twettqet bl-użu ta' Universal Quick Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)skond il-protokoll tal-manifattur.Il-pjastri ġew eżaminati bl-użu ta 'mikroskopju tad-dawl b'għan ta' immersjoni taż-żejt 100× (Primo Star, Carl Zeiss, GmbH, Ġermanja) .
Western blot. Proteina totali ġiet iżolata b'200 ul ta 'liżi buffer (1 fil-mija Triton, 150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6), u l-konċentrazzjoni kienet imkejla bl-użu ta' kit DC Protein Assay (Bio-Rad). Proteina (50 ug) ġiet isseparata bl-użu ta 'elettroforeżi tal-ġell ta' 12 fil-mija sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide u analizzata permezz ta 'western blotting b'WT1 (Tumur ta' Wilm-1 ġene) [F6] antikorp sc-7585(Santa Cruz Biotechnology). Il-kampjuni ġew normalizzati bl-użu ta 'anti-GAPDH (AB2302; Sigma, San Louis, MO, USA). Proteini ġew viżwalizzati bl-użu ta 'sistema Lumi-Light Western Blotting sc-2048(Santa Cruz Biotechnology).
benefiċċju ta' cistanche: jipproteġi l-kliewi
Riżultati
Induzzjoni ta'kliewiħsarafil-ġrieden BALB/c minn LPS.Huwa stabbilit sew li l-ħsara tal-podoċiti hija assoċjata ma 'żieda fil-proteinurja. L-albumina u l-proteina totali fl-awrina ġew determinati b'elettroforesi tal-ġel tas-sodju dodecyl sulfate-polyacrylamide u DC Protein Assay kit (Bio-Rad). Żieda sinifikanti (p=0.001) ta' albumina urinarja ġiet osservata 12-il siegħa wara l-kura b'LPS, b'żieda massima f'24 siegħa (215.87±1.41 ug/ml) meta mqabbla mal-kontroll (15.53) ±5.0 ug/ml）(Figura 1A).Il-konċentrazzjoni tal-proteina urinarja totali kienet osservata li tilħaq il-quċċata f'36 siegħa (26.02±2.43 mg/ml) u kienet ogħla b'mod sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll (p=0.01) kif muri fil-Figura 1. Il-ħsara renali indotta minn LPS ġiet analizzata bl-istoloġija.F'24 siegħa wara t-trattament, glomerulonefrite fokali kienet osservata fit-tessut tal-kliewi, bl-akbar ħsara tinstab f'36 siegħa, li żżid id-daqs tal-glomerulus, b'mesanġjali proliferazzjoni taċ-ċelluli.Fi 48 siegħa wara, irkupru gradwali tal-glomerulus kien osservat sa 72 siegħa, kif muri fil-Figura 1C.
Figura 1. Effett ta 'infjammazzjoni sistemika fuq il-kliewi.Konċentrazzjonijiet ta 'albumina urinarja (A) u proteina urinarja (B) bħala markaturi ta' ħsara fil-kliewi fil-ġrieden ittrattati b'lipopolysaccharide. C: Immaġini rappreżentattiva tal-istoloġija tal-kliewi tal-ġurdien (tbajja ta 'ematossilina u eosina) f'ħinijiet differenti (12,24,36,48, u 72 h) wara injezzjoni ta' lipopolysaccharide, bil-paragun ta 'mudell ta' infjammazzjoni kronika, ingrandiment 100 ×. Differenti b'mod sinifikanti fi: *n<><0,0]><0.00>
Produzzjoni taċ-ċitokini pro-infjammatorji TNFa u IL1 fis-serum minn ġrieden ittrattati bl-LPS. Biex tiġi kkonfermata ħsara fil-kliewi kienet indotta minn LPS, il-livelli ta 'ċitokini pro-infjammatorji ġew imkejla b'assaġġ immunosorbenti marbut ma' enżimi. Żieda ta' TNFa u I1 ġiet osservata wara 12-il siegħa (3.6±0.9 ng/ml, 11.9±5ng/ml) u sa 36h (4.44±0.1 ng/ml,18 ±0.9 ng/ml rispettivament) tat-trattament bl-LPS, li jibda jonqos minn hemm 'il quddiem (Figura 2A u B). L-espressjoni ta 'IL6 żdiedet fi 12-il siegħa (49.5 ng/ml) u 36 siegħa (23.5 ng/ml) wara t-trattament, li kienet ogħla b'mod sinifikanti mill-kontroll (Figura 2C).
Figura 2. Kors ta 'żmien tal-livelli ta' ċitokini pro-infjammatorji fattur ta 'nekrosi tat-tumur-alpha(TNFa).(A), interleukin 1 (LL1 )(B), u IL6(C) fis-serum minn ġrieden wara amministrazzjoni intraperitoneali ta' lipopolysaccharide. Differenti b'mod sinifikanti fi: *p Inqas minn jew ugwali għal 0.05,**p Inqas minn jew ugwali għal 0.01 u ***p Inqas minn jew ugwali għal 0.001 .
Espressjoni tal-ġeni WTI fit-tessut tal-kliewi minn ġrieden ittrattati bl-LPS. Sabiex inwieġbu l-mistoqsija ċentrali tagħna dwar jekk WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) ġie modulat mill-proċess infjammatorju, u dan kellu effetti renali, l-espressjoni totali tal-WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) ġie determinat f'kampjuni tal-kliewi minn ġrieden b'infjammazzjoni sistemika f'ħinijiet differenti fil-kors tal-infjammazzjoni. WT1(Tumur ta' Wilm-1 ġene) mRNA kien aktar baxx f'kull ħin analizzat fir-rigward tal-kontroll, bl-inqas espressjoni relattiva f'36 siegħa u l-ogħla fi 12-il siegħa wara l-induzzjoni ta 'infjammazzjoni sistemika kif muri fil-Figura 3A. Barra minn hekk, ġie determinat jekk it-trattament b'LPs modifika indotta tal-espressjoni tal-eson5 (17 AA±) u KTS± tal-WTI tal-isoforma permezz tal-PCR. Id-dejta wriet li ma kien hemm l-ebda deregolamentazzjoni tal-espressjoni ta 'dawn l-isoformi peress li l-istess imġieba kienet osservata bħall-grupp ta' kontroll mingħajr trattament matul il-proċess infjammatorju sistemiku indott minn LPS (Figura 3B). Il-proteina WT1 intweriet minn western blotting li tonqos matul il-proċess infjammatorju, b'irkupru żgħir f'36 siegħa wara t-trattament, madankollu, l-ammont ta 'WT1 kien inqas minn dak tal-kontroll mhux ittrattat (Figura 3C u D).
Figura 3. Effett tal-lipopolysaccharide(LPS) fuq l-espressjoni tal-ġene Wilms'tumor I (WT1) fit-tessut tal-kliewi minn ġrieden b'infjammazzjoni sistemika.A: Espressjoni relattiva ta 'WTI mRNA.B: Espressjoni relattiva ta' isoforms KTS± u 17IAA± ta 'WT1.C: Livelli ta' proteina WTI permezz ta 'immunoblotting wara trattament LPS u D: Densità ta' immunoblotting għal WT1. Differenti b'mod sinifikanti f':**p Inqas minn jew ugwali għal 0.01 u ***p Inqas minn jew ugwali għal 0.001,
Fosforilazzjoni u lokalizzazzjoni ta 'WTI f'bijopsiji tal-kliewi ta' ġrieden ittrattati bl-LPS. Avveniment importanti fil-modulazzjoni wara t-traduzzjoni tal-proteina WTI hija l-fosforilazzjoni tal-aċidu amminiku 393, li jinduċi l-ispostament tal-proteina għaċ-ċitoplasma. Ġew determinati l-fosforilazzjoni u l-lokalizzazzjoni ta 'WT1 f'kampjuni tal-kliewi minn ġrieden ittrattati b'LPS. Il-fosforilazzjoni ta 'WT1 ġiet analizzata mill-istokimika, li tindika l-preżenza ta' WT1 fosforilata fiċ-ċitoplasma taċ-ċelloli f'sezzjonijiet ta 'tessut renali li jibdew 12-il siegħa wara l-induzzjoni ta' infjammazzjoni sistemika u jinżammu sa 72 siegħa. kif muri fil-Figura 4A. Il-post tal-proteina WT1 ġie analizzat bl-immunofluworexxenza. Il-post ta 'WT1 fil-podoċiti f'kampjuni tal-kliewi minn ġrieden ittrattati bl-LPS kien prinċipalment ċitoplasmika, filwaqt li fil-podoċiti mill-kampjuni ta' kontroll, il-post ma kienx ċar (Figura 4B).
Figura 4. Fosforilazzjoni u lokalizzazzjoni ta 'Wilms'tumor I (WTI) f'kampjuni tal-kliewi minn ġrieden ittrattati b'lipopolysaccharide.A: Tbajja immunoistokimika għal fosforilati (p)-WTI li juru żieda fil-fosforilati f'serine 393 u 363 li jibdew 12-il siegħa wara l-amministrazzjoni ta 'LPS (ingrandiment 100 × fuq il-mikroskopju tad-dawl). B: Lokalizzazzjoni ta 'WTI permezz ta' immunofluworexxenza fil-kliewi; eżempji li juru lokalizzazzjoni nukleari minuri ta' WT1(kwadri) 36 siegħa wara l-għoti ta' lipopolysaccharide (ingrandiment 40× fuq il-mikroskopju konfokali).DAP1:4,6-Diamidino-2-phenylindole.
Modulazzjoni tal-espressjoni ta 'WTI u nephrin fil-kliewi minn ġrieden ittrattati bl-LPS. Il-post WT1 fiċ-ċellula jinfluwenza l-attività bijoloġika tagħha. Ġie rrappurtat li WT1 ċitoplasmika ma jeżerċitax attività traskrizzjoni; għal din ir-raġuni, l-espressjoni ta 'WT1 u nephrin mRNA ġiet analizzata permezz ta' PCR f'kampjuni tal-kliewi minn ġrieden ittrattati b'LPS (Figura 5A).PCR indikat tnaqqis fl-mRNA ta 'nephrin minn 24 sa 48 siegħa, b'żieda f'72 siegħa (Figura 5B). ), filwaqt li l-espressjoni tal-mRNA WTI żdiedet fi 12-il siegħa u wara naqset matul is-sigħat kritiċi ta 'infjammazzjoni u ħsara fil-kliewi (24 u 36 siegħa) u (Figura 5B).
Figura 5. Analiżi tal-espressjoni ta' nephrin (NPHS1) u Wilms'tumor 1(WT1)mRNA.A: Fl-analiżi tal-espressjoni tal-mRNA, NPHSI u WTI naqsu f'24,36 u 48 siegħa wara l-induzzjoni ta 'infjammazzjoni sistemika bl-użu ta' lipopolysaccharide. B: Kwantifikazzjoni tal-meded murija f'A permezz ta' densitometrija u normalizzati bl-espressjoni għal glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.
Explants tal-kliewi ttrattati b'TNFa u IL1 jimmodulaw l-espressjoni ta 'WTI u nephrin. Biex jiġi ddeterminat jekk iċ-ċitokini jimmodulawx l-espressjoni ta 'WT1, l-esplants renali ġew ikkultivati u ttrattati biċ-ċitokini TNFa u IL1 għal 6,12, u 24 siegħa biex janalizzaw l-espressjoni ta' WT1 u nephrin permezz ta 'PCR. L-espressjoni ta 'mRNA ta' Nephrin naqset u l-espressjoni ta 'mRNA ta' WTI żdiedet f'24 siegħa f'explants renali ttrattati b'TNFa u ILlb (Figura 6).
Figura 6.Analiżi ta 'l-espressjoni ta' nephrin (NPHS1) u Wilms'tumor 1 (WT1)mRNA fl-esplants renali.A: livelli ta 'espressjoni ta' mRNA ta 'NPHSi u WTI f'ħinijiet differenti f'explants renali esposti għal 10 ng/ml ta' fattur-alfa tan-nekrożi tat-tumur (TNF), u 20 nglml ta' interleukin 16 (IL16) B: Espressjoni relattiva miksuba bl-użu ta' analiżi densitometrika tal- prodott tas-sinjal. Il-meded ġew ikkwantifikati permezz ta' normalizzazzjoni għal glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.
Lokalizzazzjoni ta 'WTI fl-esplants renali permezz ta' immunofluworexxenza. Biex jiġi ddeterminat jekk TNFa u IL kinux responsabbli għall-bidla fil-lokalizzazzjoni tal-proteina WT1, l-explants tal-kliewi tal-ġrieden ġew ittrattati b'TNFa u L1 u LPS għal 24 siegħa. F'explants ittrattati b'ILlb u LPS, lokalizzazzjoni nukleu/ċitoplasmika tal-proteina WTl kienet apparenti, u fl-explants ittrattati b'TNFa, ġiet osservata lokalizzazzjoni ċitoplasmika tal-proteina WT1; sadanittant, f'kontrolli mhux ittrattati, kienet osservata prinċipalment lokalizzazzjoni nukleari ta 'WT1 (Figura 7).
Figura 7. Lokalizzazzjoni tal-proteina Wilms'tumor 1(WTI) permezz ta' immunofluworexxenza bl-użu ta' Red TX (WT1) u 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(nukleu) f'podoċiti minn esplanti tal-kliewi ttrattati b'l0 ng/ml ta' fattur tan-nekrożi tat-tumur-alfa (TNFa), 20 ng/ml ta' interleukin 16 (L1B), u lipopolysaccharide (LPS).Lokalizzazzjoni nukleari mnaqqsa ta 'WTas murija fl-explants ittrattati b'TNFa meta mqabbla mal-lokalizzazzjoni nukleari/ċitoplasmika ta' WTI taħt trattamenti IL1 u LPS. Tkabbir, 40×.
